KR860000895B1 - 인체 성장호르몬의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
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Description
본 발명은 인체성장 호르몬(이후 hGH로 약칭한다)의 제조방법에 관한 것이다.
인체성장 호르몬은, 예를들어 「생화학 데이터 핸드북 Ⅰ」제1322 내지 1324페이지. 東京化學同人社발행(1979년) 등에 보고되어 있는 바와같이 191개의 아미노산잔기로 구성되는 분자량 약 21,500의 펩리드 홀몬이다.
인체성장 호르몬(hGH)을 제조하는 방법으로는 화학적합성법, 시험관내에서의 조직배양법 또는 유전자 조환에 의한 미생물배양법등이 공지되어 있으나 이들 방법은 인체성장호르몬(hGH)의 수율이 매우 낮고 또 제조비가 극히 높다.
본 발명자는 hGH를 대량으로 생산하는 방법에 대해 예의연구를 계속한 결과 놀라웁게도 hGH생산능을 갖는 인체유래세포는 시험관내에서는 조직배양법으로 수득한 세포보다도 인간이외의 온혈동물을 사용해서 증식시킨 세포쪽이 hGH생산량이 현저하게 높아져서 세포당 약 2내지 50배에 달하는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
보다 상세히 설명하면, 본 발명은 hGH생산능을 갖는 인체유래세포를 인체이외의 온혈동물체에 이식하여 증식시키거나 또는 이와 달리 인체이외의 온혈동물의 영양체액이 전술한 인체유래세포에 공급되는 장치를 사용해서 이들 인체유래세포를 증식시키고 또 전술한 증식방법중 한 방법으로 증식시킨 인체유래세포를 성장호르몬 유도제에 노출시켜 hGH를 유도 생성함을 특징으로 하는 hGH의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법은 시험관에서 배양시키는 경우와는 달리, 유도 생성된 hGH생산량이 증가할뿐만 아니라 세포증식용으로 고가의 혈청을 함유하는 영양배지가 전혀 필요없거나 극미량으로 족하고 또 세포증식중의 배지의 유지관리가 훨씬 용이하다는 장점을 갖는다.
특히, hGH생산능을 갖는 인체유래세포는 어느 것이든지 인체이외의 온혈동물에 이식시켜 이들 동물로부터 공급되는 영양체액을 이용하거나 또는 이들 인체유래세포를 영양체액이 공급되도록 고안된 확산챔버내에 현탁시키고 또 통상의 방법으로 동물을 사육해서 용이하게 증식시킬 수 있다. 또한 본 발명은 보다 안정된 세포증식 및 보다 높은 세포증식속도와 세포당 hGH의 높은 생산성을 그 특징으로 하고 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 세포들은 hGH를 생산하며 또 인체이외의 온혈동물에서 용이하게 증식될 수 있는 것이라면 어떠한 세포라도 사용할 수 있다. 예컨데, 인체하수체전엽의 상처없는 호산성 세포, 또 이를 EB비루스 또는 X-선 조사로 형질전환시킨 세포 또는 하수체전엽호산성 세포선종의 환자에게서 얻을 수 있는 호산성 종양세포와 같은 본래 hGH생산능을 갖는 세포; 및 폐암세포 등의 이소성(異所性) hGH를 생산하는 세포 또 이들 전술한 세포를 배양주화(培養株化)시킨 세포들이 본발명에서 바람직하게 사용된다. 또한 DNA리가아제, 제한 효소(뉴클레아제)와 DNA폴리머라아제 등의 효소를 이용하는 유전자 조환방법이나 또는 폴리에틸렌콜이나 "센다이비루스"와 같은 약품을 사용하는 세포융합에 의해서 hGH생산능을 갖는 유전자를 도입시켜 보다 용이하게 계대배양(繼代培養)할 수 있는 배양주화된 인체임파아구세포를 제조사용함으로서 이들 인체세포를 인체이외의 온혈동물체에 이식하였을 때에 세포증식속도를 현저히 높일 수 있을뿐만 아니라 세포당 hGH생산성을 약 2배 내지 10배 또는 그 이상으로 높일수가 있다.
