JPH06505400A - 哺乳類の非接着細胞の粒子介在形質転換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 哺乳類の非接着細胞の粒子介在形質転換細胞への外来遺伝物質の挿入に関するも のである〇発明の背景 哺乳動物の血液細胞は、遺伝子工学により操作する上で魅力ある標的である。

多（の血液疾患が単一の遺伝子における諸欠陥により生じ、これらの諸疾患は、 適当な細胞中に単一の正確な遺伝子コピーを挿入することによる遺伝子療法によ り治療できよう。単一遺伝子欠陥の例は、血友病例えば第１Ｘ因子欠乏症及び第 ｖＴＩＩ因子欠乏症、並びに免疫不全症例えばアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ ）欠乏症等である。正常な又は訂正された遺伝子コピーの添加による血液細胞の 操作はこれら諸疾患の治療法を与えるであろう。血液細胞は全身的にペプチド又 はタンパクを放出するための理想的な候補である。というのは、該血液細胞がこ れらの生成物を循環血液中に分泌するからである。ヒト以外の動物の血液細胞の 遺伝子操作も有用であって、臨床上のプロトコール開発用の実験動物モデルを提 供する。

リンパ球は以前遺伝子操作の対象であった。リンパ球はリンパ系から生じ、全白 血球の２０％を構成する。抗原に暴露されると、該抗原により特異的なリンパ球 が感作される。感作リンパ球は増殖し、かつ該抗原に対する抗体を生成するか、 あるいは細胞免疫応答の一部となり得る。リンパ球の２つの主な型は、ヘルパー またはキラー細胞となりかつ細胞免疫応答の原因となるＴ細胞と、抗体を生成す るＢ細胞である。

リンパ球の遺伝的操作の従来の１例においては、腫瘍浸潤性リンパ球ＣＴＩＬ） をメラノーマ腫から単離し、レトロウィルスベクターに感染させ、患者に戻して いた（ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）等、　Ｎ、　Ｅｎｇ、　Ｊ、　Ｍ ｅｄ、、　１９９０．３２３．　ｐｐ、　５７０−５７８参照）・これらのＴＩ Ｌは、単にこれらを標識して患者中でのその辿る経過をモニタするために、該レ トロウィルスで感染された。この研究は、該注入されたＴＩＬが該患者中に維持 され、かつ何等悪影響を与えないことを明らかにした。最近になって、ＡＤＡ欠 乏症の治療のために、遺伝的に形質転換されたＴ及びＢ細胞が提案された。これ らのＡＤＡ欠乏症患者からのＴ及びＢ細胞を、ＡＤＡ遺伝子をコードするレトロ ウィルスベクターにより感染し、該感染細胞を該患者に戻していた（カント（Ｃ ａｎｔｏ）等、　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、　 １９８６．８３．　ｐｐ、　６５６３−６５６V）。

骨髄細胞は、もう一つの遺伝子操作用の魅力ある標的である。この骨髄細胞中に 見出される造血幹細胞は血液中に存在する全ての細胞、即ちリンパ球、赤血球、 血小板、顆粒球、マクロファージ及び単球を生成する。この幹細胞の有糸分裂は ２種の娘細胞を生成し、その何れかが該幹細胞のプールに戻され、もしくは特定 の型の血液細胞に分化する。幹細胞の分化は連続的な細胞分化を含み、かつ種々 の上記血液細胞集団を生成して終結する。該血液細胞集団は数カ月程度まで生存 し、次いで死滅する。

この造血系は幾つかの理由から遺伝子転移にとって動的な標的である。第一に、 骨髄移植に関して十分に発展した手順が存在する。第二に造血細胞は多くの異な る種の細胞に分化し、カリこれらの血液細胞に影響を与える多くの遺伝疾患があ る。

この造血系における種々の段階での遺伝子の細胞への伝達は種々の結果を与える であろう。形質転換され、分化された細胞は、限られた時間の間即ち細胞が死滅 するまで、ある型の細胞中で一時的に該遺伝子を発現するであろう。幹細胞の形 質転換は、該幹細胞由来の全細胞中で、該動物の生存のために該遺伝子を連続的 かつ安定に発現できる。

幾つかの研究グループは、本発明の方法とは異なる手順により、マウスの造血幹 細胞への遺伝子の伝達を立証した。Ａ、　Ｄ、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）、　Ｂｌ ｏｏｄ、　１９９０．７６［２］。

ｐｐ、　２７１−２７８は典型的な幹細胞の実験を記載している。ドナー動物を 、先ず５−フルオロウラシルで処理して分化した血液細胞を殺した。この処理は 幹細胞の有糸分裂を誘発するためのものであった。次いで、該細胞を分裂細胞中 のみでの形質転換に有効なレトロウィルスベクターに暴露した。次に、形質転換 されたと思われる骨髄をレシピエンド動物中に注入した。最近、幾つかのグルー プが、このレトロウィルス法を利用して、ヒトβ−グロビン及び該ＡＤＡ遺伝子 両者をマウス中での長期に渡り発現させたことを報告している。

ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）は上記文献の第２７３°頁において、骨髄の遺伝的形質 転換に関する幾つかの一般に知られている問題点を詳述している。１つの特別な 問題点は髄のりポピユレーション能（Ｒｅｐｏｐｕｌａｔｉｎｇ　ａｂｉｌｉｔ ｙ）の多くが感染処理中に失われることである。ミラーは、ドナーが制限されて いるような用途、例えばヒトに適用する場合には、このような喪失は遺伝療法の 実施における大きな障害となっていることを指摘している。遺伝子転移の技術に おいて必要なのは、血液細胞及び造血細胞等の非接着細胞の効果的な形質転換法 である。以前の非接着細胞の形質転換に向けられた多大な努力においては、レト ロウィルス形質転換ベクター又はエレクトロポーレーションを利用していた。本 発明の形質転換法で使用する装置は、外来ＤＮＡを標的細胞のゲノムに輸送する 全く異なった方法に基いている。クライー次的な発現を生じさせるのに有効であ る。この形質転換ＤＮＡは極めて小さな粒子上に被覆されており、該粒子は弾道 発射体として形質転換すべき組織中に打ち込まれる。クライン等により記載され たこの装置は、培養物中の植物細胞の形質転換における有用性をもつことが立証 されているが、この特定の装置は粒子衝撃力が調節しにくいという欠截を有して いる。従って、これは種々の細胞及び生物の形質転換のために利用することが困 難な装置である。というのは、広範囲の粒子推進のための運動エネルギーを得る ことができないからである。ヤング（Ｙａｎｇ）等（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　 Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、、　１９９０（１２月）、　８７．　Ｉ）り、　９５６８ −９５７２）は、粒子衝突によりその場で固い組織即ち哺乳動物の体細胞を形質 転換する方法を開示している。

ヤング等は電位調節可能な粒子加速装置を使用して、細胞培養物及び肝臓、皮膚 並びに筋肉組織を形質転換した。ＵＳＰ　Ｎｏ、　５，０１５，５８０には、植 物の生殖系列の形質転換において有用なものとして同様な装置が示されている。

胞を単離し、液体中に懸濁し、標的表面に配置する。該標的表面の水分量を、該 細胞懸濁液を薄膜状に展開することによりあるいは多孔性表面に該細胞懸濁液を 配置することにより調節する必要がある。粒子を核酸構築物により被覆し、該被 覆粒子を該支持された非結合細胞に向けて加速する。次いで、この処理した細胞 を該核酸の存在または発現についてア、ノセイする。

