JPS58203917A - 糖蛋白質およびその製法ならびに腫瘍治療剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は瀉血動物の網内系細胞、リンパ芽球、白血病細
胞もしくは繊維芽細胞の抽出液または培葺、し清から取
得した新規な糖蛋白質、およびその製法、ならびにこの
糖蛋白質を有効成分として含有する腫瘍治療剤に関する
。

現在、腫瘍の完全な薬物治療法はなく、これまで世界各
国の多数の研究者により多くの腫瘍治療剤が開発されて
来たにもかかわらず、依然として臨床においては新しい
治療薬や多剤併用ｗＲ法が試みられている。腫瘍の治療
剤は、癌化学療法剤と癌免疫療法剤に大別されている。

癌化学療法剤は、いわゆる細胞毒であり、細胞の増殖を
非特異的に抑制するこ七により作用を発現するので、腫
瘍細胞ばかりでなく正常細胞にも作用して、白血球減少
症、不妊、脱毛、催奇形、発癌など極めて重篤な副作用
を示すため、その使用饅には厳密な制限が設けられてい
る。

また、癌免疫療法剤は、直接に腫瘍細胞の増殖を抑制す
るのではなく、生体防御機能に働きかけて間接的に腫瘍
の増殖を抑制することにより治療作用を発現するので癌
化学療法剤に比して重篤な副作用の発現は極めて少ない
が、腫瘍患者においては生体防御機能が充分残っていな
い場合も多く、その治療効果は癌化学療法剤に比して必
ずしも充分ではない。

本発明者らは、生体防御機能の中で重要な役割を果して
いる網内系細胞が腫瘍を治療しうる物質を産生じている
可能性があると考え、多年にわたり研究を続けて来た。

既に網内系細胞からはリンホトキシン、腫瘍壊死因子、
インターフェロンなどと称する腫瘍治療作用の期待でき
る因子が採取され、それぞれ、グランジャーら（Ｇｒａ
ｎｇｅｒ　　Ｇ、Ａ、　　ｅｔａｌ、　、　Ｃｅ１ｌｕ
ｌａｒ　Ｉ　ｌ１ｕｎＯＩＯｏｙ　、　３８巻、３８８
〜４０２頁、１９７８年）、カースウェルら（Ｃａｒｓ
ｗｅｌｌ　Ｅ、　Ａ、ｅｔ　ａｔｌ、Ｐｒ０Ｃ，Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、　、７２巻、３６
６６〜３６７０頁、１９７５年）およびイサックら（（
５ｓａｃｓ、　Ａ　、−１Ｐｒｏｃ、Ｒｏｙ、　Ｓｏｃ
、Ｓｅｒ、　Ｂ。

、１４７巻、２６８頁、１９５７年）により報告されて
いる。また、最近、本発明者らは免疫能を弱めたハムス
ターに増殖させたリンパ芽球の培養液中から、前述した
リンホトキシンおよび腫瘍壊死因子などを併せ含有する
混合組成物として腫瘍破壊因子（Ｃａｒｃｉｎｏ　−Ｂ
　ｒｅａｋｉｎｑ　Ｆａｃｔｏｒ、、以下ＣＢＦと略称
する。）を多量に、かつ、容易に分取することに成功し
、このＣＢＦが動物に移植した実験腫瘍に有効であると
発表（誘光新聞、１９８１年、１１月２２日、朝刊）し
て来た。本発明者らは、このＣＢＦの研究過程において
、抗腫瘍性糖蛋白質（腫瘍破壊物質×１すなわち、Ｃａ
ｒｃｉｎｏ　−Ｂｒｅａｋｅｒ　　Ｘ　１以″ＦＣＢ×
と略称する。）なる抗腫瘍作用を有する糖蛋白質を見出
したが、さらに、瀉血動物の網内系細胞、リンパ芽球、
白血病細胞もしくは繊維芽細胞の抽出液または培養上清
に、前記した細胞障害因子などの物質とは異なる糖蛋白
質を見出し、この糖蛋白質が極めて強力かつ選択的な腫
瘍細胞障害作用により特徴づけられる腫瘍治療作用を有
すること、およびこの糖蛋白質を容易に製造し得る方法
を見出し、本発明を完成した。

本発明の糖蛋白質（以下、本物質を腫瘍破壊物質×２、
すなわちＣａｒｃｉｎＯ−Ｂ　ｒｅａｋｅｒ　　Ｘ　２
と称し％ＣＢＸ２と略称する。）の物理的、化学的なら
びに生物学的諸性質を詳述する。

■分子量；セファデックスＧ−１００（ファルマシア社
）を用い、０．０１Ｍリン酸緩衝液（１）８７．２＞を
ｍｓとしてゲル濾過を行ない分子量を測定したところ、
その分子量は、４０．０００〜５０，０００である。

■呈色反応：　ｃＢｘ　２の水溶液について呈色反応を
試験した結果を第１表に示す。なお、ローリ−およびニ
ンヒドリン反応は、生化学実験講座、１巻、蛋白質定量
法、１９７１年記載の方法、フェノール硫酸法、アンス
ロン硫酸、ナフトール硫酸、インドール硫酸およびトリ
プトファン硫酸反応は、生化学実験講座、４巻、糖質定
量法、１９７’１年記載の方法、ホルフ反応は、生化学
実験講座、３巻、脂質定量法、１９７１年記載の方法に
従って行なった。

第　　１　　表 以上のように、ＣＢＸ　２は蛋白質および糖質の呈色を
示し、脂質の呈色は示さない。

■性状・溶解性；白色粉末であり、水、塩化す１〜リウ
ム水溶液およびリン酸緩衝液に可溶であり、ベンゼン、
ヘキサンおよびクロロホルムにほとんど溶けない。

■糖含有１：Ｃ３Ｘ２の糖含有量およびその組成をスピ
ロ（Ｓｐｉｒｏ、　Ｈ，Ａ、　、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ
　Ｅｎｚｙｒａｏ＋ｏｇｙ　、　８巻、３〜２６頁、１
９６６年）の方法に準じて測定した結果、本物質の糖含
有量は３０〜３７％であり、さらにその糖成分はヘキソ
ース２０〜２３％、ヘキソサミン６〜８％、シアルｒａ
４〜６％である。

