KR870001433B1 - 적상적혈구(的狀赤血球) 붕괴인자의 제조 방법 - Google Patents

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Description

적상적혈구(的狀赤血求) 붕괴인자의 제조 방법

본 발명은 정상적혈구 붕괴인자(이후 "TCLF"로 칭함)의 제조방법과 이에 의한 악성종양 치료제의 제조방법에 관한 것이다.

TCLF는 정상적혈구로서 생쥐 섬유 아세포, L-929에 세포장해를 일으켜서 그 세포를 붕해시키는 인자로 명세서 전반에 걸쳐 사용되었으며, 지금까지 TCLF의 형태로는, 예컨데 임파성독소 및 종양괴사인자(이후 "TNF"로 칭함)의 두가지가 알려져 왔다.

1979년 일본 동경의 Igaku Shoin Ltd에 의해 발행된 Ryuichi AOKI 등의 신-면역한 총서 Vol. 6, "Lymphokines" 및 1971년 Academic Press, Lnd에 의해 발행된 B.R. Bloom과 P.R. Glade의 "In Vitro Methods in Cell-Medicated Immunity"에 기술된 바와 같이 임파성 독소라는 것은 예를 들면 감작된 T-세포들을 항원에 노출시키든가 또는 예컨대 식물성혈구응집소나 콘카나발린A를 포함하는 유사분열물질과 같은 임파성독소유도체에 비감작된 T-세포들을 노출시킴으로서 세포내-및/또는 세포외로 유도할 수 있는 세포독성의 효력이 있는 단백질 분해물질에 사용되는 용어이다. 임파성독소는 종양세포뿐만 아니라 정상세포에도 세포독성의 효력이 있다는 것은 잘 알려져 있다.

Acedemic Press Inc.에 의해 1975년 발행된 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 72. No. 9, pp.3666-3670에서 E.A. Carswell에 의해 기술되고 또 1981년 발행된 "Tumor Necrosis Factor in Lymphokines" Vol.2, pp. 235내지 272에서 E. Pick에 의해 기술된 바와 같이, TNF는 예컨데 바실디 칼메트-구에린(bacille de Calmette-Guerin) (BCG) 코리네박테리움 파르붐(Corynebacterium parvum) 또는 내독소와 같은 TNF유도제를 토끼에게 비경구적으로 투여함으로서 대식세포(大食細胞)내에서 유도될 수 있는 단백질 분해물질로서 또 메트 A사르코마(Meth A sarcoma)에 출혈성 괴사를 초래할 수 있는 물질에 사용되는 용어이다.

또한 TNF는 인간정상세포에 실질적으로 어떠한 세포붕해도 초래하지 않지만, 생쥐 정상적혈구 L-929는 물론 인간종양세포에 대해 현저하게 세포붕해를 초래하는 것으로 알려져 있다.

TCLF는 종양세포에 대하여 세포붕해 기능을 지니고 있기 때문에 악성종양 치료제로서 크게 기대되어 왔다.

TCLF의 실제적인 종특이성(Species-specificity)이 거의 나타나지 않기 때문에 인간의 질병을 치료하는데 있어 토끼나 쥐의 세포와 같은 인체 이외의 세포로부터 제조된 TCLF를 이용하는 가능성도 생각할 수 있으나, 치료에 사용할 경우 항원성 및 기타 부작용을 적게 유발시키기 때문에 인체 생세초로 부터 제조된 TCLF를 사용하는 것이 바람직하며 또 매우 안전하다.

본 발명자 등은 TCLF를 공업적 규모로 아주 용이하게 제조할 수 있는 각종 방법과 이를 악성종양 치료제로서 이용할 수 있는 가능성에 대하여 연구를 행하였다.

연구결과 TCLF 산생능을 갖고 있는 인체세포를 증식시켜 수득된 배양주학 인체세포를 TCLF 유도제에 노출시켜 증가된 TCLF 산생을 유도함으로서 다량의 TCLF가 손쉽게 수득될 수 있으며, 또 이 TCLF는 악선종 치료제로서 탁월하다는 사실을 발견하였다. 그리고 이같은 발견을 기초로 본 발명에 이르게 된 것이다.

또한 본 발명자는 이같이 해서 수득한 TCLF는 약 1×10⁴내지 1×10⁵달론 범위에서 각기 다른 분자량을 갖고 있으며 정상인체세포의 실질적인 세포 붕해는 전혀 유발시키지 않지만 생쥐 적상적혈구 L-929에서는 물론 인체종양 세포에 대해 현저한 붕해작용을 초래하는 최소한 3개 형태의 글리코프로테인을 함유하고 있다는 사실을 발견하였다. 이하에서 본 발명에 따른 TCLF의 제조방법에 대하여 좀더 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용 가능한 배양주화 인체세포는 선행 방법에 따라 시험관에서 증식시킬수 있는 세포는 어느 것이나 사용 가능하다. 본 발명을 보다 효율적으로 실시하기 위해서 인체세포를 인간 이외의 온형동물에 이식하거나 또는 이와 달리 전술한 인체세포를 인간 이외 온혈동물의 영양체액이 이 인체세포에 공급되는 종래의 확산챔비 내에서 증식시킴으로서 수득된 배양주화 인체세포를 사용하는 것이 바람직하다.

살아있는 인체세포를 시험관 내에서 증식시키는 종래 방법과는 달리 생체내 공정을 이용하는 방법은 매우 높은 역가의 TCLF를 제조할 수 있음은 물론 값비싼 혈청을 함유하는 영양배지를 전혀 필요로하지 않거나 훨씬 적게 필요로 하며 또 세포증식기간 중의 배지의 유지를 훨씬 용이하게 한다.

미합중국특허 제4,276,282호(Sugimito 등)에 비루스성 감염억제 활성을 가지는 인체-특성 인터페론 이후 "HuIFN"으로 칭함) 제조의 개선된 방법이 기재되어 있지만 여기에는 TCLF 제조에 있어 인간 이외의 온혈동물을 이용할 수 있는 어떠한 가능성도 시사하고 있지 않다.

좀더 상세히 설명하면 본 발명에 따라 숙주동물로 인간 이외의 온혈동물을 사용하는 방법에 있어서, 어떠한 인체세포들도 이들 세포를 인간 이외의 온혈동물에 이식하거나 또는 이와는 달리 이들 세포를 체액을 받아드리도록 고안된 종래 형태의 확산챔버에 넣고 또 이 챔버를 동물표피 또는 동물체내에 삽관시킨후 이들 동물을 평상시와 같이 사육함으로써 인간 이외의 온혈동물로 부터 공급되는 영양체액을 이용하여 용이하게 증식시킬 수 있다.

더우기, 본 발명에 따른 방법은 세포증식이 보다 안정되고 또 그 증식속도가 큰 점, 높은 세포생산성과 세포당 극히 높은 TCLF 산생능을 수득할 수 있다는 점에서 조직배양을 이용하는 종래의 시험관 세포증식 방법들과 아주 다르다.

본 발명에서 이용 가능한 인체세포들은 동물내에서 쉽게 이식 가능하고 또 증식 가능한 세포들로서 TCLF를 생산하는 세포들이다.

이들 세포의 예로는, Journal of Clinical Microbiology, Vol.1, 116 내지 117페이지(1975)에 기술되어 있는 Namalwa;Nature, Vol.267, 843 내지 844페이지(1977) 서 I. Miyoshi 등에 의해 기술되고 있는 것과 같은 BALL-1, TALL-1 및 NALL-1; Journal of Immunology Vol. 113, 1334 내지 1345페이지(1974)에 기술되어 있는 것과 같은 M-7002 및 B-7101 ; The Tissue Culture Vol. 6, No. 13, 527내지 546페이지(1980)에 기술되어 있는 것과 같은 JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, MoLT-3 및 EBV-HO; CCRF-SB(ATCC CCL 120); BALM 2; DND-41; 및 발암성 비루스, 약품 또는 방사선을 이용하여 정상 단핵세포 또는 과립구를 변형시켜 수득되는 이밖의 배양주학세포들을 들 수 있다.

