NL8300727A - Nieuwe glycoproteinen, werkwijzen ter bereiding daarvan alsmede therapeutische anti-tumormiddelen die dergelijke glycoproteinen bevatten. - Google Patents

Description

• ‘ -. - 53C

VO k5kk

Mewe glycoproteïnen, werkwijzen ter “bereiding daarvan alsmede therapeutische anti-tumormiddelen die dergelijke glycoproteïnen bevatten.

De uitvinding heeft betrekking op nieuwe glycoproteïnen verkregen uit een extract of een bovenlaag van eenkweekmedium van reticulo-endothele cellen, lymfoblasten, leukemiecellen of fibroblasten van warmbloedige dieren, werkwijzen ter bereiding daarvan alsmede therapeu-5 tische middelen tegen kwaadaardige tumors, welke dergelijke glycoprote-inen afzonderlijk of in ccmbinatie als een actieve component bevatten.

Er bestaat geen goede therapie tegen tumors en ongeacht het feit dat vele therapeutische anti-tumormiddelen tot dusver zijn ontwikkeld wordt verder gezocht naar nieuwe therapeutische middelen en combi-10 naties daarvan voor klinische behandeling.

De therapeutische anti-tumormiddelen kunnen globaal worden ingedeeld in twee categorieën, de chemotherapeutische en immunotherapeuti-sche middelen. Aangezien de ehemotherapeut-ische middelen, die tevens bekend staan als cytotoxische substanties, werken door niet-specifieke 15 celgrcei te onderdrukken en aldus niet alleen ten opzichte van tumorcellen maar ook ten opzichte van normale cellen giftig zijn en ernstige ongewenste nevenreacties vertonen zoals leukocytopenie, acyesis, alopecia, teratisme, kwaadaardige neoplasie enz. wordt hun dosering strikt beperkt. De immunotherapeutische middelen daarentegen zijn therapeutisch 20 werkzaam doordat zij indirect de tumorgroei door inwerking op de bio-fyiactische functies belemmeren en niet door rechtstreekse groei van tumorcellen te remmen, zodat zij veel minder gevaarlijk zijn wat betreft nadelige nevenwerkingen dan de chemotherapeutische middelen. Tumorpatiënten behouden dikwijls echter niet voldoende biofylactische 25 functies en derhalve is het therapeutische effect van immunotherapeutische middelen niet steeds bevredigend vergeleken met chemotherapeutische middelen.

Gevonden is nu dat de reticulo-endothele cellen die een belangrijke rol spelen bij biofylactische functies een stof produceren die 8300727 κ * -2- effectief tumoren "bestrijdt, en liet onderzoek is naar deze stof gericht .

Verschillende factoren die als veelbelovende therapeutische antitumor-middelen -worden beschouwd, b.v. lymfotoxine, tumornecrose-5 factor, interferon enz. zijn reeds verkregen uit reticulo-endothele cellen, zoals vermeld door G.A.Granger et al., Cellular immunology,

Vol. 38, 338 - kQ2 (1918), E.A. Carswell et al, Proc. Hatl. Acad. Sci. Ü.S.A., Vol. 72,..3666 - 33670 (1975) en A.Issacs et al., Proc. Roy. Soc. Ser. B., Vol. 1^7, 268 (1975). Verder is door de uitvinders onlangs een 10 eenvoudige werkwijze ontdekt voor het isoleren van een grote hoeveelheid Carcino-Breaking Factor (hierna aangeduid als CBF) bestaande uit een mengsel van voornoemde lymfotoxinen, tumornecrosefactor enz. uit een kweek van lymfoblasten die men liet groeien in hamsters waarvan de immunorespons was onderdrukt, waarbij gevonden werd dat dit CBF effec— 15 tief is tegen experimentele tumors die in het dier zijn getransplanteerd (The Yomiuri, ochtenduitgave, 22 november 1981).

Gedurende het verloop van het onderzoek naar CBF is door de uitvinders gevonden dat glycoproteinen die van de voornoemde cytotoxische 20 factoren zoals lymfotoxine, tumornecrosefactor, CBF enz. verschillen, in een extract of bovenlaag van het kweekmedium van reticulo-endothele cellen, lymfoblasten, leukemiecellen of fibroblasten van warmbloedige dieren aanwezig zijn, en worden gekenmerkt door een zeer sterke en selectieve cytotoxische werking tegen tumorcellen, waarbij verscheidene 25 methoden voor het zonder moeilijkheden produceren van dergelijke glyco-proteinen zijn ontwikkeld.

Het is een hoofddoel van de uitvinding te voorzien in nieuwe glycoproteinen met een antitumoractiviteit.

Een ander doel van de uitvinding is te voorzien in glyc oprot einen 30 met antitumoractiviteit die zijn gewonnen uit een extract of een bovenlaag van een kweekmedium van reticulo-endothele cellen, lymfoblasten, leukemiecellen of fibroblasten van warmbloedige dieren.

Het is een verder doel van deze uitvinding te voorzien in werkwijzen ter bereiding van antitumorglyc oprot einen uit een extract of een 35 bovenlaag van een kweekmedium van reticulo-endothele cellen, lymfoblasten, leukemiecellen of fibroblasten van warmbloedige dieren.

8300727 - 3 -

Een verder doel van de uitvinding is te voorzien in therapeutische middelen tegen tumoren die dergelijke ant i-tumorglycolproteïnen afzonderlijk of in combinatie als een actieve component bevatten.

Aldus heeft de uitvinding betrekking op een glycoproteïne met de 5 volgende eigenschappen: a) molecuulgewicht: in het gebied van 7000 — 90.000 door SDS-gelelektroforese of Sephadex-gelfiltratie; b) kleurreacties: het vertoont een kleur die proteïnen in de Lowry-reactie aangeeft, een kleur die peptidebindingen en aminozuren in 10 de ninhydrienreactie na hydrolyse met wat er stof chloride aangeeft, en het vertoont een kleur die in de fenol-zwavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzunrreactie en in de tryptofan-zwavelzuurreactie suikers aangeeft; c) uiterlijk en oplosbaarheid: een wit poeder dat in water, wate— 15 rig natriumchloride en fosfaatbuffer oplosbaar is en slecht oplosbaar ia benzeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte 8 - k-5%, waarbij 6 - 28% van de suikers hexo-sen, 1 - 11% hexosaminen en 1 - 6% sialinezuren zijn;

e) stabiel in een waterige oplossing met pH 2,0, pH 7,0 en pH

20 11,0 bij U°C gedurende 2b uren of langer en in een waterige oplossing met een pH van 7,0 bij 6o°C gedurende 3 uren of langer; en f) het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale cellen aan te tasten.

Fig.-ΐ geeft het IK-spectrum van CBx aan gemeten volgens voor-25 beeld X;

Fig.2 geeft het IH-spectrum van CBx^ aan gemeten volgens voorbeeld XV;

Fig.3 geeft het IR-spectrum van CBXg aan gemeten volgens voorbeeld XXI; 30 Fig.k geeft het IB-spectrum van CBx^ aan gemeten volgens voor beeld XXIX.

Aangezien de glycoproteïnen van deze uitvinding in vier fracties met verschillende molecuulgewicht en en suikergehalten kunnen worden verdeeld, worden deze glycoprot eïnen in de beschrijving volgens het ver-35 schil in molecuulgewicht geklasseerd; één fractie met een molecuulge- 8300727 Μ - ·* wicht van 12.000 - 17.000 wórdt aangeduid als een Carcino-Breaker X (hierna aangeduid als CB„; dit geldt tevens voor de rest van de he-schrijving); een met een molecuulgewicht van 70*000 - 90.000 als CB^, een molecuulgewicht van 1+0.000 - 50.000 als CB^ en een molecuulgewicht 5 van 7.000 - 9.000 als CB^. Wanneer men de CB^., CB^, CB^ en CB^ in hun algemeenheid beschouwt, wordt daarvoor de term "CB" gebruikt.

De fysische, chemische en biologische eigenschappen van de glyco-proteïnen volgens deze uitvinding worden hierna in meer bijzonderheden beschreven.

10 3c a) Molecuulgewicht: Gemeten volgens gelfiltratie met Sephadex G-100 (Pharmacia Co.) en 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2) als oplosmiddel, is het molecuulgewicht 12.000 - 17.000.

b) ELeurreacties: De resultaten van de proeven met de 0Βχ wate-15 rige oplossing op de kleurreacties worden weergegeven in tabel A—1.

De Lowry-reactie en de ninhydrienreactie werden volgens de procedures beschreven in Seikagaku Jikken Koza,. Tol. 1, Quantitative Method of Proteins, 1971, uitgevoerd. De fenol-zwavelzuurreaetie, de anthron-zvavelzuurreactie, de naftol-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuur-20 reactie en de tryptofan-zwavelzuurreactie werden volgens de procedures beschreven in Seikagaku Jikken Koza, Tol* U, Quantitative Method of Sugars, 1971, uitgevoerd. De Holff-reactie werd uitgevoerd volgens de procedures beschreven in Seikagaku Jikken Koza, Tol*3, Quantitative Method of lipids, 1971.

25 Tabel A-1 KLeurreactie Kleur Indicatie

Lowry blauw peptidebindingen ninhydrien purperblauw aminozuren fenol-zwavelzuur bruin suikers 30 ant hr on-zwavelzuur groenachtighlauw suikers oi -naftol-zwavelzuur purper suikers indool-zwavelzuur bruin suikers tryptofaan-zwavelzuur purper bruin suikers

Holff kleurloos geen lipiden 35 Als boven aangegeven vertoont CB kleuren die proteïnen en sui- -Λ.

8300727 * <* - 5 - kers aangeven, maar vertoont deze geen kleur aanwijzende lipiden.

c) Uiterdijk en oplosbaarheid: Uit poeder oplosbaar in water, waterig natriumchloride en f osf aatbuf f er, en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform* 5 d) Suikergehalte: Volgens de methode van Spiro (H.A.Spiro,

Methods in Enzymology, Vol. 8, 3 - 26 (1966)), het suikergehalte van CB^ is 27 - 33# en de suikersamenstelling is 17 - 20# hexosen, 5-7# hexosaminen en 5 - 6# sialinezuren.

e) Isoëlekbrisch punt: Bij meting volgens isoëlektrofocussering 10 op Ampholine, is het isoëlektrische punt daarvan 4,2-7,3.

f) Adsorbeerbaar op Ulex europeus agglutinine-geeonjugeerd Sephadex in 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2).

g) Stabiel wat betreft het molecuulgewieht door gelfiltratie en de cytotoxische activiteit tegen tumorcellen in een waterige oplossing 15 van pH 2,0, pH 7,0, pH 11,0 bij 4°C gedurende 24 uren of langer en in een waterige oplossing van pH 7,0 "bij 6o°C gedurende 3 uren of langer.

h) Het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale cellen aan te tasten.

De cytotoxiciteit van CB„ werd gemeten door 10^ cellen van tumor-

A

20 cellen of normale cellen in 0,2 ml van een medium in aanwezigheid van deze stof bij 37°C gedurende 48 uren in een 5% CO^, 95# luchtatmosfeer te kweken en het aantal van de levensvatbare cellen te tellen dat niet werd gekleurd door Trypan-blauw, en uitgedrukt volgens de concentratie waarbij de celvermeerdering in aantal met 50# werd geremd. Eén eenheid 25 van CB wordt gedefinieerd als die hoeveelheid van de stof waarbij de groei van 10^ cellen of KB-cel met 50# wordt geremd.

i) Het induceert een differentiatie van tumorcellen, d.w.z. herstelt de tumorcellen in normale cellen in een proef volgens de methode van Hozumi et al (Hozumi, et al., Cancer Research, Vol. 40, 2919 - 2924 30 (1980)), bij toepassing van myelogene leukemiecellen M-1.

GBX1 a) Molecuulgewieht: Gemeten volgens gelfiltratie met Sephadex G-100 en een 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2) als oplosmiddel, is het mole-cuulgewicht 70.000 - 90.000.

