KR860001562B1 - 인체 부갑상선 호르몬의 제조방법 - Google Patents

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내용 없음.

Description

인체 부갑상선 호르몬의 제조방법

본 발명은 인체 부갑상선 호르몬(Human parathyroid Hormone, 이하 hPTH라고 약칭함)의 제조방법에 관한 것이다.

hPTH는 부갑상선 세포가 생산하는 호르몬으로서 활성형 비타민 D₃의 합성조절작용 및 칼슘의 흡수촉진 작용을 한다. 그러나, hPTH를 대량으로 싼값에 제조하는 방법은 아직 알려져 있지 않다.

본 발명자는, hPTH의 대량공급을 목표로 예의 연구를 거듭하였던 바 의외에도 hPTH 생산능이 있는 인체의 임파아구세포가 그 중식속도가 크고, 세포당 hPTH 생산량도 크므로 hPTH 생산세포로서 가장 적합하다는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

즉, 본 발명은 hPTH 생산능이 있는 인체의 임파아구세포를 인체 이외의 온혈동물체 내에 이식하거나 또는 그 온혈 동물의 체액을 공급받으면서 증식시킨 세포로부터 hPTH를 생산시키는 것을 특징으로 하는 hPH hPTH의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명 방법은 시험관 내에서 배양시키는 경우와는 다르게, hPTH의 생산량이 클 뿐만 아니라 값비싼 혈청 등을 함유하는 영양배지를 필요로 하지 않거나 또는 크게 절약할 수 있고, 이밖에도 세포증식 중의 유지관리도 극히 용이하다.

즉, hPTH의 생산능이 있는 인체의 임파아구세포를 인체 이외의 온혈동물체내에 이식하거나, 또는 그 동물의 체액을 공급받을 수 있는 챔버에 수용해서 통상적인 방법으로 사육하면 온혈동물체로 부터 공급되는 영양물을 함유하는 체액을 이용해서 그 세포를 용이하게 증식시킬 수 있다. 이밖에, 시험관내에서 배양시키는 경우와 비교해서 이 세포의 증식이 안정되어 있다는 점, 그 증식속도가 크다는 점, 수득되는 세포량이 많다는 점, 이밖에, 세포당 hPTH 생산량이 크다는 점을 특징으로 들 수 있다.

본 발명에서 사용하는 인체의 임파아구세포는 hPTH 생산능을 가지고 있고, 또한 인체 이외의 온형동물 체내에 이식하여 용이하게 증식시킬 수 있는 것이면 무방하다. 예를들면, 부갑상선세포, 부갑상선 종양세포 등과 같이 본래부터 hPTH 생산능을 가지고 있는 세포 및 폐암세포, 난소종양세포, 신암세포, 간암 세포 등과 같이 이소성 hPTH 생산능을 갖고 있는 세포로부터 hPTH 생산유전자를, 폴리에틸렌글리콜 및 센다이 비루스 등을 이용하는 세포융합 수단이나 또는 DNA 리아가제, 제한효소(뉴클레아제), DNA 폴리머라제 등의 효소를 이용하는 유전자 재조합수단 등에 따라 도입한 인체의 임파아구 세포 또는 이소성 hPTH 생산능이 있는 인체의 임파아구세포 등이 바람직하다.

이들 임파아구 세포의 이용은 인체 이외의 온혈동물에 이식할 때 그 숙주동물의 세포와 섞이기 어려운 연질의 거대한 종양을 형성하기 쉽고 적출한 다음의 분산도 용이하기 때문에 살아 있는 인체 임파아구세포를 채취함에 있어 매우 유리하다.

본 발명에 있어서 hPTH의 제조방법에 사용하는 온혈동물은 hPTH 생산능을 갖고 있는 인체의 임파아구 세포를 증식할 수 있는 것이라면 어떤 동물을 사용해도 무방하며, 예컨데 닭, 비둘기 등의 조류, 개, 고양이, 원숭이, 산양, 돼지, 소 ,말, 토끼, 몰모트, 쥐, 햄스터, 보통마우스, 누우드마우스 등의 포유류를 사용할 수 있다.

이들 동물에 인체의 임파아구 세포를 이식하면 바람직하지 않은 면역반응을 일으킬 염려가 있으므로, 그 반응을 가능한 한 억제하기 위해서 사용하는 동물은 가급적 유약한 상태, 즉 란(卵), 배(胚), 태아, 신생기 및 유소기(幼少期)의 동물을 사용하는 것이 바람직하다.

