KR860000900B1 - 인체 황체형성 호르몬의 제조방법 - Google Patents

인체 황체형성 호르몬의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

인체 황체형성 호르몬의 제조방법
본 발명은 인체 황체형성호르몬(human luteinizing hormone, human lutropin ; 이후 hLH로 약칭한다)의 제조방법에 관한 것이다.
hLH는, 예를들어 「생화학 데이터 핸드북 Ⅰ」, 제1329내지 1333페이지, 東京化學同人社발행(1979년) 등에 기재되어 있는 것처럼, 인체 하수체전엽의 호염기성세포가 생산하는 분자량 약 29,000의 당단백질로서, 교환의 남성성호르몬, 난소의 에스트로겐, 프로게스테론 생산분비의 촉진작용을 갖고 있는 호르몬이다.
저렴한 가격으로 hLH를 대량생산하는 방법은 아직 확립되어 있지 않다.
본 발명자는 hLH의 대량생산을 위하여 예외연구를 계속한 결과 의의로 hLH산생능을 갖고 있는 인체 유래의 세포는 생체의 조직배양법에 의하여 수득되는 세포보다 인체 이외의 온혈동물을 이용하여 증식시킨 세포가 hLH산생량이 훨씬 높아서 세포당 hLH산생량이 후자의 약 2내지 50배에 달하는 사실을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은 hLH산생능을 갖는 인체 유래의 세포를 인체이외의 온혈동물 체내에 이식해서 증식시키거나 또는 이와달리, 인체 이외의 온혈동물의 영양체액이 전술한 인체 유래세포에 공급되는 장치를 사용해서 이들 세포를 증식시키고, 또 전술한 증식방법중 1개의 방법으로 증식시킨 인체 유래세포에 황체형 호르몬 유도제를 작용시켜서 hLH를 산생시킴을 특징으로 하는 hLH의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 방법은 생체외에서 조직배양시키는 경우와는 달리 hLH의 유도산생량이 증대할뿐만 아니라 고가의 혈청을 함유하는 영양배지가 세포증식용으로 전혀 필요없거나 극미량으로 족하며, 또한 세포증식중의 배지의 유지관리가 지극히 용이하다는 장점을 갖는다.
특히 hLH산생능을 갖는 인체 유래세포는 어느것이든지 인체이외의 온혈동물 체내에 이식시켜 이들동물로부터 공급되는 영양체액을 이용하거나 또는 이들 세포를 영양체액이 공급되도록 고안된 확산챔버내에 현탁시키고, 또 이들 동물을 통상의 방법으로 사육해서 이들 세포를 용이하게 증식시킬 수 있다.
또한 본 발명은 세포증식이 보다 안정되고, 세포증식속도가 보다 증대하며, 또 세포당 hLH산생량이 증대함을 그 특징으로 하고 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 인체 유래의 세포는 hLH산생능을 갖고 있고 또한 인체 이외의 온혈동물의 체내에 이식하여 용이하게 증식시킬 수 있는 것이면 어떠한 세포라도 사용할 수 있다.
예를들면 인체 하수체전엽의 호염기성선종세포, 또는 이를 EB비루스 또는 X-선 조사등에 의해 형질변환시킨 세포, 또는 하수체 전엽 호염기성세포 선종의 환자로부터 수득된 호염기성종양세포등과 같이 본래 hLH상생능을 갖고 있는 인체유래세포와 이소성(異所性) 산생능을 갖는 인체 폐암세포;와 이들 세포를 배양주화(培養株化)시킨 세포등을 사용하는 것이 본 발명에서는 유리하다.
또한 폴리에틸렌글리콜 또는 센다이 비루스와 같은 약품을 이용하는 세포융합이나, 또는 DNA라가아제, 제한효소(nuclease)와 DNA폴리머라아제등의 효소를 이용하는 유전자 조환방법 등에 의하여 이들 세포의 hLH산생능을 갖는 유전자를 도입시킨 보다 용이하게 계대(繼代)배양할 수 있는 배양주화시킨 인체 림파아세포의 사용으로 이들 세포를 인체 이외의 온혈동물에 이식하는 경우, 세포증식속도가 현저하게 증가할 뿐만 아니라 세포당 hLH산생능이 약 2내지 10배, 또는 그 이상으로 증대해서 편리하다.