35 b) KLeurreacties: De resultaten van de proeven met de CB^ wate- 8300727 ** * · - - 6 - rige oplossing op de kleurreacties worden weergegeven in tabel A-2. Tabel A-2

Kleurreactie Kleur_ Indicatie_

Lowry blauw peptidebindingen 5 ninhydrien purperblauw aminozuren fenol-zwavelzuur bruin suikers antron-zwavelzuur groenachtig bLauw suikers oc-naftol-zwavelzuur purper suikers indool-zwavelzuur bruin suikers 10 tryptofaan-zwavelzuur purperbruin suikers

Holff kleurloos geen lipiden

Als boven aangegeven vertoont CB^ kleuren die proteïnen en suikers.-aangeven, maar er zijn geen kleuren die lipiden aangeven.

c) Uiterlijk en oplosbaarheid: Wit poeder oplosbaar in water, 15 waterig natriumchloride en fosfaatbuffer, en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform.

d) Suikergehalte: Volgens de methode van Spiro is het suikergehalte van CBV1 35 — b5%, en is de suikersamenstelling 23 - 28% hexosen, 8 - 11% hexosaminen en b - 6% sialinezuren.

20 e) Isoëlektrisch punt: Gemeten volgens isoëlektrofocussering op

Ampholine is het isoëlektrische punt k,3 - 6,2.

f) Adsorbeerbaar op Ulex europeus agglutinine-geconjugeerd Sephadex in 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2).

g) Stabiel met betrekking tot het molecuulgewicht volgens gel-25 filtratie en ten opzichte van de cytotoxische activiteit tegen tumorcellen in een waterige oplossing van pH 2,0, pH 7,0 of pH 11,0 bij 4°C gedurende 2k uren of langer, en in een waterige oplossing van pH 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer.

h) Het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale 30 cellen aan te tasten. De cytotoxiciteit van CB^ werd gemeten volgens procedures beschreven in CBV.

3* a) Molecuulgewicht: Gemeten volgens gelfiltratie met Sephadex G-100 en 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2) als oplosmiddel, is het molecuul-35 gewicht UO.OOQ - 50.000.

8300727

V

- 7 -

Id) Kleurreacties: De resultaten van de proeven met de CB^ wate~ rige oplossing op kleurreacties worden in tabel A-3 aangegeven.

Tabel A-3

Kleurreactie_ Kleur_ Indicatie 5 Lowry blauw peptidebindingen ninhydrien purperblauw aminozuren fenol-zwavelzuur bruin suikers antron-zwavelzuur groenachfcïg blauw suikers -naftol-zwavelzuur purper suikers 10 indool-zwavelzuur bruin suikers trypto faan-zwavelzuur purperbruin suikers

Holff kleurloos geen lipiden

Zoals boven weergegeven toont CB^ kleuren die proteïnen en suikers aangeven, maar geen kleur die lipiden aangeeft.

15 c) Uiterlijk en oplosbaarheid: Wit poeder oplosbaar in water, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer, en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform.

d) Suikergehalte: Volgens de methode van Spiro is het suikergehalte van CB 0 30 - 37#, en is de suikersamenstelling 20 - 23# hexosen, 20 6-8# hexosaminen en k - 6% sialinezuren.

e) Isoëlektrisch punt: Gemeten volgens isoëlektrofocussering op Ampholine is het isoëlektrisehe punt b,2 - 7,3.

f) Adsorbeerbaar op Ulex europeus agglut inine-geconj ugeerd Sephadex in een 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2).

25 g) Stabiel met betrekking tot het molecuulgewicht door gelfiltra- tie en de cytotoxisehe activiteit tegen tumorcellen in een waterige oplossing met een pH 2,.0, pH 7,0 en pH 11,0 bij k°C gedurende 2b uren of langer en in een waterige oplossing met een pH van 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer.

30 h) Het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale cellen aan te tasten. De eytotoxiciteit van CB^ werd gemeten volgens de procedures beschreven voor CB^.

CBX3 a) Molecuulgewicht: Gemeten volgens SDS-gelelektroforese is het 35 molecuulgewicht 7-000 - 9.000.

8300727 • .‘τ' _ - 8 - b) Kleurreacties: De resultaten ran de proeven met de CB^ waterige oplossing op kleurreacties warden -weergegeven in tabel A-b.

Tabel A-k

Kleurreactie_, Kleur Indicatie 5 Lowry blauw peptidebindingen ninhydrien. purperblauw aminozuren fenol-zrwavelzuur bruin suikers antron-zwavelzuur groenachtig blauw suikers ct-naftol-zwavelzuur purper suikers 10 indool-zwavelzuur bruin suikers tryptofaan-zwavelzuur purperbruin suikers

Holff kleurloos geen lipiden

Zoals boven aangegeven toont CB _ kleuren die wijzen op prote-inea en suikers, maar geen kleur die lipiden aanwijst.

15 c.) Uit erlijk en oplosbaarheid: Wit poeder oplosbaar in water, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform- d) Suikergehalte: Volgens de methode van· Spiro is het suikergehalte van CB 8 - 15%, en de suikers amenstelling 6 - 10% hexosen, 20 1 -11# hexosaminen en 1 - 3% sialinezuren.

e) Adsorbeerbaar aan carboxymethylcellulose in ionenuitwisse-lingschromatografie in 0,05 M fosfaatbuffer (pH 6,1+) onder toepassing van carboxymethylcellulose.

f) Stabiel met betrekking tot het molecuulgewicht door gelfiltra-25 tie en de cytotoxische activiteit tegen tumorcellen in een waterige oplossing met een pH 2,0, pH 7,0 of pH 11,0 bij !+°C gedurende 2k uren of langer, en in een waterige oplossing met pH 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer- g) Het tast selectief tumorcellen aan. zonder nagenoeg normale 30 cellen aan te tasten. De cytotoxiciteit van CB^ werd gemeten volgens procedures beschreven in CB^..

h) De amino zuurvolgorde van de eindstandige H van het protelne-deel is alanine-alanine-.

35 De glycoprotexnen volgens de uitvinding hebben gemeenschappelij- 8300727 e - 9 - ke eigenschappen in kleurreacties, uiterlijk, oploshaarheid, stabiliteit, effect op tumorcellen enz. maar ze -verschillen van elkaar wat betreft het molecuulgewicht en het suikergehalte waardoor zij als verschillende stoffen ten opzichte van elkaar kunnen worden onderscheiden.

5 De glycoproteïnen van de uitvinding zijn duidelijk te onderschei den van lymfotoxine, tumoraecrosefactor, een mengsel daarvan, b.v. CBF of interferon, die alle worden verkregen uit reticulo-endothele cellen, lymf oplast en, leukemiecellen of fibroblasten, wat betreft de volgende bijzonderheden waardoor zij duidelijk als verschillende stoffen zijn te 10 beschouwen.

Meer in het bijzonder is bekend dat lymfotoxine aanwezig is in drie verschillende types afhankelijk van het molecuulgewicht, d.w.z.

-¾-lymfotoxine met een molecuulgewicht van 70.000 - 90.000, /3-lymfotoxine met een molecuulgewicht van 35.000 - 50.000 en S*-lymfotoxine met 15 een molecuulgewicht van 10.000 - 20.000 (Eds., Cohen et ah, Biology of the Lymphokinase, Academie Press, 1979). Wat betreft het molecuulgewicht gelijkt CB^ op f-lymfotoxine, CB^ op -lymfotoxine en CB^ op /3-lymfotoxine. Lymfotoxine echter zoals vermeld door Lucas et al (Z.J.Lucas et al., J. Immunology, Vol. 109, 1233 (1972)), heeft weinig 20 selectiviteit wat het cytotoxische effect betreft en veroorzaakt schade aan normale cellen alsmede aan tumorcellen. Ia tegenstelling daarmede is het cytotoxische effect van de glycoproteïnen volgens de uitvinding selectief ten opzichte van tumorcellen, waardoor zij duidelijk verschillen van lymfotoxine. Bovendien zij de glycoproteïnen volgens de uitvin-25 ding verschillend van lymfotoxine wat betreft de adsorbeerbaarheid en stabiliteit. Meer in het bijzonder wordt lymfotoxine bereid volgens de methode van Granger et al. (G.A.Granger et al., Cellular Immundogy,

Vol. 38, 388 - b02 (1978)) niet of slechts gering geadsorbeerd op Ulex europeus agglutinine-geconjugeerd Sephadex in een 0,01 M fosfaatbuffer, 30 terwijl glycoproteïnen volgens de uitvinding wel daarop worden geadsorbeerd. De glycoproteïnen volgens de uitvinding zijn verder stabiel in waterige oplossingen met een pH van 2,0, pH 7,0 en pH 11,0 bij i+°C gedurende 2k uren of langer en zij zijn tevens stabiel bij een pH van 7>0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer. In tegenstelling daarmede verliest 35 lymfotoxine zijn activiteit met 6ü% of meer nadat het gedurende b uren 8300727 - 10 - op 5ö°G is gehouden.

De tumornecrosefactor vertoont een selectieve cytotoxisch. effect op tumorcellen en het heeft een molecuulgewicht van 33.000 - 63.000 en een suikergehalte van 0% (E.A, Car swell et al., Proc. ïïatl. Acad. Sci.

5 U.S.A., Vol. 72, 3666 — 3670 (1975)) of het heeft een molecuulgewicht van 39.000 en een suikergehalte van kQ% (The Nippon Keizai Shimbun, ochtenduitgave, 23 augustus 1981) en heide zijn verschillend van CB^, CB^ en CB^2 wat betreft het molecuulgewicht en van CB^ wat betreft het suikergehalte.

10 Verder heeft CBF dat deze eytotoxische factoren in combinatie bevat een molecuulgewicht van ongeveer 35.000 (The Nippon Keizai Shimbun, ochtenduitgave, 22 november 1981) en verschilt het van glycoprotexnen volgens de uitvinding wat betreft het molecuulgewicht.

Tenslotte zijn de glycoproteinen van de uitvinding verschillend 15 van interferon doordat de eerste geen antivirusactiviteit heeft.

De cellen die voor de produktie van de glycoprotexnen van de uitvinding zijn toegepast, worden nu toegelicht.

De cellen die afkomstig zijn van mensen of niet-humane warmbloedige dieren, voor toepassing in de uitvinding kunnen alle reticulo-endo-20 thele cellen, lymfoblasten, leukemiecellen en fibroblasten zijn en zij kunnen hetzij in een primaire kweek of in een tot stand gebrachte cellijn worden toegepast. Cellen van humane oorsprong worden bij voorkeur toegepast omdat zij veilig zijn. en minder antigeniciteits-geïnduceerde reacties en andere nadelige reacties bij gebruik van CB in de behande-25 ling van ziekten bij de mens opwekken. Als dergelijke cellen kunnen alle cellen worden gekozen uit b.v. BALL-1 cellen, TALL-1 cellen, en NALL-1 cellen als vermeld door Miyoshi (I. Miyoshi, Nature, Vol. 267,

Sii-3 - 8kh (1977)), Namalwa-cellen beschreven in Journal of Clinical Microbiology (J. Clin. Microbiol., Vol.1, Ιΐβ - 117 (1975)), M-7002 30 cellen en B-7101 cellen beschreven in Journal of Immunology (Vol. 113, 133^· - 13^-5 (197*0 )5 Flow-7000 cellen (Flow Co.), JBL-cellen, EBV-Sa-cellen, EBV-Wa-cellen en EBV-H0-cellen beschreven in "The Tissue Culture" (Vol. 6, 527 - 5k6 (1980)), tot stand gebrachte cellijnen zoals BALM 2-cellen, CCRF-SB-cellen (ATCC CCL 120) enz., en humane lymfocyten 35 en macrofagen, alsmede cellen van een tot stand gebrachte cellijn uit 8300727 e - 11 - humane lymfocyten en macrofagen behandeld met verschillende virussen, geneesmiddelen, straling enz.

Als cellen afkomstig uit niet-humane warmbloedige dieren, kunnen alle cellen worden gekozen uit b.v. muizen BALB/C 3T3 cellen (Flow Co.), 5 muizenleukemiecellen zoals L1210 cellen («Γ. JTatl. Cancer Inst., Vol.13, 1328 (1953)) en P388 cellen (Scientific Proceedings, Pathologists & Bacteriologists, Vol. 33, 603 (1957)), muizenmelanomaclonen M-3 (Flow Co.), rattetumor LLC-WRC 256 (Flow Co.), hamstermelanoma RPMI 18U6 cellen (Flow Co.) en lymfocyten, macrofagen enz. Het is duidelijk dat 10 de cellen die in de uitvinding worden toegepast niet tot de bovenbeschreven typen zijn beperkt.