앞에서 기술한 세포들을 사용하는 대신에 2차 배양(Sub-Culture)하기가 더욱 쉽고, 폴리에틸렌글리콜 또는 센다이비루스를 사용하는 세포융합방법 ; 또는 헥산분해효소, 리가아제 및 DNA 폴리머라제를 사용하는 유전자 조환 기술에 의해 TCLF 산생넝을 갖는 인체 유전자(들)을 도입시키기가 아주 용이한 인체 임파아세포의 사용으로 세포증식속도 및 /또는 세포당 TCLF 산생능을 크게 증가시키는 결과를 얻게 되면, 또 본 명세서에서 예시한 인체세포들로 본 발명의 범위를 제한하는 것이 아님을 밝혀둔다.

경우에 따라서는 전술한 세포들의 하나 또는 그 이상의 세포들은 다음에 기술하는 TCLF 유도까지의 단계에서 자유로히 결합 사용될 수 있다. 신선한 인체혈액으로 부터 제조된 TCLF 산생능을 갖는 인체백혈구를 전술한 세포들과 결합 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용될 수 있는 인간 이외의 온혈동물은 인체세포가 증식될 수 있는 동물이면 족하다. 예를 들면, 닭 또는 비둘기와 같은 조류 ; 또는 개, 고양이, 원숭이, 토끼, 염소, 돼지, 말, 소, 기니아피그 쥐, 누우드쥐, 햄스터, 생쥐 또는 누우드생쥐와 같은 포유류 등이 있다.

이같은 인간세포의 동물이식은 바람직하지 못한 면역반응을 초래하기 때문에 가능한 한 이 면역반응을 감소시키기 위해서 인간 이외의 온혈동물은 알, 배(胚)또는 태아, 또는 신생기 또는 유소기의 동물과 같이 가능한 한 어린 것을 사용하는 것이 바람직하다.

이 식에 앞서 이같은 동물은 면역반응을 가능한 한 최저의 수준으로 감소시키기 위한 전처리로서 약 200-600rem의 X-선 또는 -선 조사 또는 항혈청이나 면역억제제를 주사한다.

누우드쥐 또는 누우드생쥐를 숙주동물로 사용하는 경우, 이들 동물은 성장된 것이라 하더라도 바람직하지 않은 면역반응을 거의 나타내지 않기 때문에 이들 동물은 이같은 전처리 과정을 거치지 않고 전술한 어떠한 세포들도 쉽게 이식할 수 있으며, 또 이들 세포는 바람직하지 않은 면역반응이 발생할 우려없이 쉽게 증식된다.

각기 다른 인간 이외의 온혈동물들을 결합 사용해서 이식을 반복함으로서 세포증식의 안정화와 TCLF생산성의 증대를 수득할 수 있다. 예를 들면, 목적물은 전술한 세포들을 햄스터에 첫번째 이식을 해서 증식시킨후 증식된 인체세포들을 누우드생쥐에 재이식함으로서 수득할 수 있다.

이 경우에 반복되는 이식은 같은 종 또는 속의 동물뿐만 아니라 같은 강 또는 목의 인간 이외의 온혈동물로서 진행시킬 수 있다.

세포가 이식될 수 있는 동물의 부위로서, 그부위에서 세포가 증식될 수 있는 한 동물의 어떤 부위에서나 세포가 이식될 수 있다. 예를 들면, 요막강내 또는 정맥내, 복강내 또는 피하에 이식할 수 있다.

이들 세포를 동물에 이식하는 대신에 앞서 기술한 세포들은 어느 것이든지 동물세포들에 의해 확산챔버가 오염되는 것을 막고 영양체액을 세포들에 공급할 수 있도록 공칭기공 직경이 약 10⁷내지 10^-5m인 막필터, 한외필터 또는 중공(中空) 필터가 설치된 각종 형태 및 크기의 종래 형태의 확산챔버에 이들 세포를 위치시키고, 이들 챔버를 동물의 복강내로 끼워넣고, 또 세포들이 동물로 부터 공급되는 영양체액을 이용하여 그 안에서 증식되도록 함으로서 손쉽게 증식시킬수 있다.

이밖에, 확산챔버는 그 챔버내의 영양체액과 영양용액이 자유로히 챔버내를 순환할 수 있도록 설계해서 동물표피에 부착시킬수 있다. 이같은 방법으로 확산챔버 내의 배양액은 세포증식기간 동안 확산챔버벽(들에 장치된 투명한 측면창(들)을 통해 관찰될 수 있고 또/또는 숙주동물을 살해함이 없이 그 수명을 다할때까지 세포증식을 계속하고 또 동물당 세포 생산성을 더욱 증가시키기 위하여 확산챔버를 계속하여 새로운 것으로 교체시킬수 있다.

이같은 확산챔버의 사용으로 인해 인체세포들은 동물세포들과 직접 접촉되지 않게 되고 이에 따라 바람직하지 않은 면역반응이 전혀 유발되지 않기 때문에 인간 이외의 어떠한 온혈동물도 전처리 없이 숙주동물로 쉽게 사용될 수 있으며, 또 이로부터 증식된 살아있는 인체세포들을 쉽게 수집할 수 있다.

동물의 사육은 통상적인 방법에 따라 쉽게 진행될 수 있고, 이식후라 하더라도 별도의 특별한 주의를 필요로 하지 않는다.

최대의 세포증식을 수득하는데는 일반적으로 1내지 10주의 기간이 요구된다. 이같이 수득된 인체세포수는 동물 한마리당 약 10⁷내지 10¹²개 또는 그 이상이다. 엄밀히 말해서, 본 발명에 의해 이식된 인체세포는 약 10²내지 10⁷배 또는 그 이상으로 증가되는데, 이는 영양배지를 사용하는 시험관내 증식방법으로 수득한 세포들이 약 10내지 10⁶배 또는 그 이상으로 된다. 따라서, 증식된 인체세포들은 본 발명의 목적물로서 유리하게 사용될 수 있다.

TCLF를 생산하기 위해 증식된 인체세포들을 유도하는 모든 방법이 본 발명에서 사용될 수 있다. 증식된 인체세포 들은 숙주동물로 사용되는 동물내에서 TCLF 유도제에 노출될 수도 있다. 예를 들면, 현탁액상의 복수증에서 증식된 인체세포 또는 예를 들면 피하에 형성된 종양세포는 TCLF 생산을 유도하기 위해 생체내에서 TCLF 유도제에 직접 노출되며, 또 축적된 TCLF는 복수, 혈청 및/또는 종양으로 부터 수거한 후 이어 TCLF의 정제를 합한다.

이와는 달리, 증식된 인체세포는 동물로 부터 수집한후, 시험관내에서 TCLF 유도제에 노출된다. 예를 들면, 복수현탁액으로 부터 수거하거나 또는 피하에 형성된 큰 종양(들)을 추출하고 분리해서 수득되는 증식된 인체세포를 약 20 내지 40℃ 범위 온도로 예열한 영양배지에 현탁시켜서 세포밀도가 약 10⁵내지 10⁸개/㎖가 되도록 하고 또 시험관내에서 TCLF 유도제에 노출시킨후 배양액으로 부터 축적된 를 수거한다.

인체세포가 종래 형태의 확산챔버에서 증식되는 경우, 증식된 인체세포들은 확산챔버 내에서나 또는 이 챔버로 부터 이들 인체세포를 수집한 후에 TCLF 유도제에 노출시킬수 있다.

이같이 해서 수득된 인체세포들은 TCLF 유도에 앞서 세대기간을 조정하기 위해 추가로 1 내지 4일동안 더 시험관 내에서 배양할 수 있다.

동물 한마리당 TCLF 산생능을 더욱 증가시키기 위해 다음 방법들중 어느 한 방법을 이용할 수 있다.