더우기 전술한 배양주화시킨 인체 림파아세포를 온혈동물체에 이식할 경우에는 분리가 용이한 거대한 종양을 형성하게 되며, 또 이들 종양은 숙주동물의 세포와 혼합되기 매우 어렵기 때문에 증식된 생존 인체 림파아세포를 용이하게 채취할 수가 있다.
본 발명에서 사용할 수 있는 동물로는 그 체내에서 이들 세포가 증식될 수만 있다면 어떠한 동물이라도 사용할 수 있다. 예를들면, 달 또는 비들기와 같은 조류; 또는 개, 고양이, 원숭이, 염소, 돼지, 소, 말, 토끼, 기니아피그, 쥐, 햄스터, 생쥐, 누우드마우스와 같은 포유류를 사용하는 것이 본 발명에서는 유리하다.
이들 동물에 인체 유래의 세포를 이식하면 바람직스럽지 못한 면역반응을 일으킬 염려가 있기 때문에 신생기 또는 유아기동물; 또는 란(卵), 배(胚) 또는 태아등과 같은 가능한한 유년기 단계의 동물을 사용하는것이 바람직하다. 이들 면역반응을 감소시키기 위해서, 세포이식 이전에 이들 동물을 약 200내지 600램의 X-선 또는 γ-선을 조사 처리한거나 또는 항혈청 또는 공지방법에 따라 제조한 면역억제 등을 주사하여 전처리를 행할 수도 있다.
인체 이외의 온혈동물로 누우드마우스를 사용하는 경우 성장한 것을 사용하더라도 약한 면역 반응을 나타내기 때문에 배양주화된 인체유래의 세포는 어느 것이든지 이같은 전처리를 행할 필요가 없이 동물체내에 이식해서 급속히 증식시킬 수 있다.
또, 인체 유래의 세포를 예컨데 우선 햄스터에 이식하여 증식시킨 후 이 세포를 다시 누우드마우스에 이식해서 목적물을 수득하는 경우와 같이 상이한 인체 이외의 온혈동물의 조합을 사용, 이식을 반복함으로서 인체 유래의 세포증식을 보다 안정화하고, 또 이로부터 산생되는 hLH산생량을 증가시킬 수 있다. 이때 반복되는 이식은 동종간(同種間), 동속간(同屬間)은 물론 동강간(同綱間), 동문간(同門間)의 동물로사 행할 수 있다.
인체 유래의 세포를 이식할 수 있는 부위는 이식한 인체유래세포가 증식될 수 있는 부위라면 동물의 부위라도 상관없다. 예를들면 뇨액강(尿液腔), 정맥, 복강, 피하등을 자유롭게 선택할 수 있다.
또 직접 동물체내에 인체 유래의 세포를 이식하지 않고 숙주세포의 확산챔버내 혼입을 방지하며, 또 이들 동물이 그 영양체액을 이들 세포에 공급할 수 있는 다공성 여과막, 예를들면 공직경(孔直徑) 약 10-7내지 10-5를 갖는 다공성 박막필터, 한외여과막 또는 중공(中空) 섬유등을 갖춘 각종 형태와 크기의 공지 확산챔버를 동물체내, 예컨데 복강내에 매설하여 동물체조부터 공급되는 영양체액을 사용하면서 hLH산생능을 갖는 공지의 배양주화시킨 인체 유래 세포는 어느 것이든지 용이하게 증식 시킬 수 있다.
또 필요한 겅우에는, 동물체내의 체액이 챔버내로 순환할 수 있도록 확산챔버를 예를들어, 숙주동물체 표면에 부착해서 이 챔버벽에 구비한 측면 투명창을 통해서 확산챔버내의 세포현탁액을 관찰할 수 있도록 하고, 또 이 확산챔버를 설계할 수 있기 때문에, 숙주동물을 도살하지 않고도 동물수명기간중의 세포증식을 보다 높은 수준으로 증가시킬 수 있으며, 또 동물당산생량이 보다 증대될 수 있다.
더우기, 이같은 확산챔버를 사용할 때에는 인체 유래의 세포가 숙주동물 세포와 직접 접촉하지 않기 때문에 증식된 인체 유래 세포만을 용이하게 채취할 수 있을뿐만 아니라 바람직하지 않은 면역반응을 일으킬 염려도 없어서 본 발명에서는 면역반응을 억제하는 전처리 없이도 인간 이외의 각종 온혈동물을 자유로히 숙주동물로 이용될 수 있다.
인체 유래세포를 이식한 숙주동물의 사육은 이들 세포 이식후에도 종래방법에 따라 용이하게 진행시킬 수 있으며, 또 별도의 특별한 취급을 요하지 않는다.