De werkwijze voor de bereiding van de glycoproteinen (CB) van de uitvinding wordt nu toegelicht.

De werkwijze voor het bereiden van CB uit cellen afkomstig uit 15 de mens of niet-humane warmbloedige dieren kan worden gekozen uit bekende methoden voor het produceren van actieve stoffen met cellen, en deze kan hetzij direct uit de cellen of nadat de cellen zijn gekweekt, worden gewonnen of indien een grotere hoeveelheid CB gewenst is, kunnen deze cellen worden blootgesteld aan een of meer promotors. De cellen 20 die afkomstig zijn uit de mens of niet-humane warmbloedige dieren, kunnen b.v. worden gesuspendeerd in een geschikt medium, dat direct wordt blootgesteld aan de promotor ter vorming van CB dat dan uit het medium kan worden gewonnen.

Als de promotor voor CB, worden in het algemeen een of meer 25 stoffen toegepast die worden gekozen uit de volgende: lectinen zoals fytohemagglutinine, concanavaline A, varkenskruid (pokeweed) mitogeen, lypopolysacchariden, polysacchariden zoals fosfomannan, dexfcranfosfaat, endotoxinen, microbiële celcomponenten, bacteriën, virussen, nuclexne-zuren, polynucleotiden enz. Verder dient voor de antigeen-gesensibili-30 seerde cellen tevens overeenkomstig antigeen als een promotor voor CB.

Aldus gevormd CB kan gemakkelijk volgens bekende zuiveringsmetho-den worden geïsoleerd, zoals uitzouten, dialyse, filtratie, centrifugeren, concentreren, vriesdrogen enz. Indien een sterkere zuivering gewenst is, kan deze worden bereid door adsorptie en elutie over een ionen-35 uitwisselbars, gelfiltratie, elektroforese of affiniteitschromatografie 8300727 *τ ' - 12 - onder toepassing van b.v. antilichaam- of Ulex europens agglutinine-geconjugeerd Sephadex,

Indien CB in grote hoeveelheid moet worden verkregen, kunnen de cellen van de tot stand gebrachte cellijn worden gekweekt in het li-5 chaam van warmbloedige dieren zoals nu wordt toegelicht.

De tot stand gebrachte cellijnen, die afkomstig zijn uit de mens of van ttiet-humane warmbloedige dieren, kunnen elk van de reticulo-endo-thele cellen, lymfoblasten, leukemiec ellen en fibroblast en zijn, en bij voorkeur zijn cellijnen van humane oorsprong gewenst en veilig omdat 10 zij minder antigeniciteits-geïnduceerde reacties en andere nadelige reacties opwekken bij gebruik van DB voor de behandeling van humane ziekten. Als dergelijke cellijnen kunnen alle cellijnen worden toegepast als boven beschreven b.v. BALL-1 cellen, TALL-1 cellen, NALL-1 cellen, ïïamalwa cellen, M-7002 cellen, B-7101 cellen, Flow 7000 cellen, 15 BALB/C 3T3 cellen, L1210 cellen, P388 cellen, lymfocyten, macrofagen enz.

Wanneer men deze cellen moet kweken in het lichaam van warmbloedige dieren, kan de transplantatie van dergelijke cellen direct worden uitgevoerd of als hierna beschreven indirect door een kamer met genoem-20 de cellen te enten en de kamer in het lichaam te plaatsen. De warmbloedige dieren waarin dergelijke cellen worden getransplanteerd, kunnen van hetzelfde of een verschillende soort zijn zo lang als de tot stand gebrachte cellijn, die afkomstig is:uit de mens of van niet-humane warmbloedige dieren daarin kan groeien. B.v. kunnen hoenders zoals kuikens, 25 duiven en warmbloedigen zoals honden, katten, apen, geiten, varkens, paarden, runderachtigen, konijnen, cavia's, ratten, hamsters, gewone muizen, geschoren muizen worden toegepast.

Wanneer-in een van deze dieren gekweekte cellen worden getransplanteerd, die afkomstig zijn van een dier van een ander soort, is er de 30 mogelijkheid van ongewenste immunologische reacties. Derhalve worden dieren in de het meest onvolgroeide toestand gebruikt, b.v. eieren, foetussen, embryo's of pasgeboren dieren, waardoor de mogelijkheid van immunologische reacties minimaal wordt gemaakt. Tevens kunnen de immunologische reacties worden onderdrukt door voorbehandelingen b.v. door 35 deze dieren te bestralen met röntgenstralen van 200 - 600 REM, of hen 8300727 . -* v - 13 - te injecteren met immunosuppres sieve middelen.

Wanneer liet als gastheer te gebruiken dier een geschoren muis is of van dezelfde soort als de te transplanteren cellen, zijn de immunologische reacties zwak en derhalve kunnen dergelijke cellen daarin 5 worden getransplanteerd en snel worden gekweekt zonder enige voorbehandeling, waardoor de toepassing van dergelijke cellen bijzonder voordelig is.

Waar keuze kan tevens een constante groei van de cellen worden gegarandeerd en de daaruit geproduceerde hoeveelheid CB worden vergroot 10 door cellen uit een warmbloedig dier in een ander warmbloedig dier te transplanteren, b.v. door cellen afkomstig uit de mens of uit niet-humane warmbloedige dieren te transplanteren in hamsters voor de kweek en daarna opnieuw deze cellen in de geschoren muis te transplanteren.

In dergelijke gevallen kan de transplantatie worden uitgevoerd tussen 15 dezelfde klasse of indeling alsmede tussen dezelfde soorten of genus.

De plaats waarnaar de van mensen of niet-humane warmbloedige dieren afkomstige cellen moeten worden getransplanteerd, kan elke plaats zijn waar de getransplanteerde cellen kunnen groeien en b.v. kan men de navelblaasholte, de aders, de lagere buikholte, alsmede onderhuids 20 plaatsen kiezen.

In plaats dat de tot stand gebrachte cellijnen afkomstig van mensen of niet-humane warmbloedige dieren direct in het lichaam van de warmbloedige dieren worden getransplanteerd en gekweekt, kan elk van de voornoemde tot stand gebrachte cellijnen worden gelnocculeerd en ge-25 kweekt in een gebruikelijke diffusiekamer met verschillende vormen en afmetingen die b.v. wordt aangebracht in de peritoneale holte van het lichaam van warmbloedige dieren. De diffusiekamer is zodanig ontworpen dat genoemde cellen kunnen, groeien doordat de opname van lichaamsvloeistof van het dier als voedingsmiddel wordt mogelijk gemaakt en tevens 30 omdat de kamer is voorzien van poreuze filtermembranen, b.v. een mem- . · - -T -3 braanfilter met een porie-afmetmg van ongeveer 10 - 10 m, een ultrafilter of een holle vezel, die verhindert dat de cellen uit de kamer migreren en toelaat dat de lichaamsvloeistof met voedingsmiddelen de kamer binnentreedt.

35 Zonodig kan de diffusiekamer worden ontworpen en b.v. geplaatst . ......+0 8300727 »iU - op het oppervlak van. het dierlijke lichaam, waarbij de voedingsvloei-stof in de hamer verbonden kan worden met de lichaamsvloeistof van het dier en deze kunnen worden gecirculeerd, zodat de groei van de in genoemde kamer geinocculeerde cellen via een kijkglas kan worden waarge-5 nomen. De diffusiekamer kan tevens zodanig worden ontworpen dat het van het lichaam van het dier kan worden losgekoppeld waardoor cellen gedurende de gehele levensduur van het dier kunnen worden gekweekt, en daardoor de opbrengst van de cellen per dier wordt verhoogd.

De methode waarbij deze diffusiekamers worden toegepast heeft 10 verder voordelen; d.w.z. dat cellen van de tot stand gebrachte cellijnen afkomstig van de mens of niet-humane warmbloedige dieren niet in direct contact worden gebracht met de dierlijke cellen, deze cellen gemakkelijk kunnen worden gewonnen en vanwege de kleinere mogelijkheid dat ongewenste immunologische reacties worden veroorzaakt, verschillende 15 warmbloedige dieren kunnen worden behandeld zonder dat het nodig is de dieren een voorbehandeling te geven terwille van immunosuppressie.

De dieren waarin de cellen zijn getransplanteerd, kunnen op de gebruikelijke wijze voor het dier worden gevoed en vast gehouden, waarbij. geen speciale voorzorgen zelfs na de transplantatie nodig zijn, 20 hetgeen bijzonder gemakkelijk is.

De periode die noodzakelijk is voor de groei van de cellen van de tot stand gebrachte cellijnen afkomstig van de mens of niet-humane warmbloedige dieren, is in het algemeen 1-10 weken. Het aantal aldus . . 7 12 verkregen cellen blijkt ongeveer 10 - 10 cellen of meer voor een 25 dier te zijn.

M.a.w. is de werkwijze volgens de uitvinding voor het produceren van CB uitermate voordelig in de produktie van CB, omdat de tot stand . 2 gebrachte cellijnen afkomstig van warmbloedige dieren met ongeveer 10 - 7 .

tot 10 -voudig of meer worden vermenigvuldigd ten opzichte van het aan- 30 tal van de cellen die direct in het dier zijn geïnoccubeerd of ongeveer 8 10- tot 10 -voudig of meer als vermenigvuldigingsfactor vergeleken met het geval waarin de cellen alleen worden gekweekt in een voedingsmedium.

De produktie van CB uit de gegroeide cellen van de tot stand gebrachte cellijn afkomstig van de mens of niet-humane warmbloedige die-35 ren kan op verschillende wijzen worden uitgevoerd. Zij kunnen direct 8300727 * ·ψ* « ' - 15 - worden gewonnen uit het lichaam waarin dergelijke cellen zijn gekweekt. B.v. kan CB direct worden gewonnen uit de cellen die zijn verkregen door de getransplanteerde cellen van de tot stand gebrachte cellijnen afkomstig van de mens of niet-humane warmbloedige dieren in ascites 5 als suspensie of door hen subcutaan te laten groeien.

Haar keuze kan de produktie van CB worden uitgevoerd door een promotor te gebruiken na het kweken van de tot stand gebrachte cellijnen afkomstig van de mens of niet-humane warmbloedige dieren in het lichaam van een dier door hetzij de promotor direct in vivo of in vitro 10 na het uit het lichaam afnamen van cellen aan te brengen. De cellen van een tot stand gebrachte cellijn die afkomstig is van de mens of niet-humane warmbloedige dieren, die zijn gegroeid in ascites en daaruit gewonnen, of die welke zijn geïsoleerd en losgemaakt van een subcu-tane tumor omvattende cellen van een tot stand gebrachte cellijn afkom-15 * stig van de mens of niet-humane warmbloedige dieren, kunnen worden ge suspendeerd in een voedingsmedium dat op > ca*' 20 - U0°C wordt gehou- 5Ö 3 den om een celconcentratie van ongeveer ICr - 10° cellen per cuT te geven, waarna zij worden behandeld met een CB-pramotor waardoor de pro— duktie van CB wordt bevorderd hetgeen dan kan worden gewonnen.

20 Waar verder de cellen van een tot stand gebrachte cellijn afkom stig van de mens of niet-humane warmbloedige dieren in een diffusieka-mer worden gekweekt, kunnen de cellen direct uit de kamer worden gewonnen of zij kunnen worden gewonnen nadat zij eenmaal uit de kamer zijn verwijderd hetzij direct of zelfs na behandeling met een of meer pro-25 motors.

De opbrengst van CB per dier kan zelfs nog verder worden opge— voerd door b.v. gebruik te maken van een methode waarin de cellen van een tot stand gebrachte cellijn afkomstig van de mens of niet-humane warmbloedige dieren die zijn gekweekt in het lichaam van een ander dier, 30 worden blootgesteld aan een promotor om de produktie van CB in situ te bevorderen waarna de gegroeide cellen, die bij een specifieke plaats of uit het gehele lichaam van een dier zijn geoogst, worden blootgesteld aan een promotor om de produktie van CB te induceren, een werkwijze waarbij de toegepaste cellen opnieuw worden blootgesteld aan een 35 inducerend middel cm de produktie van CB te induceren, een werkwijze 8300727 - ι6 - waarbij een diffusiekamer die in een of verbonden met bet lichaam van een dier is geplaatst, wordt vervangen door een nieuwe kamer om het aantal van de verkregen,cellen te vergroten enz.