(1) 증식된 인체세포들을 세포증식용 숙주동물로 사용되는 동물체내에서 TCLF 유도제에 노출시키고, 또 이어 인체세포들을 이들 동물의 특정부위 또는 전체부위로부터 수집한후 이들 인체세포를 시험관내에서 TCLF 유도체에 노출시키는 방법.

(2) 인체세포들을 반복하여 시험관내 및 /또는 생체내에서 TCLF 유도제에 노출시키는 방법, 과/또는

(3) 동물체내에 삽입하거나 또는 표피에 설치된 확산챔버를 계속해서 새로운 것으로 교체해주는 방법.

본 발명에서 사용 가능한 TCLF 유도제는 동물로부터 공급되는 영양체액을 이용해서 인체세포를 증식시켜 수득된 인체세포 중에서 TCLF 생산을 유도하는 1개 또는 그 이상의 유도제로서, 이들의 예로는 비루스, 헥산 및 뉴클레오티드와 같은 종래의 α-인터페론 유도제(IFN-α 유도제) ; 식물성혈구응집소, 콘카나발린A, 아메리카자리콩 유사분열물질, 지방다당류, 내독소, 다당류 또는 박테리아 등과 같은 γ-인터페론 유도제(IFN-γ유도제)가 TCLF 유도제를 들 수 있다. 일반적으로 TCLF가 매우 높은 역가로 유도될 수 있는 IFN-α유도제를 사용하는 것이 바람직하다. 어떠한 항원은 항원으로 감작(感作)된 세포들에 대하여 TCLF 유도제로서 작용하게 된다.

TCLF 유도제로서 IFN-α와 IFN-γ 유도제를 결합사용함으로서 유도된 TCLF 산생능이 현저한 증가를 초래하였다는 유익한 결과를 확인할 수 있었다.

또한 이 결합사용으로 HuIFN의 동시 생산이 유발한다는 사실도 확인되었다.

따라서 이같은 유도제의 사용으로 증식된 인체세포들의 보다 효율적인 이용을 가능케할 뿐만 아니라 귀중한 TCLF 및 HuIFN과 같은 2개 또는 그 이상의 생물학적 활성물질을 동시에 또 저렴한 생산비로 대량 생산할 수 있음이 확인되었다.

이같이 해서 수득된 TCLF는 농축, 염석, 투석, 여과, 원심분리 및/또는 동결건조 등의 종래 방법을 이용하는 정제 및 분리방법에 의해 쉽게 수거할 수 있다. 좀더 정제된 TCLF의 제조가 필요한 경우에는, 이온교환기에 의한 흡착 및 탈착, 겔여과, 전기영동 및/또는 등전점 분별증류 등과 같은 다른 종래 방법과 앞서 기술한 선행 방법을 결합해줌으로서 가능한 한 최고 순도의 TCLF를 제조할 수 있다.

전술한 방법을 사용하는 대신에 예를 들면, Con A-Sepharose, a product of Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Sweden 등의 티간드로서 항원 또는 유사분열물질 중 어느 하나를 사용하는 친화성 크로마토그라피를 이용함으로서 고순도 TCLF를 보다 신속하고 또 보다 용이하게 생산 수득할 수 있다.

이같이 해서 수득된 TCLF는 본질적으로 약 1×10⁴내지 2×10⁴달톤, 약 3.5×10⁴내지 5×10⁴달톤 및 약 7×10⁴내지 9×10⁴달톤의 각기 다른 분자량을 갖는 3개의 글루코프로테인으로 구성되어 있으며, 정상 인체세포에 대해서는 실질적인 세포봉해를 유발시키지않지만, 인체 종양세포들과 또한 생쥐세포, L-929에 대해서는 현저한 세포봉 해를 초래한다는 사실이 확인되었다.

따라서, TCLF는 그 치료가 매우 어려운 것으로 되어왔던 악성종양과 같은 TCLF 감작 질병들의 예방제 및/또는 치료제로서 유익하게 사용될 수 있다.

전체 명세서를 통하여 TCLF의 역가는 1971년 Academic Press, Inc에 의하여 발행된 B.R. Bloom과 P.R. Glade의 "In Vitro Method in Cell-Medicated Immunity"에 의해 보고된 임파독소 분석방법 또는 1981년 Academic Press Inc에 의하여 발행된 E. Pick의 "Tumor Necrosis Factor in Lymphokines" Vol., 235 내지 272페이지에 발표된 TNF 분석방법에 따라 측정하였으며, 이중 생쥐세포 L-929는 일정기간 동안 TCLF의 존재하에서 배양하고 또 생존 세포수를 헤아렸다.

HuIFN의 역가는 인체 양막(羊膜) 유래의 FL-세포들을 사용하는 1975년 발행된 "단백질, 헥산 및 효소" Vol. 20, No. 6, 616 내지 643페이지에 기술된 종래의 혈소판-환원방법에 따라 측정하였다.

혈구응집반응의 역가는 1944년 발행된 S.E. Salk의 "Journal of Immunology "Vol. 49, 87페이지에 보고된 방법을 약간 수정하여 측정하였다.

다음의 실시예 A는 TCLF의 1개 형태인 임파독소의 생산성을 설명하는 것이다.

[실 험 A]

시험관내 또는 생체내에서 증식된 인체세포의 임파독소-생산성

[실 험 A-1]

시험관내 세포증식

B-세포 기원의 인페 임파아구세포인 BALL-1을 RPMI 1640배지(pH 7.2)에 이식하여 20v/v% 태아송아지 혈청을 보충하고, 37℃ 현탁액 중에서 배양한다. 증식된 인체세포들을 혈청-부재의 RPMI 1640 배지(pH 7.2)로 세척한후, 이어 동일 조성의 새로운 배지에 재현탁시켜 세포밀도가 약 1×10⁶㎖가 되도록 한다.

[실 험 A-2]

생체내 세포증식

면역반응을 감소시키기 위해 통상의 방법에 따라 토끼로부터 제조한 항혈청을 갓태어난 햄스터에 주사한후, 이 동물의 피하에 B-세포 기원의 인체 임파아구세포인 BALL-1을 이식하고나서 3주간 통상의 방법으로 사육한다.

피하에 형성 수득된 큰 종양들을 추출하고 또 트립신을 함유하는 생리식염수용액에 현탁시켜서 분리한다. 이어, 이들 세포를 혈청부재의 RPMI 1640배지(pH 7.2)로 세척하고, 또 동일 조성의 새로운 배지에 재현탁시켜 세포밀도가 약 1×10⁶세포/㎖가 되도록 한다.

[실 험 A-3]

임파독소 생산

임파독소 유도는 센다이비루스 및/또는 식물성 혈구응집소를 사용하여 실시예 A-1과 A-2에서 제조된 증식된 BALL-1 세포들의 각개 세포현탁액에서 진행된다. 세포현탁액 각각에 약 300혈구응집반응역가/㎖ 및/또는 약 50㎍/㎖의 양의 센다이비루스 및/또는 식물성 혈구응집소를 각각 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 2일 동안 배양하여 TCLF 생산을 유도한다. 배양후, 임파독소뿐만 아니라 많은 양의 HuIFN-α 및 HuIFN-γ가 동시에 생성된다.

다음 표 Ⅰ에는 임파독소의 산생 결과를 수록한다.

[표 Ⅰ]

주 : 값은 ㎖당 임파독소 역가를 나타낸다 ; 괄호 안의 것은 ㎖당 HuIFN의 역가이다.

표Ⅰ에 수록된 실험 결과로 부터 명백한 바와 같이, 임파독소는 생체내에서뿐만 아니라 시험관 내에서 증식된 인체세포 중에서 생산된다. 그러나 생체내에서 유도된 임파독소의 양은 시험관 내에서 유도시킨 경우 보다 10배 또는 그 이상으로 많다. 센다이비루스를 사용하는 임파독소의 생산성은 식물성혈구응집소를 사용하여 얻는 양과 비슷하거나 그보다 높다.

