KR900007647B1 - 인간 칼리크레인의 제조방법 - Google Patents

인간 칼리크레인의 제조방법 Download PDF

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가부시기가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겡뀨우죠
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Abstract

내용 없음.

Description

인간 칼리크레인의 제조방법
본 발명은 인간 칼리크레인(human kallikrein)의 제조방법에 관한 것이다.
좀더 상술하면, 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간 세포의 생체내 증식과 그렇게 하여 얻어진 인간세포로 인간 칼리크레인의 시험관 내에서의 생산을 포함하는 인간 칼리크레인의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 바람직한 인간 세포들은 인간의 췌장, 타액선, 간 및 폐 섬유아세포로부터의 세포들이고, 그것들이 정상적인 것이든 또는 종양으로부터의 것이든 본 발명에 따라 쉽게 증식될 수 있다.
인간의 정상 또는 종양세포들의 인간 칼리크레인 생산능이 상기 효소를 생산할 수 있는 잡종세포들(hybrid ce11s)을 얻기 위해 세포융합(cell fusion)에 의해 인간 임파아구 세포들(Human lymphoblastoid lines)에 도입될 수 있다면 인간 임파아구 세포들도 본 발명에 또한 사용될 수 있다. 그러한 잡종세포들의 사용으로 세포증식과 세포망 인간 칼리크레인 생산성이 극히 높아진다.
나말바(Namalwa), BALL-1, NALL-1, TALL-1 및 JBL과 같은 인간 백혈병 또는 악성 임파종으로부터의 공지된 인간 임파아구 세포들이 특히 이러한 목적을 위해 적당하다.
본 발명에 의한 인간 칼리크레인 생산능은 시험관 내의 조직배양을 이용한 종래의 제조방법에 의한 것보다 우수하다.
본 발명은 생물학적으로 활성인 효소의 제조에 관한 것으로 좀더 상술하면, 유용한 약리학적 중요성을 가지는 인간 칼리크레인의 제조에 관한 것이다.
칼리크레인(EC 3.4.21.8)은 각기 다른 원천으로부터의 그리고 혈관 활성 펩티드류(키닌)를 혈장내의 그것들의 비활성 키니노겐 선구물질들로부터 유리하는 공통된 성질 외에 다른 특이성들을 가지는 다수의 효소들을 가르킨다.
혈관 확장 및 혈압강하 작용과 같은 칼리크레인의 약리작용은 칼리크레인을 뇌 또는 심장내의 동맥경화증 또는 고혈압과 같은 순환기관들 내의 질병을 위한 치료제로서 유용하게 한다; 따라서 칼리크레인의 수요는 급격히 증가하고 있다.
칼리크레인은 간 또는 췌장과 같은 포유동물의 기관들 ; 또는 혈액, 타액 또는 오줌과 같은 포유동물의 체액으로부터 얻을 수 있다는 것이 잘 알려져 있다.
일본 특허출원 공개번호 제102,495/77호 또는 제 167,228/80호와 같은 특허출원서에 기술된 바와 같이, 칼리크레인의 가장 좋은 생산은 종래에는 돼지의 기관들로 실행되어 왔지만, 그러나 수요를 충족시키기에는 불충분하였다.
인간의 치료제로서 사용될때 칼리크레인의 항원-항체 반응에 있어서는 인간의 생세포들로부터의 칼리크레인의 사용은 그것의 적은 항원성으로 인해 안전하게 탁월하다.
따라서 산업적 규모로 실행될 수 있는 인간 칼리크레인의 제조를 위한 저렴한 공정이 요구되어 왔다. 다음의 기술로 보다 명백하여질 것과 같이, 본 발명은 이러한 요구를 충족시켜준다.