Voor het opwekken van de produktie van CB kan elke promotor voor 5 CB als boven beschreven worden toegepast en het aldus geproduceerde CB kan in respectieve CB^, CB^ , CB^ eu CB^ met de specifieke molecuul-gewichten worden gesplitst onder toepassing van de boven beschreven bekende scheidings- en zuiveringsprocedures.

Hierna wordt de· effectiviteit, de giftigheid, de werkwijze voor 10 het toepassen en doseren van het aldus verkregen CB beschreven.

Proef T - Selectiviteit van het cytotoxische effect.

5

Monsters van 10' cellen van elk van de tumor cellijnen, omvattende KB cellen (neuskeelholtekanker), MX-1 cellen (borstkanker, geleverd door Dr. Shigeru Tsukagoshi, Kankerinstituut), HEp-2 cellen (keelkan-15 ker) en HEL cellen (hepatoma, Flow Co.) en van normale cellijnen omvattende ingewands UOT cellen, Girardi hartcellen, Chang levercellen, Ver o cellen (nier van de aap) en MDCK cellen (nier van een hond) (Flow Co.'), die alle waren voorgekweekt, gedurende resp. 2k uren en 105 cellen van elk van de P388 en L.1210 cellen (leukemie, geleverd door 20 Dr. Shigeru Tsukagoshi, Kankerinstituut) die onmiddellijk werden toege— past, werden elk gekweekt in t cm^ van Eagle's medium dat 10$ kalfs-serum en elke proefsubstantie bevat bij 37°C gedurende k8 uren in een 5$ CO^, 95$ luchtatmosfeer. Daarna, werd het aantal van de levensvatbare cellen dat niet was gekleurd met Trypan-blauw geteld onder een licht-25 microscoop en de concentratie van de proefstof waarbij 50$ van de cellen werden gedood, werd berekend ten opzichte van de controle die als 100 werd. genomen. De toegepaste proefstoffen waren CB^ verkregen in voorbeeld X, CB^ verkregen in voorbeeld XVI, CB^ verkregen in voorbeeld XX, CB^ verkregen in voorbeeld XXVI of XXIX, mengsel van 0Βχ en 30 0Βχ1, mengsel van 0Βχ, CB^, CB^g en CB^j mengsel van CB^ en CB^, o(-, /3- en -lymfotoxinen verkregen volgens een bekende methode (G.A.Granger et al.·, Cellular Immunology, Vol. 38, 388 - U02 (1978)), CBF afgescheiden uit CB^ in voorbeeld I en mitomycine C. Een eenheid van de lymfotoxinen en CBF wordt uitgedrukt door een gebruikelijke in-35 dex die is gebaseerd op de cytotoxiciteit van muize-L-cellen (Eds., 8300727 * * - 17 - B.H.Bloom. & P.R. Grade, "in Vitro. Methods in Cell-mediated Immunity", Academic Press, 19T9). De resultaten worden -weergegeven in tabellen B-l t/m B-U.

Tabel B-1 5 Celnaam Soort Concentratie voor 50# groeiremming

CB ï* -lymfo- CBF mitomy-ei-toxine ne C

(een- (eenheid/ (eenheid/ (ug/cm^) heid/ cm3) cm3) ' cm3)

10 KB humaan 1,0 16 18 3U

HEp-2 humaan 1,6 5,6 2U 17

Tumor— ΐτπτ, humaan 1,1 — 33 26 cel- , MX-1 humaan 1,9 - 3,5 32 len L1210 muis 3,0 - - U3 15 P388 muis 3,3 --36 ingewand humaan >1.000 80,0 >20.000 32 koj ^or“ Girardi humaan >1.000 - >20.000 U5 male hart cel- Change humaan >1.000 8,0 >20.000 19 _ lever len

Vero aap 650 - - 52 MDCK hond 520 Ui

Opm.: betekent dat de proef niet is uitgevoerd.

25 « 8300727 - 18 - · ^ k p I co" so a

S O

5 O --- 4· t- 'Vfl W π y) CU ON ON CU H

-pö öo on h cu on -4 oo on η h ia j-

•H -H

n ----------- Ό

•H O O O

0 UN O O O

Pc, jd » O O O I I

pq pion co -4- on oo ι ι · · · o 0 s h cu on o o o

0 g CU CU. CM

w Λ Λ ** .....ÖO — " g

*H

a I Ό g O -rt „ 0 ft 0 0 CU O oo tj ö ö cq Λ Λ Λ •η ?>·Η "con η c— i ι I i cu i oo ι i

0 Η X 0 g CU ON

O I O 0 O

ίΗ «N +3 '

tsO

65.

o UN I ^ Ο Ό

G ft 0 *H

O S G 0 00 O NO

Ο £>·Η 45 Λ * " > η κ αοη on -4 ι t ι ι no i on r ι I O 0 s H t“*

0 V -P (U CJ

•η a ^

•P

G T) · +3 CU ·Η 7 fl O Jh 0pq43^O-4UNNOJ- CU O O O OO 0 . o o G on «V .»»««· «. ο ο o -4· on o ö 0g^— r-T-T— onon σ ο o noun > 0 0 o ... 0

o w r- T- T- ÖQ

Λ \ Λ

\ G

•h ra T-0 ouNonoocucu ο ο ο · -h

jxj rj -—V ntinnn» Ο Ο O OO

pq con T- *- r- t- on oo ο ο o ohun +3 O0g · · · NO UN 0 0 ο ι— T- t— ·Η '•—l A Λ Λ. fl

Ip 0 ο GGGG G G G 5¾ +3 0000 000 ft

G 0000mta 0 0 0 G

ο i i i I -Η -H a I § ft g 0

o 3 3 3 3 G G 3 3 3 00 G

(Ο 0Λ 0

G

g G t- ·Η -P

0 0 Ο G 0 G

0 CU O 3-4- G bO G 0

c 1 r-r-CO 0 04300OW M

H ft J 1 01 Ο bOGGG0>GO 0 0 pq Η H g f 0 G0*H0 430 0 Q +3 Ü W W W S hG ft •hGG,GOH!>S 0

rG

A

r—1 G ·* 0 Ol I 0 I 3 p g H G GHHG a aj » 300 O000 ft

Eh Eh 0 H SgOH O

8300727 Λ - 19 -

Tabel Β-3

Celnaam Soort Concentratie voor 50# groeiremming

CB„*^ ^ CB mitomycine C

(eenheid/ (eenheid/ (ug/cm·3) cm3) cm3) 5 . ------ - KB humaan 1 ,0 1 »0 35 HEp-2 humaan 1,5 13T 13

Tumor- hvt, humaan 1,3 1»* 25' cel- MX-1 humaan 1,8 1 ,T 30 len . , 10 L1210 muis 3,1 2,9

P388 muis 3,^· 3,5 3T

ingewan— humaan >1.000 ?1 .000 35 den ^07

Girardi humaan >1.000 >1.000 Wi- 15 hart

Kor-

Change humaan >1.000 >1.000 21 male lever cel“ Vero aap 620 580 50 len MDCK hond 510 5^0 hk 2o primaire rat 870 910 6l cultuur rat lever

Opm.: *1) CB verkregen volgens voorbeeld XXVI X,3 *2) CB™ verkregen volgens voorbeeld XXIX 25 X3 » 8300727 - 20 - V *

Tabel B-l

Celnaam Soort Concentratie voor 50% groeiremming A*l) b*2) c*3) (eenheid/ (eenheid/ (eenheid/ . cm^) cm3) cm3) KB humaan 1.,0 1,0 1,0 HEp-2 humaan 1,5 1,U 1 »6 HEL humaan 1,6 1,7 1,9 cel" MX—1 humaan 1,8 1,7 · 1,6 10 len L1210 muis 3,0 3,2 3,0 P388 muis 3,1 3Λ - 3,2 ingevan- humaan >1.000 >1.000 >1.000 den 1*07

Hor— Girardi humaan >1.000 >1 .000 >1.000 5 male hart cel- Change humaan >1.000 >1.000 · >1.000 ‘levér len

Vero aap i6l0 590 580 MDCK hond 5Ö0 6l0 600 20 Opm.: *1) Mengsel van CB^ en CB^ *2) Mengsel van CB^, CB^, CB^ en CB^ S3) Mengsel van CB^ en CB^ 8300727 - 21 -

Zoals uit de "bovengenoemde resultaten "blijkt heeft CB evenals CBF selectief de tumorcellen aangetast zonder nagenoeg enige aantasting te veroorzaken van de normale cellen. De intensiteiten van het eytotoxi-sche effect op de "betreffende tumoren was echter voor CB en CBF ver-5 schillend. In tegenstelling daarmede vertoonden zowel cc- als β -lym-fotoxine en mitomycine C een niet-selectieve cytotoxiciteit ten opzichte van de normale cellen en de tumorcellen.

Proef 2 - Invloed op muizen getransplanteerd met Sarcoma l80 of Ehrlich-tumor.

10 Mannetjesmuizen (ddï-stam) die 25 - 30 g wogen, werden intraperi-

toneaal getransplanteerd met 3 x 10 cellen per dier van Sarcoma l80 of Ehrlich ascites tumor en de overlevingsdagen waargenomen. CB^ verkregen volgens voorbeeld VI, CB^ verkregen volgens voorbeeld XV, CB^ verkregen volgens voorbeeld XX en CB^ verkregen volgens voorbeeld XXVI

15 of XXIX werden intraveneus toegediend aan groepen van 5 muizen en wel dagelijks na een dag na de transplantatie tot hun dood. De resultaten worden uitgedrukt in percentage gemiddelde overlevingsdagen vergèlekèn met die van de controlegroep, zoals weergegeven in tabellen C-1 t/m C-3. ' 20 Tabel C-1

Tumor Proefstof Dagelijkse dosis Gemiddeld aantal overlevings dagen i%) CB 1,2 eenheden/kg 111 25 Muis k eehheden/kg 131

Sarcoma 12 eenheden/kg l6h 180 mitomycine C 0,5 mg/kg lUo cyclofosfamide 20 mg/kg 172 30 CB^ 1,2 eenheden/kg 1^1

Ehrlich ^ eenheden/kg 159 ascites 12 eenheden/kg 187 tumor mitomycine C 0,5 mg/kg 168 . cyclofosfamide 20 mg/kg 212 35 8300727 *r * - 22 -

Tabel C-2

Tumor Proefstof Dagelijkse dosis Gemiddelde aantal o verlevings dagen (%) 5 0Βχ1 1 ' eenheid/kg 113 w . 3 eenheden/kg 133

Muis 10 eenheden/kg l60

Sarcoma l8o cbx2 1 eenheid/kg 110 3 eenheden/kg 135 10 10 eenheden/kg 159 mitomycine C 0,5 mg/kg 138 cyclofosfamide 20 mg/kg 170 0Βχι 1 eenheid/kg 139 15 Ehrlich 3 eenheden/kg l6k . 10 eenheden/kg 187 81S C Χΐ es tumor 1 135 3 eenheden/kg löl 10 eenheden/kg 189 20 mitomycine C 0,5 mg/kg l6h cyclofosfamide 20 mg/kg 206

Tabel C-3

Tumor Proefstof Dagelijkse dosis Gemiddelde aantal ' overlevings dagen

25___ W

CB ) 1 eehheid/kg 110 X ó 3 eenheden/kg 129 „ 10 eenheden/kg 157

Sarcoma χ80 ' 0Βχ^*2) 1 eenheid/kg 10 8 3^ 3 eenheden/kg 131 10 eenheden/kg 150 mitomycine C 0,5 mg/kg lk2 8300727 - 23 -

Tabel C-3 (vervolg) CB al) 1 eeriheid/kg 139 S3

Ehrlich 3 eenheden/kg 155 ascites 10 eenheden/kg l8l 5 tumor CB ±2) 1 eenheid/kg 132 •S3

3 .. eenheden/kg 15T

10 eenheden/kg 179 mitomycine C 0,5 mg/kg 166

10 Opm.: *1) CB^ verkregen in voorbeeld XXVI

*2) CB^ verkregen in voorbeeld XXIX

Zoals uit de bovenstaande resultaten duidelijk blijkt toonde CB een significant anti-tumoreffect op beide soorten muizen waarin

Sarcoma 180 en Ehrlich-tumor waren getransplanteerd.