센다이비루스와 식물성혈구응집소를 함께 사용하는 경우를 센다이비루스 또는 식물성혈구응집소만을 각각 사용한 경우와 비교하여 볼때 증식방법에 관계없이 상승작용을 일으켜 인체세포내에서의 임파독소 생산성을 향상시킨다.

상승효과는 시험관 내에서 증식시킨 경우 보다는 생체내에서 증식시킨 인체세포인 경우에 더욱 현저하다.

전술한 사항으로 부터, 그-특이성 IFN 유도제, 특히 IFN-α 및 유도제를 결합 사용하는 것이 종-특이성이 없는 임파독소 유도에 보다 바람직하다는 결론에 도달할 수 있다.

다음의 실시예들은 본 발명에 따른 2가지 형태의 TCLF 즉 임파독소 및 TNF의 제조방법을 설명하고 있다.

[실시예 A-1]

면역반응을 감소시키기 위하여 종래의 방법에 따라 토끼로부터 제조한 항혈청을 산생 햄스터에 주사한 후, 이들 동물 피하에 인체 임파아구세포, BALL-1을 이식하고 3주 동안 통상적인 방법으로 사육한다.

그 결과 피하에 형성 수록된 각각 약 15g의 큰 종양들을 추출하여 세절한후 트립신을 함위하는 생리식염수에 현탁시켜 분리한다.

이같이 해서 수득된 인체세포를 혈청-부재의 RPMI 1640배지(pH 7.2)로 세척하고, 세포의 밀도가 약 5×10⁶세포/㎖가 되도록 동일 조성의 새로운 배지에 재현탁시킨다. 세포현탁액에 각각 1,000 혈구응집반응역가/㎖ 및 200㎍/㎖의 센다이비루스와 식물성혈구응집소를 첨가하고 또 혼합물을 임파독소 생산을 유도하기 위해 37℃에서 2일간 배양한다.

그후에, 배양액을 4℃에서 약 1000×g로 원심분리하고 또 상층액을 0.01M 인산염 완충액(pH 7.2)을 함유하는 생리식염수용액에 대하여 21시간 동안 투석한다.

임파독소 활성을 가지는 수득 용액을 이어 막필터로 여과하고 또 여과액을 농축하고 동결 건조해서 분말제품을 수득한다.

임파독소 수을은 햄스터 1마리당 약 5×10⁹단위이다. 분말은 또한 약 3.2×10⁹단위의 HuIFN을 함유한다.

[실시예 A-2]

인체 임파아구세포, BALL-1을 이글(Eagle) 칙소필수 배지(pH 7.4)에 접종하여, 20 v/v%의 태아송아지 혈청을 보충하고 약 37℃ 현탁액으로 시험관 내에서 배양한다.

증식된 인체세포들은 혈청-부재의 이글 칙소필수배지(pH 7.4)로 세척한 후, 이들 세포를 동일 조성의 새로운 배지에 세포밀도가 약 1×10⁹세포/㎖가 되도록 재현탁시킨다. 그 후에, 이 세포현탁액에 센다이 비루스와 콘카나발틴A를 각각 약 1,000 혈구응집반응역가/㎖ 및 5㎍/㎖의 양으로 첨가하고 또 혼합물을 38℃에서 1일간 배양해서 임파독소 생산성을 유도한다.

배양액 4℃에서 약 1000×g으로 원심분리한후 상층액을 0.01M인산염 완충액(pH 7.2)을 함유하는 생리식염수용액에 대해 15시간 동안 투석한다. 그 결과 수득된 용액을 막필터를 사용하여 여과하고 또 임파독소 활성을 가진 여과액을 농축한다.

임파독소의 수율은 유도된 1l 세포현탁액에 대해 약 4.5×10⁶단위 이고, HuIFN의 수율은 1l의 세포현탁액당 약 1.2×10⁹단위이다.

[실시예 A-3]

성숙한 누우드 생쥐들의 복강내에 B-세포 기원의 인체임파아구세포 나말바(Namalwa)을 이식하고 또 5주동안 통상적인 방법으로 사육한다. 그 후에, 이들 동물 복강내로 UV-조사로 미리 불활성화시킨 뉴우캐슬병 비루스를 동물 한마리당 약 3,000 혈구응집반응역가 접종량으로 주사하고 또 주사 24시간 후에 해부하여 복수를 수거한다.

실시예 A-1에서와 유사한 방법으로 복수를 정제, 농축하여 임파독소 활성을 갖는 분말을 수득한다.

임파독소의 수율은 동물 한마리당 약 9×10⁶단위이다. 이 분말은 또한 5.2×10⁶단위의 HuIFN를 함유한다.

[실시예 A-4]

면역반응을 감소시키기 위하여 약 400렘(rem)의 X-선을 성숙한 생쥐들에게 조사한후, B-세포 기원의 인체 임파아구세포, CCRF-SB를 피하에 이식하고 또 3주동안 통상의 방법으로 사육한다.

각각 약 10g의 크기로 피하에 형성된 큰 종양들을 추출하고 또 실시에 A-1과 유사한 방법으로 분리한다. 이같이 해서 수득된 인체세포들을 실시예 A-1에 사용된 것과 같은 동일 조성의 새로운 배지에 현탁시킨다. 이어, 이 세포현탁액에 각각 약 500 혈구응집반응역가/㎖ 및 약 0.8㎍/㎖의 양의 센다이비루스 및 콘카나발린A를 첨가한후, 이어 1일간 37℃에서 세포현탁액을 배양하여 임파독소 상산성을 유도한다.

실시예 A-1과 유사한 방법으로 배양액을 정제하고 또 농축해서 임파독소 활성을 가진 분말 생성물을 수득한다.

임파득소의 수율은 생쥐 한마리당 약 2.4×10⁹단위이고, 분말은 또한 1.9×10⁹단위의 HuIFN를 함유한다.

[실시예 A-5]

실시예 A-1에서와 유사한 방법으로 신생 햄스터에 인체임파아구세포, JBL을 이식하고, 또 이미 4주일 동안 통상적인 방법으로 사육한다.

각각 약 20g 크기로 피하에 형성 수득된 큰 종양들을 실시예 A-1에서와 유사한 방법으로 분리하여 약 3×10⁶세포 /㎖의 세포밀도를 갖는 세포현탄액을 수득한다.

이 세포현탄액에 약 1,000 혈구응집반응역가/㎖의 센다이비루스를 첨가하고 또 그 혼합물을 2일 동안 36℃에서 배양하여 임파독소 생산성을 유도한다.

배양액을 정제하고, 실시예 A-2와 유사한 방법으로 농축해서 임파독소 활성을 가지니 농축액을 수득한다.

임파독소의 수율은 햄스터 한마리당 약 1.6×10⁹단위이다. 농축액은 또한 햄스터 한마리당 약 7×10⁶단위의 HuIFN을 함유한다.

[실시예 A-6]

B-세포 기원의 인체 임파아구세포, EBV-HO을 생리식염수액용에 현탁시키고, 또 이어 수득된 현탁액을 내부용적이 약 10㎖이고, 공칭공극직경이 약 0.5μ를 가진 막필터가 장치된 플라스틱으로 된 원통형의 확산챔버에 넣고, 이어 이 확산챔버를 성숙한 쥐의 복강내에 삽관시킨다.

이어, 이 동물을 4주일 동안 통상적인 방법으로 사육하고 또 확산챔버를 이 동물로 부터 제거한다.

절술한 방법에 의하여 수득된 확산챔버 내의 증식된 인체임파아구세포의 세포밀도는 약 6×10³세포/㎖로서, 이는 영양배지를 사용하는 CO₂배양기를 사용하는 시험관 방법에 의하여 얻을수 있는 것에 약 10²배 또는 그 이상에 해당한다.

