KR830001817B1 - 타이프ⅱ 인터페론의 제조방법 - Google Patents

타이프ⅱ 인터페론의 제조방법 Download PDF

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Abstract

내용 없음.

Description

타이프Ⅱ 인터페론의 제조방법
본 발명은, 인퍼페론(interferon)중에서도 타이프 II 인터페론의 제조방법에 관한 것이다.
인터페론은, 고바야시 시게야스(小林茂保)저작 인터페론 1975년 주식회사강담사 발행 : 디. 에이. 제. 티렐(D.A.J. Tyrrell)저작 "인터페론과 이것의 임상치료 가능성" 1976; 웰리암 헤이네만(William Heinemann)의학 서적주식회사(런던)발행, "단백질, 핵산, 효소", 제21권 제4호(1976) 등에도 기재되어 있는 바와같이, 예를 들면, 비루수, 세균, 원충(原忠), 리켓치아, 핵산, 내독소 및 다당류 등의 인터페론 유도제를 생세포에 작용시켜서 그 세포의 내외에 유도하여 생성되는 단백질같은 물질인데, 그 세포내에서의 각종 비루스의 증식을 비특이적으로 억제하는 기능을 가지는 물질로 주어진 명칭이다.
인터페론이 가지는 이와같은 기능으로 인하여 인터페론은 이것을 발견한 당초부터 비루스성 질환의 예방제, 치료제로서 기대되어 왔다.
또 근년에, 인터페론은 리부스성 종양 뿐 아니라, 비 비루스성 종양에 대하여도 종양성이 인정받게 되어서 의약품으로서의 인터페론에 큰 기대를 가지기에 이르렀다.
인터페론에는, 생세포가 비루스에 노출되어서 생성되는 분자량 약 1-3만의 타이프 I 인터페론(별명 고전적 인터페론)과 임파세포가 유사분열물질에 의하여 자극되거나, 또는 항원에 대응하여 생성하는 분자량 약 4-7만의 타이프 II 인터페론(별명, 면역 인터페론)이 있는 것을 알게되었다.
"생물학 및 약제에 관한 텍사스 보고서" 제35권(1977년 미국, 텍사스, 갈베스튼, 텍사스 외과대학 지부에서 발행)의 제42면에 엘. 비이. 엡스타인(L.B. Epstcin)이 기술한 바와같이, 타이프 II 인터페론은 엄밀한 조건(pH 2이하 pH 10이상, 온도 56℃이상)하에서는 타이프 I 인터페론보다도 덜 안정한 것이 알려졌다.
그러나, 타이프 II 인터페론은 면역반응과 밀접한 관련이 있으므로, 타이프 I 인터페론보다도 인터페론 감수성 질환에 대한 예방효과, 치료효과가 큰것이 기대된다.
인터페론은, 종(種)특이성이 높아서 사람의 질환을 예방 또는 치료하기 위해서는 사람의 생세포에서 생성되는 인터페론이 아니면 효과가 없다.
종래부터, 타이프 II 인터페론의 조제에 사용되어온 사람의 생세포에는 백혈구가 있다.
그러나, 백혈구는 사람의 신선한 피에서 분리하여 조제하는 것이므로 이것의 보존도 곤란하고, 대량으로 염가로 공급하는 것은 극히 곤란한 것이다. 이와같은 이유에서, 사람의 질환의 예방이나 치료에 사용할 수 있는 타이프 II 인터페론의 제조는 아직 공업적 규모로 실시되기 까지에 이르지 못하였다.
본 발명자들은, 공업적 규모로 용이하게 실시할 수 있는 타이프 II 인터페론의 제조방법을 검토하고, 이 타이프 II 인터페론이 타이프 II 인터페론 감수성 질환의 예방제, 치료제로서 유용한 것인가를 예의 연구하였다.
