JPS6030654B2 - ヒトコロニ−刺激因子の製造方法 - Google Patents
ヒトコロニ−刺激因子の製造方法Info
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- JPS6030654B2 JPS6030654B2 JP55185732A JP18573280A JPS6030654B2 JP S6030654 B2 JPS6030654 B2 JP S6030654B2 JP 55185732 A JP55185732 A JP 55185732A JP 18573280 A JP18573280 A JP 18573280A JP S6030654 B2 JPS6030654 B2 JP S6030654B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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- C07K14/53—Colony-stimulating factor [CSF]
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトコロニ−刺激因子（ｈｕｍａｎＣｏｌｏ
ｎｙ−ＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦａｃのｒ、以下ｈＣＳ
Ｆと略記）の製造方法に関する。
ｎｙ−ＳｔｉｍｕｌａｔｉｎｇＦａｃのｒ、以下ｈＣＳ
Ｆと略記）の製造方法に関する。
ｈＣＳＦとは、ヒト骨髄幹細胞が各血液成分に分化する
際、白血球の促進する刺激ホルモンの一種と考えられて
いる。
際、白血球の促進する刺激ホルモンの一種と考えられて
いる。
最近、悪性腹傷が年間死亡率の原因の上位を占めるに到
り、悪性腰擬患者に対する放射線照射や抗癌剤の投与が
盛んに行なわれているが、このような袷療は必然的に患
者の白血球を急激に減少させ、体の抵抗力を失なわせて
しまい、治療を継続するのが極めて困難であった。前述
のようなｈＣＳＦのもつ作用から、これを現行の悪性種
湯の治療に併用することにより、更に大胆な沿療が可能
となるほか、従来不治と考えられていた白血病にも有効
と考えられる。しかしながら、人の分泌物や各組織から
ｈＣＳＦを繁雑な工程を経て採取する方法や、ｈＣＳＦ
産生能を有するヒト由来の細胞を同細胞の生長に必要な
栄養素を含有する栄養培地に接種しィンピトロで増殖さ
せたり、あるいは然るべき免疫処理を施したヒト以外の
動物の体内に移植したィンビボで増殖させ、かくして得
た増殖細胞にｈＣＳＦ誘導剤の存在下でｈＣＳＦを産生
せしめ、これを採取する方法では、得られるｈＣＳＦが
免疫学的に不活であったり、活性である場合にも、その
量が著しく徴量であるなどの欠点があった。従って、ｈ
ＣＳＦは、薬剤として大きな有用性がありながら、あく
まで潜在的なものにすぎなかった。本発明者は、臨床・
治療など各種医療用途に供するに充分かつ品質の一定し
たｈＣＳＦを製造する方法について種々検討したところ
意外にも、ｈＣＳＦ産生能を有するヒト由釆の細胞とヒ
トリンパ芽球様細胞とを細胞融合させて得た細胞は、細
胞当りのｈＣＳＦ産生能が通常２〜１ぴ音、又はそれ以
上にも達し、加うるにこの融合細胞をヒト以外の溢血動
物を利用して増殖させた細胞は、これをインビトロの組
織培養により増殖させたもの、或いはｈＣＳＦ産生能を
有するヒト正常又は癌細胞をィンビボ又はィンビトロで
増殖させたものと比較して、ｈＣＳＦ産生能において格
段に優れており、通常、細胞当りに換算して約２〜５比
音、又はそれ以上にも達することを見し、出し、本発明
の課題を解決したのである。
り、悪性腰擬患者に対する放射線照射や抗癌剤の投与が
盛んに行なわれているが、このような袷療は必然的に患
者の白血球を急激に減少させ、体の抵抗力を失なわせて
しまい、治療を継続するのが極めて困難であった。前述
のようなｈＣＳＦのもつ作用から、これを現行の悪性種
湯の治療に併用することにより、更に大胆な沿療が可能
となるほか、従来不治と考えられていた白血病にも有効
と考えられる。しかしながら、人の分泌物や各組織から
ｈＣＳＦを繁雑な工程を経て採取する方法や、ｈＣＳＦ
産生能を有するヒト由来の細胞を同細胞の生長に必要な
栄養素を含有する栄養培地に接種しィンピトロで増殖さ
せたり、あるいは然るべき免疫処理を施したヒト以外の
動物の体内に移植したィンビボで増殖させ、かくして得
た増殖細胞にｈＣＳＦ誘導剤の存在下でｈＣＳＦを産生
せしめ、これを採取する方法では、得られるｈＣＳＦが
免疫学的に不活であったり、活性である場合にも、その
量が著しく徴量であるなどの欠点があった。従って、ｈ
ＣＳＦは、薬剤として大きな有用性がありながら、あく
まで潜在的なものにすぎなかった。本発明者は、臨床・
治療など各種医療用途に供するに充分かつ品質の一定し
たｈＣＳＦを製造する方法について種々検討したところ
意外にも、ｈＣＳＦ産生能を有するヒト由釆の細胞とヒ
トリンパ芽球様細胞とを細胞融合させて得た細胞は、細
胞当りのｈＣＳＦ産生能が通常２〜１ぴ音、又はそれ以
上にも達し、加うるにこの融合細胞をヒト以外の溢血動
物を利用して増殖させた細胞は、これをインビトロの組
織培養により増殖させたもの、或いはｈＣＳＦ産生能を
有するヒト正常又は癌細胞をィンビボ又はィンビトロで
増殖させたものと比較して、ｈＣＳＦ産生能において格
段に優れており、通常、細胞当りに換算して約２〜５比
音、又はそれ以上にも達することを見し、出し、本発明
の課題を解決したのである。
