KR0157227B1

KR0157227B1 - 암 전이 억제인자의 제조방법

Info

Publication number: KR0157227B1
Application number: KR1019900007373A
Authority: KR
Inventors: 마사시 구리모도; 류우이찌 모도다; 간소오 이와끼
Original assignee: 하야시바라 겐; 가부시기 가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가구 겡규우죠
Priority date: 1989-05-22
Filing date: 1990-05-22
Publication date: 1998-10-15
Also published as: EP0401997A1; DE69022121D1; US5126148A; GR3018004T3; DK0401997T3; RU2070046C1; JP2926409B2; DE69022121T2; JPH02308799A; CA2017279A1; EP0401997B1; ES2080114T3; KR900018379A; ATE127527T1

Abstract

내용 없음.

Description

암전이 억제인자의 제조방법

본 발명은 암전이 억제인자(metastasis - inhibitory factor ; 이하, 간단히 MIF 라 함)의 제조방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 배양 주화된 인체 조혈기관 유래의 세포를 사용하여 암전이 억제인자(MIF)를 산생시켜, 이것을 채취하는 것을 특징으로 하는 암전이 억제인자(MIF)의 제조방법에 관한 것이다.

일본국 평균수명은 해마다 늘어나서 일본국 통계연감(제37판, 1987년)에 의하면, 일본국 소화 60년의 평균수명은 남자가 74.78세 이고 여자가 80.48세 였다. 사인의 제1위는 암이고, 사망자의 약 25%를 차지하고 있다.

암의 치료법은 주로 외과적 수술, 화학 요법, 방사선 요법 등이 실행되고 있다. 그러나 이러한 방법에 의하여 대부분의 치료는 할수 있겠으나, 일부의 살아 남은 암세포가 환자의 체내에 분산하여 암전이를 촉진하여 보다 중독한 전이암을 초래하여 도리어 수명을 단축하는 경우까지도 있다.

이러한 암전이를 억제할 수 있다면, 암환자의 고통을 완화하여 나머지 수명을 대폭 연장시킬 수 있는 것으로 암전이 억제방법의 개발을 몹시 열망하여 왔다.

상술한 바와 같이 암전이 억제방법의 개발이 요망되고 있다. 암전이 억제방법으로서 암전이 억제인자의 탐색과, 그 인자의 공업적 제조방법을 확립하고자 하는 것이다.

본 발명자등은 공업적 규모로 용이하게 실시할 수 있는 암전이 억제인자의 탐색과, 그 인자의 공업적 제조방법의 확립을 목적으로 예의 연구를 거듭하여 왔다.

그 결과, 인체 대장암 유래의 배양 주화 세포 RPMI 4788(미생물 공업 연구소 조례기생충 제2429호 : FERM BP - 2429)를 이용하는 전이 억제 활성으로 탐색하므로써 암전이 억제인자를 탐색할 수 있음을 발견하고, 더욱이 암전이 억제인자 산생능을 지닌 배양 주화된 인체 조혈기(造血器) 유래의 세포를 이용하여 암전이 인자를 산생시켜, 이것을 채취함에 따른 암전이 억제인자의 제조방법을 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명에서 말하는 배양 주화된 인체 조혈기 유래의 세포라 함은 예컨대, 단백질, 헥산, 효소 제20권, 제6호 제616 - 643페이지(1975년), JCRB 카탈로그(1988년), ATCC 카탈로그(1988년) 등에 기재되어 있는 인체 조혈기 유래의 세포를 적당히 선택할 수 있다.

배양 주화된 인체 조혈기 유래의 세포로서는 예컨대, T-세포, B-세포, non T - non B 세포, 골수 단구계 세포 등으로 분류되는 세포가 적절히 선택되며, 특히 예컨대 CCRF-CEM, GPB-MLT, MOLT-3, MOLT-4, P12/ICH, TALL-1 등의 T-세포가 높은 암전이 억제인자 산생능을 지니고 있어 공업적으로 제조함에 있어서 우수하다.