인체 유래세포의 최대증식은 세포이식 약 1내지 20주후에 달성할 수가 있다. 동물에 이식된 배양주화시킨 인체유래 세포가 인체 종양세포 또는 인체 림파아세포인 경우에는 이들의 세포증식속도가 유별나게 커서 세포의 최대증식은 세포이식 약 1내지 5주후에 달성할 수가 있다.
본 발명에 따라 숙주당 수득되는 인체 유래의 세포수는 약 107내지 1012, 또는 그 이상에 달한다.
환언하면 동물체내에 이식된 인체 유래세포의 수는 약 102내피 107배 또는 그 이상 증가되거나, 또는 영양배지를 사용하는 생체의 조직배양 방법으로 수득되는 세포수의 약 10내지 106배 또는 그 이상으로 증가함으로서 이들 세포는 hLH산생용으로 편리하게 사용된다.
hLH 유도방법으로는 전술한 방법에 따라 수득된 인체유래세포가 hLH를 산생시킬수만 있다면 어떤 방법을 사용하든 상관없다.
예를들면, 복강내 복수에서 부유상태로 증식시킨후 복수로부터 채취하거나 또는 피하에서 형성된 거대한 종양을 적출한 후 이 종양을 분해 채취하여 수득된 증식 인체 유래세포를 약 20내지 40℃로 유지한 영양배지에 세포농도가 약 104내지 108세포/ml가 되도록 현탁시키고 또 이어 황체형성 호르몬 유도제와 동일 온도에서 약 1-50시간 작용시켜 hLH를 유도 산생시킨다.
황체형성 호르몬 유도제의 예로는 리신, 아르기닌, 트립토판, 류우신 및 카사미노산과 같은 아미노산, 염화나트륨, 염화칼륨, 염화칼슘 또는 황산마그네슘과 같은 무기염류, 황체형성 호르몬 방출호르몬과 같은 호르몬을 들 수 있다.
또 본 발명에 따라 인체 황체형성 호르몬 이외에 인체 난포자극 호르몬(이후 hFSH로 약칭한다)과 같은 기타 호르몬을 동시에 산생시킬수도 있다.
이같이 하여 유도산생된 hLH는 염석, 투석, 여과, 원심분리, 농축 및 동결건조와 같은 공지의 정제분리 방법으로 용이하게 채취할 수 있다.
또한 보다 정제된 hLH제제를 필요로 하는 경우에는 예를들면 이온교환체의 흡착·탈착, 겔여과, 친화성 크로마토그래피, 동전점분획 및 전기영동과 같은 공지의 방법을 전술한 공지방법과 조합시킴으로서 최고순도의 제제를 수득할 수 있다. 이같이 하여서 수득한 hLH제제는 단독으로 또는 다른 1종 또는 2종 이상의 약제와 결합시켜서 예를들면 주사약, 외용약, 내복약 및 진단약등으로 인체 질환의 예방과 치료에 유리하게 이용될 수 있다.
전명세서를 통해서 hLH산생량은 A.R. Midgley, Jr., Endocrinology, Vol. 79, 10내지 18페이지(1966)에 기술된 방사면역 분석시험법에 따라 측정하고, 또 국제단위(IU)로 표시하였다.
또한 동시에 산생된 hFSH산생량은 C. Faiman, R.J. Ryan, J. Clin. Endocrinol. Metab., Vol.27, 444-447페이지(1967)에 기재되어 있는 방사면역 분석시험에 따라 측정하고 또 국제단위(lU)로 표시하였다.
본 발명의 몇가지 실시태양을 다음에 기술하였다.
[실시예 1]
성정한 누우드마우스 피하에 하수체 전엽호염기성 세포선종의 환자로부터 적출, 세절, 분산시켜서 수득된 인체호염기성 종양세포를 이식한 후 통상의 방법으로 4주간 사육하였다. 피하여 형성수득된 거대한 종양 약 10g을 적출하여 세절한 후 트립신 함유생리식염수 용액에 현탁시켜 세포를 분산시켰다.
이들 세포를 태아송아지 혈청 10v/v%을 보충한 Earle배지 199(pH 7.2)로 세정한 후, 황체형성 호르몬 유도제로서 L-아르기닌을 30mM함유하는 새로이 조제한 동일 배지에 세포농도 약 105세포/ml가 되도록 재현탁 시키고, 또 37℃에서 15시간 배양하여 hLH를 유도산생 시킨다.