더우기, 전술한 배양주화 인체 임파아세포를 동물체내에 이식하는 경우 거대한 종양을 형성하게 되며 또 이 종양은 숙주동물세포와 혼입되기 매우 어렵고 또 쉽게 분리되기 때문에 증식된 생존 인체 임파아세포를 용이하게 채집할 수 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 동물들로서는 그 체내에서 인체유래세포가 증식될 수 있다면 어떤 동물이라도 사용할 수 있다. 예컨대, 닭 또는 비둘기와 같은 조류 또는 개, 고양이, 원숭이, 염소, 돼지, 소, 말, 토끼, 기니아, 피그, 쥐, 햄스터, 생쥐 또는 누우드마우스 같은 포유동물류를 사용하는 것이 본 발명에서는 유리하다.
이와같은 세포이식은 바람직하지 못한 면역반응을 야기시킬 염려가 있기 때문에 이 면역반응을 가능한한 줄이기 위해서 신생기 동물 또는 유아기 동물; 또는 란(卵), 배(胚), 태아 등과 같은 가급적 유년기의 동물을 사용하는 것이 바람직하다.
또한 면역반응을 억제하기 위하여 이들 동물을 약 200내지 600램의 X-선 또는 γ-선 조사로 처리하거나 또는 항혈청 또는 종래방법으로 조제한 면역억제제로 주사처리할 수 있다. 인체 이외의 온혈동물로 누우드마우스를 사용하는 경우 성장한 것을 사용하더라도 약한 면역반응을 나타내기 때문에 이같은 전처리를 행할 필요가 없이 배양주화된 인체유래세포를 이식할 수 있고 또 급속히 증식될 수 있어서 사용하기에 특히 적합하다.
또 인체유래의 세포를 예를 들어 1차로 햄스터에 이식해서 증식시킨 후, 이 세포를 재차 누우드마우스에 이식해서 목적물에 수득하는 경우와 같이 상이한 인체이외의 온혈동물의 조합을 사용이식을 반복함으로서 세포증식을 보다 안정화하고 또 이로부터 유도생성되는 hGH생산량을 증가시킬 수 있다. 이 경우 동종간(同種間), 동속간(同屬間)은 물론 동강간(同綱間), 동문간(同門間)이식을 행하여도 좋다.
인체유래세포를 이식할 수 있는 부위는 이식세포가 증가될 수 있는 한은 동물의 어떤 부위라도 이식할 수 있다.
예컨데, 이들 세포는 뇨액강(尿液腔), 정맥, 복강, 피하 등에 이식할 수 있다.
또 동물체내에 인체 유래세포를 직접 이식하지 않고, 숙주세포의 확산챔버내 혼입을 방지하며 또 온혈동물이 그 영양체액을 배양주화 인체유래세포에 공급할 수 있는 다공성여과막, 예를들어 공직경(孔直經) 10-7내지 10-5m를 갖는 다공성 멤브레인막, 한외여과막 또는 중공(中空)섬유를 설치한 각종 형태와 크기의 확산 챔버를 동물체내, 예를 들어 복강내에 매설해서 동물체내로부터 공급되는 영양체액을 사용하면서 그 챔버내에서 선행배양주화된 hGH생산능을 갖는 인체유래세포는 어느 것이든지 증식시킬 수 있다.
또 필요한 경우에는 동물체내의 체액이 챔버내로 순환할 수 있도록 확산챔버를 예를 들어 숙주동물체표면에부착해서 이 챔버벽에 구비한 투명측면창을 통해서 확산챔버내의 인체유래세포의 증식상태를 투시할 수 있게 하고 또 이 확산챔버를 떼어내고 새로운 챔버로 교환할 수 있도록 확산챔버를 설계할 수 있기 때문에 숙주동물을 도살하지 않고도 동물수명기간중에 세포증식량을 보다 높은 수준으로 증대시킬 수 있으며 또한 동물당 세포생산량을 증가시킬 수 있다.