본 발명의 첫번째 목적은 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간 세포들의 증식을 위한 유효한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은 그렇게 하여 얻어진 인간 세포들로 높은 역가의 인간 칼리크레인의 제조를 위한방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 세번째 목적은 극히 높은 세포증식율과 인간 칼리크레인 생산능을 나타내는 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 잡종세포들을 얻기위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 네번째 목적은 세포망 인간 칼리크레인 생산능을 증가시키는 방법을 제공하는 것이다.
이러한 목적들은 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간 세포들을 인간 이외의 온혈동물에 이식하여 증식시키거나 또는 대안으로써, 상기 세포들을 인간 이외의 온혈동물의 영양체액이 상기 세포들에 공급되는 종래의 형태의 확산실에서 증식하도록 하고, 상기 생체내 증식방법들 중 하나에 의해 증식된 인간 세포들로 인간 칼리크레인을 생산하는 것을 포함하는 방법에 의해 달성될 수 있다.
좀더 상술하면, 이러한 목적들은 (1) 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간 세포들을 인간 이외의 온혈동물에 이식; 증식을 위해 동물로부터 공급되는 영양체액을 인간 세포들이 이용하도록 이 동물을 사육 ; 증식된 인간 세포들을 얻기위해 동물내에 형성된 생성된 종양을 적출 및 분산 ; 상당한 양의 인간 칼리크레인이 축적되기에 충분한 기간동안 칼리크레인 유도제의 존재 또는 부재하에 시험관내의 영양배지에 인간세포들을 배양 ; 그리고 배지로부터 축적된 인간 칼리크레인을 수집하거나, 또는 대안으로써, (2) 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간 세포들의 현탁액을 인간 이외의 온혈동물의 영양체액이 상기 세포들에 공급되는 종래의 형태의 확산실에 넣음 ; 그 확산실을 인간 이외의 온혈동물 내에 또는 위에 삽입 또는 놓음 ; 증식을 위해 공급된 영양체액을 인간 세포들이 이용하도록 이 동물을 사육 ; 확산실로부터 증식된 인간 세포들을 수집 ; 상당한 양의 인간 칼리크레인이 축적되기에 충분한 기간동안 칼리크레인 유도질의 존재 또는 부재하에 시험관 내의 영양배지에 이 인간 세포들을 배양 ; 그리고 배지로부터 축적된 인간 칼리크레인을 수집하는 것을 포함하는 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명은 인간 이외의 온혈동물을 이용하여 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간 세포들을 생체내에서 증식함으로써 얻은 인간 세포들을 사용하는 인간 칼리크레인 생산능은 시험관 내에서 증식된 것으로 달성된 것보다 극히 높다는 사실에 근거를 두고 있다; 본 발명은 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간 세포들을 인간 이외의 온혈동물에 이식함으로써 증식시키거나 또는 대안으로써 상기 세포들을 인간 이외의 온혈동물의 영양체액이 상기 세포들에 공급되는 종래의 형태의 확산실 내에서 증식되도록 하고 이렇게하여 얻어진 인간 세포들로 목적하는 인간 칼리크레인을 생산하는 것을 포함하는 인간 칼리크레인 생산방법을 제공한다.
시험관내의 조직배양을 이용하는 종래의 방법과는 달리, 생체내의 공정을 이용하는 방법은 값비싼 혈청을 함유하는 영양배지를 덜 필요로 하거나 또는 전혀 필요로 하지않고 세포증식 동안의 유지 및 관리를 극히 용이하게 할뿐만 아니라 매우 높은 역가의 인간 칼리크레인을 생산한다.
좀더 상술하면, 본 발명에 따라 숙주로서 인간 이외의 온혈동물을 사용하는 방법에 있어서, 어떤 인간 세포들은 그것들을 동물에 이식하거나 또는 다른 방법으로서 그것들을 영양체액을 받아드리도록 고안된 종래의 형태의 확산실에 넣고, 그 확산실을 동물내에 또는 위에 삽입하거나 또는 놓고 ; 일반적인 방법에 의해 그 동물을 사육함으로써 동물로부터 공급되는 영양체액을 이용하여 쉽게 증식될 수 있다.