すなわち、本発明は、ｈＣＳＦ産生能を有するヒト由来
の細胞とヒトリンパ芽球様細胞を融合させて得た細胞を
ヒト以外の溢血動物体内に移植、またはその温皿動物の
体液の供給を受けながら増殖させ、得られる細胞からｈ
ＣＳＦを産生せしめることを特徴とするｈＣＳＦの製造
方法に関するものである。本発明の方法によりヒト由来
の融合細胞を増殖させる場合、ィンビトロの組織培養と
比較して大量のｈＣＳＦが産生するだけでなく、高価な
血清などを含む栄養塔地が不要あるいは大幅に節約する
ことができ、加うるに細胞増殖中の維持管理も極めて容
易である。
の細胞とヒトリンパ芽球様細胞を融合させて得た細胞を
ヒト以外の溢血動物体内に移植、またはその温皿動物の
体液の供給を受けながら増殖させ、得られる細胞からｈ
ＣＳＦを産生せしめることを特徴とするｈＣＳＦの製造
方法に関するものである。本発明の方法によりヒト由来
の融合細胞を増殖させる場合、ィンビトロの組織培養と
比較して大量のｈＣＳＦが産生するだけでなく、高価な
血清などを含む栄養塔地が不要あるいは大幅に節約する
ことができ、加うるに細胞増殖中の維持管理も極めて容
易である。
すなわちｈＣＳＦ産生能を有するヒト由釆の細胞とヒト
リンパ芽球様細胞を融合させ、ｈＣＳＦ産生能を導入し
たヒトリンパ芽球様細胞をヒト以外の溢血動物体内に移
植、またはその動物の体液の供給を受けることのできる
チャンバー内に収容し、通常の飼育をすれ‘よ、溢血動
物から供給される栄養物を含有する体液を利用してその
融合細胞が容易に増殖しうるのである。更に、公知のィ
ンビトロの組織培養により増殖させる場合と比較して、
増殖速度が大きいこと、大量の細胞が容易に得られるこ
と、更には細胞当りのｈＣＳＦ産生量が大きいなどの諸
特徴を挙げることができる。最近、ｈＣＳＦ産生能を有
するヒトの正常細胞或いは、癌細胞をヌードマウスなど
の免疫不全動物に移植し、ィンビトロでｈＣＳＦ塵生細
胞を増殖せしめ、これを採取してｈＣＳＦを産生させる
方法が開発されたが、本発明の方法とこれら従来法と比
較しても、本発明により細胞を融合後、ィンビボで増殖
させた細胞のｈＣＳＦ産生量は通常２〜１０倍、又はそ
れ以上にも達する程高いのである。
リンパ芽球様細胞を融合させ、ｈＣＳＦ産生能を導入し
たヒトリンパ芽球様細胞をヒト以外の溢血動物体内に移
植、またはその動物の体液の供給を受けることのできる
チャンバー内に収容し、通常の飼育をすれ‘よ、溢血動
物から供給される栄養物を含有する体液を利用してその
融合細胞が容易に増殖しうるのである。更に、公知のィ
ンビトロの組織培養により増殖させる場合と比較して、
増殖速度が大きいこと、大量の細胞が容易に得られるこ
と、更には細胞当りのｈＣＳＦ産生量が大きいなどの諸
特徴を挙げることができる。最近、ｈＣＳＦ産生能を有
するヒトの正常細胞或いは、癌細胞をヌードマウスなど
の免疫不全動物に移植し、ィンビトロでｈＣＳＦ塵生細
胞を増殖せしめ、これを採取してｈＣＳＦを産生させる
方法が開発されたが、本発明の方法とこれら従来法と比
較しても、本発明により細胞を融合後、ィンビボで増殖
させた細胞のｈＣＳＦ産生量は通常２〜１０倍、又はそ
れ以上にも達する程高いのである。
本発明で使用する融合細胞は、ｈＣＳＦ産生能を有する
ヒト由来の細胞とヒトリンパ芽球様細胞を公知の方法に
より融合させて得られ、ｈＣＳＦ産生能を有し、かつヒ
ト以外の溢血動物の体内に移植して容易に増殖するもの
である。細胞融合させるｈＣＳＦ産生能を有するヒト由
来細胞はｈＣＳＦ産生能を有するものであればいずれを
用いてもよくその細胞由来の部位による区別はない。例
えば、ヒト肺細胞、ヒト胸豚細胞、ヒト末梢血、ヒト白
血球、ヒト胎児腎臓細胞ヒト顎下腺細胞、ヒト骨髄細胞
、ヒトＴ−リンパ球、ヒトＢ−リンパ球、ヒト胎盤細胞
、ヒト子宮細胞、またはこれを各種ウイルス、薬剤、放
射線などで腫場化させるか、肺癌患者、白血病患者、リ
ンパ種患者、子宮漣患者、腎臓塵患者、胃癌患者から得
られる癌細胞或し、は腫場細胞、更にはこれらを培養株
化させた細胞が好適である。ｈＣＳＦ産生態を細胞融合
により導入するヒトリンパ芽球様細胞は、上記ｈＣＳＦ
簾生能を有するヒト由来細胞と融合させることができ、
かつ得られる融合細胞がｈＣＳＦ産生態を保持している
かぎり、いずれのりンバ芽球様細胞を用いてもよい。
ヒト由来の細胞とヒトリンパ芽球様細胞を公知の方法に
より融合させて得られ、ｈＣＳＦ産生能を有し、かつヒ
ト以外の溢血動物の体内に移植して容易に増殖するもの
である。細胞融合させるｈＣＳＦ産生能を有するヒト由
来細胞はｈＣＳＦ産生能を有するものであればいずれを
用いてもよくその細胞由来の部位による区別はない。例
えば、ヒト肺細胞、ヒト胸豚細胞、ヒト末梢血、ヒト白
血球、ヒト胎児腎臓細胞ヒト顎下腺細胞、ヒト骨髄細胞
、ヒトＴ−リンパ球、ヒトＢ−リンパ球、ヒト胎盤細胞
、ヒト子宮細胞、またはこれを各種ウイルス、薬剤、放
射線などで腫場化させるか、肺癌患者、白血病患者、リ
ンパ種患者、子宮漣患者、腎臓塵患者、胃癌患者から得
られる癌細胞或し、は腫場細胞、更にはこれらを培養株
化させた細胞が好適である。ｈＣＳＦ産生態を細胞融合
により導入するヒトリンパ芽球様細胞は、上記ｈＣＳＦ
簾生能を有するヒト由来細胞と融合させることができ、
かつ得られる融合細胞がｈＣＳＦ産生態を保持している
かぎり、いずれのりンバ芽球様細胞を用いてもよい。
特により容易に継代培養しうる培養しうる培養株化され
たヒトリンパ芽球様細胞を使用すれば、その増殖速度が
大きいだけでなく、細胞当りのｈＣＳＦ産生能が通常数
倍〜数十倍にも高まり、ｈＣＳＦの大量生産には特に好