15 Proef 3 - Invloed op het aantal overlevingsdagen van leukemische muizen.

BDF -stam mannetj esmuizen die 20 - 25 g wogen werden intraperi-1 5 toneaal getransplanteerd met 10 cellen per dier van muize-leukemie · L1210 of 10^ cellen per dier van muize-leukemie P388, en het aantal overlevings dagen waargenomen. CB^ als verkregen volgens voorbeeld X, 20 CB.^ verkregen volgens voorbeeld XVI, CByp verkregen volgens voorbeeld XX en CBV, verkregen volgens voorbeeld XXVI of XXIX werden intraperito- •S3 neaal toegediend aan groepen van 5 muizen, hetzij dagelijks te beginnen een dag na de transplantatie tot hun dood (voor CB^, CB^ en CB^) of eenmaal op de dag volgende op de transplantatie (voor CB^). De resulta-25 ten worden uitgedrukt in percentage van het gemiddelde aantal overle-vingsdagen ten opzichte van de controlegroep zoals aangegeven in de tabellen D-1 t/m D-3.

Tabel D-1

Tumor Proefstof Dagelijkse dosis Gemiddelde aantal overlevingsdagen 30 (*) CB^ 0eenheden/kg 105

Mds 1,2 eenheden/kg 123 11 151 35 mitomycine C 0,5 mg/kg 128 L1210 6 cyclofosfamide 20 mg/kg 172 ---4—d 8300727 - 2b -

Tabel D-1 (vervolg) CB 0,U eenheden/kg 113 iv

Muis 1,2 eenheden/kg 128 leukemie ^ eenheden/kg 1^4 5 P388 mitomycine C 0,5 mg/kg 133 cyclofosfamide 20 mg/kg 1^7

Tahel D-2

Tumor Proefstof Dagelijkse dosis Gemiddeld aantal Ίn overlevings dagen 10 (Jf) CBV1 3 eenheden/kg 10 8 Λ i 10 eenheden/kg 122 leukemie 30 eenhed“^ ^

15 LI 210 CBX2 1 eenliei<i/kg HO

3 eenheden/kg 121 10 eenheden/kg 151 mitomycine C 0,5 mg/kg 136 cyclofosfamide 20 ' mg/kg 1^9 ~~ 20 CB 1 eenheid/kg 110

A I

3 eenheden/kg 126

Mtas 10 eenheden/kg lh-7 leukemie CB^ 0j3 eenheden/kg 109 25 Ρ33δ 1 eenheid/kg 125 3 eenheden/kg 151 mitomycine C 0,5 mg/kg 130 cyclofosfamide 20 mg/kg 1^5 30 Tabel D-3

Tumor Proefstof Dagelijkse dosis Gemiddeld aantal overlevings dagen {%)

Muis ) 10 eenheden/kg 109 35 LlSno"18 30 e<=nheden/kg 120 8300727 — * · - "V · - 25 -

Tabel D-3 (vervolg) 100 eenheden/kg ik9 10 eenheden/kg 111 30 eenheden/kg 121 5 100 eenheden/kg l U6 mitomycine C 5,0 mg/kg 132 CB^2*1) 10 eenheden/kg 122

Muis 30 eenheden/kg 1^5 10 leukemie 100 eenheden/kg lj6 P388 CB^*2) 10 eenheden/kg 120 30 eenheden/kg 1^8 100 eenheden/kg 171 mitomycine C 5,0 mg/kg ikl 15

Opm.: ±1) CB^ verkregen volgens voorbeeld XXVI *2) 0Βχ2 verkregen volgens voorbeeld XXIX

Zoals duidelijk uit de bovenstaande resultaten blijkt toonde CB 20 significant anti-tumoreffect ten opzichte van beide typen muizen met leukemie L121Q en P3Ö8,

Proef ^ - Invloed op het aantal overlevingsdagen van longcarcinoma dragende muizen* BDF1-stam mannetj esmui zen met een gewicht van 20 - 25 g werden * . 6 25 intramusculair in de rechterdij 2 x 10 cellen van lewis's longcarcinoma toegediend en het aantal overlevingsdagen waargenomen. 0Βχ verkregen volgens voorbeeld VII, CB^ verkregen volgens voorbeeld XVII, CB^ verkregen volgens voorbeeld XXII en CB verkregen volgens voorbeeld XXVI of XXIX werden intraveneus toegediend aan groepen van 6 muizen 30 en wel dagelijks vanaf de eerste dag na de transplantatie tot zij stierven. De resultaten worden uitgedrukt in percentages van het aantal over-levingsdagen ten opzichte van dat van de controlegroep, zoals weergegeven in tabellen E-1 t/m E-2.

___- 8300727 ' . < η - 26 -

Tabel Ε-1

Proefstof Dagelijkse dosis Gemiddeld aantal overlevingsdagen 00

5 0Βχ 1,2 eenheden/kg ÏOU

4 eenheden/kg 112 12 eenheden/kg lU6 mitomycine C 0,5 mg/kg . 121 cyclofosfamide 20 mg/kg 163 10

Tabel E-2

Proefstof Dagelijkse dosis Gemiddeld aantal overlevings dagen {%)

15 0Βχ1 1 eenheid/kg 10 T

3 eenheden/kg 113 10 eenheden/kg 1^5 CB^g - 1 eenheid/kg 109 3 eenheden/kg ’ 121--- 20 10 eenheden/kg 1^3 CB^jfel) 1 eenheid/kg 115 3 eenheden/kg lU3

10 eenheden/kg 15T

CB^2*2) 1 eenheid/kg 111 25 3 eenheden/kg 136 10 eenheden/kg 159 mitomycine C 0,5 mg/kg 120 cyclofsfamide 20 mg/kg l6h- 30 Opm. r *1) CBX3 verkregen volgens voorbeeld XXVI *2) CB^ verkregen volgens voorbeeld XXIX Proef 5 - Invloed op het aantal overlevings dagen van melanoma dragende muizen.

BDF -stam mannetjesmuizen met een gewicht van 20 - 25 g werden • 6 35 in hun rug subcutaan geïnjecteerd met 10 cellen per dier van muis-mela- 8300727 - 2T - noma Β l6, en het aantal overlevingsdagen waargenomen. CB^ verkregen volgens voorbeeld 2T,"en CB verkregen volgens voorbeeld XXVI of XXIX werden intraveneus toegediend aan groepen van 7 muizen en wel dagelijks te beginnen êén dag na de transplantatie tot aan hm dood. De resulta-5 ten worden uitgedrukt in percentages van het gemiddelde aantal overle-vingsdagen van de controlegroep, zoals weergegeven in tabellen F-1 en F-2.

Tabel F~1

Proefstof Dagelijkse dosis Gemiddeld aantal , overlevingsdagen 10 (?) CBj 1,2 eenheden/kg 112 k eenheden/kg 135 12 eenheden/kg l80 15 mitomycine C 0,5 mg/kg. 138 cyclofosf amide 20 mg/kg 158

Tabel F-2

Proefstof Dagelijkse dosis Gemiddeld aantal — overlevings dagen 20 (?) CB^Sl) 1 eenheid/kg 110 3 eenheden/kg 131 10 eenheden/kg 178 25 0Βχ2*2) 1 eenheid/kg 116 3 eenheden/kg 129 10 eenheden/kg 176

mitomycine C 0,5 mg/kg lkO

30 Opm.: *1) CB^ verkregen volgens voorbeeld XXVI *2) CB _ verkregen volgens voorbeeld XXIX Zoals duidelijk blijkt uit de bovenstaande resultaten toonde CB duidelijk een anti-tumoreffect op de muis-melamona B 16 dragende muizen.

Proef 6 - Invloed op de longmetastase van kanker 35 BDF^-stam mannetjesmuizen met een gewicht van 20 - 30 g, 6 dieren --- 8300727 - 28 - per groep, werden sub cut aan in bun rug geïnjecteerd met 2 mm vierkante segmenten van Lewises longkanker. 0Βχ verkregen volgens voorbeeld VI, 0Βχ^ volgens voorbeeld XV, CB^ volgens voorbeeld XX en CBF werden intraveneus eenmaal per dag gedurende 12 dagen na de 9e dag na de trans-5 plantatie toegediend. Op de 21e dag na de transplantatie werd de massa van de primaire tumor geïsoleerd en gewogen, waarbij bet aantal van de uitgezaaide knobbeltjes in de longen werd berekend volgens de methode van H.WexLer (J. Natl. Cancer Institute, Vol.36, 6kl (1966)). De resultatenworden aangegeven in tabellen G-1 en G-2.

10 Tabel G-1 . Proef. Proefstof Dagelijkse dosis Tumorgewicht Aantal uitge- / s zaaide knobbel— tjes in long 1 controle 9»6+1,9 29,2+7*3 15 0Βχ k eenbeden/kg 5,1+1»6X 6,8+3,2x 1)-0 eenheden/kg 3,0+0,3·°· 0 ,U+0,1)-2^ cyclofosfamide 20 mg/kg 3,1)+9,72^ 0,1)+0,2331 2 controle _____ 7,-3+9,3 29,2+1 ,1)

20 0Βχ l) eenbeden/kg 1).,1+1,2X 6,7+2»1X

1)0 eenheden/kg 2,3+0,2^ 0,5+9,2331 CBF k eenbeden/kg 6,6+0,6 22,0+5,0 1)0 eenbeden/kg l),2+0,l)-x 21,1)+1),5 25 Tabel G-2

Proefstof Dagelijkse dosis Tumorgewicht Aantal uitge— . . zaaide knobbel- lg' tjes in long controle 7,8+9»5 29,6+1,0 30 0Βχ^ 3 eenheden/kg 1),3+1,3X 7,3+2,Qx 30 eenheden/kg 2,1)+9,3321 0,5+9»8

CB^ 3 eenbeden/kg 1),9+1,33 7,1+1 >9X

30 eenbeden/kg 2,1+0,5231 0,7+0,3331 CBF 3 eenbeden/kg 6,8+0,6 23,0+5,2 35 30 eenbeden/kg 1),3+9>5X 22,1)+^,^ cyclofosfamide 20 eenbeden/kg 3,5+9,6231 0,6+0,3 8300727 - 29 -

Opa.: De resultaten in le tabellen worden uitgedrukt als (gemiddelde) + (standaardfout) i Statistisch, verschillend van de controlegroep bij een signifi-cantieniveau van 5% of minder 5 ** Statistisch verschillend van de controlegroep bij een signifi- cantieniveau van of minder.

Zoals duidelijk blijkt uit de bovenstaande resultaten was CB^ zeer succes vol bij het onderdrukken van de primaire longkanker en zijn longuitzaaiingen.» terwijl daarentegen CBF bijna geen effect had op de 10 longuitzaaiing.

Proef 7 - Effect wat betreft het .-indue eren van differentiatie van tumorcellen.

Volgens de methode van M.Hozumi et al. (Cancer Research, Vol.kO, 2919 - 292k (I98O)), werden 5 x 10^ cellen van acute myelogene leukemie-15 cellen M-t (geleverd door Dr.Mbtoo Hozumi, Saitama Cancer Center) ge-

O

suspendeerd in 1 cur Eagle rs medium dat 10% kalfsserum bevatte en dat tevens aminozuren en vitaminen bevat in hoeveelheden die tweemaal de gebruikelijke niveaus waren, waaraan elke proef stof werd toegevoegd, en bij 3T°C gedurende U8 uren in een 5% CQ^, 95%^ lucht atmosfeer, ge-20 kweekt. Daarna werden de cellen opnieuw gesuspendeerd in een medium dat 0,255 polystyreenlatexdeeltjes (Dow Chemical Co.), bevatte geincubeerd bij 37°C gedurende k uren, waarna het aantal van de cellen dat door fagocytose de deeltjes vernietigde en het aantal van de totale cellen werden geteld onder een lichtmicroscoop, waarbij de differentiatiegraad 25 werd berekend uit de verhouding van deze cellen. De resultaten worden aangegeven in tabel H.