더우기 본 발명에 따른 방법은 더욱 더 안정되고 빠른 세포증식, 높은 세포생산능 및 세포당 극히 높은 인간 칼리크레인 생산능과 같은 특징이 있다는 사실에 의해 조직배양을 이용하는 종래의 시험관 내의 세포증식방법들과 구별될 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 인간 세포들은 많은 양의 인간 칼리크레인을 생산하며 인간 이외의 온혈동물에 이식하여 거기에서 증식될 수 있는 것이다; 예를들면, 췌장, 타액선, 간, 신장, 방광 및 폐 섬유아세포로부터의 정상적인 인간세포들; 어떠한 발암 비루스 또는 방사선의 사용에 의해 정상적인 인간 세포들을 변형시킴으로써 얻어진 것들; 췌장암, 타액선 종양, 간암, 신장암 및 방광암으로부터의 인간의 종양세포들; 그리고 상기 인간 세포들의 특징세포 계통들이 본 발명에 유리하게 사용될 수 있다.
상기의 인간 세포들을 사용하는 대신에 더욱 쉽게 이차배양 할 수 있고 폴리에틸렌글리콜 또는 센다이 비루스를 이용하는 세포융합, 또는 뉴클레아제, 리가제 및 DNA폴리머라제를 이용하는 유전자 재결합 기술에 의해 인간 유전자(들) 코우딩 칼리크레인-생산능이 도입될 수 있는 인간 임포아구 세포들의 사용에 의해 세포증식율 및/또는 세포당 인간 칼리크레인 생산능을 극히 향상시켜 상기의 정상 또는 종양세포들의 사용에 의한 것보다 약 2-10배에 달하게 된다.
그러한 인간 임포아구 세포의 동물에 대한 이식은 숙주동물 세포들로 거의 오염되지 않은 종양(들)을 형성하게 한다. 또한 적출후 분리가 매우 용이하며 따라서 인간 생세포율의 수집이 쉽게 실행될 수 있다.
나말바(Namalwa), BALL-1, TALL-1, NALL-1 및 JBL과 같은 인간 백혈병 또는 임파종으로부터의 공지된 임포아구 세포들은 이러한 목적들을 위해 특히 적당하다.
본 발명에 이용될 수 있는 인간 이외의 온혈동물은 인간 세포가 증식될 수 있는 것으로 예를를면, 닭 또는 비둘기와 같은 조류 ; 또는 개, 고양이, 원숭이, 염소, 돼지, 말, 토끼, 소, 기니아 돼지, 쥐, 누드쥐, 햄스터, 생쥐 또는 누드생쥐와 같은 포유동물이다.
그러한 인간 세포들의 동물로의 이식은 바람직하지못한 면역반응을 초래하므로 계란, 태아 또는 임신 3개월이 넘은 태아, 또는 신생 또는 유아기의 동물과 같은 가능한 어린 인간 이외의 온혈동물이 가능한 한 많이 면역반응을 감소시키기 위해 바람직하다.
이식에 앞서, 면역반응을 가능한 한 낮은 상태로 감소시키기 위해 이러한 동물을 약 200-600렘의 X-선또는 γ-선 조사 또는 항혈청이나 면역억제제의 주사 처리할 수 있다. 숙주동물로서 누드생쥐 또는 누드쥐와 같은 면역이 적은 실험동물을 사용하면 그것들이 성숙된 것이라도 바람직하지 못한 면역반응을 덜 초래하기 때문에 이러한 동물에는 상기와 같은 전처리 없이도 상기의 인간세포들을 쉽게 이식할 수 있고, 이 세포들은 면역반응이 일어날 염려가 적고 쉽게 증식한다.
