JPS6030656B2 - ヒトｔ細胞増殖因子の製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトＴ細胞増殖因子の製造方法に関する。

ヒトＴ細胞増殖因子（以下、ｈＴＣＧＦという）は、ヒ
ト血清から調整されるヒトＴ細胞の増殖促進作用を示す
ホルモン様の蛋白性物質で、ヒト細胞増殖促進因子の一
種である。

Ｔ細胞は、生体内で、例えば遅延型アレルギー、腫場免
疫などの細胞性免疫をつかさどっている重要なりンパ球
である。

ｈＴＣＧＦは、このような働きを有するヒトＴ細胞の増
殖を促進し、活性化することから、インビトロでのＴ細
胞増殖促進剤として利用されるだけでなく、例えば、端
息、悪性腫傷などにおける疾患の治療研究のための医薬
、さらにはそれら疾患の免疫療法剤などしての利用が期
待されており、その大量製造方法の確立が望まれいる。

Ｔ細胞増殖因子は、成松久「Ｔ細胞増殖因子（ＴＣＧＦ
）とその応用ト代謝、Ｖｏｌ．１７、第２０６３〜２０
７刀頁（１９８ぴ王）の記載から明らかなように、別名
インターロイキンともいわれ、その作用には種依存性が
見られない。ヒト疾患の治療に際し、ヒト以外の動物細
胞由来のＴＣＧＦを使用することも考えられるが、アナ
フアキシーショツクなどの好ましいからＳＩる抗原抗体
反応が懸念される。

従って、ヒトの治療に供するには、ヒトの生細砲由来の
ｈＴＣＧＦを使用するのが安全であり、優れている。

ｈＴＣＧＦの調製材料としては、従来からヒト血清が知
られている。

しかしながら、ヒト血清はヒトの新鮮血から分離して調
整されるものであり、その保存も困難であることから、
大量に安価に供給することは極めて困難である。このよ
うな理由から、ヒト疾患の予防や治療に使用し得るｈＴ
ＣＧＦの製造は、未だ工業的規模で実施されるまでに至
っていない。

本発明者は、工業的規模で容易に実施し得るｈＴＣＧＦ
の製造方法を鋭意検討した。

その結果・ｈＴＣＧＦ産生能を有するヒト由来の細胞を
ヒト以外の溢血動物を利用して増殖させて得た細胞は、
ィンビトロでの組織培養で得られる細胞よりもｈＴＣＧ
Ｆの産生が著しく高く、細胞当り約２〜ＩＭ音、または
それ以上にも達することを見いだした、本発明を完成し
た。

すなわち、本発明は、ｈＴＣＧＦ産生能を有するヒト由
来の細胞をヒト以外の溢血動物体内に移植、またはその
溢血動物の体液の供給を受けながら増殖させ、得られる
細胞からｈＴＣＧＦを産生させることを特徴とするｈＴ
ＣＧＦの製造方法に関するものである。

本発明の方法は、従来のィンビトロで組織培養する場合
と比較して、大量のｈＴＣＧＦを生成できるだけでなく
、高価な血清などを含む栄養塔地が不要、または大幅に
節約でき、更に細胞増殖中の維持管理も極めて容易であ
る。

すなわち、ｈＴＣＧＦ産生能を有するヒト由来細胞をヒ
ト以外の溢血動物体内に移植し、またはその動物の体液
の供給を受けることのできるチャンバーに収容し、通常
の飼育をすれば、溢血動物体から供給される栄養物を含
有する体液を利用してその細胞が容易に増殖しうるので
ある。

更に、インビトロで組織培養する場合と比較して、細胞
の増殖が安定していること、その増殖速度が大きいこと
、大量の細胞が得られること、更には細胞当りのｈＴＣ
ＧＦ産生量が大きいことが特徴である。