■等電点；アンホラインを用いた等電点電気泳動におい
て、ＣＢＸ２の等電点を測定したところ、４．２〜７．
３である。

■ウレックス・ヨーロベウス・アグルチニン結合セフ１
デックスを用いた分画操作において、０．０１Ｍリン酸
緩衝液（ＤＨ７，２）中で吸着性である。

■Ｉ）ｌ−（２，Ｏ，Ｉ）Ｈ７，０もしくはｐＨ１１゜
０の水溶液中、４℃において２４時間以上、また、ｐＨ
７，０の水溶液中、６０℃において３時間以上、ＣＢＸ
２のゲル濾過法による分子量および腫瘍細胞障害活性が
安定である。

■正常細胞には実質的に障害を与えず、腫瘍細胞に選択
的に障害を与える。ｃｓｘ　２の細胞障害性は、１０’
個の細胞に本物質添加下に、３７℃、５％炭酸ガス含有
酸素ガス通気下にて４８時間培養し、トリバンブルーに
よって染色されない生残細胞数を計数し、５０％増殖抑
制濃度で示した。本物質の１単位は１０５個のに８１［
１胞の増殖を５０％抑制する濃度である。

ＣＢＸ２は網内系細胞、リンパ芽球、白血病１１［１胞
もしくは織帷芽細胞から取得されるリンホトキシンやｌ
！ｌ瘍壊死因子などあるいはこれらの混合物であるＣＢ
ＦｌまたインターフェロンやＣＢｘとは次の点で明確に
区別することができ、明らかに異なる物質である。リン
ホトキシンは、その分子量からα−リンホトキシン７０
．０００〜９０，０００、β−リンホトキシン３５゜０
００〜５０，０００、γ−リンホトキシン１ｏ、ｏｏｏ
〜２０．０００の３種、が存在することが知られている
（　（：、　ｏｈｅｎらＩＩＡ　ｒ　Ｂ　ｉｏｌｏｇｙ
ｏｆ　ｔｈｅ　ｌ、　ｙｍｐｈｏｋｉｎｅｎｓ　Ｊ　、
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ。

１９７９年）。この内、α−リンホトキシンおよびγ−
リンホトキシンはその分子量から明らかにＣＢＸ２と異
なる。さらに、β−リンホトキシンは分子量３５．−０
００〜５０，０００の糖蛋白とグランジャーらにより報
告されている（Ｇｒａｎｇｅｒ　　Ｇ、　Ａ、　ｅｔ　
ａｌ、、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　ｌ　ｗ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ
　、　３８巻、３８８〜４０２頁、１９７８年）が、グ
ランジャーらの方法に従って調製したβ−リンホトキシ
ンはウレツクス・ヨーロベウス・アグルチニン結合セフ
ァデックスに対して、０．０１Ｍリン酸緩衝液中で非吸
着であり、またル−カスら（Ｌｕｃａｓ　　ｌ、　Ｊ、
ｅｔ　ａｌ、Ｊ　、ｌ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　、１０９
巻、１２３３頁、１９７２年）が報告しているようにそ
の細胞障害性において選択性がなく、ＩＩ瘍細胞および
正常細胞を同様に障害する。しかしＣＢＸ２はその細胞
障害性において腫瘍選択性であり明らかにβ−リンホト
キシンはＣＢＸ　２と異なっている。

また、安定性において、β−リンホトキシンは、５６℃
、４時間処理において６０％その細胞障害性が失活する
がＣＢＸ　２はほとんど失活せず安定性においても大き
く異なっている。

腫瘍壊死因子は選択的に！ｌ！瘍細胞に対して障害作用
を示し、その分子量は３３．０００〜６３．０００、糖
含有量は０％（（：、　ａｒｓｗｅｌｌ、　Ｅ　。

Ａ、　ｅｔ　ａｌ、、ｐ　ｒｏｃＪＪ　ａ口、Ａｃａｄ
、ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、Ａ１．７２巻、３６６６〜３６
７０頁、１９７５年）または分子量３９，０００、糖含
有量４０％（日本経済新聞、１９８１年、８月２３日、
朝刊）であり、両者とも糖含有量においてｃｓｘ　２と
は異なっている。

さらに、これらの細胞障害因子を混有するＣＢＦは、分
子量が約３５，０００（日本経済新聞、１９８１年１１
月２２日、朝刊）であり、明らかにＣＢＸ　２と異なっ
ている。

また、ＣＢＸ　２はインターフェロンとは抗ウィルス作
用のない点で、ＣＢＸとは分子量の点で明らかに異なっ
ている。ＣＢＸの分子量は１２．０００〜１７，０００
である。

次に本発明に用いた細胞について述べる。

本発明において使用されるヒトまたは−ヒｌ〜以外の瀉
血動物由来の細胞は、網内系ＩＨ１２Ｊ、リンパ芽球、
白血病細胞もしくは繊維芽細胞であれば良く、初代培差
または培養株化された細胞のいずれを用いることもでき
、好ましくは、ヒトの治療にＣＢＸ　２を供するには、
ヒト由来の細胞であることが、治療上に生じる抗原性な
どの副作用面において安全である。このような細胞とし
ては、例えば、ミヨシ（Ｍ　１ｙｏｓｈｉ、　１　、、
Ｎａｔｕｒｅ　１２６７巻、８４３〜８４４頁、１９７
７年）により報告されたＢＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬＬ−
１細胞、ＮＡＬＬ−１細胞、ジャーナル・オプ・クリニ
カルマイクロバイオロジー（Ｊ　、　Ｃｌ１ｎ　、　Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌ、　、１巻、１１６〜１１７頁１，４
９７５年）に記載されたＮａｍａ１ｗａ細胞、ジャーナ
ル・オプ・イムノロジー（Ｊ　。

１　　＋＋ｎｕｎｏｌｏｇｙ　　、　　１　１　３　　
巻、　１３３４〜１３４５負、１９７４年）に記載され
たＭ−７００２輻胞、Ｂ−７１０１細胞、７０つ７００
０細胞〈フロラ社）、「組織培養」　（６巻、５２７〜
５４６頁、１９８０年）に記載されているＪＢｌ−細胞
、ＥＢＶ−８ａｌｌ胞、ＥＢＶ−Ｗａ細胞、ｒ　Ｆ３　
Ｖ−Ｎ　Ｏ細胞や、その他ＢＡＬＭ２細胞、ＣＣＲＦ−
８８細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１２０）などの株化細胞、ヒ
ト由来のリンパ球、マクロファージ、さらには、ヒト由
来のリンパ球、マクロファージを各種ウィルス、薬剤、
放射線などで処理し培養株化させた細胞などが自由に使
用できる。