都合である。それ以外にも情養株化されたヒトリンパ芽
球様細胞をヒト以外の溢血動物に移植すると、宿王とな
る温血動物の細胞と演りにくい軟瞳癌を形成しやすく、
これを摘用した後分散することも容易なことから、ヒト
リンパ芽球様細胞だけを採取する目的には極めて有利で
ある。このようなヒトリンパ芽球様細胞には、ヒト白血
病もしくはヒト悪性リンパ種由来の細胞株が適しており
、例えばナマルバ（Ｎａｍａｌｖａ）細胞、ＢＡＬＬ−
１細胞、ＮＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬＬ−１細胞、ＪＢＬ
細胞などの公知ヒト由来細胞株が、特に有利に使用しう
る。
たヒトリンパ芽球様細胞を使用すれば、その増殖速度が
大きいだけでなく、細胞当りのｈＣＳＦ産生能が通常数
倍〜数十倍にも高まり、ｈＣＳＦの大量生産には特に好
都合である。それ以外にも情養株化されたヒトリンパ芽
球様細胞をヒト以外の溢血動物に移植すると、宿王とな
る温血動物の細胞と演りにくい軟瞳癌を形成しやすく、
これを摘用した後分散することも容易なことから、ヒト
リンパ芽球様細胞だけを採取する目的には極めて有利で
ある。このようなヒトリンパ芽球様細胞には、ヒト白血
病もしくはヒト悪性リンパ種由来の細胞株が適しており
、例えばナマルバ（Ｎａｍａｌｖａ）細胞、ＢＡＬＬ−
１細胞、ＮＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬＬ−１細胞、ＪＢＬ
細胞などの公知ヒト由来細胞株が、特に有利に使用しう
る。
上記のｈＣＳＦ産生能を有するヒト由来細胞とヒトリン
パ芽球様細胞を融させる方法は、いずれの方法を用いて
もよい。
パ芽球様細胞を融させる方法は、いずれの方法を用いて
もよい。
例えば、センダイウイルス（ＨＶＪ）を用いる赤血球ゴ
ースト融合法、リボンーム一日ＶＪスパイク法「ＨＶＪ
添加法やポリエチレングリコールを用いる方法などから
適宜選ばれる。また前記細胞のｈＣＳＦ産生をつかさど
る遺伝子をＤＮＡリガーゼ、制限酵素、ＤＮＡポリメラ
ーゼなどの酵素を利用する遺伝子組換えの手段によって
、ヒトリンパ芽球様細胞に導入しても細胞融合による場
合と同様の効果を達成することができる。
ースト融合法、リボンーム一日ＶＪスパイク法「ＨＶＪ
添加法やポリエチレングリコールを用いる方法などから
適宜選ばれる。また前記細胞のｈＣＳＦ産生をつかさど
る遺伝子をＤＮＡリガーゼ、制限酵素、ＤＮＡポリメラ
ーゼなどの酵素を利用する遺伝子組換えの手段によって
、ヒトリンパ芽球様細胞に導入しても細胞融合による場
合と同様の効果を達成することができる。
本発明のｈＣＳＦの製造方法に使用する溢血動物は、ｈ
ＣＳＦ産生能を有するヒト融合細胞が増殖しうるもので
あればよく、例えば、ニワトリ、ハトなどの鳥類、ィヌ
、ネコ、サル、ャギ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、モル
モット、ラツト、ヌードラツト、ハムスター、普通マウ
ス、ヌードマウスなどの０甫乳類などが使用できる。
ＣＳＦ産生能を有するヒト融合細胞が増殖しうるもので
あればよく、例えば、ニワトリ、ハトなどの鳥類、ィヌ
、ネコ、サル、ャギ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、モル
モット、ラツト、ヌードラツト、ハムスター、普通マウ
ス、ヌードマウスなどの０甫乳類などが使用できる。
これらに動物にヒト融合細胞を移植すると、好ましくな
い免疫反応を起すおそれがあるので、その反応をできる
だけおさえるために、使用する動物は、できるだけ幼若
な状態、すなわち卵、服、胎児、または新生期、幼少期
のものの方が好ましい。
い免疫反応を起すおそれがあるので、その反応をできる
だけおさえるために、使用する動物は、できるだけ幼若
な状態、すなわち卵、服、胎児、または新生期、幼少期
のものの方が好ましい。
また、これら動物に例えば、約２００〜６００レムのエ
ックス線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清
若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処理をほど
こして、免疫反応を弱めて移植してもよい。
ックス線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清
若しくは免疫抑制剤などを注射するなどの前処理をほど
こして、免疫反応を弱めて移植してもよい。
使用する動物がヌードマウスやヌードラツトのような免
疫不全動物の場合には、成長したものであっても免疫反
応が弱いので、これらの前処置を必要とすることなく、
培養株化されたヒト融合細胞が移植でき、急速に増殖で
きるので特に好都合である。また、ヒト融合細胞を、例
えば先ずハムスターに移植し増殖させた後、この細胞を
更にヌードマウスに移植するなどのように、ヒト以外の
溢血動物間で移植して、ヒト融合細胞の増殖により安定
化したり、更にそれから産生されるｈＣＳＦの量を増加
させることも自由である。
疫不全動物の場合には、成長したものであっても免疫反
応が弱いので、これらの前処置を必要とすることなく、
培養株化されたヒト融合細胞が移植でき、急速に増殖で
きるので特に好都合である。また、ヒト融合細胞を、例
えば先ずハムスターに移植し増殖させた後、この細胞を
更にヌードマウスに移植するなどのように、ヒト以外の
溢血動物間で移植して、ヒト融合細胞の増殖により安定
化したり、更にそれから産生されるｈＣＳＦの量を増加