또, 이들 동물에 예컨데 약 200 내지 600REM의 X선 혹은 γ선을 조사하던가 또는 항혈청 혹은 면역 억제제 등을 주사하는 등 사전처리를 행함으로서 면역반응을 약화시켜서 이식하여도 좋다.

사용하는 동물이 누우드마우스일 경우에는 성장한 것이라 하더라도 면역반응이 약하기 때문에 전술한 사전 처리를 하지 않아도 배양주화 된 인체의 임파아구세포를 이식할 수 있으며 급속도로 증식하기 때문에 특히 바람직하다. 또, 인체의 임파아구세포를 예를들면, 우선 햄스터에 이식하고 증식시킨 다음 이 세포를 다시금 누우드마우스에 이식하는 등과 같이 인체 이외의 온형동물 사이에서 이식해서 인체의 임파아구 세포의 증식을 보다 안정되게 하거나 나아가서 그로부터 생산되는 hPTH 생산량을 증가시키는 것도 임의로 행할 수 있다.

이같은 경우에 동종간(同種間), 동속간(同屬間)은 물론이고 동강간(同綱間), 동문간(同門間)의 이식이라 하더라도 무방하다. 이밖에, 인체의 임파아구세포를 이식하는 동물체내의 부위는 이식한 세포가 증식할 수 있는 부위라면 어느 부위라도 상관없으며, 예컨데 뇨액강, 정맥, 복강(腹腔), 피하등 임의대로 선택할 수 있다.

또, 직접 동물체내로 인체의 임파아구세포를 이식하지 않고서도 동물세포의 통과를 저지할 수 있는 다공성의 여과막, 예를들면 공극직경이 약 10^-7내지 10^-5m의 멤브레인필터, 한외여과막 또는 중공(中空)섬유 등을 구비한 공지의 각종 형상, 크기의 확산챔버를 동물체내, 예를들어 복강내에 매설해서, 동물체로 부터의 영향물을 함유하는 체액의 공급을 받으면서 그 챔버내에서 배양주화 된 인체의 임파아구세포를 증식시킬 수 있다.

또, 필요한 경우 이 확산챔버내의 영양물을 함유하는 체액을 동물체내의 체액과 접속시켜서 관류하도록한 확산챔버를 예컨데 동물체 표면에 부착하고 확산챔버내에서 인체의 임파아구세포가 증식하는 상태를 투시할 수 있도록 하는 것도 또 이 확산챔버 부분만을 착탈 교환할 수 있도록 해서 동물을 도살하지 않고 수명이 다할 때까지 세포를 증식시켜서 동물개체당 세포생산량을 더욱 재고할 수도 있다.

이들 확산챔버를 이용하는 방법은 인체의 임파아구세포가 동물세포와 직접 접촉하지 않으므로 인체의 임파아구세포만을 용이하게 채취할 수 있을 뿐만 아니라 바람직하지 않은 면역반응을 일으킬 염려도 적지 않으므로 면역반응을 억제하는 사전처리를 할 필요도 없으며 각종 온형동물을 자유로히 이용할 수 있는 특징을 가지고 있다.

이식한 동물의 유지관리는 그 동물의 통상적인 사육을 지속할 수 있으면 되는 것으로, 이식후라 하더라도 특별한 취급은 전혀 필요로 하지 않는다.

인체의 임파아구세포를 증식시키기 위한 기간은 1 내지 20주, 통상 1내지 5주로서 그 목적을 달성할 수 있다. 이같이 해서 수득한 인체의 임파아구세포수는 동물개체당 약 10⁷내지 10¹²또는 그 이상에 이른다는 사실도 발견하였다.

바꿔 말하면, 본 발명에서 사용하는 hPTH의 제조방법에 따라 증식시킨 인체의 임파아구세포수는 동물개체당 이식한 세포수의 약 10²내지 10⁷배, 또는 그 이상에도 이르며, 생물체외의 영양배지에 접종해서 증식시킨 경우의 약 10¹내지 10⁶배, 또는 그 이상까지도 이르게 되어, hPTH의 제조를 위하여는 매우 바람직하다.

이같이해서, 증식시킨 인체의 임파아구세포로 부터 hPTH를 생산시키는 방법은 임의로 선택할 수 있다.

예를들면, 복강내 복수에서 부유상으로 증식시킨 인체의 임파아구세포를 채취하거나 또는 피하에서 증식시킨 거대한 종양을 적출하여 분산시킨 다음 채취하고, 이 세포를 약 20 내지 40℃로 보존한 영양배지에 세포농도가 약 10⁴내지 10⁸/㎖가 되도록 부유시켜 약 1 내지 100시간 보관해서 hPTH를 생산시키는 것이 바람직하다.