이들 세포를 초음파 처리하고 상등액중의 hLH를 측정하였다. hLH산생량은 세포현탁액 1ml당 약 400mIU이었다.
이 상등액에 동시 생성된 hFSH산생량은 세포현탁액 1ml당 약 500mIU이었다.
인체 오염기성 종양세포를 태아송아지 혈청 10v/v%를 보충한 Earle배지 199(pH 7.2)중에서 37℃로 생체의 배양시켜서 수득된 대조용 세포를 전술한 방법과 유사하게 처리해서 hLH를 유도산생시켰다.
hLH산생량은 세포현탁액 1ml당 단지 약 70mIU에 불과하였다.
[실시예 2]
하수체 전엽 호염기성세포 선종의 환자로부터 적출하고, 세절, 분산시켜서 수득된 인체 호염기성 종양세포와 인체백혈병 림파아구 나말바세포(Namalva cell)를 140mM 염화나트륨, 54mM 염화칼륨, 1mM NaH2PO4와 2mM염화칼슘을 함유하는 염류용액이 들어 있는 용기내에 상응세포 농도가 약 103세포/ml가 되도록 현탁시켰다. 얼음냉각한 이 세포현탁액을 미리 자외선으로 불활성화시킨 센다이 비루스를 함유하는 새로이 조제한 전술한 동일 염류용액과 혼합하고 약 5분후에 37℃배양기로 옮겨서 약 30분간 교반 세포융합을 행하여 인체 호염기성 종양세포의 hLH산생능을 인체 림파아구 세포에 도입시켰다.
hLH산생능을 갖는 이들 잡종세포균주를 선행방법에 따라 분리한 후에 이들 잡종세포균주를 성장한 누우드마우스 복강내에 이식하고 또 통상의 방법으로 5주간 사육하였다. 수득된 거대한 종양 약 15g을 적출하고 또 30mm L-아르기닌을 약 10mg의 황체 형성호르몬 방출호르몬으로 치환시킨 이외에는 실시예 1과 유사하게 처리해서 hLH를 유도산생시켰다. hLH산생량은 세포현탁액 1ml당 약 1400mIU있다. 상등액에 동시 산생된 hFSH산생량은 세포현탁액 1ml당 약 1600mIU였다.
대조실험을 세포융합시킨 인체 백혈병 림파아구 나말바 세포를 생체의 배양하고 또 이들 증식된 인체 유래세포를 황체형성 호르몬 유도제와 작용시켜서 실시예 1에서와 유사하게 진행시켰다.
hLH 산생량은 세포현탁액 1ml당 단지 약 90mIU에 불과하였다.
[실시예 3]
신생아와 햄스터에 토끼로부터 공지방법에 따라 제조한 항혈청을 주사한 후, 실시예 2의 방법과 유사하게 인체 호염기성 종양세포의 hLH산생능을 도입시킨 인체 림파아구 JBL세포를 이들 동물피하에 이식하고 또 이에 통상의 방법으로 3주간 사육하였다.
피하에 생성된 거대한 수득종양 약 10g를 적출해서 실시예 1에서와 유사하게 처리하여 hLH를 유도산생시킨다.
hLH산생량은 세포현탁액 1ml당 약 1,300mIU였다. 동시 생성된 hFSH산생량은 세포현탁액 1ml당 약 1,500mIU였다.
대조실험을 융합시킨 인체 백혈병 림파아구 JBL세포를 생체의 배양시키고, 또 이들 증식 인체 유래세포를 황체혈청 호르몬 유도제와 작용체켜서 실시예 1에서와 유사하게 진행시켰다.
hLH산생량은 세포현탁액 1ml당 단지 약 80mIU에 불과하였다.
[실시예 4]
신생아 쥐의 정맥내에 실시예 2의 방법과 유사하게 인체 호염기성 종양세포의 hLH산생능을 도입시킨 인체 백혈병 림파아구 나말바(Namalva) 세포를 이식한후 통상의 방법으로 4주간 사육하였다.
생성된 거대한 종양 . 40g을 적출하고 또 실시예 2에서와 유사하게 처리해서 hLH를 산생시켰다.
hLH산생량을 세포현탁액 1ml당 약 1,000mIU였다. 대조실험은 융합시킨 인체 백혈병 림파아구 나말 바세포를 생체의 배양시키고, 또 이 증식된 인체유래세포를 황체형성 호르몬 유도제와 작용시켜서 실시예 1에서와 유사하게 진행시켰다. hLH산생량은 세포현탁액 1ml당 단지 약 70mIU에 불과하였다.