서로 다른 인간 이외의 온혈동물들을 이용하여 이식을 반복함으로써 안정된 세포증식과 인간 칼리크레인 생산능을 촉진할 수 있다 : 예를들면, 상기 두가지 목적들은 인간 세포들을 처음에는 햄스터에 이식하여 햄스터 내에서 증식되도록 하고 다시 증식된 인간 세포들을 누드생쥐에 재이식함으로써 달성될 수 있다. 이러한 경우에, 연속된 이식은 같은 종 또는 속은 물론 같은 강 또는 목간의 인간 이외의 온혈동물로 실행될 수 있다.
인간 세포들이 이식될 수 있는 동물의 부위에 있어서는, 그 세포들이 증식될 수 있는한 동물의 어떠한 부위에도 이식될 수 있다; 예를 들면, 요막강내 또는 정맥내, 복강내 또는 피하에 이식될 수 있다.
인간 세포들의 동물로의 이식 대신에 상기의 인간 세포들중 어느 것이라도 확산실의 동물 세포들에 대한 오염을 방지하면서 인간 세포들에 영양체액을 공급하는 예를 들면, 구멍크기가 약 10-7-10-5m인 막필터, 울트라-필터 또는 공동필터가 장치된 여러가지 형태 및 크기의 종류에 확산실에 그 세포들을 넣고; 그 확산실을 예를 들면 복강내로, 동물내에 삽입하고; 그 인간 세포들이 동물로부터 공급되는 영양체액을 이용하여 증식되도록 함으로써 쉽게 증식될 수 있다.
더우기, 그 확산실은 확산실 내의 영양체액과 영양용액의 확산실 내를 자유롭게 순환하도록 고안되고 어느 위치에도 예를 들면 동물 위에도 놓여질 수 있다.
이러한 방법으로 확산실 내의 배양은 세포증식 동안에도 확산실 벽(들)에 설치된 투명한 측면창(들)을 통해 관찰될 수 있고, 그리고/또는 그 확산실은 계속적으로 새로운 것으로 교환할 수 있어 동물을 죽이지 않고도 그것의 수명이 다하도록 세포증식을 계속할 수 있고 동물당 세포 생산능을 더욱 더 촉진할 수 있다.
그러한 확산실을 사용하면 인간 세포들과 동물 세포들의 직접적인 접촉이 없어서 바람직하지 못한 면역반응을 덜 초래하므로 숙주로서 인간 이외의 어떠한 온혈동물도 전처리 없이 쉽게 이용할 수 있고, 증식된 인간 생세포들은 쉽게 수집될 수 있다.
동물의 사육은 일반적인 방법에 의해 쉽게 행하여 질 수 있고, 이식 후에도 어떠한 특별한 조치를 필요로 하지 않는다.
최대 세포증식을 얻는데 요하는 기간은 보통 1 내지 20주일 이내이다. 인간 세포들이 인간종양 또는 임파아구 세포로부터의 것일 때에는 최대 세포증식은 보통 약 1 내지 5주내에 얻을 수 있다. 이렇게 하여 얻을수 있는 인간 세포들의 수는 동물 개체당 약 107-1012개 또는 그 이상이다. 본 발명에 따라 이식된 인간세포들은 약 102-107배 또는 그 이상으로 증가하는데 이는 영양배지를 사용하는 시험관내의 증식방법에 의해 얻을 수 있는 것에 약 10-106배 또는 그 이상에 해당한다: 따라서, 증식된 인간세포들은 인간 칼리크레인의 생산을 위해 유리하게 사용될 수 있다.
증식된 인간 세포들의 세포세대는 이후 기술될 유도단계에 앞서 약 1-4일간 시험관내의 조직배양을 함으로써 조절될 수 있다.