더우기, 이와같은 확산챔버를 사용할 때에는 인체유래세포가 숙주동물세포와 직접접촉하지 않기 때문에, 증식된 인체유래세포만을 용이하게 채취할 수 있을뿐만 아니라 바람직하지 않은 면역반응도 일어나지 않기 때문에 면역반응을 억제하는 전처리없이도 본 발명에서는 인체이외의 각종 온혈동물을 자유롭게 숙주동물로 사용할 수 있다.
인체유래세포를 이식한 숙주동물의 사육은 이들 세포이식 후에도 종래방법에 따라 용이하게 진행시킬 수 있으며, 또 별도의 특별한 취급을 요하지 않는다.
최대세포증식은 세포이식 약 1내지 20주 후에 달성된다. 동물에 이식해서 배양주화시킨 세포가 인체종양 세포 또는 인체임파아세포인 경우에는, 그 증식속도가 매우 커서 최대세포증식은 통상 세포이식 후 1내지 5주 이내에 달성된다.
본 발명에 따라, 숙주당 수득되는 인체유래세포수는 약107내지 1012또는 그 이상에 달한다.
환언하면, 동물체내에 이식된 인체유래세포수는 약 102내지 107배 또는 그 이상 증가되거나 또는 영양배지를 사용한 시험관내 조직배양방법으로 수득되는 수의 약 10내지 106배 또는 그 이상으로 증가함으로서 이들 세포는 hGH생산용으로 편리하게 사용된다.
hGH유도방법으로는 전술한 방법으로 수득된 인체유래세포가 hGH유도제에 작용해서 인체 hGH를 생산할 수 있는 방법이라면 어떠한 방법을 사용하더라도 상관없다.
예컨대, 복강내 복수에서 부유상태로 증식시킨후 복수로부터 채취하거나 또는 피하에서 형성된 거대한 종양을 적출한 후 이 종양을 분리채취하여 수득된 증식 인체유래세포를 약 20내지 40℃의 온도로 유지한 영양배지에 약 104내지 108세포/mℓ 농도로 부유시키고 또 여기에 성장호르몬유도제를 약 1내지 20시간 동안 작용시켜서 hGH를 유도생성시켜도 좋다.
바람직한 성장호르몬 유도제의 예로는 리신, 아르기닌, 트립토판, 루우신, 카사미노산과 L-DOPA와 같은 아미노산; 세로토닌과 같은 아미노산 대사물과 펩티드를 들 수 있다. 이같이 하여 수득된 hGH는 염석, 투석, 여과, 원심분리, 농축 및 동결건조와 같은 종래방법을 사용하는 정제분리방법으로 용이하게 채취될수 있다.
또한 고도의 정제를 필요로 하는 경우에는, 전술한 공지의 방법을 예를 들어, 이온교환체에의 흡착과 탈착, 겔여과 및 친화성크로마토그라피, 등전점분획 및 전기영동과 같은 종래 기술과 결합시켜도 좋으며, 최고순도의 hGH제제를 수득할 수 있다.
이와같이 수득한 hGH제제는 표준 hGH제제와 면역학적으로 동일하기 때문에 이 호르몬제제는 단독으로 또는 여기에 하나 혹은 그 이상의 기타 약제를 결합시켜서 주사약, 외용약, 내복약 또는 진단투여제로서 인체성장촉진은 물론 인체질환의 예방 및 치료에 유리하게 사용될 수 있다.
전체 명세서를 통해서 배양배지에서의 hGH생산량은 S.M Glick외 수인의 Nature 제199권, 제784면(1963)에 기재된 방사면역분석법으로 측정하였으며, 또 National Iustitutes of Health가 배포한 hGH표준 제제에 의한 중량으로 표시하였다.
본 발명의 몇가지 태양을 다음에 기술하였다.
[실시예 1]
성장한 누우드마우스의 피하에 하수체전엽 세포선종양의 환자로부터 적출해서 세절분산시켜 수득된 인체호산성 종양세포를 이식한 후 통상의 방법으로 3주간 사육하였다. 피하에 생긴 거대한 종양 약 10g을 적출세절한 후 트립신을 함유한 생리식염수에 현탁시켜서 세포를 분산시켰다.