また、ヒト以外の瀉血動物由来の細胞としては、例えば
、マウスＢＡＬＢ／Ｃ３Ｔ３細胞（フロラ社）、マウス
白血病細胞であるＬ１２１０細胞（Ｊ　、　Ｎａｔｌ、
Ｃａｎｃｅｒ　ｌ　ｎｓｔ、、１３巻、１３２８頁、１
９５３年）やＰ３８８細胞（ＳｃｉｅｎｔＨｉｃ　Ｐｒ
ｏｃｅｅｄｉｎｏｓ、　Ｐａｔｈｏｌｏｏｉｓｔｓ　＆
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｓｔｓ、　３３巻、６０３頁
、１９５７年）、マウス黒色腫瘍Ｃ１ｏｎｅ　　Ｍ−３
（７０つ社）、ラット腫瘍ＬＬＣ−ＷＲＣ２５６（）０
つ社）、ハムスター黒色腫瘍ＲＰＭ１１８４６（フロラ
社）の他、リンパ球、マクロファージなどが使用できる
が、本発明で用い得る細胞は、前記のものに限定される
ものではない。

次に本発明のＣＢＸ　２の生成方法を述べる。

前記したヒトまたはヒト以外の温血動物由来の細胞より
ＣＢｘ　２を生成させる方法は自由であり、細胞より直
接そのまま、または、培養増殖させてＣＢｘ　２を採取
することもできるが、さらに多量のＣＢｘ　２を所望す
るなら、誘導剤をそれらの細胞に作用させることもでき
る。例えば、ヒトまたはヒト以外の瀉血動物由来の細胞
を適当な培地に浮遊させ、誘導剤を１接細胞に作用させ
てＣＢＸ２を誘導生成させ、その浮遊液力らＣＢｘ　２
を採取すれば良い。

ＣＢｘ　２の誘導剤としては、通常、例えば、フィトヘ
マグルチニン、コンカナバリンＡ１ボークウイードミト
ーゲン、リボポリサツカリドなどのレクチン、ホスホマ
ンナン、デキストランリン酸などの多糖類、エンドトキ
シン、菌体成分、細菌、ウィルス、核酸およびボリメク
レオチドなどの一種もしくは二種以上が用いられる。ま
た、感作化された細胞にとっては抗原もＣＢｘ２誘導剤
である。

このようにして生成されたＣ　Ｂ　Ｘ　２は公知の精製
分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分離、濃縮、
凍結乾燥などを行なうことによって容易に採取できる。

さらに高度には、イオン交換体への吸着、溶出、ゲル濾
過、電気泳動、または、抗体もしくはウレックス・ヨー
ロベウス・アグルチニン結合セファデックスなどを用い
たアフィニティクロマトグラフィーを用いても良い。

次に培養株化された細胞を温血動物の体内で増殖させる
方法について述べる。

本発明において使用されるヒトまたはヒト以外の温血動
物由来の培養株化された細胞は網内系細胞、リンパ芽球
、白血病細胞もしくは繊維芽細胞であれば良く、好まし
くは、ヒトの治療にＧ　Ｂ　Ｘ　２を供するには、ヒト
由来の細胞であることが、治療上に生じる抗原性などの
副作用面において安全である。このような細胞としては
、先に述べたように、例えば、ＢＡＬＬ−１細胞、ＴＡ
ＬＬ−１細胞、ＮＡＬＬ−１細胞、Ｎ　ａｉａ１ｗａ細
胞、Ｍ−７００２細胞、８−７１０１細胞、７０つ７０
００細胞、８ＡＬＢ１０３Ｔ３細胞、Ｌ１２１０細胞、
Ｐ３８８細胞、リンパ球、マクロファージなどが自由に
使用できる。

また、かかる細胞を直接移植するか、または、細胞を拡
散チャンバーに接種して植込む温血動物は、これらのヒ
トまたはヒト以外の温血動物由来の培養株化された細胞
が増殖し得るものであれば、同種または異種の動物であ
っても良く、例えば、ニワトリ、ハトなどの鳥類、イヌ
、ネコ、サル、ウサギ。ヤギ、ブタ、ウマ、ウシ、モル
モット、ラット、ハムスター、普通マウス、ヌードマウ
スなどの哺乳類が使用できる。

なお、これらの動物に異種の動物由来の培養化された細
胞を移植する場合には、好ましくない免疫反応を生じる
おそれがあるので、その反応をできるだけ抑えるため、
使用する動物はできるだけ幼若な状態、すなわち、卵、
胚、胎児、または新生剤、幼少期のものの方が好適であ
る。

また、これらの動物に例えば、２００〜６００レム程度
のエックス線、もしくは、免疫抑制剤などを注射するな
どの前処理をほどこし、免疫反応を抑えることもできる
。

使用する動物がヌードマウスまたはヒト以外の温血動物
由来の培養株化された細胞にとっても同種である場合に
は、成長したものであっても免疫反応が弱いので、前記
した前処置を必要とすることなく、ヒトまたはヒト以外
の温血動物由来の培養株化された細胞が移植でき、急速
に増殖させることができるので、特に好都合である。

また、ヒトまたはヒト以外の瀉血動物由来の細胞を、例
えば、まず、ハムスターに移植して増殖させた後、この
細胞をさらにヌードマウスに移植するなどのように、ヒ
ト以外の瀉自動物間で移植して細胞の増殖をより安定化
したり、さらにそれから生成されるＣＢＸ２Ｊｌを増加
させることも自由である。

この場合、同種間、同属間は勿論のこと同綱間、同門間
移植であってもよい。ヒト由来の細胞を移植する動物体
内の部位は、移植した細胞が増殖しうる部位であればよ
く、例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に選ばれ
る。