本発明の目的は形質転換した非接着細胞を生成することにある。

本発明のもう一つの目的は、注入又は移植可能な形質転換されたリンパ球を生成 することにある。

本発明の別の目的は、注入可能な形質転換された骨髄細胞を生成することにある 。

本発明の利点は、非接着細胞が容易カリ迅速に形質転換されることにある。本発 明の方法は融通性カリ順応性があるので、広範囲の細胞に対して適用可能である 。

本発明のもう一つの利点は、非接着細胞が依然として生存しかつ増殖性であるよ うに該非接着細胞を形質転換することにある。

本発明の更なる利点は、該核酸構築物が純粋に物理的手段により該標的細胞番二 打ち込まれることにある。

本発明のその他の目的、利点及び特徴は以下の明細書、添付図および請求の範囲 から明らかとなろう。

図面の簡単な説明 第１図は、本発明の方法を実施するために組み立てた粒子加速装置の好ましい態 様の分解した模式的な図である。

第２図は、第１図に示した粒子加速装置の水平断面図である。

第３図は、プラスミドｐＷＲＧ１６０１を示す図である。

第４図は、プラスミドＣＭＶ−ＬＵＸを示す図である。

第５図は、プラスミドＣＭＶ−Ｂｇａｌを示す図である。

発明の詳細な説明 本発明は非接着哺乳動物細胞の形質転換に関する。ここで、「非接着細胞（ｕｎ ａｔｔａｃｈｅｄ　ｃｅｌｌｓ）」なる用語は、哺乳動物身体中で独立に機能し 、カリ他の細胞または細胞マトリックスに先天的かつ構造的に結合していない細 胞を意味する。血液中に見出される細胞、例えばリンパ球及び赤血球並びに血液 細胞始原体、例えば骨髄細胞が、ここで使用する該用語の意味する非接着細胞で ある。本発明において有用な非接着細胞は、長期の初代培養物または培養物中の 細胞系統（セルライン）として維持できる。細胞はこれらの培養物から単離でき 、本発明の方法において使用できる。非接着細胞は、また哺乳動物の身体から直 接単離することもできる。

「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｎｍｔｉｏｎ）」なる用語は、核酸構築物を細胞内 に組み込むことを意味する。この組み込みは永続性のあるものでも、また一時的 なものであってもよい。ここでは、この「形質転換」なる用語は外来核酸構築物 の挿入による遺伝的形質転換の意味においてのみ使用し、同様にしばしば形質転 換と呼ばれる細胞中の腫瘍化の発現過程の記載には使用しない。

簡単に言えば、本発明の方法は先ず核酸構築物のコピーを調製し、該構築物コピ ーを生物学的に不活性なキャリヤー粒子上に被覆する工程を含む。哺乳動物の非 接着細胞を単離し、液状媒体中に懸濁し、標的表面上に配置する。本発明の目的 を首尾よく達成するためには、該標的表面上の水分量を調節することが必須であ る。本発明の１態様においては、この水分量の調節は該液状細胞懸濁液を多孔性 表面上に配置することにより達成される。もう一つの態様においては、該液状細 胞懸濁液を薄層状に展開する。これらの細胞を該構築物−被覆粒子で衝撃する。

この衝撃は、該構築物−被覆粒子を物理的に加速することからなり、該加速は適 当な大きさの力で、即ち該細胞の少なくとも幾つかの内部に該構築物−被覆粒子 が止まるような力で行う。最終工程として、該細胞中における該構築物の発現ま たはその存在を確認する。

本発明は、外因性の、しばしばキメラ型の核酸構築物を非接着細胞中に組み込む ことに関する。このような外因性の核酸構築物は別の生物（同一の種でも、異な る種であってもよい）のＤＮＡ又はＲＩＩＩＡからなる。「核酸構築物（ｎｕｃ ｌｅｉｃ　ａｃｉｄｃｏｎｓｔｒｕｃｔ）Ｊなる用語はＤＮＡ又はＲＮＡの集団 、並びに単離及び操作されたフラグメントをも包含するものとする。

この外因性のＤＮＡ構築物は、通常転写生成物又は興味あるタンパクに対するコ −ド配列を、フランキング調節配列と共に含み、ｔＰＪ！節配列はある生物の形 質転換された細胞中で該タンパク又は転写生成物を発現する上で有効である。フ ランキング調節配列の例は転写を開始させるのに十分なプロモータ配列及び転写 又は翻訳の停止の何れかによる該遺伝生成物を停止するのに十分な終止配列であ る。

適当な転写又は翻訳エンハンサ−を該外因性の遺伝子構築物中に含めて、全体と しての該形質転換工程及びコード化タンパクの発現の効率を高めることができる 。

タンパク以外の遺伝生成物を、該挿入した核酸構築物により発現させることも可 能である。例えば、該挿入された構築物は、本来の遺伝子の発現を抑制又は疾患 の病因を阻害するのに有効なマイナス鎖Ｒ１１ｉＡを発現することができる。こ の構築物は、一時的な遺伝生成物の発現を所望する場合には、ＤＮＡに代わるも のとしてのＲＮＡであり得る。

発明で使用するのに適した装置を第１図及び第２図に示した。この装置は火花放 電室１２を有し、その中には２つの電極１４が挿入され、該電極は約１〜２ａｎ の間隔で隔置されている。この火花放電室１２は、上端部における２つの開口１ ６及び１８を有する水平に延びた矩形体である。その一方の開口１６は交叉板２ ０で覆われている。

電極１４ど反対側に配置されたもう一方の開口はキャリヤーシート２２により覆 われるようになっている。

電極１４は適当に調節できる放電電位源に接続されている。このような放電電位 自動変換機の使用等により、１〜５０．０ＯＯＶの範囲内で調節可能である。適 当な切り換え手段が設けられていて、利用者が該キャパシタを安全かつ便利に該 電極１４を通して放電できるようになっている。

火花放電室１２の該開口１８上に配置されるキャリヤーシート２２は、好ましく はアルミニウムメッキしたサラン−被覆マイラー（Ｓａｒａｎ−ｃｏａｔｅｄ　 Ｍｙｌａｒ）シートである。

このキャリヤーシート２２は平坦な、比較的軽量のものであるべきである。保持 スクリーン２４は該放電室の該開口の上方的５〜１０！ＩＱの位置に配置される 。標的表面２６は該保持スクリーン２４の上方約５〜２５画の位置に配置される 。

該非接着細胞を形質転換するための該核酸構築物は、当業者には周知の適当なり ＮＡ調製技術により調製される。この構築物を、耐久性の緻密で生物学的に不活 性な物質、例えば金の粒子上に被覆する。この粒子は、典型的には０．２〜３μ の範囲の粒径を有する。特に適した金粒子の供給源はエリジットインダストリー ズ社（Ｅｌｉｃｉｔ　ｒｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　；　ＮＹ）である。

好ましくは、該粒子の粒径は０．８〜１．２μの範囲内である。

ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）沈殿法は、該粒子上にＤＮＡを被覆する方法 の一つであるが、他の方法も同様に適している。１本の試験管中で、■−の金粒 子、２５■のＤＮＡ及びｌＯを混合して全体積を１００μｌとする。１００μｌ の５０％′ＰＥＧ水溶液、１００μｌのＩＭ　ＣａＣ１，及び２００μＩのＨｔ Ｏを第２の試験管中で混合する。第一の試験管の内容物を迅速に攪拌しつつ該第 二の試験管に添加する。核酸−被覆金粒子が沈降するので、上澄を除去する。