させることも自由である。
この場合、同種間、同属間は勿論のこと同綱間、同門間
移植であってもよいｏヒト融合細胞を移植する動物体内
の部位は、移植した細胞が増殖し得る部位であればよく
、例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に選ばれる
。
移植であってもよいｏヒト融合細胞を移植する動物体内
の部位は、移植した細胞が増殖し得る部位であればよく
、例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に選ばれる
。
また、直接動物体内にヒト融合細胞を移植することなく
、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の櫨過膜、例えば
孔径約１０‐７〜１０‐５のを有するメンブランフィル
ター、限外櫨過膜またはホローフアィバーなどを設けた
公知の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体内、
例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含む体
液の供給を受けつつ、その拡散チャンバー内でヒト融合
細胞をいずれも増殖させることできる。
、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の櫨過膜、例えば
孔径約１０‐７〜１０‐５のを有するメンブランフィル
ター、限外櫨過膜またはホローフアィバーなどを設けた
公知の各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体内、
例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含む体
液の供給を受けつつ、その拡散チャンバー内でヒト融合
細胞をいずれも増殖させることできる。
また、必要に応じて、この拡散チャンバー内の栄養物を
含む体液を動物体内のそれを接続し潅流させるようにし
た拡散チャンバーを、例えば動物体表に取付け、拡散チ
ャンバー内のヒト融合細胞の増殖状態を透視できるよう
にすることも、また、この拡散チャンバー部分のみを着
脱交換できるようにして動物を屠殺せずに寿命一杯細胞
を増殖させて、動物固体当りの細胞生産量を更に高める
こともできる。
含む体液を動物体内のそれを接続し潅流させるようにし
た拡散チャンバーを、例えば動物体表に取付け、拡散チ
ャンバー内のヒト融合細胞の増殖状態を透視できるよう
にすることも、また、この拡散チャンバー部分のみを着
脱交換できるようにして動物を屠殺せずに寿命一杯細胞
を増殖させて、動物固体当りの細胞生産量を更に高める
こともできる。
これらの拡散チャンバ−を利用する方法は、ヒト融合細
胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト融合細胞のみ
が容易に採取できるだけでなく、好ましくない免疫反応
を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制る前処置の必
要もなく、各種溢血動物を自由に利用できる特徴を有し
ている。
胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト融合細胞のみ
が容易に採取できるだけでなく、好ましくない免疫反応
を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制る前処置の必
要もなく、各種溢血動物を自由に利用できる特徴を有し
ている。
移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育を続
ければよく、移植後と言えども特別の取扱いは何ら必要
としないので好都合である。ヒト融合細胞を増殖させる
ための期間は通常１〜２０園である。移植するヒト融合
細胞が培養株化されたものである場合には、その増殖速
度が特に大であり、通常１〜５週の期間で目的を達成す
ることができる。このようにして得られるヒト融合細胞
数は、動物個体当り約１び〜１び２、またはそれ以上に
達することも見し、出した。換言すれば、本発明で使用
するｈＣＳＦの製造方法により増殖させたヒト融合細胞
数は、動物個体当り移植した細胞数の約１ぴ〜１ぴ倍、
またはそれ以上にも達し、ィンピトロで栄養培地に接種
して増殖させる場合の約１び〜１ぴ、またはそれ以上に
も達して、ｈＣＳＦの製造には極めて好都合である。
ければよく、移植後と言えども特別の取扱いは何ら必要
としないので好都合である。ヒト融合細胞を増殖させる
ための期間は通常１〜２０園である。移植するヒト融合
細胞が培養株化されたものである場合には、その増殖速
度が特に大であり、通常１〜５週の期間で目的を達成す
ることができる。このようにして得られるヒト融合細胞
数は、動物個体当り約１び〜１び２、またはそれ以上に
達することも見し、出した。換言すれば、本発明で使用
するｈＣＳＦの製造方法により増殖させたヒト融合細胞
数は、動物個体当り移植した細胞数の約１ぴ〜１ぴ倍、
またはそれ以上にも達し、ィンピトロで栄養培地に接種
して増殖させる場合の約１び〜１ぴ、またはそれ以上に
も達して、ｈＣＳＦの製造には極めて好都合である。
このようにして増殖させたヒト由来の融合生細胞にｈＣ
ＳＦを産生させる方法は自由である。
ＳＦを産生させる方法は自由である。
例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖した融合細胞を採