이같이 해서 수득한 인체세포들을 실시예 A-2에서와 유사한 방법으로 현탁시키고, 또 이 세포현탁액에 열처리로 미리 불활성화시킨 뉴캐슬병 비루스와 식물성혈구응집소를 각각 500 혈구응집반응역가/㎖ 및 100㎍/㎖양으로 첨가한후 37℃에서 2일 동안 세포현탁액을 배양하여 임파독소 생산성을 유도한다.

배양액을 정제하고, 또 실시예 A-1에서와 유사한 방법으로 농축해서 임파독소 활성을 가지는 분말생성물을 수득한다.

임파독소 수율은 쥐 한마리당 약 5.4×10⁶단위이다. 이 분말은 또한 6.8×10⁶단위의 HuIFN을 함유한다.

[실시예 A-7]

인체 임파아구세포, BALL-1을 37℃에서 5일간 미리 배양한 수정된 달걀의 요막공동에 이식하고, 이 달걀을 동일 온도에서 추가로 일주일간 더 배양한다. 증식된 인체세포들을 달걀로 부터 수집하고 또 실시예 A-1에서와 유사한 방법으로 현탁시켜 세포밀도가 5×10⁶세포/㎖가 되도록 한다.

이 세포현탁액에 약 1,000 혈액응집반응역가/㎖/양의 센다이비루스를 첨가하고 또 37℃에서 1일 동안 배양해서 임파독소 생산성을 유도한다. 그 후에, 배양액을 정제하고 또 실시에 A-2에서와 유사한 방법으로 농축해서 임파독소 활성을 가지는 농축액을 수득한다.

임파독소의 수율은 10개의 수정달걀 당 약 9×10⁶단위이다. 이 분말 생성물 또는 10개의 수정달걀 당 약 3.5×10⁵단위의 HuIFN를 함유한다.

[실시예 A-8]

인체 임파아구세포, CCRF-SB 대신에 임파아구세포, MOLT-3를 실시예 A-4와 유사한 방법으로 처리해서 임파독소 활성을 가지는 분말생성물을 수득한다.

임파독소의 수율은 생쥐 한마리당 약 3.3×10⁹단위이다. 이 분말생성물은 또한 약 1.4×10⁹단위의 HuIFN를 함유한다.

[실시예 A-9]

실시예 A-1에서와 유사한 방법으로 수득한 분말생성물중의 HuIFN성분을, 1977. 6월 8일 및 9일 양일간에 걸쳐 유고슬라비아의 자그레브에서 개최된 제11차 국제면역생물학 심포지움인 "인터페론의 조제표정 및 임상학적 사용한 관한 심포지움"에서 G. Bado에 의해 발표된 방법에 따라 이온고환기를 사용하는 흡착 및 탈착법, 겔여과를 사용하는 분자량 분별법, 농축 그리고 막필터를 사용하는 여과에 의해 분리하며, 또 수득된 HuIFN-유리생성물은 농축하며 또 황산암모늄을 사용하는 염석에 의해 정제한다. 이어 수득된 상성물을 0.01M인산염 완충액(pH 7.4)중의 식물성혈구응집소-세파로스(Sepharose)를 사용해서 친화성-크로마토그라피 분리를 행하고, 흡착된 부분을 부가적으로 0.1M N-아세틸-D-갈락토사민을 함유하는 동일 완충액의 새로운 약제를 이들 부분에 충전함으로써 용리시킨다. 임파독소 활성을 가지는 용리된 분획을 N-아세틸-D-갈락토사민을 함유하지 않은 동일 완충액의 새로운 약제에 대하여 투석하고 농축한후 동결건조해서 분말생성물을 수득한다.

이같이 해서 수득된 임파득소의 고용활성은 mg 단백질당 약 30,000단위이다.

분자량에 따른 분말생성물의 겔여과로서 다음과 같은 결과를 얻게 된다.

생성물은 약 7×10⁴내지 9×10⁴달톤, 약 3.5×10⁴내지 5×10⁴달톤 및 약 1×10⁴내지 2×10⁴달톤의 각기 다른 분자량과 1 : 1 : 2의 활성비율을 갖는 3개성분으로 분리되는데, 이들 성분은 이들의 분자량과 기타 입수 가능한 물리화학적 정보명에서 볼 때 보고된 α-, β-및 γ-임파독소에 각각 상응하였다. 모든 성분들은 글리코프로테안류이고, 또 이들의 당류 함량은 이들 분자량에 따라 약 5내지 45%의 범위에 해당하였다.

[실시예 A-10]

가능한 한 면역반응을 감소시키기 위하여 통상적인 방법에 따라 토끼로 부터 제조한 항혈청을 산생햄스터들에게 주사하고, 또 이어 SV-40비루스를 사용해서 변형시킨 단핵성세포(monocytic)기원의 인체세포를 피하에 이식한후, 통상적인 방법에 따라 일주일동안 사육한다. 이어, 이 동물들의 복강내로 동물당 10⁹세포의 접종량으로 살아있는 BCG 세포들을 주사하고 또 2주일간 추가 사육한다.

그 후에, 각각 약 15g 크기로 피하에 형성 수득된 커다란 종양들을 추출하여, 세절한후 트립신을 함유하는 생리식염수용액에 현탁시켜 분리한다. 인체세포들을 이글 칙소필수배지(pH 7.2)로 세척한후 5v/v% 인체혈청을 보충하고 세포들을 동일 조성의 새로운 배지에 현탁시켜 세포밀도가 약 5×10⁶세포/㎖가 되도록 한다.

이어, 이 세포현탁액에 약 10㎍/㎖양의 대장군(E. Coli) 내독소를 첨가하고 또 37℃에서 16시간 동안 배양해서 TNF 생산을 유도한다.

그 후에 배양액을 약 4℃에서 약 1,000×g으로 원심분리하여 침전물을 제거하고 또 잔존하는 상층액을 0.01M인산염(완충액(pH 7.2)을 함유하는 생리식염수용액에 대해 21시간 동안 투석한다. 이어, 수득된 용액을 막필터를 사용해서 여과하고, 또 TNF 활성을 가지는 여과액을 동결 건조하여 분말생성물을 수득한다.

분말생성물 중의 HuIFN 성분을 1877년 6월 8일 및 9일 양일간에 걸쳐 유고슬라비아의 자그레브에서 개최된 제11차 국제면역생물학 심포지움인 "인터페론의 조제, 표정 및 임상학적 사용에 관한 심포지움에서 G. Bodo에 의해 발표된 방법에 따라 이온교환기를 사용하는 흡착 및 탈착법, 겔여과를 사용하는 분자량분별법, 농축 그리고 막필터를 사용하는 여과방법에 의해 분리하며, 또 수득된 HuIFN-유리생성물을 황산암모늄을 사용하는 염석과 스웨덴 업살라(Uppsala) 소재의 Pharmacia Fine Chemicals AB 회사의 제품인 콘 에이-세파로스(Con A-Sepharose)를 사용하는 친학성 크로마토그라피 방법에 따라 정제해서 인체의 정상세포에 대해서는 실질적인 세포붕해를 전혀 유발하지 않고 인체종양세포에 대해 현저한 붕해를 유발하며, 메트 A사르코마(Meth A Sarocoma)의 세포붕해를 가능하게 하는 TNF를 약 1×10⁶단위의 고순도로 수득한다.

이같이 해서 수득된 TNF는 TNF유도제를 전혀 함유하고 있지 않고 또 이 TNF의 고유활성은 mg 단백질량 350,000 단위이다.

[실시예 A-11]

면역반응을 감소시키기 위하여 통상적인 방법에 따라 토끼로부터 제조한 항혈청을 신생 햄스터들에게 주사한후 피하에 인체 임파아구세포, BALL-1을 이식하고 또 3주일 동안 통상적인 방법으로 사육한다.

각가 약 15g의 크기로 피하에 형성 수득된 큰 종양들을 추출하여 세절한후 수득 생성물을 트립신을 함유하는 생리식염수용액에 현탁시켜 분리한다. 인체세포들을 혈청-부재의 RPMI 1640배지(ph 7.2)로 세척한후 인체세포들을 동일 조성의 새로운 배지에 재현탁시켜 세포밀도가 약 1×10⁹세포/㎖가 되도록 한다.