また、微晶質金粒子を秤量した小型遠心管に入れ、秤量する。典型的には、約ｌ Ｏ■の金粒子を一度に被覆する。該金粒子に５倍容（μｍ／ｗ）の０．１Ｍスペ ルマジン（ｓｐｅｒｍａｄｉｎｅ）を添加する。金粒子１■当たり０．５〜２５ μｇのＤＮＡとなるようにプラスミドＤＮＡを該混合物に添加する。このプラス ミドＤＮＡ溶液の濃度は、該添加したＤＮＡ溶液の体積を使用したスペルマジン の体積の０．４倍に等しいか又はそれ以下とするのに十分な値である。これらの スペルマシン、ＤＮＡ及び金粒子を混合し、かつ室温にて１０〜１５分間インキ ュベートする。定常的に混合しながら、５倍容（μｌ／ｍｇ、使用した金粒子の 最初の質量を基準として）の２．５ＭＣａＣｌ　ｔを滴下する。この混合物を室 温にて３分間インキュベートし、次いで１０−１５秒間遠心処理して、被覆粒子 を回収する。遠心処理後に、上澄を除去し捨てる。

該粒子を被覆した後、これらを１００％エタノールで洗浄し、１００％エタノー ル中に所定の「粒子担持率」で再懸濁する。「粒子担持率」とは、キャリヤーシ ート２２上に配置される被覆キャリヤー粒子の量を表す。好ましい粒子担持率は キャリヤーシート１ｃｍ’当たり０．０５〜０．５ｍｇの被覆粒子なる値である 。この被覆キャリヤー粒子を、次いでキャリヤーシート２２上に配置し、該シー トを火花放電室１２の上部に挿入する。該被覆粒子を平坦なキャリヤーシート上 に、均一な水平方向の分布を有するように配置する。この均一な分布は、統計的 に有意な方法で多数の小さな細胞の首尾良い形質転換のために重要である。好ま しくは、被覆粒子のエタノール懸濁液をピペットで該キャリヤーシート上２２に 配置する。該被覆粒子を沈降せしめ、大部分のエタノールを排液せしめる。残留 エタノールを蒸発させることにより、薄い、均一な被覆粒子の層を得る。

非結合哺乳動物の細胞を標的表面２６上に設置する。適当な細胞は、以下の実施 例により説明するように、細胞培養系統から得るかあるいは哺乳動物から直接単 離することができる。これらの細胞は懸濁液状態にある必要がある。以下の実施 例において、該細胞は培地中に懸濁される。

該ターゲット表面２６上の水分の量を調節することは、本発明の方法の成功にと って重要である。本発明者等は、細胞／液体比を特定のパラメータ範囲内とした 場合にのみ、効果的な形質転換が達成されることを見出した。本発明の実施例に おいて、この水分量を効果的に制御する２つの方法を明らかにする。その一つの 方法は細胞を多孔質の表面上に設置することを含む。適当な多孔質表面の例は濾 紙（ファツトマン（ＴｈａｔＩｍｎ）Ｎｏ、　ｌファツトマンペーパー社（Ｔｈ ａｔｍｎ　Ｐａｐｅｒ、　Ｌｔｄ、　）及びポリカーボネート膜（孔径２−５μ ｍ１リバーモアＣＡのボアティックス社（Ｐｏｒｅｔｉｃｓ　Ｃｏｒｐ、　）） である。他の多孔性材料も適しているが、該材料は細胞の生存を保証するのもで なければならない。「多孔質（ｐｏｒｏｕｓ）Ｊなる用語は、過剰のる。水分を 制御するもう一つの方法は、該細胞懸濁液のアリコート（約１０〜２５μｍ、１ 〜５Ｘ１０’個の非接着細胞を含有する）を該標的表面２６上に設置し、この液 を展開して薄膜とし、該細胞／液体比が効率の良い粒子衝撃に適したものとする 。

水の小滴（体積的２〜４μＩ）を電極１４末端部間を架橋するように配置する。

次いで、アクセス板カバー２０を放電室Ｉ２の上部を覆うように配置する。好ま しくは、該装置及び標的を包囲し、かつ該包囲体内にヘリウムガスを導入して、 キャリヤーシート２２と標的２６との間の雰囲気の大部分をヘリウムで置換する 。

キャリヤーシート２２は軽量であり、かつ急速に加速されるので、これは極めて 柔軟性である。従って、キャリヤーソートｎを推進する方法が重要となる。とい うのは、単一の点に掛かる力は該シートを歪ませ、標的表面２６上の細胞内に侵 入する所定の均一な層の粒子を与えないからである。ガス衝撃波が該キャリヤー シート四を衝撃するのに使用する手段であり、これは該シートを平面運動状態で 上昇させ、その所定の形状を損なうことなしに該キャリヤーシート匹を維持スク リーン２４に至るまでの間隔を横切って移動させる。第１図及び第２図の装置は 、火花放電を利用してこの作用を達成する。しかし、同様なガス衝撃波を得るた めの他の手段も存在する。

この時点で、電極１４間の火花放電は適当な電気的スイッチ手段により開始され る。この放電の力は電極１４間の火花放電間隙に電弧を形成し、瞬間的に該電極 １４間に配置された該水の小滴を蒸発させる。この水の蒸発の力は火花放電室１ ２内に衝撃波を生成し、該衝撃波は外方向に向くあらゆる方向に放射される。こ の衝撃波は大きな速度で該キャリヤーシート四を上方に、該キャリヤーシートと が核維持スクリーン２４と接触するまで推進する。ヘリウムの存在は該キャリヤ ーシート及びキャリヤー粒子の飛行に対してより小さな抗力を生じ、かつ該衝撃 波の該標的２６への伝播を軽減するより低粘性の媒体を与える。

キャリヤーシートｎは保持スクリーン２４で保持さ札そして被覆粒子がキャリヤ ーシートから飛び出し、標的表面に向かって自由に移動する。粒子は標的表面に 進み、細胞に入る。粒子が標的細胞の表面に衝突する際の粒子の運動量は、電極 １４に適用される初期の放電の電圧に基いて調節可能である。電極１４中で放電 された電気エネルギーの量の変化により、粒子が標的に衝突する速度が調節し得 る。

こうして、標的の細胞中の粒子の浸透の深さは、放電の調節の範囲にわたって連 続的に調節し得る。また、粒子の浸透は、粒子サイズ（大きい粒子は、通常、更 に浸透する）及び形状（スピア形の粒子は球形の粒子よりも更に浸透する）を変 えることにより調節し得る。

核酸で被覆した粒子による衝撃後に、細胞は適当な培地中で培養される。細胞は 、核酸構成物の存在及び／または発現を確かめるために分析される。好適なアッ セイが、以下の実施例で開示される。実施例に開示されたような容易に分析され た遺伝子は、治療上関心のある遺伝子とタンデムにカップリングし得る。また、 抗生物質抵抗性遺伝子のような選択荊が、治療上関心のある遺伝子でタンデムに 形質転換し得る。抗生物質による培養後に、抵抗性細胞は増殖し続け、一方、非 抵抗性細胞は死滅するであろう。最終的に、これらの形質転換された血液細胞及 び血液細胞前駆細胞は、当業界で知られている操作により患者に注入される。

以下の実施例のうちの幾つかの付着されなかった細胞は一過性にのみ形質転換さ れるようであるが、本発明の方法はまた下記の別の実施例に示されるようにこれ らの細胞の安定な形質転換を生じることができる。ヤング（Ｙａｎｇ）ら（Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔ　ｌ。

Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　ＵＳＡ　８７：９５６８（１９９０））は、二種の 細胞系が粒子衝撃を受ける場合に２ｘ１０−’〜６　Ｘ　１０−’の割合で安定 に形質転換されることを実証した。更に、種々の植物細胞及び細菌細胞が粒子媒 介形質転換法を受けた場合、一過性に発現する形質転換体の０．１〜５％が安定 な形質転換体であることが判明した。これらの安定な形質転換体の検出は、多数 の一過性形質転換体をスクリーニングすることを必要とした。同様に、付着され なかった細胞の安定な形質転換は、形質転換細胞の統計上多量の試料が試験され る場合に検出された。細胞の集団（そのうちの一部が安定に形質転換されている ）は、形質転換細胞が選択的に増殖し得るように選択し得る。このプロセスは、 治療の意味で宿主哺乳類の体に戻し得る安定に発現する細胞の安定な集団または 培養物をもたらすことができる。こうして、細胞が除去され、治療用タンパク質 の遺伝子（及び選択マーカー）で形質転換され、選択され、増殖され、次いで生 体に戻されて治療用タンパク質を送出し得る。

Ａ、リンパ球の形質転換 ■、リンパ球の調製 Ｂ細胞及びＴ細胞はリンパ球の二つの主要な類である。全てのリンパ球への本発 明の適用可能性を調べるために、夫々の型の代表的な細胞を形質転換することを 選択する。マウスＣＴＴＬ−２細胞（ＡＴＣＣＴｌＢ２１４）（これらは細胞毒 性のＴリンパ球細胞である）及びヒトＷＩＬ−ＮＳ細胞（ＡＴＣＣｔＲＬ８１５ ５）にれらはＢリンパ芽球細胞である）を選択する。（リンパ芽球は未熟リンパ 球である）。これらの細胞をＡＴＣＣ（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレ クション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ−１１ｅｃｔｉ ｏｎ））から入手し、”Ｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌ　Ｌｉｎｅｓ　ａ ｎｄ　Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”、第６ｍ。

１９８８、　ＡＴＣＣにおいて供給業者により提案された培地中で増殖した。

２、核酸構成物の調製 リンパ球細胞をプラスミド１）ＷＲＧ１６１）ｌで形質転換した。図３はｐｉｖ ＲＧＩ６Ｑｌの線図である。Ｉ）ＷＲＧ１６０１による形質転換は、広範囲の哺 乳類細胞タイプでヒト成長ホルモンの発現及び分泌を生じる。プラスミドｐＷＲ Ｇ１６０１は、ヒトサイトメガロウィルス（ＣＭＶ）即時−初期プロモーター（ ポサー（Ｉｔ　Ｐｏ５ｅｒ）ら（１９８５）Ｃｅｌｌ　４１：５２１−５３０） 及びヒト成長ホルモン（ＨｕＧＨ）遺伝子からの転写領域及び下流のフランキン グ領域（シエルデン（Ｒ，Ｆ、　Ｓｈｅ　１ｄｅｎ　）ら（１９８６）Ｍｏ１． Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　６＋３１７３−３１７９）を含むキメラ遺伝子を含む。

ＣＭＶ−ＨｕＧＨＩＬ伝子の他に、ｐＷ’ＲＧ１６０１は、エプスタイン・バー ルウィルス（ＥＢＶ）からの領域（これらの領域は複製の原点（ＯＲ４Ｐ）及び キメラ核抗原１　（ＥＢＮＡＩ　）遺伝子を含む）、及び細菌プラスミドベクタ ーｐＧＥＭ３（プロメガ）を含む。ＥＢＶ領域は、マウス細胞中ではなく、ヒト 及び幾つかのその他の哺乳類細胞中の自律的プラスミド複製に充分な機能を与え る。こうして、これらの領域はこれらの実験に必須ではない。ｐＧＥＭ３領域は Ｅ、ｃｏｌｉ中のプラスミドの複製及び選択を与える。

プラスミドを通常のＥ、ｃｏｌｉ宿主株中で増殖させ、プラスミドＤＮＡを通常 の方法により単離した。プラスミドＤＮＡを、上記の０．８〜１．２ミクロンの 微結晶性の金粒子に被覆した。金粒子を、金粒子１■当たり０．５〜２５μｇの ＤＮＡで被覆した。

３、標的調製 培地中の細胞のアリコートを血球計数器でカウントした。次いで細胞を培養液か ら遠心分離（３００ｘ　ｇで７分間）により回収し、新しい培地中に再懸濁させ た。

次いで１０”〜１０’個の細胞を含むアリ゛コートを無菌濾紙（ワットマンＮ０ ．１）または培地で前もって濡らされた無菌濾紙をオーバーレイするポリカーボ ネート膜にピペットで移した。過剰の培地は濾紙により吸い取られた。

次いで標的をｐＷＲＧ１６０１で被覆された金粒子１６３μｇで１ｏｋＶで衝撃 した。プラスチングの直後に、培地を標的に添加した。次いで細胞及び培地を除 去し、上記のＡＴＣＣカタログに記載された通常の懸濁培養条件下で培養した。

４、形質転換リンパ球によるＨｕＧＨの生産及び分泌衝撃された細胞及び衝撃さ れなかった細胞（対照）からの培地を、ヒト成長ホルモンを特異的に検出する市 販のイムノアッセイキット（Ｎｉｃｈｏｌｓ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　Ｄ−ｉａｇ ｎｏｓｔｉｃｓ、　Ｓａｎ　Ｊｕａｎ　Ｃａｐｉｓｔｒａｎｏ、　ＣＡ）を使用 してヒト成長ホルモンにつき分析した。衝撃の３日後及び７日後に、リンパ球を 上記のようにして回収し、新しい培地中に再懸濁させた。次いで使用済の培地を ＦｌｕＧＨにつき分析した。衝撃されなかった細胞からの培地を対照試料として 使用して成長ホルモンアッセイに関するバックグラウンド・レベルを確立した。

全ての場合、バックグラウンド・レベルを測定し、これは）ｌｕＧＨが存在しな い試料のレベルとほぼ同じであった。ヒト成長ホルモンの発現及び分泌を、ｐＷ ＲＧ１６０１で被覆された粒子による衝撃を受けたＢリンパ芽球及び１１２８球 の両方で検出した。“発現及び分泌”は、毎日１０６個の細胞当たり５ｎｇより 多くのＨｕＧＨが測定されたことを意味する。培養期間中にヒト成長ホルモンを 発現し、分泌した形質転換Ｂリンパ芽球培養物を、マウスへのその後の注入のた めに同定した。

５、形質転換細胞によるマウスの注入 これらの実験をＢリンパ芽球で首尾よく行った。衝撃の８日後に、細胞の三つの 群−−一つの対照群（衝撃されなかったＷＩＬ２−ＮＳ細胞）及びｐＷＲＧ１６ ０１で形質転換されたＷＩＬ２−ＮＳ細胞の二つの群−を、カウントし、夫々的 ３　ｘ　１０’個の細胞を含むアリコートに分けた。衝撃された細胞の二つの群 をＵＦＩＯＢ及ｒＪ′Ｆ１２Ａと称したっこれらの細胞を３００　Ｘ　ｇで７分 間の遠心分離により培地から回収した。上澄みの培地をアスピレーションにより 除去し、ヒト成長ホルモン・アッセイのために保持した。これらの細胞を約１０ ’〜ｌＯ′個の細胞／ｍｌで新しい培地中に再懸濁させた。成長ホルモン・アッ セイは、形質転換リンパ芽球が１０〜２０１ｇ／１０’個の細胞７２４時間の速 度でヒト成長ホルモンを分泌していたことを示す。全ての場合、対照培養物はヒ ト成長ホルモンの生産を示さなかった。