소의 태아혈청 10v/v%를 보충한 Earle배지 199(pH 7.2)로 세포를 세척한 후에, 이들 세포를 성장호르몬 유도제로서 30mM의 L-아르기닌을 함유한 새로운 동일한 배지에 다시 현탁시킨 후 또 37℃에서 6시간 동안 배양하여 hGH를 유도생성시켰다. 그 후에, 이 세포를 초음파처리하고 수득된 상등액중의 hGH를 측정하였다.
hGH생산량은 세포현탁액 1mℓ당 약 500ng이었다.
소의 태아혈청 10v/v%를 보충한 시험관내의 Earle배지 199(pH 7.2) 중에서 인체호산성 종양세포를 증식시키고 또 37℃에서 배양시켜 수득한 대조세포를 성장호르몬 유도제로 전술한 바와 유사하게 처리하여 hGH를 유도생성시켰다. hGH생산량은 세포현탁액 1mℓ당 약 100ng에 불과하였다.
[실시예 2]
하수체전엽 호산성 세포선종양의 환자로부터 적출하고 세절, 분산시켜 수득된 인체호산성 종양세포와 인체백혈병 임파아구 나말바(Namalva) 세포를 140mM NaCl, 54mM KCl, 1mM NaH2PO42mM CaCl2를 함유하는 염류용액의 들어 있는 용기내에 상응세포농도가 약 103세포/mℓ가 되도록 부유시켰다.
얼음냉각한 세포현탁액을 미리 자외선 조사하여 비활성화시킨 "센다이 비루스"를 함유하는 전술한 동일 염류용액과 혼합하고 혼합 약 5분 후에 37℃의 배양기로 옮겨서 약 30분간 교반을 계속해서 세포융합을 행하여 인체백혈병의 임파아구 나말바세포에 인체호산성 종양세포의 hGH생산능을 도입시켰다. hGH생산능을 갖는 잡종양세포균주를 종래의 방법으로 분리한 후에 이 잡종종양세포균주를 성장한 누우드마우스의 복강내에 이식하고 이를 통상의 방법으로 5주간 사육하였다.
이렇게 수득한 거대한 종양을 각각 약 15g씩 적출하여 30mM의 L-아르기닌을 L-DOPA로 대체한 이외에는 실시예 1에서와 유사하게 처리해서 hGH를 유도생성시켰다. hGH생산량은 세포현탁액 1mℓ당 약 1,800ng이었다.
대조시험을 융합시킨 잡종종양세포를 시험관내에서 배양하고 또 이 증식세포를 성장호르몬 유도제에 노출시켜 실시예 1에서와 유사하게 진행하였다.
hGH생산량은 단지 세포현탁액 1mℓ당 약 100ng에 불과하였다.
[실시예 3]
세포이식으로 야기될 수 있는 면역반응을 억제하기 위하여 신생아 햄스터에 토끼로부터 공지방법에 따라 제조한 항혈청을 미리 주사한후, 그 피하에 실시예 2에서와 유사하게 인체호산성 종양세포의 hGH생산능을 도입시킨 인체백혈병 임파아구 JBL세포를 이식하고 또 3주간 통상방법으로 사육하였다. 이같이 해서 피하에 형성된 거대한 수득 종양을 각각 약 10g씩 적출하여 실시예 1에서와 유사하게 처리해서 hGH를 유도생성시켰다. hGH생산량은 세포현탁액 1mℓ당 약 2,000ng이었다.
대조시험은 융합시킨 인체백혈병 임파아구 JBL세포를 시험관내에서 배양하고, 또 이 증식세포를 성장호르몬 유도제에 노출시켜 실시예 1에서와 유사하게 진행하였다.
hGH생산량은 단지 세포현탁액 1mℓ당 약 200n에 불과하였다.
[실시예 4]
실시예 2에서와 유사하게 인체호산성 종양세포의 hGH생산능을 도입시킨 인체백혈병임파아구 나말바세포를 신생아쥐의 정맥내에 이식하고, 또 이어 통상방법으로 4주간 사육하였다. 이같이 해서 수득된 거대한 종양을 각각 40g씩 적출하고 또 실시예 1에서와 유사하게 처리하여 hGH를 유도생성시켰다. hGH생산량은 세포현탁액 1mℓ당 약 1,500ng이었다.