取し、または皮下で増殖した瞳癌を摘出し、分散させた
後探取し、この細胞を約２０〜４０ｏｏに保った栄養培
地に細胞濃度が１ぴ〜１ぴ／泌になるように浮遊させ、
これを約１〜１５日間この温度に保ってｈＣＳＦを産生
させればよい。このとき必要に応じて、培地中にｈＣＳ
Ｆ増収剤を添加し、ｈＣＳＦの産生量を更に高めること
もできる。従釆より公知のいずれの増収剤をも利用でき
るが、例えば、天然二重鎖ＲＮＡ、ｐｏｌｖ ｌ−ｐｏ
ｌｙＣなどの合成二重鎖ＲＮＡ、微生物が産生するリボ
多糖、ファイトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、ツ
ベルクリン（ＰＰＤ）、ポークウイードミトーゲンなど
のミトーゲン、デキストラン硫酸などの半合成高分子、
各種カチオン性低分子、ピラン共重合体、ポリアクリル
酸などの合成高分子、各種エンドトキシン、Ｌｊ２Ｃ０
３、ＬｊＣＩなどのＩＪチウム化合物の中から適宜選ば
れる。このようにして産生せしめたｈＣＳＦは、公知の
精製分離法、例えば塩析、透析、櫨過、遠心分離、濃縮
、凍結乾燥などを行なうことによって容易に精製分離し
、採取することができる。
取し、または皮下で増殖した瞳癌を摘出し、分散させた
後探取し、この細胞を約２０〜４０ｏｏに保った栄養培
地に細胞濃度が１ぴ〜１ぴ／泌になるように浮遊させ、
これを約１〜１５日間この温度に保ってｈＣＳＦを産生
させればよい。このとき必要に応じて、培地中にｈＣＳ
Ｆ増収剤を添加し、ｈＣＳＦの産生量を更に高めること
もできる。従釆より公知のいずれの増収剤をも利用でき
るが、例えば、天然二重鎖ＲＮＡ、ｐｏｌｖ ｌ−ｐｏ
ｌｙＣなどの合成二重鎖ＲＮＡ、微生物が産生するリボ
多糖、ファイトヘマグルチニン、コンカナバリンＡ、ツ
ベルクリン（ＰＰＤ）、ポークウイードミトーゲンなど
のミトーゲン、デキストラン硫酸などの半合成高分子、
各種カチオン性低分子、ピラン共重合体、ポリアクリル
酸などの合成高分子、各種エンドトキシン、Ｌｊ２Ｃ０
３、ＬｊＣＩなどのＩＪチウム化合物の中から適宜選ば
れる。このようにして産生せしめたｈＣＳＦは、公知の
精製分離法、例えば塩析、透析、櫨過、遠心分離、濃縮
、凍結乾燥などを行なうことによって容易に精製分離し
、採取することができる。
更に、高度の精製を必要とする場合には、例えば、イオ
ン交換体への吸着・脱着、分子量分画およびアフィニテ
ィクロマトグラフィー、等霞点分画、電気漆動などの公
知の方法を更に組み合わせればよく、最高純度のｈＣＳ
Ｆを採取することも可能である。このようにして得たｈ
ＣＳＦは、人の組織から抽出分離されたものと免疫学的
にも物理化学的にも差異がないことはもとより、血清や
尿から採取したもののように肝炎ウイルスや発熱性物質
などの混入がないことから、単独でまたは他の一種もし
くは二種以上の物質を含有せしめ薬剤としてヒト疾病の
予防・治療に有利に利用できる。
ン交換体への吸着・脱着、分子量分画およびアフィニテ
ィクロマトグラフィー、等霞点分画、電気漆動などの公
知の方法を更に組み合わせればよく、最高純度のｈＣＳ
Ｆを採取することも可能である。このようにして得たｈ
ＣＳＦは、人の組織から抽出分離されたものと免疫学的
にも物理化学的にも差異がないことはもとより、血清や
尿から採取したもののように肝炎ウイルスや発熱性物質
などの混入がないことから、単独でまたは他の一種もし
くは二種以上の物質を含有せしめ薬剤としてヒト疾病の
予防・治療に有利に利用できる。
なお明細書を通じてｈＣＳＦの産生量は、マウス骨髄細
胞を使用し、Ｓ．兆ａｎｏ ｔ ａｌ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｃ
ａｎｃｅｒ、Ｖｏｌ．６８９−６９４（１９８０）に記
載の方法に準じて行なった。ｈＣＳＦＩ単位とはｈＣＳ
Ｆ試料０．１の‘を用い、５×１ぴ個のマウス骨髄細胞
からコロニー１個を形成する活性量を定義する。以下２
〜３の実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、
この実施例は、本発明の好ましい実施態様の単なる例示
であり、何ら本発明を限定するものでないことは言うま
でもない。
胞を使用し、Ｓ．兆ａｎｏ ｔ ａｌ．、Ｂｒ．Ｊ．Ｃ
ａｎｃｅｒ、Ｖｏｌ．６８９−６９４（１９８０）に記
載の方法に準じて行なった。ｈＣＳＦＩ単位とはｈＣＳ
Ｆ試料０．１の‘を用い、５×１ぴ個のマウス骨髄細胞
からコロニー１個を形成する活性量を定義する。以下２
〜３の実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、
この実施例は、本発明の好ましい実施態様の単なる例示
であり、何ら本発明を限定するものでないことは言うま
でもない。
実施例 １
肺癌患者から摘出、細切、分散させて得た肺癌細胞とり
ンパ芽球様ナマルバ細胞（Ｎａｍａｌｖａｃｅｌｌ）と
を１４０ｍＭ Ｎａｃｌ、５４ｍＭ ＫＣ１、１ｍＭＮ
ａ弦Ｐ０４、２のＭ ＣａＣ１２を含有する塩類溶液に
それぞれ約１ぴ／泌になるように浮遊させ、これに予め
紫外線で不活化したセンダィウィルスを含有する前記塩
類溶液を、氷冷下で混合し、約５分後に３７℃恒温水槽
に移して、約３０分間鶴拝しつつ細胞融合させリンパ芽
球様ナマルバ細胞にｈＣＳＦ産生を導入した。
ンパ芽球様ナマルバ細胞（Ｎａｍａｌｖａｃｅｌｌ）と
を１４０ｍＭ Ｎａｃｌ、５４ｍＭ ＫＣ１、１ｍＭＮ
ａ弦Ｐ０４、２のＭ ＣａＣ１２を含有する塩類溶液に
それぞれ約１ぴ／泌になるように浮遊させ、これに予め
紫外線で不活化したセンダィウィルスを含有する前記塩