リンパ芽球懸濁液（対照群及び形質転換群の両方）をＢＡＬＢ／ｃマウスに静脈 内注射、腹腔内注射または皮下注射した。５０μｌを尾部静脈に静脈内注射し、 １００μｍを腹腔内注射し、また１００μｌを皮下注射、皮肉注射した。リンパ 芽球の注射２時間後に血液試料をマウスから回収した。注射の２４時間後にマウ スを犠牲にし、最終の血液試料を回収した。血清中のヒト成長ホルモンレベルの 分析は下記ノ結果を与えた。

゛表１ ｓｕｂＱ　ＵＦＩＯＢ　２時間　８８．６±７６＄２ｓｕｂＱ　Ｆ１２Ａ　２時 間　０．１＋０．４゜ＩＰ　ＵＦＩＯＢ　２　時間５．０−に：０．２ＩＰ　Ｆ １２Ａ　２時間　４．８±０．６ＩＶ　ＵＦＩＯＢ　２　時間５．１±３．６ｓ ｕｂＱ　ＵＦＩＯＢ　２４時間　＜０．１±０゜０５１１Ｐ　ＵＦＩＯＢ　２４ 時間　０１ １Ｐ　ＦＩ２Ａ　２４時間　〈０．２±０９０２９ＩＶ　ＬＩＦｔＯＢ　２４時 間　〈０．ｌ±０．０１”＊これらの値は有意差がない。

につのアッセイの平均値上標準偏差 ２アッセイの一つは高いＨｕＧＨレベルを示し、一方、他のアッセイは高いＨｕ ＧＨレベルを示さず、高い標準偏差を生じた。

これらの結果は、ヒト成長ホルモン遺伝子を発現する形質移入されたリンパ芽球 の静脈内注射及び腹腔内注射の両方が循環血液中のヒト成長ホルモンの一過性の 出現を生じたことを示す。皮下注射からの一つのアッセイは有意差のあるＨｕＧ Ｈの読みを示したが、重複アッセイは実質的にバックグランド・レベルを示した 。

Ｂ、骨髄細胞の形質転換 １、総説 本発明者らの骨髄形質転換の一般的なプロトコルは以下のとおりであった。骨髄 細胞を雄のホルツマン・ラット（生後約５週）の脛骨及び大腿骨から流出させた 。骨髄細胞の単離は、ミツシェル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）及びシイギ（Ｓｈｉｉｇｉ ）著、ＳｅｌｅｃｔｅｄＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｉｍｍｕｎ ｏｌｏｇｙ、　１１頁、フリー７：／−７：／ド・カンハニイ発行、ニューヨー ク、１９８０に記載されている。簡単に言えば、ラットを最初に殺し、アルコー ル中に浸漬する。脛骨及び大腿骨を皮膚及び筋肉から分離し、緩衝液を含む培養 皿に移した。骨を両端で針で孔を開け、緩衝液を骨中に押しやることにより骨髄 を追い出した。骨髄を針の出し入れで取り出して単細胞懸濁液を得る。

骨髄細胞をフィコルーハイベーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）で遠心分離 により赤血球から分離して精製した。ミツシェル及びシイギ（上記の文献、２Ｏ ２頁）が、この方法を記載している。簡単に言えば、その方法は、緻密な媒体を 通過し、遠心分離中にペレツトを形成する成る密度の細胞に依存する。ペレット は、赤血球、死亡した細胞、及び細胞デブリを含む。界面及びフィコルーハイベ ークはその他の細胞を含む。その方法は以下のとおりである。１４％のフィコル 溶液１２部を３２．８％のハイベーク溶液５部と混合し、滅菌する。その混合物 はｌａｎ”当たり１．０９ｇの密度を有するべきである。冷却した細胞溶液を２ ０℃に前もって温め、遠心分離管中の４ｍｌのフィコルーハイベーク溶液の上に 層形成する。管を、前もって温めた遠心分離機中に入れ、２０００　ｘ　ｇで２ ０分間遠心分離する。部分精製した骨髄細胞を、ハンクス基本培地中で３回すす ぐことによりフィコルーハイベークから分離して精製し、小容積の培地中で再懸 濁させた。

別途、赤血球を実施例Ｂ−１で低張ショックによる溶解により部分除去した。赤 血球溶解はミツシェル及びシイギ（上記の文献、２２頁）に記載されている。こ の操作は以下のとおりである。濃縮細胞０６１ｍ１を希釈剤（ハンクス基本培地 ）０．１ｍｌで希釈し、細胞ペレットを再懸濁させる。１／１ｏ希釈液１〜２ｍ ｌを細胞に添加、混合する。細胞を１５秒の低張ショックに暴露し、充分な強さ くｌｘ）の希釈液を添加、混合する。細胞混合物を２００　ｘ　ｇで１０分間遠 心分離する。

いずれかの方法により精製した骨髄細胞を３５ａｎの細胞培養皿の表面に１８　 ｘ　１８Ｉのパターンで塗布した。この塗布を、細胞懸濁液ｌＯμｍ〜２５μｌ を３５ａｎのベトリ皿の中央にピペットで入れ、その液体を使い捨て型の細胞ス クレーパ（バクスター・マツボウ・パーク（Ｂａｘｔｅｒ　ＭｃＧａｗＰａｒｋ ）、　ＩＩＩ）で１８　ｘ　１８　ａｎの正方形に塗布することにより行う。夫 々の標的に対し培地ｌＯμＩ中５　ｘ　１０’個の細胞を入れることか好ましい 。標的に対し５〜５０μｍの容積中Ｉ　Ｘ　１０＠〜５　Ｘ　１０’個の細胞を 使用した。１０μＩが最適容積である。

粒子を被覆するために、プラスミドＤＮＡを通常の方法で調製した。骨髄細胞を ７’−ｙ　スミｔ”ｐＣＭＶ−ＬＵＸ　（図４）及びｐＣＭ’Ｖ−Ｂｇａｌ（図 ５　）ｔ−衝撃ス６　コトを選択する。

ｐＣＭＶ−ＬＵＸプラスミドはホタル・ルシフェラーゼをコードする。ｐＣＭＶ −ＢｇａｌプラスミドはＥ、ｃｏｌｉＢ−ガラクトシダーゼをコードする。

これらの細胞を、ＤＮＡで被覆した粒子で５〜１９ｋＶの電圧で衝撃した。実施 例Ｂ−４は、最適衝撃電圧が６ｋＶであることを実証した。衝撃後に、培地１〜 ２ｍｌを添加し、骨髄細胞を５％のＣＯｔ：９５％の空気雰囲気中で３７℃のイ ンキュベーションにより一夜にわたって培養した。翌日、細胞をリポータ−遺伝 子、ルシフェラーゼ及真−ガラクトシダーゼの発現につき分析した。

ルシフェラーゼの測定は、デウエット（ｄｅＷｅｔ）等、Ｍｏ１．　Ｃｅ１１． 　Ｂｉｏｌ、　７；　７２５−７３７　（１９８７）に記載されているように実 施された。一般に、その測定はルシフェラーゼによって触媒されるルシフェリン の酸化で測られる。酸化されたルシフェリンは光子（ｐｈｏｔｏｎ）を放射し、 それをルミノメータ−（Ａ、　Ｌ、　Ｌ、モノライト（Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ）　 ２００１）を使用して測定した。光子生成の率、つまり光強度はルシフェラーゼ 濃度の尺度を提供する。抽出バッフｙ　（１００ｒｒＭＫＰＯ−１ｐＨ７，５、 １００μｇ／ｍｌウシ血清アルブミン、０，６２■／ｍｌ　ロイペプチン、２． ５ｒＩＭ　フェニルメチルスルホニルフルオリド、１％トリトン　Ｘ−１００、 ］ｌｌｌ１１１　ジチオトレイトール）を等しい重量　容量で細胞に添加した。