그 결과 타이프 II 인터페론 생산능력을 가진 배양주화(培養株化)된 인간의 세포를 생체의(시험관 내에서) 영양배지에 이식하여 중식시키는 것은 아니고 그 세포들을 인간 이외의 온혈동물에 이식하거나, 또는 동물체내에 또는 동물에 부착되어 그 세포들이 그 동물의 영양체액을 이용하여 증식 할수 있도록 고안된 필터막 삽입 확산살에 채워진 배지에 접종하여 상기의 인간 이외의 온혈동물의 체액이나 확산실내의 체액을 이용하여 이식 또는 접종된 세포들이 증식되도록 하고, 증식된 세포들을 생체내에서 또는 시험관내에서 타이프 II 인터페론 유도체에 노출시켜 타이프 인터페론을 유도한 후, 유도된 타이프 II 인터페론을 정제 및 분리함으로써 다량의 고역가의 타이프 II 인터페론을 용이하게 얻을 수 있다는 것을 발견하였으며, 그와같은 방법으로 제조된 타이프 II 인터페론은 타이프 II 인터페론 감수성 질환의 치료 및 예방제로서 탁월하다는 것도 알게 되었다.
본 발명에서 사용되는 타이프 II 인터페론의 제조방법은 셍세포를 생체의(시험관내)에서 증식 시키는 경우와는 달라서 고가인 혈청 등을 포함하는 영양배지가 불필요하고, 또는 대폭으로 절약할 수 있을뿐 아니라 세포증식중의 유지관리도 극히 용이하고 그외에 유도하여 생성되는 타이프 II 인터페론 활성이 높은 특징을 가진다.
즉, 배양주화된 사람 본래의 세포를 사람 이외의 온혈동물의 체내에 이식하고 또는 이 동물의 체액의 공급을 받을 수 있는 확산실내에 수용하고 이 확산실을 동물체내에 매설하여 보통 사육을 하면, 온혈동물체에서 공급되는 영양물을 함유하는 체액을 이용하여 그 세포가 용이하게 증식할 수 있는 것이다.
또한 생체의(시험관내)에서 증식 시키는 경우와 비교하여, 이 세포의 증식이 안정되어 있는 것, 그 증식속도가 빠른 것, 얻어지는 세포량이 많은 것, 그외에 세포 당(當) 타이프 II 인터페론의 수량이 현저하게 증가하는 것도 큰 특징이다.
본 발명으로 사용하는 타이프 II 인터페론의 제조방법에 사용하는 배양주화된 사람 본래의 세포는, 사람 이외의 온혈동물 체내에 이식하여 용이하게 증식할 수 있고, 그외에 타이프 II 인터페론 생산능력을 가진 것이면 적당하여, 예를들면, "단백질, 헥산, 효소 제23권 제6호" 제697-711면(1978)에 보고되어 있는 HPB-ALL세포 MOLT 3세포, P12/이찌가와 세포, HPB-MLT세포, P8/세끼세포, JBL세포, HCL세포, P10/시바다세포 등과, "임상세균학지 제1권" 제116-제117면(1975)에 보고되어 있는 나말바(Namalva)세포와 아이.미요시(I. Miyoshi)저작 "자연 제267권" 제843-844면(1977)에 보고되어 있는 BALL-1세포, TALL-1세포, NALL-1세포 등이 자유로 사용되는데, 본 명세서에 기재하는 주화(株化)세포만이 한정시키는 것은 아니다.
이들의 세포는 후에 기술하는 타이프 II 인터페론을 유도하여 생성시킬때 까지의 과정에서 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 자유로 사용된다.
특히, 타이프 II 인터페론의 제조에 사용되는 본래의 세포가 백혈구 특히 임파구일 때는 전술한 배양주화된 인간세포에 부가해서 B 임파구(B세포) 및 T 임파구(T세포)를 함유하는 세포혼합의 사용은 유도타이프 II의 인터페론의 작용을 보다 더 증진시킬 수 있다.
필요하면 배양주화된 인간세포에 신선한 사람의 피로 제조된 백혈구를 혼용한다.
본 발명에서 사용하는 타이프 II 인터페론의 제조방법에 사용하는 온혈동물은, 사람 본래의 세포가 증식할 수 있는것이면 무관하여 예를 들면, 닭, 비둘기 등의 조류, 개, 고양이, 원숭이, 산양, 돼지, 소, 말, 토끼, 모르모므, 쥐, 헴스터(hamster), 보통 생쥐, 누우드 생쥐 등의 토유류 등이 사용된다.