本発明で使用するヒト由来の細胞は、ｈＴＣＧＦ産生能
を有し、かつヒト以外の温血動物の体内に移植して容易
に増殖するものであればよい。例えば、ヒト末梢血細月
包、ヒト健臓細胞、ヒト局桃細胞、或いはヒト局桃自重
場細胞、ヒト肝臓癌細胞、ヒト肺癌細胞など、更にはこ
れら細胞を培養株化させたものなどが好適である。また
、培養株化された公知のヒト由来の細胞としては、例え
ば、組織培養Ｖｏｌ．６、第５２７〜５４６頁（１９８
０年）に記載されているＫＳ−５、ＭＯＬＴ−３、ＭＴ
−１、Ｍｏｎｏ−１、ＯＵＭＳ−１９などが適宜選択さ
れる。

また、これら細胞のｈＴＣＧＦ産生能を持つ遺伝子を例
えば、ポリエチレングリコールやセンダイウイルスはど
を利用する細胞融合の手段や、ＤＮＡリガーゼ、制限酵
素（ヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素を
利用する遺伝子組み換えの手段などによって、より容易
に継代培養しうる培養株化されたヒトリンパ芽球様細胞
に導入して使用することは、その増殖速度が大きいだけ
でなく、細胞当りのｈＴＣＯＦ産生能が約２〜１０倍、
またはそれ以上にも高まるので特に好都合である。

また、培養株化されたヒトリン芽球様細胞を利用すれば
、ヒト以外の溢血動物に移植する際、その宿主動物の細
胞と混りｌこくい鼓腫癌を形成し易く、摘出後の分散も
容易なので、ヒトリンパ芽球様生細胞だけを採取するの
にきわめて有利である。

このようなヒトリンパ芽球様細胞には、ヒト白血病もし
くはヒト悪性リンパ腹由来の細胞株が通しており、例え
ばナマルバ（Ｎａｍａｌｖａ）細胞、ＢＡＬＬ−１細胞
、ＮＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬＬ−１細胞、ＪＢＬ細胞な
どの公知ヒト由来細胞株が、特に有利に使用しうる。

本発明のｈＴＣＧＦの製造方法に使用する溢血動物は、
ｈＴＣＧＦ産生能を有するヒト由釆の細胞が増殖しうる
ものであればよく、例えば、ニワトリ、ハトなどの鳥類
、ィヌ、ネコ、サル、ャギ、ブタ、ウシ、ウマ、ウサギ
、モルモット、ラツト、ヌードラツト、ハムスター、普
通マウス、ヌードマウスなどの０甫乳類などが使用でき
る。

これら動物にヒト由来の細胞を移植すると、好ましくな
い免疫反応を起すおそれがあるので、その反応をできる
だけおさえるために、使用する動物は、できるだけ幼若
な状態、すなわち卵、豚、胎児、または新生期、幼少期
のものの方が好ましい。また、これら動物に例えば、約
２００〜６００レムのエックス線若しくはガンマ線を照
射するか、または抗血清若しくは免疫抑制剤などを注射
するなどの前処置をほどこして、免疫反応を弱めて移植
してもよい。

使用する動物がヌードマウスやヌードラツトなどの免疫
不全動物の場合には、成長したものであっても免疫反応
が弱いので、これらの前処置を必要とすることなく、培
養株化されたヒト由来の細胞が移植でき、急速に増殖で
きるので特に好都合である。また、ヒト由来の細胞を、
例えば先ずハムスターに移植し増殖させた後、この細胞
を更にヌードマウスに移植するなどのように、ヒト以外
の温皿動物間で移植して、ヒト由来の細胞の増殖をより
安全化したり、更にそれから生成されるｈＴＣＧＦ量を
増加させることも自由である。

この場合、同種間、同属間は勿論のこと同綱間、同門間
移植であってもよい。ヒト由来の細胞を移植する動物体
内の部位は、移植した細胞が増殖し得る部位であればよ
く、例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に選ばれ
る。

また、直接動物体内にヒト由来の細胞を移植することな
く、動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の猿過膜、例え
ば孔蓬約１０‐７〜１０‐５のを有するメンブランフィ
ルター、限外櫨過膜またはホローファィバーなどを設け
た公知の各種形状、大きさの拡散チャンバ−を動物体内
、例えば腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含む
体液の供給を受けつつ、そのチャンバー内で公知の培養
株化されたヒト由来の細胞を何れも増殖させることがで
きる。