또한, 이들 세포의 암전이 억제인자 산생능을 지닌 유전자를, 예컨대 폴리에틸렌 글리코올이나 센타이 비루스 등을 이용하는 세포 융합의 수단 또는 DNA 리가아제, 제한효소(뉴클레아제), DNA 폴리메라아제 등의 효소를 이용하는 공지의 유전자 재조합 수단 등에 의하여, 보다 용이하게 계대(繼代) 배양할 수 있는 배양 주화된 세포에 도입하여 그 증식속도를 더욱 높이는 것도, 또 그 암전이 억제인자 산생능을 더욱 높이는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 배양 주화된 인체 조혈기 유래의 세포를 증식시키는 방법은 적당히 선택할 수 있다. 예컨대 암전이 억제인자 산생능을 가진 인체 조혈기 유래의 세포를 영양배지에 접종하여 증식시키는 생체외 조직 배양법이나, 암전이 억제인자 산생능을 가진 인체 조혈기 유래의 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나, 또는 인간 이외의 온혈동물의 체내 혹은 체외에 부착한 확산체임버 내에 이식하여, 그 체액의 공급을 받으면서 증식시키는 생체 내에서 하는 방법 등이다.

우선 생체외에서 증식시키는 경우에 대하여 설명한다.

이때 사용하는 영양배지는 인체 조혈기 유래의 세포를 접종하여 증식할 수 있는 것이면 좋고, 예컨대 RPMI 1640 배지 및 이이글 최소 기본배지 등이 있는데, 필요에 따라서 다시금, 비타민, 무기물, 탄수화물, 아미노산 및 포유류의 혈청 등을 보충하여 개량할수도 있다.

배양방법은 단층배양법 또는 부유배양법을 적당히 선택할 수 있다.

배양온도는 약 20 - 40℃, 바람직하게는 약 35 - 38℃이고, 접종량은 접종 후 약 1주간 이내에 최대 세포발육을 달성할 수 있는 배지 1㎖ 당의 세포수로 하는데, 바람직하게는 배지 1㎖ 당 약 10⁴- 10⁷개이다.

세포를 접종한 배지를 상기한 조건에서 약 4 - 10일간 배양하고, 이 동안에 배지를 정기적으로 신선한 것과 바꾸어주어 영양물을 충분히 보급함과 아울러 배지속에 방출된 대사산물을 세정 또는 희석하여 증식시키는 것이 바람직하다.

다음에 생체내에서 세포를 증식시키는 방법에 대하여 설명한다.

이 방법에서는 암전이 억제인자 산생능을 가진 배양 주화된 인체 조혈기 유래의 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하거나, 또는 그 체액의 공급을 받을 수 있는 체임버내에 수용하여 통상의 사육을 하면, 온혈동물의 체내에서 공급되는 영양물을 함유하는 체액을 이용하여 그 세포가 용이하게 증식할 수 있기 때문에, 체외에 있어서의 조직배양과 같이 값비싼 혈청 등을 함유하는 영양배지를 사용하지 않거나 또는 대폭 절약하여도 대량의 암전이 억제인자를 생성시킬 수 있다.

즉, 인간 이외의 온혈동물을 이용하는 방법은 세포증식중의 유지관리가 용이하다는 것은 물론이고 생체외에서 배양하는 경우와 비교하여 안정하게 세포를 증식시킬 수 있는 외에도 세포당의 암전이 억제인자 산생량이 증대한다는 것, 특히 2 - 10배, 또는 그 이상으로도 높아지므로 극히 유리하다.

이 방법에서 사용하는 온혈동물은 배양 주화된 인체 조혈기 유래의 세포가 증식할 수 있는 것이면 좋으며, 예컨대 닭, 비둘기 등의 조류, 개, 고양이, 원숭이, 산양, 돼지, 소, 말, 토끼, 기니아 피그, 쥐, 햄스터, 생쥐, 누우드 마우스 등의 포유류 등을 사용할 수 있다.

이들 동물에 인체 조혈기 유래의 세포를 이식하면 바람직하지 않은 면역 반응을 일으킬 우려가 있으므로, 그 반응을 가급적 억제하기 위하여 사용하는 동물은, 될수 있는 한 어린 상태, 즉, 알, 배아, 태아, 또는 신생기, 유소기의 것일수록 좋다.