이들 동물에 인간의 세포를 이식하면 반갑지 않은 면역 반응을 인으킬 염려가 있으므로 이러한 반응을 될수 있는대로 억제하기 위해 사용하는 동물은, 될수있는 대로 어린 것, 즉 알, 배, 태아 또는 신생기, 유아기의 것이 적당하다.
또 이들 동물에 예를들어, 200-600렘(rem)정도의 엑스선 혹은 감마선을 조사하거나 또는 항혈청 또는 면역 억제제 등을 주사하는 등의 사전 처치를 실시하여 면역반응을 약하게 하여 이식하여도 무방하다.
사용하는 동물이 누우드 생쥐인 경우에는, 성장한 것이라도 면역 반응이 약하므로 이들의 사전처치를 필요로 하지 않고 배양주화된 사람 본래의 세포가 이식되어 급속하게 증식할 수 있으므로 특히 적합하다.
또 배양주화된 인간의 세포를 예를 들면, 먼저 햄스터에 이식하여 인간의 세포의 증식을 더 안정화 하거나, 또는 이들로부터 유도하여 생성되는 타이프 II 인터페론의 량을 증가시키는 것도 자유이다.
이 경우, 동종간(同種間), 동속간(同屬間)은 물론이고 동강간(同綱間), 동문간(同門間)이식이라도 무방하다.
배양주화된 인간세포를 이식하는 동물체내의 부위는 이식한 세포가 증식할 수 있는 부위 이면에 적합하여, 예를 들면 복강내, 정맥내, 피하, 요막강 등에 자유로 선택할 수 있다.
직접 인간 이외의 온혈동물체내에 배양주화된 인간세포를 이식하여 증식시키는 대신에, 상기의 세포들을 예를 들면 복강내에 삽입되고 세포들의 체액을 이용할 수 있도록 고안된 종래의 형태의 확산실내의 인간 이외의 온혈동물의 영양체액에 접종하여 증식시킬 수도 있다.
본 발명에서 이용될 수 있는 확산실은 여러가지 형태와 크기를 가질 수 있으며 세포들의 누출을 막기 위해 예를 들면 막필터, 한외필터 및 공동섬유와 같은 필터막이 삽입되어 있어야 한다.
특히, 구멍크기가 약 10-7내지 10-5m인 필터막이 삽입되어 있는 확산실이 바람직하다.
만약 필요한다면 동물의 양양체액이 확산실을 통해 순환하고 접종된 배양주화된 인간세포들의 발육을 확산실 벽에 설치한 투명한 창을 통해 관찰할 수 있도록 확산실은 예컨대 동물의 체표에 부착될 수 있도록 고안될 수 있다.
또한, 이 확산실 부분만을 작탈 교환할 수 있게 하여 동물을 도살하지 않고 수명이 다할 때까지 세포를 증식 시켜서 동물개체당의 세포 생산량을 더 높일 수도 있다.
이들의 확산실을 이용하는 방법은, 인간의 세포가 동물세포와 직접 접촉하지 않으므로 인간의 세포만이 용이하게 채취될 수 있을 뿐만 아니라 면역 반응을 일으킬 염려도 극히 낮으므로 면역 반응을 억제하는 전처리 없이도 각종 온혈동물을 자유로 이용할 수 있는 특징을 가지고 있다.
본 발명에 따른 방법에서는 배양주화된 인간세포들을 이식할 동물은 일반적인 방법으로 사발될 수 있고 세포를 이식한 후에도 특별한 취급을 전혀 필요로하지 않는 편리함이 있다. 의식된 배양주화된 인간세포를 증식시키기 위한 기간은 보통 약 1-10주의 기간으로 목적을 달성할 수가 있다.
증식된 인간 세포수는 동물 개체량 약 107-1012또는 그 이상에 달하는 것도 발견하였다.