また、直接動物体内にヒトまたはヒト以外の場面動物由
来の培養株化された細胞を移植することなく、動物細胞
の通過を阻止し得る多孔性の濾過躾、例えば、孔径的１
０”７〜１０°３−を有するメンブランフィルタ−１限
外濾過膜またはフォローファイバーなどを設けた公知の
各種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体内、例えば
腹腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含む体液の供
給を受けつつ、そのチャンバー内で前述の培養株化され
たヒト由来の細胞を何れも増殖させることができる。。

また、必要に応じて、こ９ｔヤンバー内の栄養物を含む
溶液を動物体内の体液と接続し、潅流させるようにした
チャンバーを、例えば動物体表に取付け、チャンバー内
のヒト由来の細胞の増殖状態を透視できるようにするこ
とも、また、このチャンバ一部分のみを着脱交換できる
ようにして動物を屠殺せずに寿命一杯ｍＷ＆を増殖さｔ
ｉ　ｒ、動物個体当りの細胞生産量を更に高めることも
できる。

これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒトまたは
ヒト以外の場面動物由来の株化された細胞が動物細胞と
直接接触しないので、この細胞のみが容易に採取できる
だけでなく、好ましくない免疫反応を起す心配も少ない
ので、免疫反応を抑制する前処置の必要もなく、各種瀉
血動物を自由に利用できる特徴を有している。

移植した動物の維持管埋は、その動物の通常の飼育管理
を続ければよく、移植後といえども特別の取扱いは伺ら
必要としないので好都合である。

ヒトまたはヒト以外の瀉血動物の培養株化された細胞を
増殖させるための期間は通常１〜１０週の期間で目的を
達成することができる。このようにして得られるヒトま
たはヒト以外の場面動物由来の培養株化された細胞数は
動物個体当り１０’〜１０”Ｉｔ、またはそれ以上に達
することも見出した。

換言すれば、本発明で使用するＣＢＸ　２の製造方法に
より増殖させたヒト以外のｌ１面動物由来の培養株化さ
れた細胞数は、動物個体当り移植した細胞数の約１０８
〜１０７倍、また１、１それ以上にも達し、生体外の栄
養培地に接種して増殖させる場合の約１０〜１０６倍、
またはそれ以−りにも達して、ＣＢＸ　２の製造のため
に極めて好都合である。

このようにして増殖させたヒトまた＆まヒト以外の場面
動物由来の培養株化された細胞ｈ＼ら、ｃａｘ　２を精
製させる方法は自由である。それが増殖した動物体内の
ままで採取することもできる。例えば、腹腔内の腹水に
浮遊状で増殖したヒトまたはヒト以外の瀉血動物由来の
培養株化された細胞に、または皮下に増殖させｌこ細胞
より、直接そのままＣＢＸ２を採取すればよ６Ｘ。

また、ヒトまたはヒト以外の瀉血動物由来の培養株化さ
れた細胞を動物体内に増殖させたまま、または、体外に
取り出し、生体外で誘導剤を作用させてＣＢ　Ｘ　２を
誘導生成させることもできる。例えば、腹水中で増殖し
たヒトまたはヒト以外の場面動物由来の培養株化された
細胞を分取し、また皮下に生じたヒトまたはヒト以外の
瀉血動物由来の培養株化された細胞を含む腫瘍を摘出、
分散し、得られる細胞を約２０〜４０℃に保った栄養培
地に細胞濃度が約１０％〜１０”／ｍｌになるように浮
遊させ、これにＣＢＸ２の誘導剤を作用させることによ
ってＣＢＸ２を誘導生成させ、これを採取すればよい。

さらに、ヒトまたはヒト以外の瀉血動物由来の培養株化
された細胞を拡散チャンバー内で増殖させた場合は、増
殖させた細胞をチャンバー内のままで、またはチャンバ
ーから取り出して、直接そのまま、または、誘導剤を作
用させＣＢＸ２を採取することもできる。

また、例えば増殖させたヒトまたはヒト以外の場面動物
由来の培養株化された細胞にまず動物体内のままでＣＢ
Ｘ２を誘導生成させたのち、ついで同一動物個体の特定
の部位または全体から採取したヒトまたはヒト以外の瀉
血動物由来の培養株化された細胞に動物体外でＣＢＸ２
を誘導生成させる方法、また再度ｃｓｘ　２の誘導生成
に使用する方法、または動物体内に埋設、もしくは接続
するチャンバーを交換して得られる細胞数を増加させる
方法などによって、使用する動物個体当りのｃｓｘ　２
生成−を史に＾めることも自由である。

なお、ＣＢＸ　２を誘導生成するには、先に述べたＣＢ
Ｘ２の誘導剤を用いれば良く、このようにして生成され
たＣＢＸ２も先に述べた公知の生成分離法、ざらに＾度
な生成分離法などを用いても良い。

後述する実験例から明らかなように、ＣＢＸ２は腫瘍細
胞に選択的な増殖抑制作用を示し、へ しかも癌転移を著明に抑制するばかりでなく、極めて多
種多様の腫瘍に有効であったにもかかわらず、これらの
薬理作用を示す用量に比して充分高い用量においても、
まったく安全であり、腫瘍の治療に用いて極めて有用で
ある。ＣＢＸ２は、通常用いられる投与法である注射剤
、点眼剤、点鼻剤、吸入剤、外用剤、経口投与用剤、直
腸投与用剤、腟内投与用剤などに用いることができる。

また、ＣＢＸ　２の成人１日当りの治療−は、その安全
性から考えて、特に限定するまでもないが、０．５〜５
００．０００単位であり、さらに好ましくは、局所適用
においては０．５〜５．０００１＄位−１静脈注射、筋
肉注射などの全身注射においては２０〜１００．０００
１１位、軽口投与においては、５０〜５００゜０００単
位であり、用法あるいは症状に応じて適宜増減すること
ができる。

ＣＢＸ２は任意慣用の一薬用担体、基剤あるいは賦形剤
とともに慣用の方法で医薬用製剤とすることができる。

軽口投与剤としてはカプセル剤、錠剤、散剤などの謁１
製剤、直腸内投与剤としては直腸半期、注射剤としては
水溶性注　　　　□制剤あるいは同時において注射用蒸
留水に溶解して使用する凍結乾燥注射剤、外用剤として
は軟膏剤あるいはローションとして用いるのが好ましい
。このほか、白眼剤、点鼻剤もしくは吸入剤として用い
ることもできる。