또한, 이들 동물에 예컨대 약 200 - 600 rem 정도의 X - 선 또는 γ- 선을 조사하거나, 혹은 항혈청 또는 면역 억제제 등을 주사하는 등의 사전처치를 하여, 면역반응을 약화시켜 이식하여도 좋다.

사용하는 동물이 누우드 마우스인 경우에는 성장한 것이라도 면역 반응이 약하므로, 이러한 사전처치를 할 필요 없이 배양 주화된 인체 조혈기 유래의 세포를 이식할 수 있고, 급속하게 증식할 수 있으므로 특히 편리하다.

또한, 배양 주화된 인체 조혈기 유래의 세포를, 예컨대 우선 햄스터에 이식하여 증식시킨 다음, 이 세포를 다시금 누우드 마우스에 이식하는 등과 같이 인간 이외의 온혈동물 사이에서 이식하여 인체 조혈기 유래의 세포의 증식을 보다 안정화한다거나, 더욱이 이들로 부터 유도 생성되는 암전이 억제인자량을 증가시키는 것도 자유이다.

이러한 경우에 있어서, 동종간, 동속간은 물론이고, 동강간, 동문간 이식이어도 좋다. 인체 조혈기 유래의 세포를 이식하는 동물체내의 부위는 이식한 세포가 증식할 수 있는 부위이면 좋은데, 예컨대, 뇨액강, 정맥, 복강, 피하 등을 자유로히 선택할 수 있다.

그리고, 직접 동물체내에 인체 조혈기 유래의 세포를 이식하는 일이 없이 동물세포의 통과를 저지할 수 있는 다공성의 여과막, 예컨대 구멍의 지름이 약 10^-7- 10^-5m인 멤브레인 필터, 한외여과막 또는 유공섬유(hollow fiber) 등을 설치한 공지의 각종 형상 및 사이즈의 확산 체임버를 동물 체내, 예컨대 복강 내에 매설하여 동물체로 부터의 영양물을 함유하는 체액의 공급을 받으면서 그 체임버 내에서 전술한 배양 주화된 인체 조혈기 유래의 세포를 어느 것이나 증식시킬 수 있다.

또한, 필요에 따라서는 이 체임버내의 영양물을 함유하는 용액물 동물체내의 체액과 접속하여 관류(灌流) 시키도록 한 체임버를 예컨대 동물체 표면에 부착하여, 체임버내의 인체 조혈기 유래의 세포의 증식상태를 투시할 수 있도록 하는 것도, 그리고 이 체임버 부분만을 착탈 교환할 수 있도록 하여 동물을 도살하지 않고도 수명이 다 할때까지 세포를 증식시켜 동물 개체당의 세포 생산량을 더욱 높일수도 있다.

이들 확산 체임버를 이용하는 방법은 인체 조혈기 유래의 세포가 동물세포와 직접 접촉하지 않으므로 인체 조혈기 유래의 세포만을 용이하게 채취할 수 있을뿐 아니라, 바람직하지 않는 면역반응을 일으킬 염려도 적으므로, 면역반응을 억제하는 사전처치의 필요도 없고, 각종 온혈동물을 자유로히 이용할 수 있는 특징을 지니고 있다.

이식한 동물의 유지관리는 그 동물의 통상의 사육을 계속하면 좋으며, 이식후라 하더라도 특별한 취급을 전혀 필요로 하지 않으므로 매우 편리하다.

인체 조혈기 유래의 세포를 증식시키기 위한 기간은 통상 약 1 - 10주의 기간으로 목적을 달성할 수 있다.

이와같이 하여 얻을수 있는 배양 주화된 인체 조혈기 유래의 세포수는 동물 개체당 약 10⁷- 10¹², 또는 그 이상에 달한다.