また、必要に応じて、この拡散チャンバー内の栄養物を
含む体液を動物体内のそれと接続し漣流させるようにし
た拡散チャンバーを、例えば動物体表に取付け、拡散チ
ャンバー内のヒト由来の細胞の増殖状態を透視できるよ
うにすることも、また、この拡散チャンバー部分のみを
着脱交換できるようにして動物を屠殺せずに寿命一杯細
胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生産量を更に高め
ることもできる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト由来の細胞
のみが容易に採取できるだけでなく、好ましくない免疫
反応を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制する前処
置の必要もなく、各種温血動物を自由に利用できる特徴
を有している。

移植した動物の維持管理は「その動物の通常の飼育を続
ければよく、移植後と言えども特別の取扱いは何ら必要
としないので好都合である。

ヒト由来の細胞を増殖させるための期間は通常１〜２０
週である。移植する培養株化された細胞が種場細胞であ
るかりンパ芽球様細胞である場合には、その増殖速度が
特に大であり、通常１〜５週の期間で目的を達成するこ
とができる。このようにして得られるヒト由来の細胞数
は、動物個体当り約１０７〜１び２、またはそれ以上に
達することも見し、出した。換言すれば、本発明で使用
するｈＴＣＧＦの製造方法により増殖させたヒト由来の
細胞数は、動物個体当り移植した細胞数の約１ぴ〜１０
７倍、またはそれ以上にも達し、ィソピトロで栄養培地
に接種して増殖させる場合の約１び〜１ぴ倍、またはそ
れ以上にも達して、ｈＴＣＧＦの製造にはきわめて好都
合である。

このようにして増殖させたヒト由来の生細胞からｈＴＣ
ＧＦを産生させる方法は自由である。

例えば、腹腔内の腹水に浮遊状で増殖したヒト由来の細
胞を採取し、または皮下で増殖した腫癖を摘出し、分散
させた後探敬し、この細胞を約２０〜４０ｑｏに保った
栄養培地に細胞濃度が約１ぴ〜１ぴ／泌になるように浮
遊させてｈＴＣＧＦを産生させればよい。この際、必要
ならばｈＴＣＧＦ譲導剤を作用させてもよい。ｈＴＣＧ
Ｆ誘導剤は、溢血動物を利用して増殖させて得られるヒ
ト由来細胞からｈＴＣＧＦを誘導生成できる物質であれ
ば何でもよく、例えば、フイトヘマグルチニン、コンカ
ナバリンＡ、ポークウイードミトーゲン、リポポリサツ
カリド、エンドトキシン、多糖類、細菌などのミトーゲ
ンやウイルス、核酸、ポリヌクレオチドなどが適宜選択
される。，また、ｈＴＣＧＦ産生に際し、ｈＴＣＧＦ安
定剤を添加し、生成したｈＴＣＧＦの安定化を計ってｈ
ＴＣＧＦの収量を高めることも自由である。

このようにして誘導生成されたｈＴＣＧＦは、公知の精
製分離法、例えば、塩析、透析、猿過、遠心分離、濃縮
、凍結乾燥などを行なうことによって容易に精製分離し
、採取することができる。

更に、高度の精製を必要とする場合には、例えば、イオ
ン交換体への吸着・脱着、ゲル櫨週、ァフィニティクロ
マトグラフィー、等電点分画、雷気泳動などの公知の方
法を更に組も合わせればよく、最高純度のｈＴＣＧＦを
採取することも可能である。本発明により製造したｈＴ
ＣＧＦは、従来公知のヒト血清より調製したｈＴＣＧＦ
と免疫学的に差異がないことはもとより、発熱性物質や
肝炎ウイルスの混入もない。従って、ｈＴＣＧＦ単独で
、またはこれに例えば、ビタミン、ホルモン、抗癌剤な
どその他の一種もしくは二種以上の物質を含有せしめ、
内服薬、注射薬などしてヒト疾病の予防や治療に有利に
利用できる。なお明細書を通じてｈＴＣＧＦの活性は、
ＧｉｌｌｉｓＳ．ｅｔａｌ．、Ｊ．ｌｍｍｕｎｏｌ．、
Ｖｏｌ １２０、第２０２７〜２０３２頁（１９７８年
）に記載されている方法に準じて３Ｈ−チミジンの取り
込みを促進する活性量を測定した。