類溶液を、氷冷下で混合し、約５分後に３７℃恒温水槽
に移して、約３０分間鶴拝しつつ細胞融合させリンパ芽
球様ナマルバ細胞にｈＣＳＦ産生を導入した。
このリンパ芽球様ナマルバ細胞を成長したヌ−ドマゥス
の腹腔内に移植した後、通常の方法で５週間飼育した。
の腹腔内に移植した後、通常の方法で５週間飼育した。
生じた瞳癖約１４夕を摘出し、トリプシン含有生理食塩
水に浮遊させ細胞を分散させた。この細胞を牛胎児血清
１帆／ｖ％を補足したＲＰＭＩ１６４批者地（ｐＨ７．
２）で洗浄した後、同培地に細胞濃度約１×１び／叫に
なるように浮遊させ、‐定期的に培地を交換しながら３
７０に７日間保ってｈＣＳＦを産生させた。
水に浮遊させ細胞を分散させた。この細胞を牛胎児血清
１帆／ｖ％を補足したＲＰＭＩ１６４批者地（ｐＨ７．
２）で洗浄した後、同培地に細胞濃度約１×１び／叫に
なるように浮遊させ、‐定期的に培地を交換しながら３
７０に７日間保ってｈＣＳＦを産生させた。
次いで細胞を超音波処理し、上清中に含まれるｈＣＳＦ
の量を測定したところ浮遊液の‘当り約２５０山単位で
あった。対照として、細胞融合させていない肺癌細胞を
同様に処理してｈＣＳＦを産生させたところ、浮遊液の
‘当り約１２山単位の産生量にすぎなかった。更に前記
融合細胞と肺癌細胞を、それぞれ牛胎児血清１小／ｖ％
を補足したＲＰＭＩ１６４０者地（ｐＨ７．２）を使用
し、３７０にてィンビトロで培養、増殖させ前記同機に
処理してｈＣＳＦを産生させたところ、浮遊液のと当り
のｈＣＳＦ産生量は更に低くそれぞれ約９９単位と８３
単位にすぎなかった。実施例 ２ ハムスター新生児に公知の方法でウサギから調製した抗
血清を予め注射し、ハムスターの免疫反応を弱めた後、
その皮下に、実施例１の方法に準じてヒトＢーリンパ球
のｈＣＳＦ産生能を導入したりンパ芽球様ＮＡＬＬ−１
細胞を移植し、その後通常の方法で３週間飼育した。
の量を測定したところ浮遊液の‘当り約２５０山単位で
あった。対照として、細胞融合させていない肺癌細胞を
同様に処理してｈＣＳＦを産生させたところ、浮遊液の
‘当り約１２山単位の産生量にすぎなかった。更に前記
融合細胞と肺癌細胞を、それぞれ牛胎児血清１小／ｖ％
を補足したＲＰＭＩ１６４０者地（ｐＨ７．２）を使用
し、３７０にてィンビトロで培養、増殖させ前記同機に
処理してｈＣＳＦを産生させたところ、浮遊液のと当り
のｈＣＳＦ産生量は更に低くそれぞれ約９９単位と８３
単位にすぎなかった。実施例 ２ ハムスター新生児に公知の方法でウサギから調製した抗
血清を予め注射し、ハムスターの免疫反応を弱めた後、
その皮下に、実施例１の方法に準じてヒトＢーリンパ球
のｈＣＳＦ産生能を導入したりンパ芽球様ＮＡＬＬ−１
細胞を移植し、その後通常の方法で３週間飼育した。
生じた瞳癖約９夕を摘出し、実施例１と同機に処理して
ｈＣＳＦを産生させたところ、浮遊液の‘当りのｈＣＳ
Ｆ産生量は約３５０山単位であった。
ｈＣＳＦを産生させたところ、浮遊液の‘当りのｈＣＳ
Ｆ産生量は約３５０山単位であった。
実施例 ３下顎痛患者から採取した癌細砲とりンパ芽球
様ＪＢＬ細胞を使用し、実施例１の方法に準じてｈＣＳ
Ｆ産生態を導入したりンパ芽球横釘ＢＬ細胞をラット新
生児の静脈内へ移植した後、通常の方法で４週間飼育し
た。
様ＪＢＬ細胞を使用し、実施例１の方法に準じてｈＣＳ
Ｆ産生態を導入したりンパ芽球横釘ＢＬ細胞をラット新
生児の静脈内へ移植した後、通常の方法で４週間飼育し
た。
生じた腫葱約３７夕を摘出し、実施例１と同様に処理し
てｈＣＳＦを産生させた。
てｈＣＳＦを産生させた。
浮遊液の【当りのｈＣＳＦ産生量は約２９０■単位であ
った。実施例 ４ｈＣＳＦ増収剤として、ファイトヘマ
グルチニンを培地の‘当り約１０仏タ添加したこと以外
実施例３と同様にしてｈＣＳＦを産生させたところ、浮
遊液の‘当りのｈＣＳＦ産生量は、約４５０山里位とな
った。
った。実施例 ４ｈＣＳＦ増収剤として、ファイトヘマ
グルチニンを培地の‘当り約１０仏タ添加したこと以外
実施例３と同様にしてｈＣＳＦを産生させたところ、浮
遊液の‘当りのｈＣＳＦ産生量は、約４５０山里位とな
った。
実施例 ５胃癌患者から得た胃癌細胞とりンパ芽球様Ｔ
ＡＬＬ−１細胞とをポリエチレングリコールを用いる公
知の方法で融合させ、リンパ芽球様ＴＡＬＬ−１細胞に
ｈＣＳＦ産生能を導入した。
ＡＬＬ−１細胞とをポリエチレングリコールを用いる公
知の方法で融合させ、リンパ芽球様ＴＡＬＬ−１細胞に
ｈＣＳＦ産生能を導入した。
この細胞を、約４００レムのガンマ線を照射し、その免
疫反応を弱めた成長普通マウスの皮下に移楯し、次いで
通常の方法で４週間飼育した。
疫反応を弱めた成長普通マウスの皮下に移楯し、次いで
通常の方法で４週間飼育した。
皮下に生じた腫癖約１５夕を摘出し、実施例１と同様に
ｈＣＳＦを産生させたところ浮遊液の上当りのｈＣＳＦ
産生量は約３５０の単位であった。実施例 ６ 孔蚤約０．５ミクロンのメンブランフィルターを設けた
内容量約１０のとのプラスチック製円筒型拡散チャンバ
ー内に、実施例５の方法に準じて腎臓痛患者から採取し
た腎臓癌細砲のｈＣＳＦ産生能をリンパ芽球様ＴＡＬＬ
−１細胞に導入した。
ｈＣＳＦを産生させたところ浮遊液の上当りのｈＣＳＦ
産生量は約３５０の単位であった。実施例 ６ 孔蚤約０．５ミクロンのメンブランフィルターを設けた
内容量約１０のとのプラスチック製円筒型拡散チャンバ
ー内に、実施例５の方法に準じて腎臓痛患者から採取し
た腎臓癌細砲のｈＣＳＦ産生能をリンパ芽球様ＴＡＬＬ
−１細胞に導入した。
リンパ芽球様ＴＡＬＬ−１細胞を生理食塩水に浮遊させ