증식된 인간 세포들이 인간 칼리크레인을 생산하도록 유도되는 방법이라면 어떠한 방법도 본 발명에 이용될 수 있다: 예를 들면, 복수 현탁액(ascite suspension)으로부터의 수집, 또는 예를 들면 피하에 형성된 종양(들)을 적출하고 분산함으로써 얻은 증식된 인간 세포들을 영양배지에 현탁시키고 약 20°-40°의 온도범위로 예열하여 세포농도가 약 104-108개/ml가 되도록 한 후, 거기에서 배양시켜 인간 칼리크레인을 얻는다. 이러한 경우에 인간 세포들은 칼리크레인 생산능을 향상시키기 위해 칼리크레인 유도체에 노출될 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 칼리크레인 유도제는 인간 이외의 온혈동물을 이용하여 인간 세포들을 증식함으로써 얻어진 인간 세포들의 인간 칼리크레인 생산을 유도하는 것들중 한가지 또는 그 이상의 것들이다; 예를 들면, 글리신 또는 페닐알라닌과 같은 아미노산류; 카세인과 같은 단백질; 글루코스, 이노시톨, 리보스 또는 디옥시리보스와 같은 당류; 또는 아드레날린과 같은 호르몬 등이 칼리크레인 유도제로서 사용될 수 있다.
인간 칼리크레인의 배양에 있어서의 안정화와 인간 칼리그레인 생산능의 증강작용은 배지에 칼리크레인 안정제 또는 트립신(EC 3.4.21.4)이나 알칼로이드와 같은 칼리크레인 증강제를 첨가함으로써 이루어질 수 있다.
배지내의 인간 칼리크레인은 농축, 염산, 투석, 여과, 원심분리 및/또는 동결건조와 같은 공지의 정제 및 분리방법들에 의해 쉽게 수집될 수 있다. 더욱 정제된 인간 칼리크레인의 제조가 요망된다면, 가능한 한 높은 순도의 제제는 이온교환기로의 흡착과 탈착, 겔여과, 전기영동, 친화-크로마토그라피 및/또는 동전점분별 등과 같은 다른 종래의 방법들과 상기의 방법들을 결합한 방법에 의해서 얻을 수 있다.
본 인간 칼리크레인은 인간의 뇨로부터의 것과 면역학적으로 동일하고, 피로겐이나 간염 비루스를 함유하고 있지 않다: 따라서 그것은 인간의 질병의 예방이나 치료를 위해 내복 또는 주사용으로 단독으로 또는 스테로이드 호르몬, 항응고제 또는 제암제 등과 같은 다른 한가지 또는 그 이상의 약제들과 결합하여 유리하게 사용될 수 있다.
전 명세서를 통해, 인간 칼리크레인의 역가는 모리야(Moriya) 등에 의해 1965년도 생화학지(Journal of Biochemistry) 제58권, 20l페이지에 게재된 생물검사방법을 약간 변형한 방법에 의해 측정되고 인간 칼리크레인을 투여한 개의 혈압저하를 측정함으로써 검사되는 생울학적 단위(KU)에 의해 표시된다.
본 발명의 몇가지 실시예들이 이후에 기술될 것이나, 이는 본 발명의 영역을 결코 제하하는 것은 아니다.
실시예 1
성숙한 누우드생쥐들의 피하에 인간의 췌장암 세포, COLO 357를 이식하고 일상적인 방법으로 4주일간 사육한다. 그러한 세포이식과 사육에 의해 동물들의 피하에 형성된 각각 약 10g 정도의 종양들을 적출한후 잘게 썰고 트립신을 함유하는 생리식염수에 현탁시켜 분산시킨다. 그리고나서, 인간 세포들을 10v/v%의 소의 태아혈청을 보충한 Earle's 199배지(pH 7.2)로 세척하고 상기와 같은 조성에 약 1mg/ml의 카세인을 부가적으로 함유한 신선한 배지에 현탁시켜 세포농도가 약 1×105개/ml가 되도록 한 후,37℃로 10일간 유지시켜 인간 칼리크레인 생산을 유도한다.