환언하면, 본 발명의 방법에 의해 동물의 체내 또는 확산실에 이식 또는 접종하여 증식한 세포의 수는 동물개체당 이식한 세포수의 약 102-107배, 또는 그 이상에도 달하고 생체 외의 영양 배지에 접종하여 증식시키는 경우의 약 101-106배, 또는 그 이상이므로 본 발명에 따른 타이프 II 인터페론을 제조방법이 극히 유리하다.
타이프 II 인터페론의 유도를 위해서는 그 방법으로 증식된 인간의 생세포들에서 타이프 II 인터페론을 유도할 수 있는한 어떠한 방법이라도 이용될 수 있다.
세포들은 그것들이 증식되는한 타이프 II 인터페론 유도제의 작용에 노출시킬수도 있다.
예들 들면 복강내의 복수(腹水)에 부유상으로 증식한 인간의 세포에 또는 피하에 생긴 종양세포에 타이프 II 인터페론 유도제를 그것들의 증식된 생체내에서 직접 작용시키고 유도된 타이프 II 인터페론을 정제하여 복수 또는 종양에서 타이프 II 인터페론을 분리할 수 있다.
또는 반대로 증식된 인간세포를 동물체내에서 단리한 후, 생체외에서 타이프 II 인터페론을 유도제를 작용시켜서 타이프 인터페론을 유도할수도 있다.
예를 들면, 복수로 부터 채취한 증식된 인간 세포 또는 피하에 생긴 종양을 적출(摘出)하여 분산하여 얻어진 세포를 약 20-40℃로 유지된 영양배지에 세포농도가 약 205-108/ml이 되게 부유시키고, 이거에 타이프 II 인터페론 유도제를 작용시키고 유도된 타이프 II 인터페론을 정제하고 분리한다.
또한, 사람 본래의 세포를 확산실 내에서 증식시킨 경우는 증식시킨 세포를 확산실 내에서 그대로 또는 확산실에서 들어내어 타이프 II 인터페론 유도제를 작용시키어 타이프 II 인터페론을 유도하여 생성 시킬 수 있다.
또, 타이프 II 인터페론을 유도하여 생성할시에, 필요하면, 예를 들어, 사람에 종특이성이 높을 인터페론을 사용하여 프라이밍(Priming)방법 및 또는 대사 저해제를 사용하는 슈퍼인덕션법등의 공지된 방법을 채용하여서 생성하는 타이프 II 인터페론의 량을 더 높일수도 있다.
또 예를 들면, (1) 증식시킨 세포들에 먼저 등골체 내에서 그대로 타이프 II 인터페론 유도제를 작용시켜 타이프 II 인터페론을 유도하고 계속하여 그 동물개체의 특정한 부위 또는 전체에서 채취한 후 동물체외에서 타이프 II 인터페론 유도제를 작용시켜 타이프 II 인터페론을 유도하는 방법, 또 (2) 타이프 II 인터페론의 생성에 이미 1차 사용한 또는 여러번 사용한 인간세포들을 타이프 II 인터페론 유도제의 작용에 생체내 또는 생체외에서 노출시켜 상기 인터페론을 유도하는 방법 또는 (3) 동물 체내에 매설 또는 접속하는 확산실를 교환하여 얻어지는 세포수를 증가시키는 방법 등의 방법에 의하여 사용하는 동물 개체당의 타이프 II 인터페론 생산량을 더 높일 수도 있다.
타이프 II 인터페론 유도제로서는 보통으로 예를들면, 피토헤마 글루티닌, 콘카나발린 A, 폭크워이드리토겐, 리포다당류, 내독소, 당당류 및 박테리아 등의 유사분열물질이 적당한 것이다.
또, 감작화(感作化)된 세포에 대해서는 항원도 타이프 II 인터페론 유도제로서 작용한다. 상기의 타이프 II 인터페론 유도제는 보통으로 약 0.001㎍∼10mg/ml의 농도로 사용된다.
예를 들면, 비루스, 핵산, 폴리누클테오리드 등의 타이프 I 인터페론 유도제 타이프 II 인터페론 유도제와 병용 함으로써 유도되는 타이프 II 인터페론의 량을 더 증가시킬 수도 있으며 또한 타이프 I 인터페론과 타이프 II 인터페론을 동시에 생성시킬 수도 있다.