이때 생산량을 보다 제고하기 위해서, 예컨데 글리신, 류우신, 리신, 아르기닌, 시스테인 등의 아미노산, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘, 황산마그네슘 등의 염류, 도파민, 이소프로테레놀, 에피네프린, 노르에피네프린 등의 호르몬 중 1종 또는 2종 이상의 물질에 공존시키는 것도 매우 바람직하다.

이같이 해서 생산시킨 hPTH는 공지된 정제분리법, 예를들면, 염석, 투석, 여과, 원심분리, 응축, 동결건조 등을 실시해 줌으로서 용이하게 정제분리하여 채취할 수 있다.

이밖에 고도의 정제를 필요로 할 경우에는 예를들면 이온교환체에의 흡착, 탈착, 겔여과, 친화성크로마토그라피, 등전점분획, 전기영동 등의 공지 방법을 재차 조합시켜서 최고순도의 hPTH를 채취할 수도 있다.

이같이 해서 수득한 hPTH는 단일물질로서 또는 hPTH에 다른 1종 또는 2종 이상의 물질을 함유시켜서 예컨데 주사약, 외용약, 내복약, 진단약 등으로 만들어서 인체 절환의 예방 및 치료에 유익하게 이용될 수 있다.

hPTH의 생산량은 J.A. Parson등, Endocrinology Vol.92, 454 내지 462(19

73)에 보고되어 있는 생물학적 분식법에 준하여 측정하고 미국 NIH로 부터 입수가능한 1mg가 1,300USP 단위인 표준품의 중량으로 표시할 수 있다.

다음에 2-3의 실시예를 상술한다.

[실시예 1]

부갑상선 종양환자로 부터 적출하여 세절하고 분산시켜서 수득한 인체 부갑상선 종양세포와 임파아구 나말바세포(Namalwa cell)를 140mM NaCl, 54mM KCl, 1mM NaH₂PO₄, 2mM CaCl₂를 함유하는 염류용액에 각각 약 10⁴／㎖가 되도록 부유시키고 여기에 미리 자외선으로 비활성화한 센다이비루스를 함유하는 동일 염류용액을 조제하여 빙냉하에서 혼합한 다음 약 5분 후에 37℃의 항온수조로 옮기고 약 30분간 교반하면서 세포융합을 진행시켜서 임파아구 나말바세포에 hPTH 생산능을 도입하였다. 이 임파아구 나말바세포를 성장한 누우드마우스의 복강내에 이식한 다음 통상적인 방법으로 5주간 사육하였다.

생겨난 거대한 종양 약 15g을 적출하여 세절한 다음 트립신을 함유하는 생리식염수에 현탁해서 세포를 분사시켰다. 이 세포를 소의 태아혈청 10v/v%를 보충한 Earle 배양기 199(pH 7.2)로 세척한 다음 L-아르기닌을 30mM, CaCl₂20mM을 첨가한 동일 배지에 세포농도 약 10⁵／㎖가 되도록 부유시키고 37℃에서 40시간 보관해서 hpTH를 생산시켰다. 그후 세포를 초음파 처리하여 수득한 상등액을 이용해서 hPTH량을 측정한 결과, 부유액 ㎖당 약 830ng이었다.

대조용으로 인체 부갑상선 종양세포를 소의 태아혈청 10v/v%를 보충한 Earle 배지 199(pH 7.2)에서 37℃로 시험관내 배양시키고, 수득한 세포를 동일하게 처리해서 hPTH를 생산시킨 결과 부유액 ㎖당 겨우 약 4ng에 불과하였다.

[실시예 2]

신장암 환자에서 적출하여 세절하고 분산시켜서 수득한 신장암세포와 임파아구 JBL 세포를 실시예 1의 방법에 준하여 세포 융합시켜서 임파아구 JBL 세포에 hPTH생산능을 도입하였다. 이 세포를 토끼로 부터 공지의 방법으로 조제한 항혈청을 미리 주사하여 면역반응을 약화시킨 갓난새끼 햄스터의 피하에 이식한 다음 통상적인 방법으로 3주간 사육하였다.