、これを成長したラツトの腹腔内の埋設した。このラッ
トを通常の方法で４週間飼育した後、この拡散チャンバ
ーを取り出した。これにより得られた細胞濃度は、約２
×１び／私であり、ィンビトロでの炭酸がスィンキュベ
ーター中で培養する場合の約１ぴ倍以上にも達すること
がわかった。増殖細胞を実施例１に同様に処理してｈＣ
ＳＦを産生させたところ、浮遊液の‘当りのｈＣＳＦ産
生量は約４２００単位であった。実施例 ７実施例６の
方法で融合・増殖させた細胞を、培地中に合成二重鎖Ｒ
ＮＡｐｏｌｙ １・ｐｏｌｙＣを机当り約５仏夕を以外
実施例１と同様にしてｈＣＳＦを産生させたところ、浮
遊液の‘当りのｈＣＳＦ産生量は約７３０■単位となっ
た。
、これを成長したラツトの腹腔内の埋設した。このラッ
トを通常の方法で４週間飼育した後、この拡散チャンバ
ーを取り出した。これにより得られた細胞濃度は、約２
×１び／私であり、ィンビトロでの炭酸がスィンキュベ
ーター中で培養する場合の約１ぴ倍以上にも達すること
がわかった。増殖細胞を実施例１に同様に処理してｈＣ
ＳＦを産生させたところ、浮遊液の‘当りのｈＣＳＦ産
生量は約４２００単位であった。実施例 ７実施例６の
方法で融合・増殖させた細胞を、培地中に合成二重鎖Ｒ
ＮＡｐｏｌｙ １・ｐｏｌｙＣを机当り約５仏夕を以外
実施例１と同様にしてｈＣＳＦを産生させたところ、浮
遊液の‘当りのｈＣＳＦ産生量は約７３０■単位となっ
た。
実施例 ８
予め３７０に５日間保ったニワトリの受精卵に実施例１
の方法で調製したｈＣＳＦ産生能を導入したりンパ芽球
様ナマルバ細胞を移植た後、この温度に１週間保った。
の方法で調製したｈＣＳＦ産生能を導入したりンパ芽球
様ナマルバ細胞を移植た後、この温度に１週間保った。
Claims (1)
- １ ヒトコロニー刺激因子産生能を有するヒト由来の細
胞とヒトリンパ芽球様細胞とを融合させ、この融合細胞
をヒト以外の温血動物の体内に移植、またはその温血動
物の体液の供給を受けながら増殖させ、得られる細胞か
らヒトコロニー刺激因子を産生せしめることを特徴とす
るヒトコロニー刺激因子の製造方法。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55185732A JPS6030654B2 (ja) | 1980-12-31 | 1980-12-31 | ヒトコロニ−刺激因子の製造方法 |
| GB8138591A GB2092159B (en) | 1980-12-31 | 1981-12-22 | Process for the production of human colony stimulating factor |
| IT49993/81A IT1148022B (it) | 1980-12-31 | 1981-12-23 | Procedimento per la produzione del fattore di stimolo della differenziazione cellulare nell'uomo |
| KR1019810005159A KR870001149B1 (ko) | 1980-12-31 | 1981-12-28 | 인체 콜로니 자극인자의 제조방법 |
| FR8124363A FR2497099A1 (fr) | 1980-12-31 | 1981-12-29 | Production de facteur leucopoietique humain |
| CH8352/81A CH649786A5 (fr) | 1980-12-31 | 1981-12-30 | Production de facteur leucopoietique humain. |
| US06/585,617 US4621050A (en) | 1980-12-31 | 1984-03-05 | Process for the production of human colony-stimulating factor |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP55185732A JPS6030654B2 (ja) | 1980-12-31 | 1980-12-31 | ヒトコロニ−刺激因子の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS57114525A JPS57114525A (en) | 1982-07-16 |
| JPS6030654B2 true JPS6030654B2 (ja) | 1985-07-17 |
Family
ID=16175883
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP55185732A Expired JPS6030654B2 (ja) | 1980-12-31 | 1980-12-31 | ヒトコロニ−刺激因子の製造方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4621050A (ja) |
| JP (1) | JPS6030654B2 (ja) |
| KR (1) | KR870001149B1 (ja) |
| CH (1) | CH649786A5 (ja) |
| FR (1) | FR2497099A1 (ja) |
| GB (1) | GB2092159B (ja) |
| IT (1) | IT1148022B (ja) |
Cited By (3)