Tabel 5

Proefstof Concentratie Differentiatiegraad (%) controle 1 3Q CBV 0,00¼ eenheden/cm^ 8 λ. - n 0,0¼ eenheden/cm 11 0,¼ eenheden/cm"5 18 *3 dexamethason 20,0 ng/cm 25 CB^. vertoonde een effect van het opwekken van differentiatie.

_____ q 8300727 -30 -

Proef 8 - Pyrogeenproef.

Volgens de methode beschreven in de Japanse Pharmacopeia werd CB^ verkregen volgens voorbeeld III intraveneus toegediend aan witte konijnen in een dosis van. 100 eenheden per dier. De resultaten van de 5 meting.van de rectale temperatuur 3 uren later onder toepassing van een thermokoppel type thermometer worden in tabel J weergegeven.

Tabel J

Konijn Gewicht Rectale temperatuur vodr en na CBV injectie (°C) (lr \ ^ ' vöor 1 uur 2 uren 3 uren injectie later later later A 2,0 38,90 38,70 38,80 38,80 B 2,0 38,90 38,90 38,97 38,97 • C 2,0 39,25 39,25 39,22 39,30

Proef 9- - Invloed op borstkanker hebben muizen.

15 Aan BALB/C stam kaalgeschoren muizen die 20 - 25 g wogen, 6 die ren in elke groep, werden door transplantatie subeutaan in hun rug 2 mm vierkante segmenten van humane borstkanker MX-1 toegediend. CB ver- X3 kregen volgens voorbeeld XXVI of XXIX werd intraveneus aan de muizen toe-—gediend gedurende ik dagen na de lUe dag volgende op de transplantatie.

20 Op de 15e dag na de eerste toediening werd het volume van de primaire tumor gemeten. De resultaten worden aangegeven in tabel K.

Tabel K

*1)

Proef stof Dagelijkse dosis Tumorvolume _ _ (em^)_ 25 controle 9,7 + 2,2 CB^*2) 1 eenheid/kg Jt6 + 1,3

3 eenheden/kg h,3 + 1,3X

10 eenheden/kg 2,2 + 0,9^ 0Βχ3Α3) 1 eenheid/kg 7,3+1,2

30 3 eenheden/kg h,6 _+ 1,4X

10 eenheden/kg 2,0 + 1,0^

mitomycine C 0,5 mg/kg 1+,¼ + 1,1X

Opm.: *1) (gemiddelde waarde) + (standaardfout)

*2) CB^ verkregen volgens voorbeeld XXVI 35 *3) CB verkregen volgens voorbeeld XXIX

8300727 - 31 - x Statistisch verschillend, van de controlegroep hij een signifi-cantieniveau van 5% of minder.

xx Statistisch verschillend van de controlegroep hij een signifl-cantieniveau van \% of minder.

5 Proef 10 - Invloed op methylcholanthreen-geïnduceerde tumor.

3rmethylcholanthreen opgelost in olijfolie werd suhcutaan geïnjecteerd in de zijbuik van ddï-stam muizen die 20 - 25 g wogen, 8 dieren in elke groep, en wel 0,5 mg per muis. CB^ verkregen volgens voorbeeld XXVI of XXIX werd intraveneus aan de muizen eenmaal per dag gedu-10 rende 21 dagen van ongeveer 60 dagen na de 3-methylcholanthreen-injectie toegediend. Op de 21e dag na de eerste CB toediening werd het volume ij van de tumor gemeten. De resultaten worden aangegeven in tahel I.

Tabel L

XI)

Proef stof Dagelijke dosis Tumorvolume 2$ (cm3) controle 10,5 * 2,3 CB^2*2) 1 eenheid/kg 8,5 + 1Λ 3 eenheden/kg 5 Λ + 1,bx

10 eenheden/kg 2,5 + 0,7XX

20 CB^2*3) 1 eenheid/kg 8,9 + 1,5

3 eenheden/kg 5,1 ± 1,3X

10 eenheden/kg 2,2 + 0,8^

mitomycine C 0,5 mg/kg 6,6 + 1,3X

Opa.: *1) (gemiddelde waarde) + (standaardfout)

25 *2) CB verkregen volgens voorbeeld XXVI

AJ

*3) CB^2 verkregen volgens voorbeeld XXIX

x Statistisch verschillend van de controlegroep bij een significant ieniveau van 5% of minder.

xx Statistisch verschillend van de controlegroep bij een signi-30 ficantieniveau van λ% of minder.

Zoals duidelijk is uit de bovengenoemde resultaten toonde CB^ duidelijk een anti-tumoreffect ten opzichte van de spontane tumor.

Proef 11 - Toxiciteitsproef (enkelvoudige toediening).

BDF^-stam mannet jesmuizen met een gewicht van 20 - 25 g, 10 die-35 ren per groep, werden intraveneus geïnjecteerd met CB en het aantal dode dieren na 7 dagen waargenomen. Het bleek dat alle 10 dieren dit over- 8300727 - 32 - leefden zonder enige verandering in het lichaamsgewicht en de algemene condities te vertonen, zelfs hij toediening van 10 *000 eenheden/kg CB^, CB^ of CB·^ of 100.000 eenheden/kg 0Βχ^·

Proef 12 - Toxiciteitsproef (30 dagen durende continue toediening).

5 BDP^-stam mannet j esmui zen die 20 - 25 g wogen, 10 dieren per groep,, werden intraveneus geïnjecteerd met het CB gedurende 30 dagen waarna het aantal dode dieren, de verandering in het lichaamsgewicht en de algemene condities werden waargenomen.

Het lichaamsgewicht werd gewogen tussen 9 uur en 10 uur 's mor-10 gens, terwijl de waarneming van de algemene condities werd uit gevoerd op de 10e, 20e en 30e dag volgens de methode van Arvien (Science, Vol.

36, 123 (1962)),, Het bleek dat er in deze 30 dagen geen dode dieren waren bij toediening van 1000 eenheden/kg/dag CB^ , CB^ of CB^g of 10.000 eenheden/kg/dag CB^ terwijl de lichaamsgewichtkramme min of 15 meer gelijk was aan die van de controlegroep. Verder bleken de algemene condities even normaal te zijn als in de controlegroep.

Zoals blijkt uit de bovenbeschreven experimenten onderdrukt CB selectief de groei van tumorcellen terwijl zij bovendien niet alleen op aanmerkelijke wijze de kankeruitzaaiing onderdrukken maar tevens 20 uitermate effectief zijn tegen verschillende tumoren en nog steeds zeer veilig zijn zelfs bij doses die hoger zijn dan de dosis waarbij het farmaceutische effect zal optreden. Derhalve is CB uitermate geschikt voor de therapie van verschillende tumoren zoals maagkanker, longkanker, hepatoma, darmkanker, borstkanker, uteruskanker, leukemie enz.

25 CB kan worden toegediend in de vorm van gebruikelijke prepara ten, zoals injecties, oogdruppels, neusdruppels, inhaleringsmiddelen, uitwendige preparaten, orale preparaten, rectale preparaten, vaginale preparaten enz. De dagelijkse therapeutische dosis van CB voor een volwassene is niet bijzonder kritisch vanwege de grote veiligheid daarvan, 30 maar in het algemeen is dit 0,5 - 500.000 eenheden, bij voorkeur 0,5 - 5.000 eenheden voor uitwendige toediening, 20 - 100.000 eenheden voor systemische toediening, zoals intraveneuze injectie, intramusculaire injectie enz. en 50 - 500.000 eenheden voor orale toediening, waarbij de dosis geschikt kan worden ingesteld afhankelijk van de toepassings- 35 methode of de ernst van de ziekte. De preparaten kunnen elk CB , CB ., A Al 8300727 - 33 - - CB^2 en CB^ afzonderlijk of in combinatie met elkaar in elke gewenste verhouding bevatten.

CB kan worden samengesteld tot farmaceutische preparaten volgens elke gebruikelijke methode waarbij farmaceutisch aanvaardbare dragers, 5 bases, excipient ia, enz. worden toegepast. Bij voorkeur worden zij toegepast als orale preparaten, zoals enterische preparaten, b.v. capsules, tabletten, poeders enz., rectale preparaten, zoals zetpillen, injecties, zoals waterige injecties, reconstitueerbare preparaten van gevriesdroogd poeder voor oplossing in gedestilleerd injectiewater voorafgaande aan 10 het gebruik, alsmede uitwendige preparaten zoals zalf, lotions, enz.

Tevens kunnen zij worden toegepast als oogdruppels, neusdruppels of inhaleringsmiddelen.

Voorbeelden van vaste dragers en excipiëntia die met voordeel kunnen worden toegepast, zijn gebruikelijke excipiëntia zoals lactose, 15 mannitol, maïszetmeel en aardappelzetmeel, binders zoals kristallijn cellulose, cellulosederivaten, arabischegom, maïszetmeel en gelatine; desintegrerende middelen zoals maïszetmeel, aardappelzetmeel en calcium-carbohydroxymethylcellulose; en glijmiddelen zoals talk en magnesium-stearaat. Voorbeelden van vloeibare dragers die met voordeel kunnen wor-20 den toegepast, omvatten gedestilleerd injectiewater, fysiologische pe-keloplossing, plantaardige oliën voor injectiedoeleinden en glycolen zoals propyleenglycol en polyethyleenglycol.

Voorbeelden worden hierna gegeven maar de uitvinding is hiertoe 25 niet beperkt.

Voorbeeld I

Humane lymfocyten (2 x 10^ cellen) werden gesuspendeerd in 4000 cm^ Eagle's medium dat 10% kalfsserum bevatte en bij 37°C gedurende uren gekweekt in een 5% C02? 95% lucht atmosfeer. Daarna werd de 30 bovenlaag van het kweekmedium gedialyseerd ten opzichte van 0,01 M fos-faatbuffer (pH 7,2), en er werd een fractie uitgezout met hO - 80% ammo-niumsulfaat als het dialysaat verkregen. Deze fractie werd opnieuw gedialyseerd ten opzichte van genoemde fosfaatbuffer en daarna onderworpen aan gelfiltratie met Sephadex G-100 (Pharmacia Co.). Een fractie 35 van een molecuulgewicht van 12.000 - 17.000 werd verzameld, die wordt _ 8300727 - 34 - aangeduid als de ruwe CB^. fractie, terwijl de. eerder geëlueerde fractie wordt aangeduid als de ruwe CBF fractie. De ruwe CB^. fractie werd geadsorbeerd aan IDLex europeus agglutinine (Maruzen Oil Co.^geconjugeerd Sephadex, geëlueerd met 0,01 M fosfaatbuffer die 0,5 M fucose 5 bevatte. Nadat fucose door dialyse was verwijderd werd CB^ opnieuw geadsorbeerd aan het UIex europeus agglutinine-geconjugeerde Sephadex, gevolgd door elutie volgens de gradiëntmethode onder toepassing van fosfaatbuffer (piï 7,2), waardoor het gezuiverde CB werd geëlueerd. In totaal 0,02 mg CB^. werd verkregen. De totale activiteit van het verkre-10 gen CBV was 150 eenheden, zoals bepaald door de bovengenoemd beschreven methode. Aldus was de specifieke activiteit van het gezuiverde CB^ 7.500 eenheden/mg.

Voorbeeld II

Bunder lymfoc y ten (2 x 10^ cellen) werden gesuspendeerd in 1000 15 ml van Eagle's medium dat 10% kalfsserum bevatte en gedurende 48 uren bij 37°C in een 5$ C02, 95$ lucht atmosfeer gekweekt. Daarna werd de bovenlaag van het kweekmedium onderworpen aan de procedures van voorbeeld I ter zuivering van CBV waarbij 0,01. mg CB„ werd verkregen. De totale activiteit van het verkregen CB^ was 20 eenheden, aldus was de speci-20 fieke activiteit van het gezuiverde CB^ 2.000 eenheden/mg.

Voorbeeld III

Muislymfocyten (5 x 10^ cellen) werden gesuspendeerd in 5000

O

cur Eagle's medium dat 10$ kalfsserum bevatte en gedurende 1)-8 uren bij 37°C in een 5% 00^, 95$ lucht atmosfeer gekweekt. Daarna werd de boven-25 laag van het kweekmedium onderworpen aan de procedures van voorbeeld I ter zuivering van CB^ en werd 0,12 mg GB^ verkregen. De totale activiteit van het verkregen 0Βχ was 400 eenheden, aldus was de specifieke activiteit van het gezuiverde CB^ 3.333 eenheden/mg.