그리고나서, 그 세포들을 초음파 처리하고, 표면에 떠오른 인간 칼리크레인의 역가를 측정한다. 인간 칼리크레인 생산량은 현탁액 1ml당 약 600KU이었다. 대조실험은 다음과 같이 행한다: 인간 췌장암 세포COLO 357을 10v/v%의 소의 태아혈청을 보충한 Parker's 199배지(PH 7.2)에 시험관 내로 배양하고 증식된 인간 세포들을 상기와 유사한 방법으로 인간 칼리크레인 생산을 유도한다. 인간 칼리크레인 생산량은 현탁액 1ml당 단지 20KU에 불과하였다.
실시예 2
인간 췌장암 세포, COLO 357과 인간 임파아구 세포, 나말바(Namalwa)를 140mM NaCl, 54mM KCl, 1mM NaH2PO4및 2mM CaCl2를 함유하는 염류용액이 들어있는 용기에 부유시켜 각각의 세포농도가 약103개/ml가 되도록 한다. 이 세포 현탁액에 상기와 같은 조성에 UV-방사선으로 미리 불활성화한 센다이 비루스를 부가적으로 함유한 신선한 염류용액을 얼음으로 냉각한 조건하에서 부가한다. 부가후 5분이 경과한 후에 이 혼합물을 37℃ 항온기에 넣고 약 30분간 교반하여 세포융합 시킨후, 인간의 췌장암 세모의 인간 칼리크레인 생산능을 인간의 임파아구 세포에 도입한다.
생성된 잡종세포들을 성숙한 누드생쥐들의 복강내에 이식한 후 일반적인 방법에 의해 5주간 사육한다. 각각 약 15g의 생성된 종양들을 적출한 후 세포 현탁액을 카세인 대신에 0.1/w/v% 페닐알라닌과 0.1w/v% 글루코스를 사용하는 것을 제외하고는 실시예 1과 유사한 방법으로 처리하여 인간 칼리크레인의 생산을 유도한다. 인간 칼리크레인의 생산량은 현탁액 1ml당 약 1,300KU이었다.
대조실험으로서, 잡종화된 인간 세포들을 시험관내에서 배양하여 증식시킨후 실시예 1과 유사한 방법으로 처리하여 인간 칼리크레인을 생산하였으나, 현탁액 1ml당 인간 칼리크레인의 생산량은 단지 약 100KU에 불과하였다.
실시예 3
환자의 신장 종양조직을 적출하여 얻은 인간의 신장 종양세포들을 잘게 썰고 분산시킨 후 140mM NaCl, 54mM KCl, 1mM NaH2PO4및 2mM CaCl2를 함유하는 염류용액이 담긴 용기에 인간의 임파아구 세포, BALL-1와 함께 현탁시켜 각각의 세포농도가 약 103개/ml가 되도록 한다.
이 세포 현탁액에 얼음으로 냉각된 조건하에 UV-방사선으로 미리 불활성화한 센다이 비루스를 부가적으로 함유한 상기와 같은 조성의 신선한 염류용액을 부가한다. 부가후 약 5분이 경과한 후에 이 혼합물을 37℃ 항온기에 넣고 약 30분간 교반하여 세포융합시킨 후 인간 임파아구 세포에 인간의 신장 종양세포들의 인간 칼리크레인 생산능을 도입시킨다. 면역 반응을 감소시키기 위해 일반적인 방법에 의해 토끼로부터 제조한 항혈청을 신생 햄스터들에 주사한 후에 이 동물들의 피하에 잡종세포들을 이식시키고 일반적인 방법으로 3주간 사육한다.
각기 약 10g의 피하에 형성된 종양들로부터 얻은 세포 현탁액을 실시예 1과 유사한 방법으로 처리하여 인간 칼리크레인 생산을 유도한다. 인간 칼리크레인 생산량은 현탁액 1ml당 약 2,10KLU이다. 대조실험으로써, 잡종화된 BALL-1을 실시예 1과 유사한 방법으로 시험관 내에서 배양하여 증식시킨 후 실시예 1과 유사한 방법으로 처리하여 인간 칼리크레인을 생산하였으나, 인간 칼리크레인의 생산량은 현탁액 1ml당 단지 200KU에 불과하였다.