抽出はトリトン分解及び超音波処理により実施された。サンプルは冷却遠心機中 で回転されて、細胞破片を除去し直ちに無細胞抽出物を測定した。反応キュベツ トにおいて、８０μｌの５％反応バッファーを蒸留水と混合し、無細胞抽出物の １−５０μｌのサンプルを添加した（全容量は４００μｌと等しくあるべきであ る）。その混合物をかき混ぜ、１００μｌの０．５酬　ルシフェリンを添加した 。ルシフェラーゼ活性の量は、衝撃を与えられたターゲット５清アルブミンであ って、ｐＨが７．８に調節されている。

β−ガラクトシダーゼの測定は、非蛍光性ガラクトシドである４−メチル−ウン ベリフェリル−β−ガラクトシド（ＭＵＧ）のＤ−ガラクトース及び高蛍光性メ チルウンベリフェロンへの転化に依存する。蛍光性生成物をフルオロメーター（ ３５０ｎｍで励起設定及び４５０ｎｍで蛍光放射を読む）を使用して測定した。

この測定は極めて感度が良（、僅かに数千の細胞がβ−ガラクトシダーゼ活性の 正確な測定に要される。

β−ガラ’）トンダーゼの測定は、マツフグレボ−（ＭｃＧｒｅｇｏｒ　）等、 ５ｏｒｎ、Ｃｅ１ｌ曵江［蝕坦ｔ−＋　１３；　２５３−２６５（１９８７）に 詳細に記載されている。簡潔には、細胞をＺ−バッファ　−（６０ｍＭ　Ｎ１２ ＰＯ，−７ＨｔＯ；　４０ｍＭ　ＮａＨ２ＰＯ２−ＨｔＯ，ＩＭ　ＫＣＩ　；　 １ｍＭ　ＭｇＳＯ４・７Ｈ７０、ＮａＯＨ又はＨＣｌ−リＨを７．０とする）に 再懸濁した。１０５μｌまでの該細胞懸濁液をマイクロタイター皿のウェルに置 いた。１５μｌの１％トリトンＸ−１００を各ウェルに添加した。そのサンプル を５−１０分間インキュベートして細胞を溶解した。３０μｉの３ｍＭ　ＭＵＧ を各ウェルに添加した。停止溶液（３００−グリシン、５ＤｒｒＭＥＤＴＡ　、 　ｐｌ（０，２）を９０分後に各ウェルに添加した。得られた溶液をフルオロメ ーター内に置き、蛍光強度を測定した。

２、骨髄の形質転換：ルシフェラーゼ ２匹のラットから骨髄細胞を我々の標準プロトコールにあるように採収し、プー ルした０この実施例では、骨髄を部分的に精製する２種の方法を比較した。赤血 球細胞を除去したく、しかしその後に骨髄細胞の数を可能な限りありのままで残 したかった。多くの作業者はフィコール−ハイバーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａ ｑｕｅ（Ｆ／Ｈ））精製細胞を使用する。しかしながら、幾らかの骨髄細胞はこ の方法における遠心中にベレットへ失われる。代わりに低張ショックによる赤血 球細胞の溶解を試みた。低張ショックは上述のように実施された。

精製した骨髄細胞を遠心（３００ｘｇ、５分）によって濃縮し少容量の媒体に再 懸濁し、上述のように標的表面上へ散布した。　“低張ショックを受けた”細胞 は６Ｘ　１０’細胞／１０μｍに濃縮した。フィコール／ノ・イパークー精製細 胞は２．６Ｘ１０”細胞７１０μＩに濃縮した。各サンプルの１０μＩを標的表 面上に散布した。細胞にその後、ｐＣＭＶ−ＬＵＸにより１ＯｋＶで衝撃を与え 、直ちに培養基を添加した。この実験の結果である表２は、骨髄細胞の部分精製 のどちらの方法においても同様の形質転換頻度を示した。

表２ サンプル　＃　粒子負荷量　分離　結果５　０．２■／ゴ　Ｆ／Ｈ１２８８４Ｒ ＬＵ／標的６　０、２　ｍｇ／ａｍ２　低張シＨ７り　４６２３２　ＲＬＵ／標 的７　０．４■／口２　Ｆ／Ｈ２１６３２ＲＬＵ／標的８　０、４　ｍｇ／ｃｍ ”　低張ショック　４０７９０１１ＬＵ／標的３、骨髄の形質転換 この実施例では、我々は標的表面上の種々の細胞濃度を試験し、どの濃度が細胞 を無駄にすることなく最も高い移動活性を与えるかを見出した。細胞にｐＣＭＶ −Ｂｇａｌを使用して、１０ｋＶでキャリヤーシート上の０．３■／ａｎ’粒子 負荷量で衝撃を与えた。我々はｌＯμｌの細胞懸濁液をその標的表面上をおおっ た。表３は結果を作表したもので、最適な遺伝子移入に一定の細胞密度が必要と されることを示している。

表３ サンプル　＃　細胞／標的　相対的ＭＵＧ活性／１０６細胞１　２．５　ＸＩＯ ’　１ ２．３　５ＸｌＯ’　４．５ ４．５　７．５　ｘｌＯ’　４．７５ ６．７　１　ＸＩＯ’　６．７５ ８．９　２．５　ｘｌＯ’　３．５ ＭＵＧ蛍光定量的測定で得られた値はｌＸｌ０’細胞レベルに標準化された０結 果は、標的光たりｌＸｌ０’細胞／１０μｌが、細胞の最も効率のよい使用量で あることを示す。

４、骨髄の形質転換　アグルチニン処理この実施例の細胞は我々のプロトコール により抽出された。大豆アグルチニン（ＳＢＡ）処理を使用して、より成熟した リンパ球の表面上にある特定の残基に結合するレクチンであるＳＢＡによって細 胞が凝集する能力に基づいて、骨髄細胞を２つの群に分別した。非分化骨髄幹細 胞はＳＢＡに結合しない。

大豆アグルチニン処理はミツシェル（Ｍｉｓｈｅｌｌ）及びシーギ（Ｓｈｉｉｇ ｉＸ上述、２２６頁）に記載されている通りである。簡潔には、細胞を等容量の ＳＢＡ含有溶液と混合して、室温で５〜ｌＯ分間インキュベートする。細胞は２ ％ウシ血清アルブミンを含む４０ｍ１のバッファーの最上で層となって、室温で １５−３０分間インキュベートして凝集した細胞と非凝集細胞の分離が可能とな る。細胞の最上の層と底の層を別々に取り出して、パスツールピペットで遠心チ ューブに移した。細胞の底の層を０．２Ｍガラクトースに懸濁して室温でインキ ュベートした。その細胞をペレットにして、該ガラクトース溶液で２回洗浄し、 前に使用したｌくツフア−で１回洗浄した。

衝撃を与える前に、ＳＢＡ＋　１２サンプルの細胞をペトリ皿上に置かれた５μ ｍのポリカーボネートメンブラン上に置いた。

表４に示される結果は、両者のサンプルにおけるルシフェラーゼの発現を示して いる。

表４ サンプル　キャリヤー　墾 ＳＢＡ＋　＃２　５　ａｍポリカーボネート　９１８１７　ＲＬＵ／標的ＳＢＡ ＋　＃４　プラスチック培養皿　８８６１０　ＲＬＵ／標的５、骨髄の形質転換 ：出力検討（ｐｏｗｅｒ　５ｔｕｄｙ）本実施例は、細胞を攻撃するために使用 されるｋＶ量のキャリブレーションである０本発明者らが開発した他のｌくラメ −ター（ＩＸＩＯ’細胞／１細胞７１櫟胞に対する最適ｋＶは６ｋＶであった。