피하에 생긴 거대한 종양 약 10g을 적출하여 세절한 다음 콜라겐아제를 함유하는 생리식염수에 현탁하여 세포를 분산시켰다. 이 세포를 인체혈청 5v/v%를 보충한 Eagle의 최소 기본배지(pH7.4)로 세척한 다음20mM CaCl₂, 20mM 도파민을 첨가한 동일배지에 세포농도 약 10⁶/㎖가 되도록 부유시키고 37℃로 20시간 보관해서 hPTH를 생산시켰다. 그 생산량을 측정한 결과 부유액 ㎖당 약 1.3㎍이었다. 대조용으로 hPTH생산능을 도입한 임파아구 JBL 세포를 사용해서 실시예 1과 동일하게 시험관내에서 배양하여 hPTH를 생산시킨 결과 부유액 ㎖당 약 16ng에 불과하였다.

[실시예 3]

갓난 새끼 쥐의 정맥내에 실시예 1의 방법에 준해서 인체의 난소종양세포에서 hPTH 생산능을 도입한 임파아구 BALL-1세포를 이식한 다음 통상적인 방법으로 4주간 사육하였다. 생겨난 거대한 종양 약 30g을 적출하여 실시예 1과 동일하게 처리해서 hPTH를 생산시켰다. 그 생산량은 부유액 ㎖당 약 900ng이었다.

대조용으로 hPTH 생산능을 도입한 임파아구 BALL-1를 세포를 시험관에서 배양해서 hPTH를 실시예 1과 동일하게 생산시킨 결과 부유액 ㎖당 약 10ng에 불과하였다.

[실시예 4]

성장한 보통 마우스에 약 400REM의 X선을 조사해서 마우스의 면역반응을 약화시킨 다음, 그 피하에 실시예 1의 방법에 따라 인체의 폐암세포에서 hPTH 생산능을 도입한 임파아구 NALL-1 세포를 이식하고 통상적인 방법으로 3주간 사육하였다.

피하에 생긴 거대한 종양 약 15g을 적출하여 실시예 2와 동일하게 처리해서 hPTH를 생산시켰다.

그 생산량은 부유액 ㎖당 약 1.2μg이었다.

대조용으로 hPTH 생산능을 도입한 임파아구 NALL-1 세포를 시험관내에서 배양하고 hPTH를 실시예 2와 동일하게 생산시킨 결과 부유액 ㎖당 약 20ng에 불과하였다.

[실시예 5]

공극직경 약 0.5μ의 멤브레인 필터를 구비한 용적 약 10㎖의 프라스틱제 원통형 확산챔버내에 실시예 1의 방법에 준하여 인체의 부갑상선 종양세포에서 hPTH 생산능을 도입한 임파아구 TALL-1 세포를 생리적 식염수에서 부유시키고 이것을 성장한 쥐의 복강내에 매설하였다.

이 쥐를 통상적인 방법으로 4주간 사육한 다음, 이 확산챔버를 떼어냈다. 이같이 해서 수득한 TALL-1세포의 농도는 약 6×10⁸／㎖로서 시험관내에서의 탄산가스 항온기중에서 배양할 경우 약 10²배 이상에까지도 이른다는 사실을 알았다. 이 세포를 실시예 2와 동일하게 처리해서 hPTH를 생산시켰다. 그 생산량은 부유액 ㎖당 약 1.1㎍이었다.

대조용으로, 인체의 부갑상선 종양세포를 동일한 방법으로 확산챔버내에 수용하고 쥐의 복강내에 매설해서 마찬가지로 4주간 사육하였던 결과 세포농도 약 8×10⁶／㎖를 얻었다. 이 세포를 이용하여 실시예 2와 동일하게 hPTH를 생산시킨 결과 부유액 ㎖당 약 3ng에 불과하였다.

[실시예 6]

37℃에서 5일간 보관한 닭의 수정난에 실시예 1의 방법에 따라서 인체의 폐암세포에서 LPTH 생산능을 도입한 임파아구 JBL세포를 이식한 다음 37℃에서 1주간 보존하였다.

이 알을 난할한 다음, 증식한 세포를 채취하고 실시예 1과 동일하게 처리해서 hPTH를 생산시켰다.

그 생산량은 부유액 ㎖당 약 700ng이었다.

대조용으로 인체의 폐암세포를 동일한 닭의 수정난에 이식하였으나 증식하는 것은 볼 수 없었다.

Claims (1)

1. 인체의 부갑상선 호르몬 생산능이 있는 인체의 임파아구 세포를 인체 이외의 온혈동물에 이식하거나, 또는 그 온혈동물의 체액을 공급받으면서 증식시킨 세포로부터 인체 부갑상선 호르몬을 생산시키는 것을 특징으로 하는 인체 부갑상선 호르몬의 제조방법.