실시예 4
신행 쥐들의 정맥내에 실시예 2와 유사한 방법으로 인간 칼리크레인 생산능을 도입한 잡종화된 인간 임파아구 세포, 나말바(Namalwa)를 이식한 후, 이 동물을 일반적인 방법에 의해 4주간 사육한다.
각기 약 40g의 생성된 종양들을 적층한 후 세포 현탁액을 실시예 2와 유사한 방법으로 처리하여 인간 칼리크레인 생산을 유도한다. 인간 칼리크레인의 생산량은 현탁액 1ml당 약 1,400KU이었다.
실시예 5
면역반응을 감소시키기 위해서 약 400렘의 X-선을 성숙한 생쥐들에게 조사한 후, 이 동물들의 피하에 인간의 암세포 COLO 357을 이식하고 일반적인 방법에 의해 4주간 사육한다.
각기 약 15g의 피하에 형성된 종양들을 적출하고 실시예 1과 유사한 방법으로 처리하여 인간 칼리크레인 생산을 유도한다. 인간 칼리크레인 생산량은 현탁액 1ml당 약 900KU이었다.
실시예 6
실시예 3의 방법과 유사한 방법으로 인간 칼리크레인 생산능이 도입된 잡종화된 인간 임파아구 세포 BALL-1을 내부 용적이 약 10ml이고 구멍크기가 약 0.5μ인 막필터가 장치된 플라스틱제 원통형 확산실내의 생리식염수에 현탁시키고 이 확산실을 성숙한 쥐의 복강내에 삽입한다. 그리고나서, 이 동물을 일반적인 방법에 의해 4주간 사육한 후 확산실을 제거한다.
확산실 내의 인간 세포농도는 CO2항온기를 사용하는 시험관 내 조직배양 방법에 의한 것보다 약 13배인ml당 약 2×19개 이었다.
그리고나서, 인간세포들을 실시예 2에서와 유사한 방법으로 처리하여 인간 칼리크레인 생산을 유도한다. 인간 칼리크레인 생산량은 현탁액 1ml당 약 1,800KU이었다.
실시예 7
실시예 3에서와 유사한 방법으로 인간 칼리크레인 생산능을 도입한 잡종화된 인간 임파아구 세포 BALL-1을 37℃에서 5일간 예비 보온시킨 수정란의 요막강 내에 이식하고, 이 계란을 이 온도에서 1주일간 더 보온한다.
이 계란으로부터 인간 세포들을 수집하고 실시예 2에서와 유사한 방법으로 처리하여 인간 칼리크레인 생산을 유도한다. 인간 칼리크레인 생산량은 현탁액 1ml당 약 l,200KU이었다.