바꾸어 말하면, 인간 이외의 온혈동물을 이용하는 방법에 따라 증식시킨 인체 조혈기 유래의 세포수는 동물 개체당 이식한 세포수의 약 10²- 10⁷배, 또는 그 이상에도 달하며, 생체외의 영양배지에 접종하여 증식시킬 경우의 약 10¹- 10⁶배, 또는 그 이상에도 달하여 암전이 억제인자의 제조를 위하여 극히 합리적이다.

이와같이 하여 증식시킨 인체 조혈기 유래의 생세포를 이용하여 암전이 억제인자를 산생시키는 방법은 자유이다. 그것이 증식한 동물체내에서 그대로 암전이 억제인자 유도제를 작용시킬수도 있다. 예컨대 복강내의 복수에 부유상으로 증식한 인체 조혈기 유래의 세포에, 또는 피하에 발생한 종양세포에 암전이 억제인자 유도제를 직접 작용시켜서 암전이 억제인자를 유도 생성시킨 다음, 그 복수 또는 종양으로 부터 암전이 억제인자를 정제하여 채취하는 것이 좋다.

또, 인체 조혈기 유래의 세포를 동물체내로 부터 채취하여 생체외에서 암전이 억제인자 유도제를 작용시켜서 암전이 억제인자를 유도 생성시킬 수도 있다. 예컨대 복수속에서 증식한 인체 조혈기 유래의 세포를 채취하거나, 또는 피하에 발생한 인체 조혈기 유래의 세포를 함유한 종양을 적출, 분산하여 수득되는 세포를 약 20 - 40℃로 유지한 영양배지에서 세포농도가 약 10⁵- 10⁸/㎖가 되도록 부유시켜, 여기에 암전이 억제인자 유도제를 작용시킴으로써 암전이 억제인자를 유도 생성시키고, 이것을 정제하여 채취하면 된다.

더욱이 인체 조혈기 유래의 세포를 확산 체임버 내에서 증식시켰을 경우에는 증식시킨 세포를 체임버 내에서 그대로 또는 체임버로 부터 꺼내어 암전이 억제인자를 유도 생성시킬 수도 있다.

그리고, 예컨대 증식시킨 인체 조혈기 유래의 세포에 먼저 동물체내에서 그대로 암전이 억제인자를 유도 생성시킨 다음 동일한 동물개체의 특정한 부위 또는 전체로 부터 채취한 인체 조혈기 유래의 세포에 동물체외에서 암전이 억제인자를 유도 생성시키는 방법, 또한 한번 암전이 억제인자의 유도생성에 사용한 세포를 다시금 2번 이상 암전이 억제인자의 유도생성에 사용하는 방법, 또는 동물체내에서 매설, 혹은 접속하는 체임버를 교환하여 수득되는 세포수를 증가시키는 방법 등의 방법에 따라 사용하는 동물 개체당의 암전이 억제인자 생성량을 더욱 높이는 것도 자유이다.

암전이 억제인자 유도제로서는 통상 예컨대 피토헤마글루티닌, 콘카나발린 A, 아메리카자리공 유사분열물질(pokeweed mitogen), 리포폴리삭카리드, 리피드 A, 엔도톡신, 다당류, 세균, 비루스, 핵산, 폴리뉴클레오티드 등의 미토겐(mitogen)이 가장 적합하다.

이들 암전이 억제인자 유도제를 사용하였을 경우에는 통상 약 0.001㎍ - 10mg/㎖의 농도에서 사용된다. 필요하다면, 이들 유도제를 2종 이상 병용하여 암전이 억제인자량을 더욱 증가시키는 것도, 암전이 억제인자와 함께 그밖의 다른 림포카인을 동시에 생성시키는 것도 자유이다.

이와같이 하여, 유도 생성시킨 암전이 억제인자는 공지의 정제 분리법, 예컨대 염석, 투석, 여과, 원심분리, 농축, 동결 건조 등을 하므로서 용이하게 정제분리하여 채취할 수 있다. 더욱 고도의 정제를 필요로 하는 경우에는 예컨대, 이온 교환체에의 흡착·용출, 겔 여과, 친화성 크로마토그래피, 등전점 분획, 고속 액체 크로마토그래피, 전기영동 등의 공지의 방법을 조합하면 좋은데, 특히 모노클로날 항체를 이용한 크로마토그래피 등에 의해 최고순도의 암전이 억제인자를 채취할수도 있다.