このようにして製造されたＣ　Ｂ　Ｘ　２について、以
下に有効性、毒性、用法および用量を述べる。

実験例１　細胞障害作用の選択性 腫瘍細胞であるＫＢ（鼻咽腔癌）細胞、ＭＸ−１（乳癌
）細胞（癌研究会、塚越茂博士より分与）　、ＨＥｐ−
２（咽頭癌）、ＨＥＬ（肝癌）細胞（）Ｌｌつ社）、正
常細胞である小腸（Ｉ　ｎｔｅａＬｉｎｅ）　４０７細
胞、ジラルデイ心臓（Ｇ　１ｒａｒｄｉ　　ｌ−１ｃａ
ｒｔ）細胞、チャング肝（Ｃｈａｎｏ　　Ｌｉｖｅｒ）
細胞、べ０　（Ｖｅｒｏ　、サル腎）細胞、ＭＤＣＫ（
イヌ腎）細胞（７０つ社）を、それぞれ、ｉｏ’ａあら
かじめ２４時間培ＩＩ、Ｐ３８８およびＬ　１２１０　
（白血病）細胞（癌研究会、塚越茂博ｔより分与）１０
Ｓ個を直ちに、被検物質を添加した１０％仔牛血清含有
イーグル培地１−！中で、３７℃、５％炭酸ガスを含む
酸素ガス通気下に４８時間培養した。培＊＊−了債、ト
リバンプルーで染色されない生残細胞数を光学順微繞下
に計数し、対照を１００として被検物質の５０％細胞死
滅ｓａ゛を計算した。被検物質としては、後述する実施
例２（製造例）で得たＣＢＸ２．公知方法（Ｑ　ｒａｎ
（１０ｒ、　Ｇ　、　Ａ　、　ｅｊａｌ　　、　、　　
Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　　Ｉ　　ＩＩｕｎｏｌｏ（ＩＶ　　
、　　３　８　巻、　３８８〜４０２頁、１９７８年）
により取得したβ−リンホトキシン、後述する実施例２
（製造例）でＣＢＸ２と分離されたＣＢＦならびにマイ
トマイシンＣを用いた。また、リンホトキシンおよびＣ
ＢＦの１単位は、マウスし細胞に対する障害性を指標と
する公知の方法（Ｂ　ｌｏｏｍ。

Ｂ、Ｒ，、Ｇｒａｄｅ、Ｐ、Ｒ，共＠　［［ｎ　ＶＯｔ
ｒＯｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｃｅｌｌ　−ｍｅｄｉａｔ
ｅｄ　ｉｍｍｕｎｉｔｙ　Ｊ　Ａｃａｄｅｍｉｃ　ｐｒ
ｅｓｓ、　１９７７年）により表示した。

結果を第２表に示した。

第２表 以［の結果から明らかなとおり、ＣＢＦと同様に正常細
胞に実質的には障害を与えることなく、腫瘍細胞に選択
的に障害を与えた。ただし、各々の腫瘍細胞に対する障
害作用強度は、ＣＢ×２とＣＢＦとの間で異なっていた
。これに対し、β−リンホトキシンおよびマイトマイシ
ンＣは、いずれも、正常細胞および腫瘍Ｉｌｌ胞に対し
、選択性のない障害作用を示した。

実験例２　ザルコーマ１８０およびエーリツヒ癌移植マ
ウス及ぼす影響 ザルコーマ１８０細胞、エーリツヒ癌細胞を体重２５〜
３０ｇのｄｄＹ系雄マウスに１匹当り３Ｘ１０’個を腹
腔内移植し、生存日数を観察した。後述する実施例１（
製造例）で得たＣＢ×２を、１群５匹のマウスに腫瘍移
植翌日より死亡直前まで連日静脈注射した。結果を対照
群の平均生存日数を１００として第３表に示した第３表 以上の結果より、ｃｓｘ　２はザルコーマ１８０および
エーリツヒ癌のいずれを移植したマウスにおいても、明
らかな抗腫瘍作用を示した。

実験例３　白血病マウスの生存日数に及ぼす影響体１１
２０〜２５ＱのＢＤＦ＋　ＩＡ雄ママウス腹腔内に１匹
当り１０’個のマウス白血病１．１２１０又は１０６個
のマウス白血病Ｐ３８８を移植し、生存日数を観察した
。１群を５匹として後述する実施例２（製造例）で得た
Ｃ　Ｂ　Ｘ　２を、移ｗ４翌日より死亡直前まで連日腹
腔内投与した。

結果を対照群の平均生存日数を１ｏｏとして第４表に示
した。

第４表 双トの結果より、ＣＦ３Ｘ　２はマウス白血病し１２１
０およびＰ２Ｓ５のいずれの担癌マウスにおいても、明
らかな抗腫瘍作用を示した。

実験例４　肺癌マウスの生存日数に及ぼす影響体Φ２０
〜２５ｐのＢＤＦ＋系雄マ系層の右大腿部筋肉内に２Ｘ
１０６個のルイス肺癌細胞を移植し、生存日数を観察し
た。１群を６匹とし・で、後述する実施例３（製造例ン
で得たｃ８×２を移植翌日より死亡直前まで連日静脈注
射した。結果を、対照群の平均生存日数を１００として
、第５表に示した。

第５表 以上の結゛果よりＣＢ　Ｘ　２は、ルイス肺癌担癌マウ
スにおいて、明らかに抗腫瘍作用を示した。

実験例５　癌の肺転移に及ぼす影響 １群６匹の体重２０〜３０ａのＢＯＦ＋系雄マ系層の背
部皮下に、ルイス肺癌２１１角片を移植し、９日後より
１２日間、後述する実施例１（製造例）で得たＣＢｘ　
２およびＣＢ　Ｆを１日１回静脈注射し、移植２１後に
原発巣腫瘍Φ―および肺転移結節数をウエクスラ（Ｗｅ
ｘｌｅｒ　。