すなわち、ＢＡＬＢ／ｃマウスからの胸腺細胞をｗｅｌ
ｌ当り１００仏そ（１『個）ずつになるようにマイクロ
プレートにとり、これに段階的に希釈したｈＴＣＧＦ含
有液１００仏〆を加え、３７０で２８間インキュベート
した後３Ｈ−チミジンをｗｅｌｌ当り０．５ＡＣｉずつ
加え、４時間後に細胞内に取り込まれた３Ｈ−チミジン
量を液体シンチレーションカウンターで測定した。

ｈＴＣＧＦの活性単位は、測定値が５００比ｐｍになる
希釈倍数とした。以下、２〜３の実施例を挙げて更に詳
細に本発明を説明するが、この実施例は、本発明の好ま
しい実施態様の単なる例示にすぎず、本発明を何ら限定
するものでないことは言うまでもない。

実施例 １成長したヌードマウスの皮下に、ヒト末梢血
細胞を培養株化させたＭＴ−１細胞を移植した後、通常
の方法で３週間飼育した。

皮下に生じた腫癖約１０夕を摘出して細切した後、トリ
プシン含有生理食塩水に浮遊させ細胞を分散させた。こ
の細胞を血清無含有ＲＰＭＩ １６４０培地（ｐＨ７．
２）で洗浄した後、細胞濃度約１×１び／肌になるよう
に同培地に浮遊させ、３７ｏ０で３日間保ってｈＴＣＧ
Ｆを産生させた。

培養終了後、細胞浮遊液を約８００仇ｐｍで３び分間遠
心分離し得られる上清に含まれるｈＴＣＧＦの量を測定
したところ浮遊液１００仏夕当り約１６０山単位であっ
た。対照として、ＭＴ−１細胞を仔牛血清ｌｖ／ｖ％及
び肉エキス２Ｗ′ｖ％を含有するＢａｇｅ培地（冊７．
２）を用い３７００、ィンビトロで組織培養して得た対
照の細胞を用いて、前記同様にｈＴＣＧＦを産生せしめ
たところ浮遊液１００ムク当り約４瓜単位の産生量にす
ぎなかった。

実施例 ２ 鳥桃腫傷患者から摘出、細切、分散させた腫陽細砲とリ
ンパ芽球様ナマルバ細胞（ＮａｍａｌｖａＣｅｌｌ）と
を１４０ｍＭ ＮａＣ１、５４ｍＭ ＫＣ１、１ｍＭ
ＮａＨ２Ｐ０４、２ｍＭ ＣａＣ１２を含有する塩類溶
液にそれぞれ約１ぴ／叫になるように浮遊させ、これに
予め紫外線で不活化したセンダイウイルスを含有する前
記塩類溶液を、氷冷下で混合し、約５分後に３７ｏ０に
恒温水槽に移して、約３０分間縄拝しつつ細胞融合させ
、リンパ芽球様ナマルバ細胞にｈＴＣＧＦ産生能を導入
した。

このリンパ芽球様ナマルバ細胞を成長したヌードマウス
の腹腔内に移植した後、通常の方法で５週間飼育した。
生じた種癒約１５夕を摘出し、凧【当り１ムタのフィト
ヘマグルチニンを加えた培地を使用した以外は実施例１
と同様に処理してｈＴＣＧＦを産生せしめた。浮遊液１
００山そ当りのｈＴＣＧＦ産生量は約５８０山単位であ
った。対照として細胞融合させたりンパ芽球様ナマルバ
細胞を実施例１と同様にィンビトロで組織培養して得た
細胞を用いて、ｈＴＣＧＦを産生せしめたところ、浮遊
液１００仏そ当り約９山単位の産生量にすぎなかった。

実施例 ３ ハムスター新生児にウサギから公知の方法で調製した抗
血清を予め注射し、ハムスターの免疫反応を弱めた後、
その皮下に、実施例２の方法に準じてｈＴＣＧＦ産生能
を導入したりンパ芽球様ＪＢＬ細胞を移植し、その後通
常の方法で３週間飼育した。