이와같이 하여 유도된 타이프 II 인터페론은, 공지된 정제분리법, 예를들면 염석, 투석, 여과, 원심분리, 농축, 동결건조 등을 행하여서 용이하게 정제 및 분리할 수가 있다.
또, 고도의 정제를 필요로 하는 경우에는, 예를 들면 이온교환체에 의한 흡착 및 탈착, 겔여과, 친화성 크로마토그라피, 등전검분별 및 전기영 등등의 공지된 방법을 상기의 방법과 병용하여 최고 순도의 타이프 II 인터페론을 얻을 수 있다.
사람에 종특이성이 높은 타이프 I 및 타이프 II 인터페론의 활성은,「단백질 핵산 및 효소」(1975년 발행, 제20권 제6호 제616면 내지 제643면)에 기재되어 있는 사람의 양막 세포를 사용하는 종래 플라아크 반감법으로 측정되었다.
적혈구 응집 단위는 제이.이.솔크(J. E. Salk)저작 면역학지 제49권 87-98(1944)의 방법에 준하여 측정하였다.
다음에, 타이프 II 인터페론 생산에 관한 실험 A를 기술한다.
〔실험 A〕
생체의(시험관내) 또는 생체내에서 증식된 세포의 인터페론 생산능.
실험 A-1, 생체의(시험관내)에서의 증식
BALL-1세포를 20%의 소(牛)태아 혈청으로 보충한 RPMI-1640배지(pH 7.2)에 접종하여, 37℃에서 부유배양 하였다.
증식된 세포를 혈청 무첨가의 RPMI-1640배지(pH 7.2)로 세정하고 그와 같은 조성의 새로운 배지에 세포농도가 약 1×106/ml로 되게 현탁하였다.
실험 A-II 생체 내에서의 증식
신생햄스터에, 토끼로부터 공지된 방법으로 조제한 항혈청을 미리 주사하여 햄스터의 면역 반응을 약하게 한 후 이것의 피하에 BALL-1세포를 이식하고, 그후 보통방법으로로 3주간 사육한다.
피하에 생긴 종양을 적출하여 세절한 후 트립신을 함유한 생리식 염수에 현탁하여 증식된 세포를 수집한다.
얻어진 세포를 혈청 무첨가의 RPMI-1640배지(pH 7.2)에서 세정하고 그와 같은 조성의 세로운 배지에 세포 농도가 약 1×106/ml가 되도록 현탁 한다.
실험 A-III 인터페론의 생산
실험 A-1, A-II에서 얻은 세포농도가 약 1×106/ml인 BALL-1세포에 현탁액을 피토헤마글루티닌 및 또는 센다이 비루스에 노출시켜 인터페론을 유도한다.
좀더 상술하면 피로헤마글루티닌을 단독으로 사용하는 경우에는 현탁액에 피토헤마글루티닌을 ml당 약 100㎍을 첨가하여 37℃로 3일간 배양하여, 인터페론을 유도한다.
또, 센다이 비루스만을 사용하는 경우에는 현탁액 ml당 약 300적혈구 응집 단위의 비율로 첨가하여 37℃로 1일간 배양하여 인터페론을 유도한다.
또, 피토헤마글루티닌과 센다이 비루스를 병용하는 경우에는, 현탁액에 피토헨마글루티닌을 ml당 약 100㎍을 첨가하여 37℃로 2일간 배양한 후, 이것에 센다이 비루스를 ml당 약 300적혈구 응집 단위의 비율로 첨가하여 37℃로 1일간 다시 배양하여 인터페론을 유도한다.
이와같이 하여 얻은 인터페론을 함유하는 현탁액을 원심 분리하고 이것의 상청액을분리(cut-off) 분자량 6,000의 한의필터로 농축하고 계속하여 이 농축액을 텍스트란겔로 분자량에 따라 분류하고 분자량 약 25,000의 타이프 I 인터페론과 분자량 약 50,000의 타이프 II 인터페론의 활성을 측정하여 배양한 현탁액 1ml 당의 인터페론 활성을 평가한다.