세포현탁내에 각각 약 1,000 혈구응집반응역가/㎖ 및 약 20㎍/㎖량의 센다이비루스와 대장균(E. Coli) 내독소를 첨가한후 TNF 생산성을 유도하기 위해 37℃에서 2일 동안 세포현탁액을 배양한다.

그 후에, 배양액을 약 4℃에서 약 1,000×g로 원심분리해서 침전물을 제거하고 또 잔유하는 상층액을 0.1M인산염 완충액(pH 7.2)을 함유하는 생리식염수용액에 대해 21시간 동안 투석한후, 이어 수득된 용액을 막필터를 사용해서 여과한다. 이어, TNF 활성을 가지는 여과액을 농축하고 또 동결건조시켜 분말생성물을 수득한다.

TNF의 수율은 햄스터 한마리당 약 8.3×10⁹단위이다. 이 생성물은 또한 약 4.1×10⁹단위의 HuIFN을 함유한다.

[실시예 A-12]

성숙한 누우드생쥐의 복강내에 인체 임파아구세포, TALL-1을 이식하고 통상적인 방법으로 5주일동안 사육한다. 그 후에, 이들 동물의 복강내로 UV-조사에 의해 미리 불활성화시킨 뉴캐슬병 비루스 누우드생쥐 한마리당 약 3,000 혈구응집반응역간의 접종량을 주사하고, 주사 24시간 후에 해부하여 복수를 수거한다.

수거한 복수를 실시예 A-11과 유사한 방법으로 정제, 농축 그리고 건조해서 TNF 활성을 가진 분말생성물을 수득한다.

TNF의 수율은 누우드생쥐 한마리당 약 6.2×10⁶단위이다. 이 생성물은 또한 약 4.5×10⁶단위의 HuIFN을 함유한다.

[실시예 A-13]

면역반응을 감소시키기 위해 약 400g렘(rem)의 X-선을 성숙한 생쥐들에게 조사한후 피하에 인체세포 Mono-1을 이식하고 또 3주일 동안 통상적인 방법으로 사육한다. 그 후에, 각각 약 10g 크기의 피하에 형성 수득된 큰 종양들을 실시예 A-10에서와 유사한 방법으로 추출하여 세절한후 분리한다.

그 후에, 인체세포들을 실시예 A-10에서 사용한 것과 동일한 조성의 새로운 배지에 재현탁시켜 동일한 세포밀도가 되게 한다. 이 세포현탁액에 콘카나발린A 및 센다이비루스를 각각 0.8㎍/㎖와 약 500 혈구응집반응역가/㎖의 양으로 첨가한후, 수득된 혼합물을 약 37℃에서 1일 동안 배양하여 TNF 생산성을 유도한다.

수득된 배양액을 이어 실시예 A-11에서와 유사한 방법으로 정제, 농축 그리고 건조하여 TNF 활성을 가지는 분말생성물을 수득한다.

TNF의 수율은 생쥐 한마리당 약 6.8×10⁹단위이다. 이 분말생성물은 또한 약 1.3×10⁹단위의 HuIFN를 함유한다.

[실시예 A-14]

신생 햄스터에 실시예 A-10과 유사한 방법으로 인페임파아구세포, 나말바(Namalwa)를 이식하고, 또이어 4주일 동안 통상적인 방법으로 사육한다.

실시예 A-11과 유사한 방법으로 각각 약 20g 크기로 피하에 형성 수득된 큰 종양들을 추출하여, 세절한후 분리해서 세포밀도가 약 3×10⁶세포/㎖인 세포현탁액을 수득한다. 이어, 이 세포현탁액에 약 1,000혈구응집반응 역가/㎖의 양으로 센다이비루스를 첨가하고, 또 이어 36℃에서 2일 동안 배양해서 TNF생산성을 유도한다. 그 후에, 배양액을 실시예 A-11에서와 유사한 방법으로 정제하고, 농축해서 TNF 활성을 가지는 농축액을 수득한다. TNF수율은 햄스터 한마리당 약 4.3×10⁹단위이다.

이 생성물은 또한 약 8.2×10⁶단위의 HuIFN를 함유한다.

[실시예 A-15]

인체 임파아구세포, NALL-1을 생리식염수용액에 현탁시킨후, 이 세포현탁액을 내부용적이 약 10㎖이며, 공칭공극 직경이 약 0.5μ인 막필터가 설치된 플라스틱으로 된 원통형의 확산챔버에 넣고 또 이 확산챔버를 성숙한 쥐의 복강내에 삽관하였다.

이어, 이 동물을 4주일 동안 통상적인 방법으로 사육하고, 또 확산챔버를 이 동물로 부터 제거한다.

이같이 해서 수득된 챔버내의 세포밀도는 약 5×10⁹세포/㎖로서 이는 영양배지를 사용하는 CO₂배양기에 의한 시험관 조직배양의 경우 수득된 값 보다 약 10²배 또는 그 이상에 해당한다.

증식된 인체세포를 실시예 A-10에서 사용한 것과 동일한 조성의 새로운 배지에 재현탁시켜 동일한 세포밀도가 되도록 하고, 또 수득된 세포현탁내에 각각 약 500 혈구응집 반응역가/㎖ 및 약 100㎍/㎖의 양으로 UV-조사로 미리 불활성화시킨 뉴캐슬병 비루스와 식물성혈구응집소를 첨가한후 37℃에서 2일간이 세포현탁액을 배양해서 TNF 생산성을 유도한다.

그 후에, 이 배양액을 실시예 A-11과 유사한 방법으로 정제, 농축 그리고 건조해서 TNF 활성을 가지는 분말생성물을 수득한다.

TNF의 수율은 쥐한마리당 약 2.6×10⁹단위이다. 이 분말생성물은 또한 9.4×10⁶단위의 HuIFN를 함유한다.

[실시예 A-16]

인체 임파아구세포, JBL을 37℃에서 5일간 배양한 수정된 달걀의 요막공동에 이식하고 또 이 달걀을 동일 온도에서 추가로 1주일간 더 배양한다.

그 후에, 증식된 인체세포들을 실시예 A-10에서 사용한 것과 동일한 조성의 새로운 배지에 현탁시켜서 세포밀도가 5×10⁶세포/㎖가 되도록 한다. 이어, 세포현탁액에 약 1,000 혈구응집반응역가/㎖양으로 센다이비루스를 첨가하고, 또 37℃에서 1일간 배양해서 TNF 생산성을 유도한다. 이 배양액을 실시예 A-11에서와 유사한 방법으로 정제하고 농축해서 TNF 활성을 가지는 농축액을 수득한다.

TNF 수율은 수정된 달걀 10개당 약 1.5×10⁶단위이고, 또 입수 가능한 물리화학적 성질들은 Carswell 동이 보고한 성질과 잘 일치된다. 이 농축액은 또한 수정된 달걀 10개당 약 4.0×10⁵단위의 HuIFN을 함유한다.

실시예에서 수득된 본 발명 TCLF는 예를 들명, 주사액, 내부용 또는 외부용 투여약제, 점안제 또는 점비제의 형태 단독으로 또는 1개 또는 그 이상의 약제와 결합 사용하므로서 TCLF-감작(感作) 질병의 예방 및 또는 치료제로 유리하게 사용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 "TCLF-감작 질병"이란 용어는 TCLF를 사용하여 예방 및/또는 치료할 수 있는 인간의 모든 질병을 의미하며 예를 들면, 유방암, 폐암, 자궁암, 방광암, 결장암, 위암, 빈형성, 백혈병, 임파종 및 피부암과 같은 악성종양을 의미한다.

다음의 실험 B와 C는 본 발명 TCLF의 효능, 독성, 처방 및 투여량을 설명하는 것이다.