生じた腫暦約１８夕を摘出し、ＲＰＭＩ １６４功者地
に代えて、肉エキス２仇′ｖ％を含有するＥａｇｅ堵地
（ｐＨ７．２）を用いたこと及び叫当り５０仏夕のコン
カナバリンＡを加えた培地を用いたこと以外は実施例１
と同様にしてｈＴＣＧＦを産生させた。

浮遊液１００ム〆当りのｈＴＣＧＦ産生量は約１２０山
単位であった。対照として細胞融合させたりンパ芽球様
訂ＢＬ細胞を実施例１と同様にィンビトロで培養増殖さ
せ、次いでｈＴＣＧＦを産生せしめたところ、浮遊液１
００仏〆当り約１５０単位の産生量にすぎなかった。実
施例 ４ ラット新生児の静脈内へ、リンパ芽球様ナマルバ細胞の
代りにリンパ芽球様ＢＡＬＬ−１細胞を用いた以外実施
例２と同様にしてｈＴＣＧＦ産生態を導入したりンパ芽
球様ＢＡＬＬ−１細胞を移植し、通常の方法で４週間飼
育した。

生じた腫櫨約３５夕を摘出し、実施例２と同様に処理し
てｈＴＣＧＦを産生せしめた。

浮遊液１００りそ当りのｈＴＣＧＦ産生量は約５３０山
単位であった。これに対して、対照としてインビトロで
培養増殖させ、ｈＴＣＧＦを産生せしめたものは、浮遊
液１００仏そ当り約１１の単位の産生量にすぎなかった
。実施例 ５成長した普通マウスに、約４００レムのガ
ンマ線を照射してマウスの免疫反応を弱めた後、その皮
下にヒト末梢血細砲を培養株化させたＭｏｎｏ一１細胞
を移植し、その後通常の方法で４週間飼育した。

皮下に生じた腫癖約２０夕を摘出し、実施例３と同様に
処理してｈＴＣＧＦを産生せしめた。

浮遊液１００仏そ当りのｈＴＣＧＦ産生量は約３５０■
筆位であった。これに対して、対照としてィンビトロで
培養増殖せしめ次いでｈＴＣＧＦを産生させたものでは
、浮遊液１００メタ当り約３山単位の産生量にすぎなか
つた。

実施例 ６ 孔径約０．５ミクロンのメンブランフィルターを設けた
内容量約１０の‘のプラスチック製円筒型拡散チャンバ
−内に、実施例１で用いたＭＴ−１細胞を生理食塩水に
浮遊させ、これを成長したラットの腹腔内に埋設した。

このラツトを通常の方法で４週間飼育した後、この拡散
チヤンバーを取り出した。これにより得られたヒト由釆
の細胞は、約１ぴ／私にも達し、インビトロの炭酸ガス
ィンキュベーター中で培養する場合の約１ぴ倍以上にも
達することが判明した。こうして得た細胞を実施例３と
同様に処理してｈＴＣＧＦを産生せしめた。

浮遊液１００山夕当りのｈＴＣＧＦ産生量は約３２０の
筆位であった。実施例 ７予め３７０で５日間保温して
おいたニワトリの受精卵に実施例４の方法でｈＴＣＧＦ
産生能を導入したりンパ芽球様ＢＡＬＬ−１細胞を移植
し、次いで３７０に１週間保った。

この卵を割卵して増殖細胞を採取し、実施例１と同様に
処理してｈＴＣＧＦを産生せしめた。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ ヒトＴ細胞増殖因子産生能を有するヒト由来の細胞
   をヒト以外の温血動物体内に移植し、またはその温血動
   物の体液の供給を受けながら増殖させ、得られる細胞か
   らヒトＴ細胞増殖因子を産生せしめることを特徴とする
   ヒトＴ細胞増殖因子の製造方法。 ２ ヒトＴ細胞増殖因子を産生せしめるに際し、得られ
   る細胞にヒトＴ細胞増殖因子誘導剤を作用せしめること
   を特徴とする特許請求の範囲第１項記載のヒトＴ細胞増
   殖因子の製造方法。