대조시험은 융합시킨 인체백혈병 임파아구 나말바세포를 시험관내에서 배양하고 또 이 증식세포를 성장호르몬 유도제에 작용시켜서 실시예 1에서와 유사하게 진행하였다.
hGH생산량은 단지 세포현탁액 1mℓ당 약 100ng에 불과하였다.
[실시예 5]
성장한 보통 쥐에 400렘의 X-선을 조사하여 쥐의 면역반응을 약화시킨 후 실시예 1에서와 유사하게 수득한 인체 호산성 종양세포를 피하에 이식하고 통상방법으로 3주간 사육하였다. 이같이 해서 피하에 형성된 거대한 수득종양을 각각 15g씩 적출하고 실시예 2에서와 유사하게 처리해서 hGH를 유도생성시켰다.
hGH생산량은 세포현탁액 1mℓ당 약 600ng이었다. 대조시험은 인체호산성 종양세포를 시험관내에서 배양하고 또 이 증식세포를 성장호르몬 유도제에 노출시켜서 실시예 1에서와 유사하게 진행하였다. hGH생산량은 단지 세포현탁액 1mℓ당 약 200ng에 불과하였다.
[실시예 6]
기공직경 약 0.5μ의 멤브레인 필터를 설치한 내용적 약 10mℓ의 확산챔버내에서 실시예 3에서와 유사하게 인체호산성 종양세포의 hGH생산능을 도입한 인체백혈병임파아구 JBL세포를 생리식염수에 부유시키고 또 이 챔버를 성장한 쥐의 복강내에 매설하였다. 통상방법으로 이 쥐를 4주간 사육한 후에 이 챔버를 꺼냈다. 전술한 같은 방법으로 수득된 챔버내의 인체유래세포 밀도는 약 5×109/mℓ로서, 이것은 CO2배양기를 사용한 시험관내 배양으로 얻은 값의 약 103배 또는 그 이상이었다. 이와같이 해서 수득된 세포는 실시예 1에서와 유사하게 처리하여 hGH를 유도생성시켰다. hGH생산량은 세포현탁액 1mℓ당 약 2,200ng이었다.
대조시험은 융합시킨 인체백혈병 임파아구 JBL세포를 시험관내에서 배양하고, 또 이 증식세포를 성장호르몬 유도제에 노출시켜서 실시예 1에서와 유사하게 진행하였다.
[실시예 7]
실시예 3에서와 유사하게 인체호산성 종양세포의 hGH생산능을 도입한 인체백혈병 임파아구 JBL세포를 37℃에서 5일간 미리 항온 처리한 닭의 수정란에 이식하였다.
이들 수정란을 동일온도에서 1주일간 추가로 배양한 후에 증식인체유래세포를 채취하였다. 이 세포를 실시예 1에서와 유사하게 처리해서 hGH를 유도생성시켰다.
hGH생산량은 세포현탁액 1mℓ당 약 1,300ng이었다.
대조시험은 융합시킴 인체백혈병 임파아구 JBL세포를 시험관내에서 배양하고 증식세포를 성장호르몬 유도제에 노출시켜서 실시예 1에서와 유사하게 진행하였다.
hGH생산량은 단지 세포현탁액 1mℓ당 약 200ng에 불과하였다.
Claims (1)
- 인체성장호르몬(hGH)산생능이 있는 인체하수체전엽에서 유래한 종양성 호산성세포, 나말바(Namalva)세포 또는 제.비.엘(JBL)세포를 누우드마우스, 햄스터, 쥐, 생쥐 또는 닭의 체내에 이식하거나, 또는 이들 동물의 체액을 공급받을 수 있는 공직경(孔經直) 약 0.5미크론의 멤브레인막이 설치된 내용적 약 10mℓ의 챔버를 사용해서 증식시키고, 이 종식세포에L-아르기닌 또는 L-DOPA를 작용시켜서 분자량 약 21,500의 인체성장 호르몬을 생산시킴을 특징으로 하는 인체성장호르몬의 제조방법
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