表５はこれらの結果を示す。

サンプル　ｋＶ　結果 ■、２　６　３４９６９ＲＬＵ／標的 ３、４　８　１３０２７ＲＬＵ／標的 ５、６　１０　７４０ＲＬＵ／標的 ６、骨髄　ヒト成長ホルモン 本実施例において、ＳＢＡ凝集処理及びヒト成長ホルモン（ＨｕＧＨ）遺伝子を コードするプラスミドｐＷＲＧ１６０２を用いた形質転換を調べた。骨髄細胞の 抽出及び濃縮は標準プロトコールに従った。この細胞をプラスミドｐＣＭＶ−Ｌ ＵＸ及びｐＷＲＧ１６０２で攻撃した。ＨｕＧＨの存在は、市販の免疫測定キッ ト（Ｎｉｃｈｏｌｓ）を用いて測定した。

表６に示す結果は、ＳＢＡ凝集は一過性の活性を約２倍に増加させたことを示し ている。ＳＢＡはレクチンであるが、ヒトまたはマウスリンパ球に対するマイト ジェンであると報告されている。ＳＢＡ処理の本来の目的は、始原細胞を部分的 に精製することであって、一過性の活性を刺激することではなかった。

表６ 処理　ＨｕＧＨ　ＣＰＭ　ＨｕＧＨ　（ＣＰＭ）　Ｌｕｘ（ＲＬＵ／標的）（２ ４時間）（２４時間）（７２時間）（２４時間）無　２４２７　２０３５　１２ ８０２８ＳＢＡ　５７２３　４３９０　２２８６１５７、骨髄・ウシ胎児血清 本実験により、異なる再懸濁培地および胎仔ウシ血清（ＦＢＳ）の濃縮を試験し た。ＡＩＭ−ＶおよびＲＰＭＩはギブコ社から配布された標準哺乳類培養培地で ある。細胞カウントは、測定時にはわずかな生存細胞が存在することを示してい たが、ＦＢＳ無添加のＲＰＭＩ培地はかつて記録した中でも最も高いＬＵＸカウ ントを与えた。本実験のために、抽出可能な全タンパクに対するルシフェラーゼ タンパクの量を計算した。

表７ ブラスト後の培地　ＬＵＸ　ＲＬＵ／標的　ｐｇ　ＬＵＸ／■全タンパクＡＩＭ −Ｖ　２　４　０　７　７　７　８　５ＲＰＭＩ　６　４　２　９　２　８　２ 　３　４ＲＰＭＩ＋ＩＯ％ＦＢＳ　３　７　９　５　５　０　７　７ＲＰＭＩ　 ＋　２０％ＦＢＳ　２　７　７　３　１　６　４　８Ｃ１安定な形質転換及び選 択 本実施例は、マウスリンパ球であるＣＴＴＬ−２を用いて行われた。このＣＴＴ Ｌ−２細胞を採取し、上記したメンブレンターゲットアセンブリ法を用いて形質 転換した。９．５ｋＶ出力の粒子加速（ｐａｒｔｉｃｌｅ　ａｃｃｅｌｅｒａｔ ｉｏｎ）、１８ａｎのヘリウム、キャリヤーシートＩＣが当たり０．０５ｍｇの 粒子負荷速度で、約５ＸｌＯ’のＣＴＴＬ−２細胞を形質転換した。使用したＤ ＮＡは、ｐＷＲＧ１６０１　（１μｇ／■粒子）およびｐＲＳＶ−ｎｅｏ　（０ ．　５μｇ／■粒子）であった。これらの粒子は、全てプラスミドの混合物で被 覆されていた。プラスミドｐＲｓＶ−ｎｅｏは、ゲネチシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉ ｎ）に対する耐性の哺乳類細胞発現カセットを含んでいる。粒子攻撃の後、細胞 を再び２日間培養した後、０、３■／ｍｌのゲネチシンを含有する新しい培地で １．１０に希釈し、その後、組織培養フラスコ（Ｔ７５）中の８つの等しいアリ コートに分割した。ゲネチシンは、ＲＳＶ−ｎｅｏ遺伝子構築物を発現する細胞 のために選択された。

選択下で１８日間培養した後、細胞を洗浄し、培地中に蓄積した成長ホルモンを 除いた。０．３■／ｍｌのゲネチシンを添加した新しい培地中に細胞を再懸濁し 、２４時間以上培養した。この時、培地を収集し、細胞から分泌されたヒト成長 ホルモンの存在を測定した。この測定の結果を以下の表８に示す。

°表８ ＨｕＧＨ２，０１，９１，４１，２１，３１，８１，４２，２（ｎｇ／ｍｌ） 細胞を今度は０．６■／ｍｌのゲネチシンを添加した新しい培地中で１＝１０に 再度希釈し、各培養物を４つのアリコートに分割した。アリコートを６日以上培 養し形質転換後２６日）、その後、再度上記のように二次培養し、培地を分析の ために収集した。今度は、培養物にホルモンを７２時間蓄積させた。結果を以下 の表９にまとめた。

表９ ５　Ａ、１　８．　４ 培養物１．Ｂ、　１．１．Ｂ、　２　、２．Ｂ、　２．６．Ａ、　ｌ及び８．８ ．２を更に増殖させるために選択した。しかしながら、培養物８．８．２は汚染 され、中止した。更に８日間培養した後（形質転換から３４日後）、残りの培養 物を再度０．６■／ｍｌのゲネチシンを添加した新しい培地中へ希釈し、４８時 間後のＨｕＧＨの蓄積を測定した。この時点で、培養物間に細胞密度の有意差が 見られた。これを補償するように、これらの培養物中のホルモンの測定の結果を 記載した以下の表１０の結果は、１００万個の細胞当たりのＨｕＧＨを基準とし たデータを示している。

表１０ １、Ｂ、１．１．　１１．２　５．６　２８．０ＩＰ＋９　１０．４　５．２　 ２６．０１、Ｂ、１．３　９．６　４．８　２４．０１、　Ｂ、　１．４　３． ４　１．７　８．５１、Ｂ、２．ｌ　１３．６　６．８　２２．７！、Ｂ、２． ２　１０．６　５．０　１６．７１、Ｂ、２．３　９．６　４．８　１６．０１ 、Ｂ、２．４　Ｂ、８　４．４　１４．７２、Ｂ、２．１　１２．０　６．０　 ３０．０２、Ｂ、２．２　１１．２　５．６　２８．０２、Ｂ、２．３　１２． ０　６．０　３０．０２、Ｂ、２．４　１２．４　６．２　６２．０６、ん１． １　３２．０　！６．０　４０．０６、Ａ、１．２　３４．４　１７．２　４３ ．０６、ん１．３　３３．６　１６．８　４２．０６、Ａ、！、４　３５．２　 １７．６　４４．０培養物１．Ｂ、　１．１−４および１．８．２−１−４等を プールし、冷凍保存した。このプールした培養物１．Ｂ、　ｌ　、１．１１１． ２及び２．８．２を選択培地中に継続的に培養維持した。このプールした培養物 を、形質転換後３７日目および４７日目に再度測定した。その結果、ＨｕＧＨ発 現レベルは、３７日目と４７日目に、それぞれ、１４．６及び１３．７ｎｇのＨ ｕＧＨ／ｍｌ／２４時間であった。培養物はゲネチシンに対して耐性のままであ った。培養時間、持続する耐性、及び持続するＨｕＧＨの発現は、形質転換が安 定であることを裏付けた。増殖中のＨｕＧＨレベルの増加は、また、細胞集団が ＨｕＧＨ発現細胞に富んでいることを示している。しかし、培養物は、クローｖ ７＋１９−１　１ｊｃ＋６＋　Ｊ：ｘ：％−ソｒ−呵１”ＩＷｅｌマ一−リ′− ツ？　１６ｙＱｓ’ＥｉＭ刀Ｖツノ　ソー　ｒ’　Ｌ／Ｊ@ｆｉ　’？　Ｕ）　 Ｊす るまいの原因となっている。