[실시예 5]
성장한 생쥐에 약 400램의 X-선을 조사하여 생쥐의 면역반응을 약화시킨 후 그 피하에 실시예 1의 방법과 유사하게 수득한 인체 호염기성 종양세포를 이식하고 또 이어 통상의 방법으로 4주간 사육하였다.
3주간 피하에 형성수득된 거대한 종양 약 15g을 적출하고 실시예 2에서와 유사하게 처리해서 hLH를 유도산생시켰다. hLH산생량은 세포현탁액 1ml당 약 500mIU였다.
대조실험은 인체 호염기성 종양세포를 생체의 배양시키고, 또 이 증식된 인체 유래세포를 황체형성 호르몬 유도제와 작용시켜서 실시예 1에서와 유사하게 진행시켰다.
hLH산생량은 세포현탁액 1ml당 단지 약 500mIU에 불과하였다.
[실시예 6]
실시에 3의 방법과 유사하게 인체 호염기성 종양세포의 hLH산생능을 도입시킨 인체 백혈병 림파아구 JBL세포를 생리식염수 용액에 현탁시키고 또 이것을 공직경(孔直徑) 약 0.5마이크론의 박막필터를 설치한 내용적 약 10ml의 플라스틱제 원통형 확산챔버내로 이송시켰다.
성장한 쥐 복강내에 이 챔버를 매설한 후에 이 쥐를 통상의 방법으로 4시간 사육한 후 이 확산챔버를 들어냈다.
상기 조작에 의해 수득된 챔버내의 인체유래세포 농도는 약 2×109세포/ml로서 이 값은 탄산가스 배양기중에서 생체의 배양하는 경우 수득하는 값의 약 103배 또는 그 이상에 해당하였다. 이같이 수득된 인체유래세포를 실시예 2와 유사하게 처리하여 hLH를 유도산생시켰다.
hLH산생량은 세포현탁액 1ml당 약 1,600mIU였다. 동시에 생성된 hFSH산생량은 세포현탁액 1ml당 약 1,300mIU였다.
대조실험은 융합시킨 인체백혈병 림파아구 JBL세포를 생체외 배양시키고 또 이 증식된 인체유래세포를 황체형성호르몬 유도제와 작용시켜 실시예 1에서와 유사하게 진행시켰다.
hLH산생량은 세포현탁액 1ml당 겨우 약 80mIU에 불과하였다.
[실시예 7]
실시예 3의 방법과 유사하게 인체 호염기성 종양세포의 hLH산생능을 도입시킨 인체백혈병 림파아구 JBL세포를 37℃에서 5일간 미리 배양시킨 닭의 수정란에 이식하였다. 이들 수정란은 37℃에서 1주간 추가로 배양한 후에 증식된 인체유래세포를 채취하였다. 이같이 수득한 세포를 실시예 1과 유사하게 처리하여 hLH를 유도산생시켰다. hLH산생량은 세포현탁액 1ml당 약 1,200mIU였다.
대조실험은 융합시킨 인체백혈병 림파아구 JBL세포를 생체의 배양시키고, 또 이 증식된 인체유래세포를 황체형성호르몬 유도제와 작용시켜서 실시 예 1에서와 유사하게 진행시켰다. hLH산생량은 세포현탁액 1ml당 겨우 약 80mIU에 불과하였다.

Claims (1)

  1. 인체 황체형성 호르몬(hLH)생산능을 갖는 인체 하수체 전엽유래의 종양성 호염기성세포, 나말바(Namakva)세포 또는 제.비.엘(JBL)세포를 누우드마우스, 햄스터, 쥐, 생쥐 또는 닭의 체내에 이식하거나 또는 이들 동물의 체액을 공급받을 수 있는 공직경(孔直徑)약 0.5미크론의 멤브레인막이 설치된 내용적 약 10ml의 챔버를 사용해서 증식시키고, 이 증식세포에 L-아르기닌 또는 황체형성호르몬 방출호르몬을 작용시켜서 분자량 약 29,000의 인체 황체형성호르몬을 생산시킴을 특징으로 하는 인체 황체형성호르몬의 제조 방법.
KR1019810003047A 1980-08-27 1981-08-21 인체 황체형성 호르몬의 제조방법 KR860000900B1 (ko)

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