결과는 제1표에 나타덴다
[제1표]
Figure kpo00001
(주의) 배양하여 측정된 총인터페론 활성은 현탁액 1ml당의 단위로 표현된 것이며, 각 제조법에 대한 타이프 II 인터페론의 활성은 괄호안에 표시하였다.
제1표의 결과에서 명백한 바와같이, 생체 외에서 증식시킨 세포에서는 소량의 인터페론의 유도되는 반면 생체내에서 증식시킨 세포에서는 다량의 인터페론이 유도된다.
또, 생체내 뿐만 아니라 생체 외에서 증식된 세포는 센다이브루스에 노출시키는 경우에 타이프 I 인터페론을 생산한다.
그러나 생체 내에서 증식시킨 세포를 사용하는 경우가 생체 외에서 증식시킨 세포를 사용할 때보다 약 4배나 높은 활성이 얻어진다.
또, 인터페론 유도제가 피토 헤마글루티닌 단독 또는 센다이 비루스 단독의 경우에 유도되는 인터페론 활성과 피토헤마글루티닌과 센다이 비루스를 병용하는 경우에 유도되는 인터페론 활성에 착안하면, 생체내에서 증식시킨 세포를 사용한 경우에는 타이프 I 인터터페론, 타이프 II 인터페론의 어는것이든지 인터페론 유도제의 상승효과가 현저하게 인정된다.
특히 피토 헤마글루티닌과 센다이 비루스를 병용하여 유도되는 타이프 II 인터페론은, 피토 헤마글루티닌 단독으로 유도되는 타이프 II 인터페론에 비해 약 28배나 높은 활성을 갖는다.
그러하나, 생체 외에서 증식시킨 세포를 사용한 경우에는 상승효과가 거의 인정되지 않는다.
다음에 타이프 II 인터페론의 몇가지 제조 예를 기술한다.
타이프 II 인터페론의 제조 예 1.
성장한 누우드 생쥐의 피하에, 배양주화된 인간의 BALL 1세포를 이식한 후, 보통 방법으로 3주간 사육한다.
피하에 생긴 약 10g의 종양을 적출하여 세절한 후, 트립신을 함유한 생리 식염수에 현탁하여 세포를 분산 분취한다.
이 세포를 5v/v%의 사람의 혈청을 함유하는 pH 7.2의 이이글(eagle)의 최소 기본 배지로 세정하고 37℃의 동일한 조성의 새로운 배지에 세포 농도가 약 5×10ml로 되게 희석하고, 이것에 부분 정제한 사람의 종 특이성이 높은 인터페론을 약 100단위 ml의 비율로 가하여서 약 2시간 배양한다.
이 혼합물에 피토 헤마글루티닌을 약 200㎍/ml의 비율로 가하고 3일간 배양하여서 타이프 II 인터페론을 유도하여 생성시켰다.
이것을 약 4℃, 약 1000×g으로 원심분리하고, 세포부스러기 등의 침전물을 제거하여서 얻어진 상청액을 0.01M 인산염 완충액으로 pH 7.2로 완충한 식염수로 24시간 투석하고 필터막으로 조심스럽게 여과하여 얻은 타이프 II 인터페론 함유여액을 농축하고 동결 건조하여 분말을 얻었다.
분말상의 타이프 II 인터페론의 활성은, 누우드 생쥐 1마리 약 1,500,000단위이었다.
타이프 II 인터페론의 제조 예 2.
성장한 누우드 생쥐의 복강내에 배양주화된 인간의 TALL-1세포와 BALL-1세포를 이식한 후 보통 방법으로 5주간 사육한다.
이 복강내에 피토헤마글루티닌 1mg을 주입하고 24시간후에 또 약 3000적혈구응 집단 위의 뉴우캐슬 병비루스를 자외선에 의하여 미리 거의 불활성화 시켜서 주입하고, 24시간 후에 도살하여 복수를 채취한다.