이와같이 하여 수득한 암전이 억제인자는 암전이 억제인자 감수성 질환의 예방제, 치료제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

암전이 억제인자 감수성 질환이라 함은 암전이 억제인자에 의하여 예방 또는 치료되는 질환인데, 그것이 비루성 질환, 예컨대 유행성 결막염, 헤르페스성 각막염, 인플루엔저, 풍진, 혈청 간염, 에이즈 등이어도, 또한 비(非) 비루성 질환, 예컨대, 대장암, 폐암, 간암, 골육종 등의 악성 종양, 나아가서는 아토피성 알레르기, 중증 근무력증, 교원병(collagen disease), 악성 빈혈, 관절 류머티스, 전신성 에리데마토더스 등의 면역질환 등이어도 좋다.

또한, 암전이 억제인자 감수성 질환 예방제, 혹은, 치료제는 그 목적에 따라서 그 형상을 자유로히 선택할 수 있다. 그 한가지 예를 들면, 분무제, 점안제, 함수제, 주사제 등의 액제, 연고, 습찜질제(cataplasm)와 같은 페이스트제, 분제, 과립제, 캡슐제, 정제 등의 고제(固制) 등이다.

이러한 예방제, 치료제에는 암전이 억제인자를 통상적으로 1그램당 1 - 10,000,000 단위 정도의 활성을 함유시키면 좋고, 필요에 따라서 암전이 억제인자와 함께 그밖의 림포카인, 예컨대, 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 종양 괴사인자, 림포톡신, 인터로이킨 1, 인터로이킨 2 및 B-세포 분화인자 등의 암전이 억제인자 이외의 림포카인, 나아가서는 다른 천연 또는 합성의 화학치료제 등의 1종 또는 2종 이상을 유효성분으로 함유시켜, 그 예방 및 치료효과를 더욱 높이는 것도 유리하게 실시할 수 있다.

더욱 필요하다면, 보조제, 증량제 및 안정제 등의 1종 또는 2종 이상을 병용하는 것도 마음대로이다.

이와같이 하여 제조되는 본 발명의 암전이 억제인자 감수성 질환의 예방제, 치료제는 암전이 억제제로서 뿐만 아니라, 예컨대, 항비루스제, 항종양제로서, 또 항종양성 화학요법제의 항종양 효과 증강제, 악성종양의 재발 방지제, 면역 조절제, 면역질환 치료제 등으로서 유리하게 이용할 수 있다.

암전이 억제인자의 활성은 Naomoto 등이 문헌[Journal of Cancer Research Clinical Oncology, Vol. 113, pp. 544 - 549 (1987년)]에서 보고하고 있는 인체 대장암 유래의 배양주화 세포 RPMI 4788 (FERM BP - 2429)을 이용하는 폐 전이 유도방법에 준하여 누우드 마우스에 폐전이를 일으키게 함과 동시에, 여기에 암전이 억제인자 함유액을 투여하여 그 전이억제 활성을 구하였다.

즉, RPMI 4788 세포를 2 X 10⁶개 함유하는 생리 식염수 0.2㎖을 BALB/c 누우드 마우스의 꼬리 정맥에 주사하고, 그 다음날로 부터 암전이 억제인자 함유액 0.1㎖을 매일 10일간 꼬리 정맥에 주사하였다. 21일째에 도살하고, 폐표면에 전이한 RPMI 4788 세포의 결절(마디)을 염색하여 그 수를 계측한다. 대조로는 생리식염수를 사용하여 1회 시험액에 대하여 누우드 마우스 8마리씩 사용한다. 전술한 조건에서 대조의 발생 결절수가 100개 이상인 경우, 이 결절수를 1/2 로 감소하는 활성을 암전이 억제인자의 활성 1,000 단위로 한다. 단, 시험액은, 여기에 함유되는 인터페론-α, 인터페론-β, 인터페론-γ, 종양 괴사인자-α, 종양 괴사인자-β, 인터로이킨 1 및 인터로이킨 2의 활성을 각각의 모노클로날 항체로 제거하여 사용하였다.