Claims (10)

  1. (1) 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간세포를 인간 이외의 온혈동물에 이식한 후; 이 인간세포들이 동물의 영양체액을 이용하여 증식되도록 하고; 증식된 인간세포들이 인간 칼리크레인을 생성하도록 하거나, (2) 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간세포를 인간 이외의 온혈동물의 영양체액이 공급되는장치에 넣고; 그 장치를 동물내에 또는 위에 삽입 또는 놓은후에; 인간세포들이 영양체액을 이용하여 증식되도록 하고; 증식된 인간세포들이 인간 칼리크레인을 생성하도록 한 인간 칼리크레인의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간세포를 인간 이외의 온혈동물에 이식하고; 인간세포들이 동물의 영양체액을 이용하여 증식하도록 동물을 사육한 후; 동물내에 형성된 종양을 적출 및 분리하여 증식된 인간세포들을 얻은 다음; 이 인간세포를 칼리크레인 유도제의 존재 또는 부재하에서 상당량의 인간 칼리크레인이 축적되도록 충분한 기간동안 시험관내의 영양배지에서 배양하고; 배지로부터 축적된 인간 칼리크레인을 수집하거나, (2) 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간세포의 현탁액을 인간 이외의 온혈동물의 영양체액이 인간세포에 공급되는 종래 형태의 확산실에 넣고; 이 확산실을 인간 이외의 온혈동물내 또는 위에 삽입 또는 놓은 후; 인간세포가 체액을 이용하여 증식되도록 동물을 사육한 다음; 확산실로부터 증식된 인간세포를 수집하고; 이 인간세포를 칼리크레인 유도제의 존재 또는 부재하에서 상당량의 인간 칼리크레인이 축적되도록 충분한 기간동안 시험관내의 영양배지에서 배양하고; 축적된 인간 칼리크레인을 배지로부터 수집하는 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간세포가 인간의 췌장세포들, 인간의 타액선세포들, 인간의 간세포들, 인간의 신장세포들 및 인간의 폐섬유아(fibroblastoid) 세포들로 구성된 그룹으로부터 선택된 정상적인 인간세포들인 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 인간세포가 인간 췌장암세포들, 인간의 타액선암세포들, 인간의 간암세포들, 인간의 신장암세포들, 인간의 방광암세포들, 그리고 제2항에 기술된 인간세포들의 변형에 의해 얻어진 것들로 구성된 그룹으로부터 선택된 인간의 종양세포들인 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 인간세포들이 인간 칼리크레인인 생산능이 도입된 잡종세포들(hybrid cells)인 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 인간세포가 인간세포의 인간 칼리크레인 생산능을 인간의 임파아구 세포에 도입하기 위해 제2항과 제3항에 기술된 인간세포들 중 어느것으로 잡종화 한 인간 임파아구 세포인 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 인간의 임파아구 세포를 나말바(Namalwa), BALL-1, NALL-l, TALL-1 및 JBL로 구성된 그룹으로부터 선택하는 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 인간 이외의 온혈동물이 포유동물 또는 조류인 제조방법.
  9. 제1항에 있어서, 칼리크레인 유도제가 아미노산, 단백질, 설탕 및 흐르몬으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 성분인 제조방법.
  10. 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간세포들이 증식하고 상당량의 인간 칼리크레인이 축적되도록 충분한 기간동안 칼리크레인의 유도제의 존재 또는 부재하에서의 증식된 인간세포를 배양하여 인간 칼리크레인을 제조하는 방법에 있어서, (1) 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간세포를 인간 이외의 온혈동물로 이식하고; 인간세포가 동물의 영양체액을 이용하여 증식될 수 있도록 그 동물을 사육한 후; 증식된 인간세포들을 얻기 위해 동물내에 형성된 종양들을 적출 및 분리하고; 상당량의 인간 칼리크레인이 축적되도록 충분한 기간동안 칼리크레인 유도제의 존재 또는 부재하에서 인간세포를 시험관내의 영양배지에서 배양하고; 배지로부터 축적된 인간 칼리크레인을 수집하거나, (2) 인간 칼리크레인을 생산할 수 있는 인간세포의 현탁액을 인간세포에 영양체액이 공급되는 확산실내에 넣고; 그 확산실을 인간 이외의 온혈동물내에 또는 위에 삽입 또는 놓고; 인간세포들이 영양체액을 이용하여 증식되도록 동물 사육한 후; 확산실로부터증식된 인간세포들을 수집하고; 상당량의 인간 칼리크레인이 축적되도록 충분한 기간동안 칼리크레인 유도제의 존재 또는 부재하에 시험관 내의 영양배지에서 인간세포들을 배양하고; 배지로부터 축적된 인간 칼리크레인을 수집하여 극히 향상된 세포증식율과 인간 칼리크레인 생산능을 올린 개량방법.
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