이것을 4℃, 약 1,000×g으로 원심분리하여 세포 부스러기 등의 침전물을 제거하고 얻어진 상청액을 0.01M인산염 완충액으로 -pH 7.2로 완충한 생리 식염수로 15시간 투석하고, 필터막으로 조심스럽게 여과 및 농축하여 인터페론을 함유하는 농축액을 얻었다.
농축액의 총 인터페론활성은 누우드 생쥐 10마리 당 약 800,000단위이고, 이중에서 타이프 II 인터페론활성은 약 300,000 단위이었다.
타이프 II 인터페론 제조 예3.
신생 헴스터에 토끼로부터 공지된 방법으로 조제한 항혈청을 미리 주사하여, 햄스터의 면역 반응을 약하게 한 후 이것의 피하에 배양주화된 인간의 JBL세포를 이식하고 그후에 보통방법으로 4주간 사육한다.
피하에 생긴 약 30g의 종양을 적출한 후, 제조에 1과 동일한 방법으로 세포를 분산한다.
이 세포를 10v/v% 송아지의 혈청을 함유한 pH 7.4의 RPMI 1640배지에서 세정한후, 37℃의 동일한 조청인 배지에 세포농도가 약 2×10/ml로 되게 현탁한다.
이것에 부분 정제한 사람에게 종특이성이 높은 타이프 II 인터페론을 약 200단위/ml의 비율로 가하고 약 1시간 배양한후 콘카나발린(Concanaualin)를 500g/ml의 비율로 가하여 3일간 배양하고 또 센다이 비루스를 약 300적혈구 응집 단위 /ml의 비율로 가하고 16시간 배양하여 인터페론을 유도한다.
이후에 그 혼합물을 제조 예 2와 같이 필터막으로 조심스럼게 정제하고 농축하여 인터페론을 함유하는 용액을 얻었다. 용액의 총 인터페론 활성은 햄스터 1마리당 약 17,000,000단위인데, 이중에 타이프 II 인터페론 활성은 약 6,000,000단위이었다.
타이프 II 인터페론 제조 예 4.
신생 쥐의 정맥내에 배양주화된 인간의 나말바(namalva)세포를 이식한 후 보통 방법으로 4주간 사육한다.
피하에 생긴 약 50g의 종양을 적출한 후 제조 예 1과 동양으로 하여 세포를 분산시켰다.
계속하여 피토 헤마글루티닌의 대신 마루야마(九山)왁진을 약 ㎍/ml의 비율로 가한 것을 제외하고는 제조 예 1과 같이 처리하여 타이프 II 인터페론을 유도하고 유도된 타이프 II 인터페론을 제조 예 1과 같이 정제하고 타이프 II 인터페론을 함유하는 생성된 용액을 동결 인조하여 분말로 만들었다.
분말의 타이프 II 인터페론 활성은 쥐 1마리당 약 8,000,000단위 이었다
타이프 II 인터페론 제조 예 5.
성장한 보통 생쥐에 약 400렘의 엑스선을 미리 조사하여 생쥐의 면역반응을 약하게 한 후, 이 생쥐의 피하에 배양주화된 인간의 TALL-1세포를 이식하고 그 후, 보통방법으로 3주간 사육한다
피하에 생긴 약 10g의 종양을 적출하여 잘게썬후 제조 예 1과 같이하여 종양세포를 분산한다.
이 세포를 제조 예 3과 같이 처리하여 인터페론을 유도한다. 유도된 인터페론을 제조 예 2와 같이 정제하고 농축하여 인터페론을 함유하는 농축액을 얻었다.
농축액의 총인터페론 활성은, 보통생쥐 1마리당 약 9,000,000 단위이고 이 중에 타이프 II 인터페론은 약 3,000,000단위이었다.
타이프 II 인터페론 제조 예 6.
배양주화된 인간의 MOLT-3세포를 먼저 헴스터의 피하에 제조 예 3의 방법으로 이식하고, 3주간 사육하여 세포를 증식한다.
계속하여 생후 10일의 누우드 생쥐의 복강내에 증식된 세포를 이식하고, 이 누우드 생쥐를 보통 방법으로 5주간 사육한 후, 마취하여 복수를 채취하고, 원심분리하여 증식한 세포를 얻는다.