적혈구 응집가는 문헌 [J. E. Salk, The Journal of Immunology, Vol. 49, pp. 87 (1944년)]에 기재된 방법에 준하여 측정하였다. 다음에 본 발명을 실험을 이용하여 상세히 설명한다.

[실험]

배양 주화된 인체 조혈기 유래의 세포의 암전이 억제인자

산생능의 비교

[실험 1]

생체외에서 증식시킨 세포에 의한 암전이 억제인자의 산생

소태아 혈청 20 v/v %를 보충한 RPMI 1640 배지(pH 7.2)에 배양 주화된 인체 유래의 각종 세포를 각각 접종하여 37℃에서 통상의 방법에 따라서 배양한 다음, 혈청을 첨가하지 않은 RPMI 1640 배지 (pH 7.2)에서 세정하여, 이 배지에 농도 5 X 10⁶/㎖가 되도록 현탁하였다.

이와같이 하여 수득한 인체 유래의 각종 세포현탁액 각각에 BCG를 1㎖ 당 10㎍을 가하고 37℃에서 1일 동안 유지하고, 여기에 리포폴리삭카리드를 1㎖ 당 1㎍을 가하고 다시 37℃에서 1일간 유지하여 암전이 억제인자를 유도시켜 원심분리한 다음, 상청액(supernatant)를 분획 분자량 6,000의 막(membrane)으로 50배로 농축하여 암전이 억제인자의 활성을 측정하고, 상청액 1㎖ 당의 활성을 산출하였다.

그 결과를 제1표에 종합하였다.

제1표의 결과로 부터 명백한 바와 같이, 배양주화된 인체 조혈기 유래의 각종 세포는 암전이 억제활성 산생능을 가지고 있다. 특히 T - 세포의 산생능이 많다는 것이 발견되었다. HPB - MLT 세포(FERM BP - 2430)는 암전이 억제인자 산생능이 높고 본 발명에 유리하게 이용할 수 있다.

[실험 2]

생체내에서 증식시킨 세포에 의한 암전이 억제인자의 산생

신생아의 햄스터에 토끼로 부터 공지의 방법으로 조제한 항혈청을 미리 주사하여, 햄스터의 면역을 약하게 한 다음, 그 피하에 배양 주화된 인체 조혈기 유래의 세포를 각각 이식한 후, 통상의 방법으로 3주간 사육하였다. 피하에 발생한 종양을 적출하여 잘게 절단한 다음, 트립신 함유의 생리 식염수에 현탁하여 세포를 분산시켜 채취하였다.

수득한 각각의 세포를 실험1과 마찬가지로 현탁액으로 하여 마찬가지로 활성을 측정하였다. 그 결과를 제2표에 종합하였다.

[실험 3]

암전이 억제인자의 부분정제

실험2의 방법으로 생체내에서 증식시킨 HPB - MLT 세포를 사용하여 실험1의 방법에 준하여 암전이 억제인자를 산생시켜 원심분리하였다. 그 상청액을 분획 분자량 6,000의 막을 사용하여 50배로 농축하고, 이것을 Pharmacia 사제의 겔 (상품명 PBE-94, 스웨덴국)을 사용하여 크로마토 포커싱 (chromato focusing)을 하여 pH 5 - 7의 암전이 억제인자 고함유 획분을 채취하고, Pharmacia 제의 겔 (상품명 Sephacryl S-200, 스웨덴국)을 사용하여 겔 여과 크로마토그래피를 하여 분자량 10,000 - 450,000의 암전이 억제인자 고함유 획분을 채취한 다음 농축하여 1㎖ 당 약 2,800,000 단위를 함유하는 부분정제액을 활성수율 약 60%로 수득하였다.

이 제품은 인체 대장암 유래의 RPMI 4788 세포의 폐장에의 전이억제 활성을 나타내었을 뿐만 아니라, 인체 대장암 유래의 LoVo (ATCC CCL 229)의 간장에의 전이억제 활성도 나타내었다.