Voorbeeld IV

30 BALL-1 cellen (humane cellijn, 1 x 10^° cellen), die waren voor-

O

gekweekt, werden gesuspendeerd in 2.000 cmJ Eagle's medium dat 10$ kalfsserum bevatte, en gedurende 48 uren bij 37°C in een 5% C02, 95$ luchtatmosfeer gekweekt. Daarna werd de bovenlaag van het kweekmedium onderworpen aan de procedures van voorbeeld I .ter zuivering van CB^ en

35 werd 0,7 mg CB verkregen. De totale activiteit van het verkregen CBV

X X

8300727 • *· · - 35 - was 4.000 eenheden, aldus was de specifieke activiteit van het gezuiverde ΟΒχ 5.?l4 eenheden/mg.

Voorbeeld V

Plow 7000 cellen (humane fibroblast lijn, 3 x 10^ cellen), die 3 5 waren gekweekt door een celeultuur, werden gesuspendeerd in 600 cm

Eagle's medium dat 10% kalfsserum bevatte en gedurende 48 uren bij 37°C in een 5% CO^, 95% luchtatmosfeer gekweekt. Daarna werd de bovenlaag van het kweekmedium onderworpen aan de procedures van voorbeeld I ter zuivering van CB^ en werd 0,005 mg CB^ verkregen. De totale activiteit 10 van het verkregen CBY was 10 eenheden, aldus was de specifieke activi- Λ» teit van het gezuiverde CB^ 2.000 eenheden/mg.

Voorbeeld VI

Humane lymfocyten (2 x 10^ cellen) werden gesuspendeerd in 4000 cm^ Eagle's medium dat 10¾ kalfsserum bevatte, waarna zij na toevoeging 15 van fytohemagglutinine (Difco Co.) bij een eindconcentratie van 50 yg/cm^, gedurende 48 uren bij 37°C in een 5% CO^» 95% lucht atmosfeer werden gekweekt. Daarna werd de bovenlaag van het kweekmedium onderworpen aan de procedures volgens voorbeeld I ter zuivering van CB^ en werd

1,0 mg CB„ verkregen. De totale activiteit van het verkregen CBY was X X

20 10.000 eenheden, aldus was de specifieke activiteit van het gezuiverde CB^ 10.000 eenheden/mg.

Voorbeeld VII

Plow 7000 cellen (humane fibroblastlijn, 3 x 10^ cellen) werden gesuspendeerd in 600 cm^ Eagle's medium dat 10¾ kalfsserum bevatte, 25 waarna na toevoeging van fytohemagglutinine tot een eindconcentratie 3 o van 50 yg/em , werd gekweekt gedurende 48 uren bij 37 C in een 5% CO^, 95% luchtatmosfeer. Daarna werd de bovenlaag van het kweekmedium onderworpen aart de procedures volgens voorbeeld I ter zuivering van CB^ en werd 60 yg CE^ verkregen. De totale activiteit van h-t verkregen CB^ 30 was 480 eenheden, aldus was de specifieke activiteit van het gezuiverde CB^ 8.000 eehheden/mg.

Voorbeeld VIII

TALL-1 cellen (humane cellijn, 9 x 10^}, die waren gekweekt door een celeultuur, werden gesuspendeerd in 800 cm^ Eagle's medium dat 10¾ 35 kalfsserum bevatte, en na toevoeging van fytohemagglutinine tot een 8300727 - 36 -

• · eindconcentratie van 50 yg/cmJ werden zij gedurende 48 uren bij 37 C

gekweekt in een 5% CO^, 95% luchtatmosfeer. Daarna werd de bovenlaag van het kweekmedium onderworpen aan.de procedures volgens voorbeeld I ter zuivering van CB^ en werd 0,8 mg CB^, verkregen, De totale activi-5 teit van het verkregen· CB^ was 7.500 eenheden, aldus was de specifieke activiteit wan het gezuiverde 0Βχ 9,375 eenheden/mg.

Voorbeeld IX

Volwassen muizen werden voorbehandeld door bestraling met röntgenstralen van ongeveer 400 BEM ter onderdrukking van hun immunorespons, 10 waarna door transplantatie subcutaan TALL-1 cellen (humane oorsprong) werden aangebracht. Daarna werden de muizen gedurende 3 weken gevoerd.

De tumormassa die zich subcutaan had gevormd woog ongeveer 10 g, en werd geïsoleerd, fijngehakt en gedissocieerd in een fysiologische pekel-oplossing die trypsine bevatte, waarna de gedispergeerde cellen werden 15 verzameld» Deze cellen werden behandeld volgens de methode van voorbeeld I ter verkrijging van 0Βχ. Opbrengst van 0Βχ was ongeveer 190 eenheden per muis.

Voorbeeld X

BALL-1 cellen (humane cellijn, 9 x 10^ cellen) werden gesuspen-

O

20 deerd in 1.800 cur Eagle's medium dat 10% kalfsserum bevatte waarna na toevoeging van 9 x 10 pfu (plaque vormende eenheden) van Sendai virus (HVJ), gedurende 48 uren bij 37°C werd gekweekt in een 5$ CO^, 95$ lucht atmosfeer. Daarna werd de bovenlaag van het kweekmedium onderworpen aan de procedures volgens voorbeeld I ter zuivering van CB^ en 25 werd 720 yg CB^ verkregen. De totale activiteit van het verkregen CB^ was 7.920' eenheden, aldus was de specifieke activiteit van het gezuiverde CB^ 11.000 eenheden/mg.

CB„ zoals boven verkregen, werd opgelost in een fysiologisch \ X 3 pekeloplossing bij een concentratie· van 1 mg/cm en de optische draai- 30 ing van de oplossing bij 598 nm (Ha. D lijn) werd gemeten bij 26,5 - 28,5°C door een polarimeter (Hihon Bunko DIP-181) onder toepassing van een microcel van 10 mm in een lichtbundel. Er werd voor gezorgd dat de optische rotatie van de fysiologische pekel als blanco nul was. CB^ vertoonde levo-rotatie.

35 CB^ (lO yg) als boven verkregen, werd tot een microtablet ge- 8300727 - 3T - vormd met kaliumbromidepoeder -voor het meten Van het IR-spectrum van CB^. De geïntegreerde meting (60-maal) werd uitgevoerd volgens Fourier transformatie infraroodspectrofotometer fX-6201 (Analect Instruments Co ·) * 5 De resultaten worden weergegeven in fig. 1.

Voorbeeld XI

Aan volwassen kaalgeschoren muizen werden subcutaan BALL-1 cellen (humane oorsprong), getransplanteerd waarna zij gedurende 3 weken werden gevoerd. De resulterende tumormassa die zich subcutaan had ge-10 vormd woog steeds ongeveer 10 g, en werd geïsoleerd, fijngehakt en daarna gedissocieerd in een fysiologische pekeloplossing die trypsine bevatte waarbij de gedispergeerde cellen werden verzameld. Deze cellen werden gewassen met Eagle's medium dat 5$ humaan serum bevatte, daarna 9 3 werden 2 x 10 cellen daarvan gesuspendeerd in 2.000 cm van hetzelfde 15 medium en gedurende U8 uren bij 3T°C in een 5% C0g, 95% lucht atmosfeer gekweekt. Vervolgens werd de bovenlaag van het kweekmedium onderworpen aan de procedures volgens voorbeeld I om CB^ te verkrijgen. Opbrengst aan CB^ was ongeveer 200 eenheden per kaalgeschoren muis.

Voorbeeld XII

20 JBL cellen (humane cellijn) werden gesuspendeerd in fysiologische pekel en de suspensie werd daarna gebracht in een kunststof cilindrische diffusiekamer met een capaciteit van ongeveer 10 ml en voorzien van een membraanfilter met een poriënafmeting van ongeveer 0,5 micron, waarbij deze kamer werd gebracht in de peritoneale holte van een volwas-25 sen rat. De rat werd gedurende k weken gevoerd en de kamer werd daarna verwijderd.

De celconcentratie van de aldus verkregen humane cellen bleek 9 3 3 .

ongeveer 5 x 10 cellen per cm te zijn, hetgeen ongeveer het 10 -voudi- ge of meer betekent dan die verkregen door het in vitro kweken in een 30 voedingsmedium in een 5% CO , 95% luchtatmosfeer.

10 ^

In totaal 1 x 10 JBL cellen dxe volgens de bovenbeschreven me-

O

thode waren verkregen, werden gesuspendeerd in ^.000 cmJ Eagle’s medium dat 10$ kalfsserum bevatte en gedurende U8 uren bij 3T°C in een 5% C0g, 95% luchtatmosfeer gekweekt. Daarna werd de bovenlaag van het kweekmedi-35 um onderworpen aan de procedures volgens voorbeeld I ter verkrijging van _______j 8300727 " » * - 38 - CByr· De opbrengst van CB^ was ongeveer 350 eenheden per rat.

Voorbeeld XIII

Aan volwassen kaalgeschoren muizen werden subcutaan door transplantatie BALL-1 cellen (humane oorsprong) toegediehd, waarna zij ge-5 durende 5 weken werden gevoerd* Daarna werd elke muis intraperitoneaal geïnjecteerd met 1 mg fytohemagglutinine waarna zij 2b uren later na de injectie werden geofferd en de ascites werd verzameld. De ascites werd bij 1j-°C en 1000 g gecentrifugeerd waarna de verkregen bovenlaag werd gèdialyseerd tegen een fysiologische pekeloplossing die 0,01 M 10 fosfaatbuffer (pH 7»2) bevat en wel gedurende 15 uren. De oplossing werd verder ultragefiltreerd met een membraanfilter waarna het fil-traat werd geconcentreerd en men een oplossing verkreeg die CB^ bevatte. De hoeveelheid CB^. was ongeveer 8.000 eenheden per kaalgeschoren muis. Voorbeeld XIV

15 MLL-1 cellen (humane cellijn) werden gesuspendeerd in fysiolo gische pekel en gegoten in een kunststof cilindrische diffusiekamer met . . 3 een capaciteit van ongeveer 10 cm en voorzien van een membraanfliter met een poriënafmeting van ongeveer 0,5 micron, welke kamer werd aangebracht in de peritoneale holte van een volwassen rat. Deze rat werd ge-20 durende It· weken gevoerd waarna de kamer werd verwijderd. De aldus gegroeide cellen werden gewassen met Eagle’s medium dat 5% humaan serum bevatte en opnieuw in hetzelfde medium gesuspendeerd bij een celconeen- 6 3 tratie van. ongeveer 5 x 10 cellen per cm"5. Aan de suspensie werd onge-3 veer 200 yg/cm fytohemagglutinine toegevoegd waarna het mengsel bij 25 37°C gedurende 2 dagen werd geïncubeerd om de vorming van CB^ in te leiden.. Het aldus geproduceerde CB^ werd gezuiverd en geconcentreerd als beschreven in voorbeeld I en daarna geconcentreerd en gevriesdroogd waarna een poeder van CB^ werd verkregen. De opbrengst aan CB^ was ongeveer 15.000 eenheden per rat.

30 Voorbeeld XV

Volgens de procedures beschreven in voorbeeld VI werden humane lymfocyten gekweekt en werd de bovenlaag van het kweekmedium gezuiverd om een gezuiverde fractie met een molecuulgewieht van 70.000 - 90.000 te verkrijgen. Deze fractie werd aangeduid als de CB^. De totale acti-35'~ viteit van de 0,1 mg gezuiverde CB^ was 5.000 eenheden, aldus was de 8300727 - 39 - specifieke activiteit van. het gezuiverde CB^ 50.000 eenheden/mg.

De optische rotatie van CB^ als hoven verkregen werd gemeten als beschreven in voorbeeld X. CB^ toonde een dextro-rotatie.

De IR-meting van CB^ als boven verkregen, werd uit gevoerd als 5 beschreven in voorbeeld X. Het resultaat wordt aangegeven in fig.2.

Voorbeeld XVI

Volgens de procedures als beschreven in voorbeeld X werden BALL-1 cellen gekweekt en werd de bovenlaag van het kweekmedium gezuiverd cm een gezuiverd CB^ te verkrijgen. De totale activiteit van de 10 100 yg gezuiverd CB^ als verkregen was k.200 eenheden, aldus was de specifieke activiteit van het gezuiverde CB^ 1*2.000 eenheden/mg.