このデータは、そのような非接着細胞を用いた遺伝子療法の実用性を実証するも のである。リンパ球のような非接着細胞を身体から分離し、その後、粒子加速に より形質転換し、培養中に選択してもよい。選択した形質転換細胞を培養中に増 殖させ、適当な数で身体に戻すことができる。選択した細胞を長期間培養するこ とも可能であるようだ。身体に再度導入した形質転換細胞は、所望のいかなる治 療目的を有する導入遺伝子をも発現するであろう。

浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、３ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、４ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、５ 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、６ 平成　年　月　日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．哺乳類の非接着細胞を遺伝的に形質転換する方法であって、以下の工程：（ １）核酸構造物のコピーを調製し、 （２）前記構造物のコピーを、生物学的に不活性なキャリヤー粒子に被覆し、（ ３）液体懸濁液中にある哺乳類の非接着細胞を単離し、（４）前記細胞懸濁液を 標的表面上に置き、この場合、前記細胞懸濁液は前記標的表面上に拡がって、薄 層を形成し、 （５）前記被覆粒子の幾つかが前記細胞の少なくとも幾つかの内側に装入される ように、該被覆粒子を前記細胞中に促進させ、そして（６）前記装入細胞中にお ける前記構造物の存在及び発現を証明する、ことを含む方法。 ２．前記被覆粒子を、平坦状キャリヤーシート上に層形成させる工程を更に含む 請求の範囲第１項記載の方法。 ３．前記キャリヤーシートを、ガス状衝撃波によって促進させる請求の範囲第２ 項記載の方法。 ４．前記キャリヤー粒子が、０．２〜３μｍの金ビーズである請求の範囲第１項 記載の方法。 ５．前記細胞が、リンパ球である請求の範囲第１項記載の方法。 ６．前記細胞が、骨髄細胞である請求の範囲第１項記載の方法。 ７．前記工程（４）における前記細胞懸濁液が、約１×１０６細胞μｌ液である 請求の範囲第１項記載の方法。 ８．前記工程（４）における細胞懸濁液の容積が、約１０μｌである請求の範囲 第１項記載の方法。 ９．前記工程（３）における前記細胞が、哺乳類の動物の体から直接単離され、 かつ以下の工程（７）： 前記工程（５）からの前記細胞を哺乳類の動物に導入する工程、を更に含む請求 の範囲第１項記載の方法。 １０．前記工程（５）の後、前記核酸構造物中に含まれる選択剤の遺伝子を発現 する前記工程（５）からの細胞を選択する工程を更に含む請求の範囲第１項記載 の方法。 １１．請求の範囲第１項記載の方法によって製造された、形質転換非接着哺乳類 細胞。 １２．哺乳類の非接着細胞を遺伝的に形質転換する方法であって、以下の工程： （１）核酸構造物のコピーを調製し、 （２）前記構造物のコピーを、生物学的に不活性なキャリや一粒子に被覆し、（ ３）液体懸濁液中にある哺乳類の非接着細胞を単離し、（４）前記細胞懸濁液を 多孔質で平坦な標的表面上に置き、（５）前記粒子の幾つかが前記細胞の少なく とも幾つかの内側に装入されるように、前記細胞を攻撃し、そして （６）前記攻撃細胞中における前記構造物の存在及び発現を証明する、ことを含 む方法。 １３．前記被覆粒子を、平坦なキャリヤーシート上に層形成させる工程を更に含 む請求の範囲第１２項記載の方法。 １４．前記キャリヤー粒子が、０．２〜３μ口の金ビーズである請求の範囲第１ ２項記載の方法。 １５．前記細胞が、リンパ球である請求の範囲第１２項記載の方法。 １６．前記細胞が、骨髄細胞である請求の範囲第１２項記載の方法。 １７．請求の範囲第１２項記載の方法によって製造した形質転換細胞。 １８．請求の範囲第１５項記載の方法によって製造した形質転換細胞。 １９．請求の範囲第１６項記載の方法によって製造した形質転換細胞。 ２０．哺乳類の非接着細胞を遺伝的に形質転換する方法であって、以下の工程： （１）核酸構造物のコピーを調製し、 （２）前記非接着細胞において遺伝子産物を発現することのできる前記構造物の コピーを、前記細胞の大きさに対して非常に小さい大きさでかつ濃厚な材料のキ ャリヤー粒子に被覆し、 （３）前記被覆キャリヤー粒子を、平坦なキャリヤーシート上に層形成し、（４ ）前記キャリヤーシートを、火花放電室に置き、（５）一対の離隔した電極末端 間に水滴を置いて、前記電極間の間隙を架橋し、（６）液体懸濁液中にある哺乳 類の非接着細胞を単離し、（７）前記細胞懸濁液を標的表面上に置き、この場合 、前記標的表面上の湿度の量が量少となるが、細胞の生存には十分な量であり、 （８）前記電極間の前記間隙に火花が連絡するように、該電極間に高電圧電気放 電を開始して、前記水滴を気化させるとともに、前記キャリヤーシートを前記細 胞に向けて促進させ、この場合、前記キャリヤーシートは、前記細胞に当たらな いようにされているが、別記キャリヤー粒子は前記細胞中に移動し、また前記キ ャリヤー粒子が前記細胞を攻撃する力は、前記電極に印加する前記高電圧電気の 電圧を制御することによって調整することができ、もって前記核酸構造物は、前 記細胞への最少の損傷で、該細胞中に導入され、そして（９）前記細胞中におけ る前記構造物の存在及び発現を証明する、ことを含む方法。 ２１．前記工程（８）における前記電極に印加する電圧が、約７〜１０ｋＶであ る請求の範囲第２０項記載の方法。 ２２．前記工程（６）における前記細胞を、哺乳類動物から直接単離し、更に以 下の工程（１０）： 前記工程（８）における前記攻撃された細胞を哺乳類動物に導入する工程、を含 む請求の範囲第２０項記載の方法。 ２３．請求の範囲第２０項記載の方法によって製造された形質転換細胞。 ２４．哺乳類の非接着細胞を遺伝的に形質転換する方法であって、以下の工程： （１）哺乳類の細胞において発現できる核酸構造物のコピーを調製し、（２）前 記核酸構造物のコピーを、生物学的に不活性なキャリヤー粒子上に被覆し、 （３）液体懸濁液から哺乳類の非接着細胞を単離するとともに、該細胞が生存で きるに十分な湿度に該細胞が暴露されるように、前記細胞を多孔質支持体表面に 置き、 （４）前記被覆粒子の幾つかが前記細胞の少なくとも幾つかの内側に装入される ように、前記被覆粒子を前記細胞に促進させ、そして（５）前記処理された細胞 中における前記構造物の存在及び発現を証明する、ことを含む方法。