이 제품은 암전이 억제인자로서 단독으로 사용하거나 또는 그밖의 림포카인, 화학요법제, 나아가서는 수술, 방사선 치료 등과 병용하여 암환자의 치료에 유리하게 이용할 수 있다.

다음에 본 발명의 몇가지 실시예를 설명한다.

[실시예 1]

RAMOS 세포 (ATTCC CRL 1596)를 태아소혈청 10 v/v%를 보충한 RPMI 1640 배지 (pH 7.2)에 세포농도 5 X 10/㎖가 되도록 접종하였다.

그런 다음, 통상의 방법에 따라 정기적으로 신선한 배지와 바꾸어가면서 37℃에서 배양하고, 이어서 신선한 같은 배지에서 세정하여 이 배지에 농도 2 X 10/㎖가 되도록 현탁하였다. 여기에 BCG및 리포폴리삭카리드를 1㎖ 당 약 10㎍ 씩 첨가하고 37℃에서 2일간 유지하여 암전이 억제인자를 유도하였다. 이것을 원심분리하여 그 상청액 1㎖당 약 60단위의 암전이 억제인자를 수득하였다.

[실시예 2]

신생아의 햄스터에 토끼로 부터 공지의 방법으로 조제한 항혈청을 미리 주사하여 햄스터의 면역을 약하게 한 다음, 그 피하에 HPB - MLT 세포 (FERM BP - 2430)를 이식하고, 통상의 방법으로 5주간 사육하였다. 피하에 발생한 약 20g의 종양을 적출한 다음 콜라게나아제 함유의 생리 식염수에 현탁하여 세포를 분산시켜 채취하였다.

이 세포를 이이글의 최소 기본배지에서 세정한 다음 37℃로 유지한 같은 조성의 배지에 세포농도가 약 2 X 10/㎖가 되도록 희석하고, 여기에 1㎖ 당 피토헤마글루티닌 200㎍ 및 리피드 A를 5㎍을 가하고, 37℃에서 2일간 유지하여 암전이 억제인자를 유도시켰다. 이것을 원심분리하여 상청액 1㎖ 당 약 9,400 단위의 암전이 억제인자를 수득하였다. 따라서 햄스터 1마리당 약 16,500,000 단위의 암전이 억제인자를 수득할 수 있었다.

[실시예 3]

신생아의 래트의 정맥내에 MOLT - 3 세포 (ATCC CRL 1552)를 이식한 다음 통상의 방법으로 4주간 사육하였다.

피하에 발생한 약 20g의 종양을 적출한 다음, 실시예 2와 마찬가지로 하여 분산하여 세포 현탁액을 수득하였다. 여기에 1㎖ 당 센다이 비루스 약 100 적혈구 응집가 및 리포폴삭카리드 약 5㎍을 가하고 37℃ 에서 2일간 유지하여 암전이 억제인자를 유도시켰다.

이것을 원심분리하고 다시 초원심 분리한 후 멤브레인 여과하여 비루스를 제거하므로서, 이 여과액 1㎖ 당 약 4,200 단위의 암전이 억제인자를 얻었다. 래트 1마리당 약 6,900,000 단위의 암전이 억제인자를 수득할 수 있었다.

[실시예 4]

구멍의 지름 약 0.5 미크론 되는 멤브레인 필터를 설치한 내용량 약 10㎖의 플라스틱제 원통형 체임버내에 TALL - 1세포 (JCRB 0086)를 생리 식염수로 부유시켜, 이것을 성장한 래트의 복강내에 매설하였다.

이 래트를 통상의 방법으로 4주간 사육한 다음, 이 체임버를 꺼내었다.

이 세포를 실시예 1과 마찬가지로 처리하여 암전이 억제인자를 유도시켰다. 이것을 원심분리하여 상청액 1㎖ 당 약 1,600 단위의 암전이 억제인자를 수득했다. 래트 1마리당 약 1,800,000 단위의 암전이 억제인자를 수득할 수 있었다.