[실 험 B]

TNF의 효능과 독성

[실 험 B-1]

BALB/C 누우드생쥐들의 등부분 피하에 인체 유방암 조직의 소편(小片을 이식한다. 수득 종양이 약 200㎣가 되도록 성장시킨후, 실시예 A-10에서 수득된 TNF 제제의 분취량을 100 단위/kg/일 또는 1,000단위/kg/일의 투여량으로 매우 정맥 주사한다.

15일간 주사한후 이 동물들을 해부하고 또 수득된 큰 종양의 무게를 측정한다. 수득된 결과는 다음 표 Ⅱ에 수록한다. 대조 실험으로서 TNF-부재의 생리식염수용액을 정맥주사한다.

[표 Ⅱ]

주 : *는 값이 대조실험에 대해 5%의 신뢰한계로 통계적 의미를 갖음을 의미한다.

[실 험 B-2]

각각의 체중이 약 25g이고, 그룹당 10마리의 숫컷 BDF₁생쥐들로 구성되는 그룹들의 등부분 피하에 2㎟의 루이스(Lewis) 폐암조직을 이식한다. 이식하고 8일이 경과한 후에, 실시예 A-10에서 수득한 TNF를 100단위/kg/일 또는 1,000단위/kg/일의 투여량으로 매일 정맥주사한다. 21일 동안 주사한후 이 동물들을 해부하고 또 수득된 종양의 무게를 측정한다.

수득결과는 다음 표 Ⅲ에 수록한다. 대조실험으로서 TNF-부재의 생리식염수용액을 정맥주사한다.

[표 Ⅲ]

주 : *는 값이 대조실험에 대해 5% 신뢰한계로 통계적 의미를 갖음을 의미한다.

[실 험 B-3]

실시예 A-10에서 수득된 TNF제제에 대해 생후 20일된 생쥐들을 이용하여 급성독성 실험을 한 결과 TNF제제의 독성이 매우 낮아서, 복강내 주사에 의한 LD₅₀이 200,000단위/kg 또는 그 이상임을 확인하였다. 다음의 실험 C는 TCLF의 한 형태인 임파독소의 효능, 독성, 처방 및 투여량을 설명하는 것이다.

[실 험 C]

[실험 C-1]

BALB/C 누우드생쥐들의 등부분 피하에 인체 유방암 조직의 소편을 이식한다. 종양이 약 200㎣으로 성장한 후에 실시예 A-9에서와 유사한 방법으로 수득한 7×10⁴내지 9×10⁴달톤, 3.5×10⁴내지 5×10⁴달톤 및 1×10⁴내지 2×10⁴달톤 분자량의 임파독소 시료들을 함유하는 임파독소 혼합물 분취량을 4단위/kg/일 또는 40단위/kg/일의 투여량으로 매우 두번씬 정맥주사한다.

15일 동안 주사한후, 이 동물들을 해부하고 또 수득된 종양의 무게를 측정한다. 수득된 결과는 다음 표Ⅳ에 수록한다. 대조실험으로서 임파독소-부재의 생리식염수용액을 정맥주사한다.

[표 Ⅳ]

주 : *는 값이 대조실험에 대해 5%의 신뢰한계로 통계적 의미를 갖고 있음을 의미한다.

[실 험 C-2]

그룹당 각각의 체중이 약 25g인 숫컷 BDF₁, 생쥐 10마리로 구성된 그룹들에 등부분 피하에 2㎟의 루이스 폐암조직을 이식한다. 이식하고 8일이 경과한 후에 실시예 A-9에서 수득한 분자량이 1×10⁴내지 2×10⁴달톤인 임파독소 혼합물 또는 γ-임파독소 제제를 하루에 두번씬 4단위/ kg/일 또는 40단위/kg/일의 투여량으로 정맥주사한다. 21일간 주사한 후, 이들 동물을 해부하고 또 수득된 종양의 무게를 측량한다. 수득된 결과는 다음 표 V 에 수록한다. 대조실험으로 임파독소-부재의 생리식염수용액을 정맥주사 하였다.

[표 V]

주 : *는 값이 대조실험에 대해 5% 신뢰한계로 통계적 의미를 갖고 있음을 의미한다.

실험 C-3

그룹당 각각의 체중이 약 25g인 숫컷 BDF₁생쥐 20마리로 구성된 그룹들에 등부분 피하에 생쥐 빈혈성 백혈병 세포, L-1210을 이식한다. 50%가 생존하게 되는 기간을 측정하기 위해 이식한 다음 날로 부터 매일 두번씩 30단위/kg/일 또는 300단위/kg/일의 투여량을 정맥주사 한다.

대조실험으로서 임파독소-부재의 생리식염수용액 또는 미토마이신(mitomycin) C를 0.5mg/kg/일의 투여량으로 정맥주사한다. 수득된 결과는 다음 표 Ⅵ 에 수록한다.

[표Ⅵ]

전술한 표Ⅵ에 수록된 실험 결과로 부터 임파독소 혼합물의 투여량이 상대적으로 소량임에도 불구하고 1 일 투여회수를 한번에서 두번으로 증가시킴으로서 보다 효과적인 치료를 기대할 수 있다는 사실을 확인하였다.

실험 C-4

그룹당 각각의 체중이 약 25인 숫컷 BDF₁생쥐 10마리로 구성된 그룹들에 생쥐 빈혈성백혈병 기원의 세포계통 P 388의 이식한다. 이식 다음 날로부터 이 동물들에 매일 정맥내로 임파독소 혼합물을 30일간 주사하여 투여량과 생존일수 또는 생존율(%) 사이의 관계를 측정한다.

대조심험을 위하여 임파독소-부재의 생리식염수용액 또는 미토마이신 C를 0.5mg/kg/일의 투여량으로 정맥주사한다. 다음 표 Ⅶ에 수득 결과를 수록한다.

전술한 표 Ⅶ의 실험결과로 부터 자명한 바와 같이 임파독소 혼합물이 예방제 또는 치료제로 사용또는 경우에는 1,000단위/kg/일 또는 그 이상과 같이 투여량이 많을수록 더욱 효과적이다.

[표 Ⅶ]

실 험 C-5

급성독성

실시예 A-9에서와 유사한 방법으로 수득된 임파독소 혼합물을 생후 20일된 생쥐들 그룹에 투여하는 급성독성 실험 결과 임파독소 혼합물의 독성은 복강내주사로서 LD₅₀이 10000단위/kg 또는 그 이상으로 아주 낮다는 사실을 확인하였다.

시험관내 세포증식의 50% 억제에 요구되는 임파독소 혼합물의 농도는 정상인 체세포포 또는 인체종양세포를 사용해서 통상적인 방법으로 측정한 결과 다음과 같은 결과를 얻게 되었다 ; 예를 들면, 인체장세포(407계통), 인체창(Chang)간세포 및 기라트디(Girardi) 심장세포와 같은 정상인체 세포인 경우는 농도가 20,000단위/m

또는 그 이상으로 아주 높은 반면 비인강(鼻咽腔) 기원의 KB 세포, 인체후두 기원의 HEp-2세포 및 폐암 기원의 HEL 세포와 같은 인체종양세포인 경우, 농도는 각각 18단위/m

,24단위/m

및 33단위/m

등으로 아주 낮다.

전술한 실험으로 부터 명백한 바와 같이, 본 발명 TCLF는 많은 투여량으로도 정상세포에 어떠한 실질적인 영향을 끼치지 않고 반면 적은 투여량으로 종양세포에 현저한 영향을 미친다는 관점에서 매우 안전하고 또 효과적이다.

따라서 각종 TCLF-감작 질병들의 치료에 유리하게 사용될 수 있다.

악성종양으로 고통을 받는 환자에게 TCLF를 투여하기 전에 만약 필요하다면 환자로 부터 추출된 종양조직편을 시험관 내에서 처리하여 그 면역유전성(immunogenicity)을 향상시키고 또 환자에 투여하여 악성종양의 더욱 효과적인 치료를 수행하도록 할 수 있다.