Ｈ，）の方法（Ｊ、Ｎａｔ、ｌ　、　（：、ａｎｃｅｒ
　Ｉ　ｎ５ｔｉｔｕｔｅ、３５巻、６４１頁、１９６６
年）に従って算定した。結果を第６表に示す。

第６表 人中の結果は平均値上標準誤差で示した。

＊危険率５％以下で対照群に比し、推計学的に有意の差
あり。

以トの結果より、ＣＢｘ　２は原発巣の肺癌および肺転
移を極めて良く抑制したが、ＣＢＦは肺転移にほとんど
効果がなかった。

実験例８　毒性試験　（１回投与） 体重２０〜２５ｇのＢＤＦ、系層マウスを１群１０匹と
し、後述する実施例２（製造例）で得たＣ　Ｂ　Ｘ　２
を静脈注射して７日間の死亡花数を観察した。その結果
、ＣＢＸ　２１０，０００ψ位／ＫＯを投与しても、体
重、一般症状に変化なく、１０匹全綱が生存した。

実験例９　毒性試験　（３０日間連続投与）体φ２０〜
２５０のＢ　Ｄ　Ｆ　＋系雄マウスを１群１０匹とし、
後述する実施例１（製造例）で得たＣ　ＢＸ　２を３０
日間静脈注射し、死亡画数、体重変化、一般症状の観察
を行なった。体重は午前９時から１０時の間に測定し、
一般症状の観察は、アーウィンの方法（５ｃｉｅｎｃｅ
、　１３６巻、１２３頁曵１Ｏ６２年）に準じ、１０．
２０．３０日１に行なった。結果として、ＣＲｘ２を、
１，０００単位／ＫＱ　／日投与によって３０日間に死
亡例はなく、体重増加曲線も対照群と差がみられなかっ
た。また、一般症状においても対照群と同様に、異常を
認めなかった。

以トに、実施例を示すが、本発明はこれに限定されるも
のではない。

実施例１（製造例） ヒト末梢リンパ球２　Ｘ　１０１６個を４．０００１１
の１０％仔牛血清含有イーグル培地に浮遊させ、フィト
ヘマグルチニン（ディフコ社）を５０Ｐｇ／ｍｌとなる
よう添加し、３７℃、５％炭酸ガス含有酸素ガス通気下
、４８時間培養する。

培養終了後、上清を０．０１Ｍリン酸緩衝液（１）ｌ−
１７，２）に透析後、４０〜８０％硫安塩析画分を得る
。この画分を再び前記のリン酸緩物液に透析後、セファ
デックスＧ−１００（ファルマシア社）用いてゲル濾過
を行ない、分子１４０．０００〜５０，０００の分画を
得、相Ｇ　Ｂ　Ｘ　２自分とした。

相ＣＢ　Ｘ　２画分を、ウレツクス・ヨーロペウス・ア
グルチニン（丸善石油）結合セファデックスに吸着させ
、０．５Ｍフコース含有０．０１Ｍリン酸緩衝液で溶出
後、透析によりフコースを除いて再びウレックス・ヨー
Ｄベウス・アグルチニン結合セファデックスに吸着させ
てリン酸緩衝液（１）８７．２）の濃度を徐々に＾める
°、いわゆるグラジェント方式でＣＢＸ　２を溶出した
。このようにして、ｃｓｘ　２０．２５霧ｑを得る。こ
のようにして得られたＣＢＸ　２の活性は５．２００単
位であり、蛋白１＋ｏ当りの比活性は２０．８００Ｑｉ
位／ｍ１ｌｌであった。

実施例２（製造例） ヒトＢＡＬＬ−１細胞（Ｍ　１ｙｏｓｈｉ、　Ｎ　ａｔ
ｕｒｃ２６７巻、８４３〜８４４頁、１９７７年）９ｘ
　１０”　ＷＡ’ｉｒ　１　、８００＋ｎ　Ｉ　（７）
１０％仔牛ｍｌ含有イーグル培地に浮遊させ、センダイ
ウィルスを９ｘ１０６ｐｆｕ添加し、３７℃、５％炭酸
ガス含有酸素ガス通気下、４８時間培ＩＩ、、ｈ清を実
施例１の方法に従って精製した。このようにしてＣＢＸ
２７５Ｊ１ｇを得ることができる。

このようにして得られたＣＢＸ　２の活性は１０゜００
０中位であり、比活性は１３３．３３３ａ１位／ＷＡｏ
であった。

実施例３（製造例） ヒト繊維芽細胞７０つ７００００細胞（フロラン１）３
ｘ１０・個！６００ｍ　ｌの１０％仔牛［６１滴含有イ
ーグル培地に浮遊させ、フィトヘマグルチニンを終濃度
５０）Ｉｇ／ｇ＋Ｉになるように添加して、３７℃、５
％炭酸ガス含有酸素ガス通気上、４８時時間側Ｌ上清を
実施例１の方法に従って精製した。このようにしてＣＢ
Ｘ２２０にを得ることができる。このようにして得られ
たＣ　Ｂ　Ｘ　２の活性は５００単１位ひあり、比活性
は２５．０００単位であった。

実施例４ ウシ末梢血リンパ球２ｘ１０’　ｔ！Ａを１．０００ｍ
１の１０％仔牛血清含有イーグル培地に浮遊させ、３７
℃、５％炭酸ガス含有酸素ガス通気下、４８時間培養す
る。培養終了後、培養上演を実施例１の方法に従って精
製した。このようにしＴｃＥ３Ｘ　２０．００１１　Ｑ
を得ることがぐきる。このようにして得られたＣＦ３ｘ
２の活性は４０単位であり、蛋白１１０当りの比活性は
４０，０００単位／ｌＡＱであった。

実施例５ 細胞培養で増殖させたヒトＢＡＬＬ−１細胞（’Ｍｉｙ
ｏｓ旧、Ｎａｔｕｒｅ　１２６７巻、８４３〜８４４頁
、１９７７年）１ｘ１０”個を２，０００ｍμの１０％
仔牛血清含有イーグル培地に浮遊させ、３７℃、５％炭
酸ガス含有酸素ガス通気下、４８時開環養する。培養終
了後、培養上清を実施例１の方法に従って精製した。こ
のようにして、ＣＢｘ　２０．２５１０を得る。コ（Ｊ
）ようにして得られたＣＢＸ　２の活性は、２，９００
単位であり、蛋白Ｉ　　ＩＮ３当りの比活性は１１．６
００単位／１ｇであった。