이 세포를 제조 예 1의 방법으로 세정하고 처리하여 타이프 II 인터페론을 유도하고 유도된 타이프 II 인터페론을 제조 예 2와 같이 정제하고 농축하여 타이프 II 인터페론을 함유하는 농축액을 얻는다.
농축액의 타이프 II 인터페론 활성은, 누우드 생쥐 1마리 당 약 500,000단위이었다.
타이프 II 인터페론 제조 예 7.
구멍크기가 약 0.5미크론의 막 필터를 삽입한 용적 약 10ml의 플래스틱제 원통형 확산실 안에, 배양 주화된 인간의 JBL 세포를 생리 식염수로 부유시키고 이것을 성장한 쥐의 복강내에 매설한다.
이 쥐를 보통 방법으로 4주간 사육한 후, 이 확산실을 들어 내었다.
확산실내에서 중식된 인간세포의 세포 농도는 약 5×109/ml이며 그것은 생체밖의 영양배지에 탄산가스 배양기 중에서 증식 시키는 경우의 약 103배 이상에 해당한다.
이 세포에 인터페론 제조 예 6으로 얻은 MOLT-3세포를 얻어진 세포의 현탁액에 첨가하여 농도가 약 20v/v%되게하고 제조 예 1과 같이 처리하여 타이프 II 인터페론을 유도한다.
유도된 타이프 II 인터페론을 정제하여 농축하고 동결 건조하여 타이프 II 인터페론 활성을 가지는 분말을 얻는다.
분말의 타이프 II 인터페론 활성은, 쥐 1마리당 약 4,000,000단위이었다.
타이프 II 인터페론 제조예 8.
37℃로 5일간 예비 배양한 닭의 수정란의 요막강에 배양 주화된 인간의 NALL-1세포를 이식한 후 37℃로 1주간 배양한다.
이 알을 깬 후, 증식된 세포를 채취하고, 이 세포의 현탁액에 인터페론 제조 예 5에서 얻은 TALL-1세포를 같은 부피로 첨가하고 제조 예 1과 같이 처리하여 타이프 II 인터페론을 유도한다.
유도된 타이프 II 인터페론을 제조 예 2와 같이 정제하고, 농축하여서 타이프 II 인터페론을 함유하는 농축액을 얻는다.
농축액의 타이프 II 인터페론 활성은, 수정란 10개당 약 300,000단위이었다.
타이프 II 인터페론의 제조 예 9.
제조 예 1의 방법으로 조제한 타이프 II 인터페론 분말을 지, 보도(G. Bodo)의 보고서("인터페론의 제조, 표준화 및 임상 사용에 관한 심포지움" 유고슬라비아, 자그렙, 1977, 6월 8일 및 9일 개최, 제11회 국제 면역생물학의 심포지움)에 기술한 바와 같이 이온교환기에 의한 흡착 및 탈착 분자량에 따른 겔여과에 의한 분류, 농축 및 정밀 여과등의 종래의 방법에 의하여 pH 4 내지 9의 범위에서 다시 정제한다.
비활성(泌活性)이 단백질 1mg당 2×106단위인 고순도 인터페론을 수율 약 40%로 얻었다.

Claims (1)

  1. 타이프 II 인터페론 생산능을 가진 배양 주화된 인간의 세포를 사람 이외의 온혈동물 체내에 이식하거나 또는 동물체내에 또는 동물에 부착되어 그 동물의 영양체액을 이용하여 거기에 접종된 세포들이 증식할 수 있도록 고안된 필터 -막-삽입 확산실에 채원진 배지에 접종하여 상기의 인간이외의 온혈동물의 체액이나 확산실내의 체액을 이용하여 이식 또는 접종된 세포들이 증식되도록 하고 증식된 세포들에 타이프 II 인터페론 유도제를 생체 내에서 또는 생체 외에서(시험관 내에서) 작용시켜 타이프 II 인터페론을 유도한 후, 유도된 타이프 II 인터페론을 정제 및 분리하는 것을 특징으로 하는 타이프 II 인터페론의 제조방법.
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