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|---|---|---|---|---|
| JPS6439855A (en) * | 1987-08-05 | 1989-02-10 | Nec Corp | Surface acoustic wave device |
| JPH02211748A (ja) * | 1989-02-10 | 1990-08-23 | Nec Eng Ltd | 直交変調回路 |
| JPH03241947A (ja) * | 1990-02-20 | 1991-10-29 | Murata Mfg Co Ltd | ４相位相変調器 |
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| DE3588199T2 (de) * | 1984-07-06 | 1999-04-08 | Novartis Ag, Basel | Lymphokin-Herstellung und -Reinigung |
| JPS61227526A (ja) * | 1984-07-25 | 1986-10-09 | Chugai Pharmaceut Co Ltd | 新規なコロニー刺激因子 |
| UA29377C2 (uk) * | 1984-09-19 | 2000-11-15 | Новартіс Аг | Спосіб отримання білка з активністю колонієстимулювального фактора гранулоцитів та макрофагів(gm-csf) приматів |
| US4968618A (en) * | 1984-11-16 | 1990-11-06 | University Of Florida | Composition and method for promoting growth of granulocytes |
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| US6117422A (en) * | 1985-02-05 | 2000-09-12 | Chiron Corporation | N∇2-CSF-1(long form) and carboxy truncated fragments thereof |
| US4847201A (en) * | 1985-02-05 | 1989-07-11 | Cetus Corporation | DNA encoding for CSF-1 and accompanying recombinant systems |
| JP2561255B2 (ja) * | 1985-02-05 | 1996-12-04 | シタス コ−ポレイシヨン | 組換コロニ−刺激因子▲下−▼１ |
| US5573930A (en) * | 1985-02-05 | 1996-11-12 | Cetus Oncology Corporation | DNA encoding various forms of colony stimulating factor-1 |
| WO1986004605A1 (en) * | 1985-02-08 | 1986-08-14 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Human granulocyte colony stimulating factor |
| US5532341A (en) | 1985-03-28 | 1996-07-02 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Human pluripotent hematopoietic colony stimulating factor |
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| NZ218336A (en) * | 1985-12-09 | 1991-08-27 | Kirin Amgen Inc | Monoclonal antibodies to human pluripotent granulocyte colony stimulating factor (hpg-csf) |
| JPH0618780B2 (ja) * | 1986-01-22 | 1994-03-16 | 中外製薬株式会社 | 骨髄性白血病抑制剤 |
| JPH0618779B2 (ja) * | 1986-01-22 | 1994-03-16 | 中外製薬株式会社 | 造血機能回復促進剤 |
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1981
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- 1981-12-29 FR FR8124363A patent/FR2497099A1/fr active Granted
- 1981-12-30 CH CH8352/81A patent/CH649786A5/fr not_active IP Right Cessation
-
1984
- 1984-03-05 US US06/585,617 patent/US4621050A/en not_active Expired - Fee Related
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