実施例６（水溶性注射剤） ＣＢＸ２　　　　　１００，０００ψ位塩化ナトリウム
　　　　　　９．０ｇ 注射用蒸留水にて全ｆｉ１．０００ｍ１本物質および塩
化ナトリウムを秤量して混合した後、注射用蒸留水５０
０ｇ１ｌに溶解し、更に注射用蒸留水で全一を１．００
０ｍ１とする。

この水溶液を、メンブランフィルタ−を用いて無菌的に
濾過し、濾液を滅菌したガラス容器に２１ずつ充填して
密栓し、水溶性注射剤とした。

実施例７（凍結乾燥注射剤） ＣＢｘ　２　　　　　　１００．０００単位２０％ヒト
血清アルブミン　　１０１ 塩化ナトリウム　　　　　　９．　Ｏａ注射用蒸留水に
て全１１，０００ｍ１ ＣＲＸｚおよび塩化ナトリウムを秤量して混合した後、
注射用蒸留水５００１に所定−のヒト血清アルブミンを
加えた水溶液に溶解し、更に注射用蒸留水で全■を１．
０００ｇｇ１　とする。この水溶液を、メンブランフィ
ルタ−を用いて無菌的に濾過し、２１ずつ滅菌したガラ
ス容器に充填し、凍結乾燥する。これを密栓し、凍結乾
燥粉末製剤とした。

実施例８（点眼剤） ＣＢＸ　２　　　　　　１００，０００単位塩化ナトリ
ウム　　　　　　　　５ｇ 注射用蒸留水にて全＊　　ｉ、ｏｏｏ　■１上記各成分
を秤量して９５０ｍ１の注射用蒸留水に溶解する。全一
を１．０００ｍ１にしてメンブランフィルタ−を用い、
無菌的に濾過して点眼剤とした。

実施例９（半期） ＣＢＸ　２　　　　　　　　１００．０００ψ位ポリエ
チレングリコール１５００　２５０　Ｑポリエチレング
リコール４０００約７５０ｇ１．０００　Ｑ Ｆ記成分を秤■し、ＣＢＸ２およびポリエチレングリコ
ール１５００の全一、およびポリエチレングリコール４
０００の５００９をよく研和し、さらに残りのポリエチ
レングリコール４０００を加えて全一を１．００００と
してよく研和して溶融法により５，０００１！ＩＩの直
腸半期とした。

実施例１０（点鼻剤） ＣＢｘ　２　　　　　１００，０００単位塩化ナトリウ
ム　　　　　　　　５Ｑ クロ「１ブタノール　　　　　　　５ 蒸留水にて全１　　　　１，０００＋＋＋１上記各成分
を秤■し、９５０ｍ１の蒸留水に溶解して放冷後、全量
１．０００ｍ１に希釈し、点鼻剤とする。

実施例１１（爲溶性錠剤） ＣＢＸ　２　　　１．０００．０００単位乳糖　　　　
　　　　　　６４．０　！Ｊポテト澱粉　　　　　　約
３０．　Ｏａポリビニールアルコール　　３．０ｇ ステアリン　マグネシウム　３．０ｇ １、ＯＯＯ。

上記成分をそれぞれ秤量した後、ＣＢ　Ｘ　２および乳
糖の各全一、およびポテト澱粉の約半量を混合し、さら
に残りのポテト澱粉を加えて全量を９４．Ｏａとして均
一に混合する。この混合物にポリビニールアルコールの
水溶液を加え、湿式顆粒造粒法により顆粒を調製する。

この顆粒を乾燥し、ステアリン酸マグネシウムを混和し
た後圧縮打錠して、重量２００ｓ＋ｏの錠剤を製造する
。これにメチルセルロースツタレートをコーティングし
て腸溶性錠剤とした。

実施例１２（軟膏剤） ＣＢｘ　２　　　　　　１００．０００１位流動パラフ
ィン　　　　　　　１０（＋ワセリン　　　　　　約１
．００００ ｉ、ｏｏｏ　ａ 上記成分をそれぞれ秤齢した後、ＣＢ　Ｘ　２を流動パ
ラフィンに研和し、５００ｇのワセリンを加えてよく混
合する。これに残りのワセリンを加えてゆき、全憬をｉ
、ｏｏｏｇとし、よく混和して軟膏剤とした。

手続補正書（方式） ％式％ ３、　ｈｌｉ　＋ｆ：、する者 ’ＩＩ　ｆ’ｌとの関係　！＃軒出赦人（ほか　　ｌ　
名） り−Ｆ＋ｌｔ＋ｌ：請合の１１付 タイプ印書によシ鮮明に記載した明細書を４　）１−１
−ｔ　Ａ　−