본 발명 TCLF의 투여량은 통상 성인을 기준으로 1 일 5-50,000,000단위의 범위내이다. 특히 점안제 또는 국소 주사와 같은 국소투여의 경우는 1일 5-1,000,000단위; 연고 또는 좌약과 같은 경피 또는 경점막 투여형태의 경우는 1일 10-5,000,000단위; 정맥 또는 근육주사와 같은 전신계 투여의 경우는 1 일 50-10,000,000단위; 경구투여의 경우는 1 일 500-500,00,000단위이다. 그러나, 이 투여량은 처방이나 환자의 증세에 따라 얼마든지 변경될 수 있다.

필요한 경우에는 이들 TCLF를 종래의 담체, 기체 및/또는 부형제와 혼합한후 종래방법에 따라 약제로 조제할 수 있다 하더라도 이에 포함된 TCLF의 함량은 그 특성, 효과적인 투여량 및 안정성을 감안해서 최소한 g당 5 단위는 되어야 한다.

악성종양용 약제의 모양가 형태는 유효성분이 함유되어 있는 한 어떠한 형태가 되어도 상관이 없다; 예를 들면, 경구투여를 위해서는 예컨데 캡슈울, 정제 또는 분말과 같은 장(腸)을 제제형태로 제조될 수 있으며; 직장투여를 위해서는 좌약형태; 또한 점비제, 점안제 또는 연고뿐만 아니라 주사를 위해서는 예를 들면 사용전에 증류수로 용해시켜 주사용액으로 만들어 사용하는 동결 건조 주사용 분말의 형태를 취할 수도 있다.

다음 실시예들은 TCLF를 함유하는 제제를 예시하는 것으로, 본 발명의 범위를 결코 이들로 한정하는 것은 아님을 밝혀둔다.

[실시예 B-1]

주사제

실시예 A-9에서와 유사하게 수득한 임파독소 혼합물 20,000단위를 200m

의 생리식염수용액에 용해시켜 제조한 임파독소 용액을 무균상태 하에서 막필터를 사용해서 여과한다.

여과액의 2m

분취량을 살균한 유리 바이알에 담고 동결 건조한후 포장하여 표제 생성물을 수득한다.

이 주사제는 유방암, 폐암, 간암 및 빈혈성백혈병 치료에 유리하게 사용될 수 있다.

[실시예 B-2]

연고제

실시예 A-3에서와 유사한 방법으로 수득한 임파독소 혼합물을 최소량의 액체 파라핀과 혼합하고, 이 혼합물을 다시 와세틴과 혼합하여 g당 50단위의 임파독소를 함유하는 연고를 통상적인 방법에 따라 수득한다.

이 연고제는 피부암, 유방암 또는 임파종 치료에 유리하게 사용될 수 있다.

[실시예 B-3]

점안제

800m

의 증류수, 5m

의 β-페닐에틸알코올 및 실시예 A-6에서와 유사한 방법으로 수득한 임파독소 혼합물 40,000단위의 혼합물을 추가량의 증류수에 용해시킨 염화나트륨과 혼합해서 1,000m

의 동장액을 수득한다.

수득된 용액은 망막아종을 치료한 점안제로서 유리하게 사용할 수 있다.

[실시예 B-4]

장용(腸用) 피복정제

장용피복정제는 전분 말토오스 및 정제당(100㎎) 2,000단위의 임파독소를 함유하도록 실시예 A-9에서와 유사한 방법으로 수득한 분자량 1×10⁴내지 2×10⁴달톤의 임파독소 제제의 혼합물을 정제로 만들고 이들 정제를 매틸셀률로오스의 프탈산 에스테트로 피복해서 표제생성물을 수득하는 선행방법에 따라 제조한다.

이 정제는 결장암과 간암 치료에 유리하게 사용될 수 있다.

[실시예 B-5]

주사제

실시예 A-10에서 수득된 TNF 제제 500,000단위를 200m

의 생리식염수용액에 용해하여 제조한 TNF용액을, 무균상태하에서 막필터를 사용해서 여과한다. 여과액의 2m

분취량을 살균된 유리 바이알에 담고 동결 건조한후 포장하여 표제 생성물을 수득한다.

이 주사제는 유방암, 폐암, 간암 및 빈형성백혈병 치료에 유리하게 사용될 수 있다.

[실시예 B-6]

연고제

실시예 A-11에서 수득된 TNF 제제를 최소량의 액체 파라핀과 혼합하고 또 이 혼합물을 다시 와셀린과 혼합하여 g당 TNF 함량이 20,000 단위인 연고제를 통상적인 방법에 따라 수득한다.

이 연고제는 피부암, 유방암 및 임파총 치료에 유리하게 사용될 수 있다.

[실시예 B-7]

점안제

800m

의 증류수, 5m

의 β-페닐에틸알코올 및 실시에 A-14에서 수득된 TNF 제제 20,000,000 단위의 혼합물을 추가량의 증류수 및 염화나트륨과 함께 혼합하여 1,000m

의 등장액을 수득한다.

이 용액은 망막하종을 치료하는 점안제로서 유리하게 사용될 수 있다.

[실시예 B-8]

장용피복정제

장용피복정제는 전분, 말토오스 및 실시예 A-12에서 수득된 TNF 제제의 혼합물을 정제당(100mg) TNF를 200,000단위 함유하도록 정제로 만든후 이들 정제를 메틸셀률로오스의 프탈산 에스테트로 피복해서 표제 생성물을 수득하는 종래 방법에 따라 제조된다.

이 정제는 결장암과 간암을 치료하는데 유리하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

1. TCLF 생산능을 갖는 인체세포를 TCLF 유도체에 노출시켜 TCLF 생산을 유도하며, 또 축적된 이 TCLF를 수집 정제함을 특징으로 하는 TCLF(적상적혈구 붕괴인자)의 제조방법.
2. 제 1 항에 있어서, TCLF 생산능을 갖는 인체세포를 인간 이외의 온열동물에 이식하거나 또는 대안으로써 이들 인체세포에 인간 이외의 온열동물의 영양체액이 공급되도록 설계된 장치에서 이들 인체세포를 증식해서 TCLF 생산능을 갖는 인체세포를 증식시키고; 전술한 증식방법중 1 개 방법에 따라 증식된 인체세포를 TCLF 유도제에 노출시켜 TCLF 생산을 유도하고; 또 축적된 TCLF를 수집, 정제함을 특징으로 하는 TCLF의 제조방법.
3. 제 1 항에 있어서, 인체세포가 BALL-1, 나발바(Namalwa), CCRF-SB, TALL-1, MOLT-3, NALL1, Mono-1, JBL, EBV-HO 및 단핵세포 기원의 주화세포들로 구성되는 군으로 부터 선정한 1 개 또는 그 이상의 세포인 TCLF의 제조방법.
4. 제 1 항에 있어서, IFN-α 또는 IFN-γ 유도제가 TCLF 유도제로 사용는되 TCLF의 제조방법.
5. 제 4 항에 있어서, IFN-α 유도제가 비루스이고, 또 IFN-γ가 식물성혈구응집소 또는 콘카나발린A(Concanavalin A)인 TCLF의 제조방법.
6. 제 1 항에 있어서, TCLF와 HuIFN이 동시에 제조되는 TCLF의 제조방법.
7. 제 1 항에 있어서, 상기 TCLF 가 분자량이 1×10⁴내지 1×10⁵달톤의 범위내이고, 또 당류함량이 5 내지 45%인 글리코프로테인들인 TCLF이 제조방법.
8. 제 1 항에 있어서, TCLF가 약 1×10⁴내지 2×10⁴달톤, 약 3.5×10⁴내지 5×10⁴달톤과 약 7×10⁴내지 9×10⁴달톤 분자량을 갖는 1 개 이상의 시료를 함유하는 TCLF의 제조방법.
9. 제 1 항에 있어서 TCLF가 임파독소 또는 TNF를 함유하는 TCLF의 제조방법.