[실시예 5]

37℃에서 5일간 유지한 닭의 수정란에 U - 937세포 (ATCC CRL 1593)를 이식한 다음 37℃ 에서 1주간 유지하였다. 이 수정란을 깨어, 증식세포를 채취하고, 그 세포를 실시예 2와 마찬가지로 처리하여 암전이 억제인자를 유도시켰다. 이것을 원심분리하여 상청액 1㎖ 당 약 120단위의 암전이 억제인자를 수득하였다. 수정란 10개당 약 9,000단위의 암전이 억제인자를 수득할 수 있었다.

위에서 설명한 바와 같이 본 발명은 인체 조혈기 유래의 세포로 부터 암전이 억제인자의 제조방법을 확립한 것이다.

암전이 억제인자는 암의 전이를 억제하여 암환자의 고통을 완화하고 나머지 수명을 연장할 수 있을뿐 아니라 암전이 억제인자 감수성 질환, 예컨대 비루스성 질환, 악성 종양, 면역 질환 등의 예방제, 치료제 등으로서도 유용하므로, 의약품 업계에 주는 공업적 의의는 매우 크다.

Claims

(가) (1) 암전이 억제인자(MIF) 산생능을 지닌 배양 주화된 인체 조혈기 유래의 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내에 이식하고, 이 온혈동물을 사육하면서 이 온혈동물의 영양체액을 상기 인체 조혈기 유래의 세포에 공급하여 상기 세포를 증식시키거나, (2) 인체 조혈기 유래의 배양 주화된 세포를 인간 이외의 온혈동물의 체내 혹은 체외에 부착한 확산 체임버내에 접종하고, 이 온혈동물을 사육하면서 이 온혈동물의 영양체액을 상기 인체 조혈기 유래의 세포에 공급하여 상기 세포를 증식시키거나, 혹은 (3) 암전이 억제인자(MIF) 산생능을 지닌 배양주화된 인체 조혈기 유래의 세포를 영양배지에서 배양하여 세포를 증식시켜 얻게 되는 암전이 억제인자(MIF) 산생능을 지닌 배양 주화된 인체 조혈기 유래의 세포를 이용하여 암전이 억제인자를 산생시키고, (나) 산생된 암전이 억제인자를 채취하는 것을 특징으로 하는 암전이 억제인자(MIF)의 제조방법.
제1항에 있어서, 인간 이외의 온혈동물이 닭 또는 포유동물인 것을 특징으로 하는 암전이 억제인자의 제조방법.
제1항에 있어서, 인체 조혈기 유래의 세포가 T - 세포임을 특징으로 하는 암전이 억제인자의 제조방법.
제1항에 있어서, 암전이 억제인자 산생능을 지닌 배양 주화된 인체 조혈기 유래의 세포에 암전이 억제인자 유도제를 접촉시키는 것을 특징으로 하는 암전이 억제인자의 제조방법.
제4항에 있어서, 암전이 억제인자 유도제가 미토겐임을 특징으로 하는 암전이 억제인자의 제조방법.
제1항에 있어서, 암전이 억제인자는 인체대장암 유래의 배양 주화된 세포 RPMI 4788 (FERM BP - 2429)를 사용할 경우에는 전이억제 활성을 나타내고, 인터페론 활성, 종양 괴사인자 활성, 인터로이킨 1활성 및 인터로이킨 2활성을 나타내지 않으며, 겔 여과법에서 10,000 - 45,000의 범위의 분자량을 나타내는 것을 특징으로 하는 암전이 억제인자의 제조방법.
제1항에 있어서, 배양 주화된 인체 조혈기 유래의 배양 주화된 세포가 RAMOS 세포 (ATCC CRL 1596), HPB - MLT 세포 (FERM BP - 2430), MOLT - 3세포 (ATCC CRL 1552), TALL - 1세포 (JCRB 0086) 및 U - 937세포 (ATCC CRL 1593)로 된 군으로 부터 선택된 1종인 것을 특징으로 하는 암전이 억제인자의 제조방법.
제1항의 방법에 의하여 항상 제조되는 암전이 억제인자.