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）次の性質を有する糖蛋白質： ■分子ＩＩ；４０．ｏｏｏ〜５０，０００■呈色反応二
   〇−リー反応により蛋白質の１色を示し、塩酸加水分解
   後のニンヒドリン反応においてペプチド結合およびアミ
   ノ酸の呈色を示し、フェノール硫酸反応、アンスロン硫
   酸反応、インドール硫酸反応、トリプトファン請酸反応
   により糖類の呈色を示す。 ■性状・溶解性；白色粉末であり、水、塩化ナトリウム
   水溶液およびリン酸緩衝液に可溶であり、ベンゼン、ヘ
   キサンおよびクロロホルムにほとんど溶けない。 ■糖含有量が３０〜３７％であり、その組成が、ヘキソ
   ース２０〜２３％、ヘキソサミン６〜８％、シアル１１
   ４〜６％である。 ■等電点；４．２〜７．３ ■ウレックス・ヨーロペウス・アグルチニン（ＬＪ　ｌ
   ａｘ　ｅｕｒｏｐｅｕｓ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　）結
   合セファデックスを用いた分画操作において、０．０１
   Ｍリンｌ緩衝液（ｐＨ７，２）中で吸着性である。 ■ｐＨ２，０、ｐＨ７，０もしくはｐＨ１１゜０の水溶
   液中、４℃において２４時闇以上安定であり、また、ｐ
   Ｈ７，０の水溶液中、６０℃において３＃ｆｌｆ以上安
   定である。 ■正常細胞には実質的に障害を与えず、腫瘍細胞に選択
   的に障害を与える。 ２）下記の性質； ■分子量；４０．０００〜５０，０００、■呈色反応；
   ローリー反応により蛋白質の９色を示し、塩酸加水分解
   後のニンヒドリン反応においてペプチド結合およびアミ
   ノ酸の呈色を示し、フェノール硫酸反応、アンスロン硫
   酸反応、インドール硫酸反応、トリプトファン硫酸反応
   により糖類の呈色を示す、 ■性状・溶解性：白色粉末であり、水、塩化すトリウム
   水溶液およびリン酸緩衝液に可溶であり、ベンゼン、ヘ
   キサンおよびりｏＯホルムにほとんど溶けない、 ■糖含有量が３０〜３７％であり、その組成が、ヘキソ
   ース２０〜２３％、ヘキソサミン６〜８％、シアル酸４
   〜６％である、 ■等電点；４．２〜７．３、 ■ウレックス・ヨーロベウス・アグルチニン（Ｕ　ｔａ
   ｘ　ｅｕｒｏｐｅｕｓ　ａｏｇｌｕｔｉｎｉｎ　）結合
   セフ１デツクスを用いた分画操作において、０．ＯＩＭ
   ！Ｊン！ＩＩＩ！Ｉｌｌ　（１）８７．２＞中Ｆ吸１ｔ
   Ｉである、 ■ｐＨ２，０、ｐＨ７，０もしくはＩＩＨｌｌ。 ０の水溶液中、４℃において２４時間以［宥定であり、
   また、ｐＨ７，０の水溶液中、６０℃において３時間以
   上安定である、 ■正常細胞には大質的に障□害を与えず、ＩＩ瘍細胞に
   選択的に障害を与える、 を有する抗腫瘍性糖蛋白質の産生能を有するヒトまたは
   ヒト以外の、温血動物由来の細胞より、１接そのまま、
   または培養増殖させて該糖蛋白質を採取することを特徴
   とする抗腫瘍性糖蛋白質の製造方法。 ３）濡面動物由来の細胞が、培養株化されたものである
   特許請求の範囲第２項記載の抗腫瘍性糖蛋白質の駿造方
   法。 １）湯面動物由来の細胞に誘導剤を作用させる特許請求
   の範囲第２項記載の抗腫瘍性糖蛋白質の製造方法。 ５）下記の性質； ■分子量；４０．０００〜５０，０００゜■♀色反応；
   ローリー反応により蛋白質の呈色を示し、塩酸加水分解
   後のニンヒドリン反応においてペプチド結合およびアミ
   ノ酸の呈色を示し、フェノール硫酸反応、アンスロン硫
   酸反応、インドール硫酸反応、トリプトファン＠酸反応
   により糖類の呈色を示す、 ■性状・溶解性：白色粉末であり、水、塩化ナトリウム
   水溶液およびリン酸緩衝液に可溶であり、ベンゼン、ヘ
   キサンおよびクロロホルムにほとんど溶けない、 ■糖含有量が３０〜３７％であり、その組成が、ヘキソ
   ース２０〜２３％、ヘキソサミン６〜８％、シアルｉ！
   １４〜６％である、 ■等電点：４．２〜７．３、 ■ウレツクス・ヨーロペウス・アグルチニン（ＬＪ　ｌ
   ｅｘ　ｅｕｒｏｐｅｕｓ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　）結
   合セファデックスを用いた分画操作において、０．０１
   Ｍリン５ｓｉｉ衝液（ｐｔ（７，２）中で吸着性である
   、 ■ｐＨ２，０、ｐＨ７，０もしくはｐト１１１゜０の水
   溶液中、４℃において２４時間以上安定であり、また、
   ｐＨ７，０の水溶液中、６０℃において３時間以上安定
   である、 ■正常細胞には実質的に障害を与えず、腫瘍細胞に選択
   的に障害を与える、 を有する抗腫瘍性糖蛋白質の産生能を伺するヒトまたは
   ヒト以外のｍ自動物由来の培養株化された細胞を、ヒト
   以外の同種もしくは異種の湯面動物体内に直接移植する
   か、または、その温血動物の体液の供給を受は得るよう
   にこの細胞を接種した拡散チャンバーを動物に植込み、
   増殖させて得られる細胞より、直接そのまま、または、
   さらに培養増殖させて該糖蛋白質を採取することを特徴
   とする抗腫瘍性糖蛋白質の製造方法。 ６）部面動物由来の培養株化された細胞に誘導剤を作用
   させる特許請求の範囲第５項記載の抗腫瘍性糖蛋白質の
   製造方法。 ７）次の性質を有する糖蛋白質を有効成分として含有す
   るＩＩＩ治療剤： ■分子１：４０．ｏｏｏ〜５０，０００■〒色反応；ロ
   ーリ−反応により蛋白質の呈色を示し、ａＳＳ加水分解
   後のニンヒドリン反応においてペプチド結合およびアミ
   ノ酸の呈色を示し、フェノール硫酸反応、アンスロン硫
   酸反応、インドール硫酸反応、トリプトファン硫酸反応
   により糖類の呈色を示す。 ■性状・溶解性；白色粉末であり、水、塩化ナトリウム
   水溶液およびリンＳｔＳ＊衝液に可溶であり、ベンゼン
   、ヘキサンおよびクロロホルムにほとんど溶けない。 ■糖含有饅が３０〜３７％であり、その組成が、ヘキソ
   ース２０〜２３％、ヘキソサミン６〜８％、シアル酸４
   〜６％である。 ■等電点；４．２〜７．３ ■ウレックス・ヨーロベウス・アグルチニン（ｊＪ　ｔ
   ｅｘ　ｅｕｒｏｐｅｕｓ　ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ　）結
   合セファデックスを用いた分画操作において、０．０１
   Ｍリン酸緩衝液（１）８７．２）中で吸着性である。 ■ｐｌ−１２，０、ｐＨ７，０もしくはＩｌＮ　１１　
   。 ０の水溶液中、４℃において２４時間以上安定であり、
   また、ｐＨ７，０の水溶液中、６０℃において３時間以
   上安定である。 ■正常細胞には実質的に障害を与えず、腫瘍細胞に選択
   的に障害を与える□。