Voorbeeld XVEI

Volgens de procedures beschreven in voorbeeld VII werden Flow T00Q cellen gekweekt en werd de bovenlaag van het kweekmedium gezuiverd 15 om gezuiverd CB^ te verkrijgen in een hoeveelheid van 10 yg. De totale activiteit van het verkregen CB^ was 250 eenheden, aldus was de specifieke activiteit van het gezuiverde CB^ 25.000 eenheden/mg.

Voorbeeld XVIII

Volgens de procedures beschreven in voorbeeld II, werden runder-20 lymfocyten gekweekt en werd de bovenlaag van het kweekmedium gezuiverd waarna 0,002 mg gezuiverd CB^ werd verkregen. De totale activiteit van het verkregen CB^ was 1^· eenheden, aldus was de specifieke activiteit van het gezuiverde CB^ 7.000 eenheden/mg.

Voorbeeld XIX

25 Volgens de procedures beschreven in voorbeeld IV werden BALL-1 cellen gekweekt en werd de bovenlaag van het kweekmedium gezuiverd waarbij. 0,2 mg gezuiverd CB^ werd verkregen. De totale activiteit van het verkregen CB^ was 2.300 eenheden,, aldus was de specifieke activiteit van het gezuiverde CB^ 11.500 eenheden/mg.

30 Voorbeeld XX

Volgens de procedures beschreven in voorbeeld VI werden humane lymfocyten gekweekt en werd de bovenlaag van het kweekmedium gezuiverd waarbij een gezuiverde fractie met een molecuulgewicht van 1*0.000 - 50.000 werd verkregen. Deze fractie werd aangeduid als CByp. De totale 35 activiteit van de 0,25 mg gezuiverde CBvo was 5.200 eenheden, aldus was jd ___·_ 8300727 “ * < * - ko -

de specifieke activiteit van het gezuiverde CB^ 20*800 eenheden/mg. Voorbeeld XXI

Volgens de procedures "beschreven in voorbeeld X werden BALL-1 cellen gekweekt en werd de bovenlaag van het kweekmedium gezuiverd 5 waarbij men 75 yg. van gezuiverd CB^g verkreeg. De totale activiteit van het verkregen CB^ was 10.000 eenheden, aldus was de. specifieke activiteit van het gezuiverde CB^g 133*333 eenhedén/mg.

De optische rotatie van het als boven verkregen CB^g werd gemeten als beschreven in voorbeeld X* CB„„ toonde dextro-rotatie.

λΖ 10 De IR-meting van het als boven verkregen CB^ werd uitgevoerd

als beschreven in voorbeeld X. Dit resultaat wordt weergegeven in fig.3. Voorbeeld XXII

Volgens de procedures beschreven in voorbeëd VII werden Flow 7000 cellen gekweekt en werd de bovenlaag van het kweekmedium gezuiverd 15 waarbij 20 yg gezuiverd CB^g werd verkregen. De totale activiteit van het verkregen CBvo was 500 eenheden, aldus was de specifieke activiteit van het gezuiverde CByp 25*000 eenheden/mg.

Voorbeeld XXIII

Volgens de procedures, beschreven in voorbeeld II werden runder— 20 lymfocyten gekweekt en werd de bovenlaag van het kweekmedium gezuiverd waarbij 0,001 mg gezuiverd CB^p werd verkregen. De totale activiteit van het verkregen CB^g was kO eenheden, aldus was de specifieke activiteit van het gezuiverde CB^ kO.OOO eenheden/mg.

Voorbeeld XXIV

25 Volgens de procedures beschreven in voorbeeld IV werden BALL-1 cellen, gekweekt en de bovenlaag van het kweekmedium gezuiverd waarbij 0,25 mg gezuiverd CB^g werd verkregen. De totale activiteit van het verkregen CB^g was 2.900 eenheden, aldus was de specifieke activiteit van het gezuiverde CB^g 11.600 eenheden/mg.

30 Voorbeeld XIV

Humane lymfocyten (2 x 10^ cellen) werden gesuspendeerd in

O

kOOO cur Eagle's medium dat 10$ kalfsserum bevatte, waarna na toevoeging

O

van fytohemagglutinine bij een concentratie van 50 yg/cm de suspensie gedurende k8 uren bij 37°C werd gekweekt in een 5% COg, 95$ luchtatmos-35 feer. Daarna werd de bovenlaag van het kweekmedium gedialyseerd ten 8300727 - 4l - opzichte van 0,01 M fosfaatbuffer (piï 7*2) en werd een fractie die was uitgezout met 40 - 80% ammoniumsulfaat nit het dialysaat verkregen.

Deze fractie werd opnieuw gedialyseerd ten opzichte van genoemde fos-faatbuffer en daarna onderworpen aan gelfiltratie met Sephadex G-100 5 waarbij een fractie werd verkregen met een molecuulgewicht van 7.000 - 9.000, die werd aangeduid als de ruwe CBV, fractie.

De ruwe CB^ fractie werd geadsorbeerd aan fytohemagglutinine-geconjugeerd Sephalose, geëlueerd met 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2) die 0,5 M N-acetyl-D-galact os amine bevatte. Na het verwijderen van 10 N-acetyl-D-galact os amine door dialyse werd de resulterende oplossing aangébracht op carboxymethylcellulose, in evenwicht gebracht met 0,05 M fosfaatbuffer (pH 6,4), gevolgd door elutie met 0,05 M fosfaatbuffer (pH 6,4) die 0,5 M natriumchloride bevat. Aldus werd 0,1 mg CB^ kregen. De totale activiteit van het verkregen CB^ was 5.000 eenheden.

15 Voorbeeld XXVI

Pasgeboren hamsters werden voorbehandeld door injectie van een antiserum op conventionele wijze bereid uit konijnen, teneinde hun immunorespons zoveel mogelijk te verlagen waarna subcutaan BALL-1 cellen werden getransplanteerd en zij gedurende 3 weken werden gevoerd.

20 De tumormassa die zich subcutaan had gevormd en ongeveer 15 g woog, werd geïsoleerd, fijngehakt en gedissocieerd in fysiologische pekel.

Nadat de verkregen cellen met serumvrij Eagle's medium waren gewassen, 11 · 3 werden 1 x 10 cellen daarvan gesuspendeerd m 150 dm Eagle’s medium 6 dat 10# kalfsserum bevatte, en na toevoeging van 9 x 10 pfu Sendai 25 virus (HVJ) gedurende 48 uren bij 37°C in een 5% 00^, 95% lucht atmosfeer gekweekt. De bovenlaag van het kweekmedium werd gedialyseerd ten opzichte van 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2) en werd een fractie die was uitgezout met 4θ - 80# ammoniumsulfaat uit het dialysaat verkregen. Deze fractie werd opnieuw gedialyseerd tegen genoemde fosfaatbuffer en daar-30 na onderworpen aan gelfiltratie onder toepassing van Sephadex G-100 waarbij een fractie werd verkregen met een molecuulgewicht van 7.000 - 9.000, die werd aangeduid als de ruwe CB^ fractie. Deze ruwe CB^ fractie werd geadsorbeerd aan concanavaline A-geconjugeerd Sephalose, ge-elueerd met 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2) die 0,5 M «c-methyl-D-manno-35 side bevatte. Na verwijdering van het oC-methyl-D-mannoside door dialy- --. - Ü 8300727 -* * % ' - k2 - .

se werd de oplossing aangebracht op carboxymethylc ellulos e en in even-* ‘ wicht gebracht met 0,05 M fosfaatbuffer (pH 6,0), gevolgd door elutie met 0,05 M fosfaatbuffer (pH 7,8). De totale activiteit van de verkregen 0,2 mg CB.,., was 12.000 eenheden, en het isoëlektrische punt daar-5 van was 6,3 - 7,8.

Voorbeeld XXVII

Plow 7000 cellen (3 x 10^ cellen) werden gesuspendeerd in 1,0

O

dm-3 Eagle’s medium dat 10$ kalfsserum bevatte, waarna na toevoeging

O

van fytohemagglutinine tot een eindconcentratie van 50 yg/cm geduren-10 de 1)-8 uren bij 37°C werd gekweekt in een 5$ CO^, 95$ luchtatmosfeer.

De bovenlaag van het kweekmedium werd onderworpen aan de procedures volgens voorbeeld XXVI ter zuivering van het CB^ waarbij 0,1 mg CB^ werd verkregen. De totale activiteit van het verkregen CB^ was 3.1Q0 eenheden.

15 Voorbeeld XXVTII

Kunderlymfocyten (5 x 10^ cellen) werden gesuspendeerd in 10 dm^ Eagle's medium dat 10$ kalfsserum bevatte en gedurende U8 uren bij 37°C in een 5$ 00^, 95$ luchtatmosfeer gekweekt. Daarna werd de bovenlaag van het kweekmedium onderworpen aan de procedures in voorbeeld 20 XXVI ter zuivering van CB^, waarbij 0,1 mg gezuiverd CB^ werd verkregen. De totale activiteit van het verkregen CB^ was 1,700 eenheden. Voorbeeld XXIX

BALL-1 cellen (5 x IQ11 cellen), die door een celcultuur waren

O

gekweekt, werden gesuspendeerd in 100 cbn Eagle's medium dat 10$ kalfs-25 serum bevatte, en vervolgens gedurende U8 uren bij 37°C in een 5$ 00^, 95$ luchtatmosfeer gekweekt. Daarna werd de bovenlaag van het kweekmedium gedialyseerd tegen 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2) en werd een fractie die-was uitgezouten met ^0 - 80$ ammoniumsulfaat verkregen. Deze fractie werd opnieuw gedialyseerd_tegen genoemde fosfaatbuffer en. daar-30 na onderworpen aan gelfiltratie onder toepassing van Sephadex G-100 waarmee een fractie werd verkregen met een molecuulgewicht van 7 «000 - 9.000. Deze fractie werd geadsorbeerd op fytohemagglutinine-geeonju-geerd Sephalose, geëlueerd met 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2) die 0,5 M IT-acetyl-D-galactosamine bevatte. Na verwijdering van het N-acetyl-D-35 galactosamine door dialyse werd de gedialyseerde oplossing aangebracht 8300727 -^3- op carboxymethylcellulose in evenwicht gébracht met 0,05 M trisbuffer (pH 8,0), gevolgd door elutie met 0,05 M trisbuffer (pH 8,0) die 0,5 M natriumchloride bevatte, waardoor 0,1 mg gezuiverd CB^ werd verkregen, De totale activiteit van het verkregen CB^ was 8.200 eenheden en zijn 5 isoaLektrische punt was 8,0 - 9,2.

De optische rotatie van het verkregen CB^ werd gemeten als beschreven in. voorbeeld X, CB^ toonde geen optische rotatie.

De IR-meting van CB als boven verkregen, werd uitgevoerd als beschreven in voorbeeld X. Het resultaat wordt aangegeven in fig.^.

10 Voorbeeld XXX (waterige injecties) CB^ 100.000 eenheden natriumchloride 9 g 3

Gedestilleerd water voor injectie tot 1000 cm .

Het CBV en het natriumchloride werden afgewogen en gemengd, daar- 3 15 na opgelost in 500 cm. gedestilleerd water voor injectie, waarna het *3 totale volume werd ingesteld op 1000 cm met gedestilleerd injectiewa-ter. Deze waterige oplossing werd onder steriele omstandigheden met behulp van een membraanfilter gefiltreerd waarbij steeds 2 cm van het filtraat werd gebracht in gesteriliseerde glazen houders en afgesloten 20 ter bereiding van waterige injecties.

Voorbeelden XXXI - XXXIII

Procedures analoog a.an die van voorbeeld XXX werden uitgevoerd voor CB^, CB^2 en CB^ ter bereiding van waterige injecties.

Voorbeeld XXXIV (gevriesdroogde injecties) 25 CBY 100.000 eenheden

20% humane serumalbumine 10 cmJ

natriumchloride 9 g 3 gedestilleerd injectiewater tot 1.000 cm

Het CB^ en het natriumchloride werden afgewogen en gemengd, daar-30 na opgelost in een oplossing die was verkregen door de vooraf ingestel- 3 de hoeveelheid van het humane alhumine toe te voegen aan 500 cm gedestilleerd injectiewater, waarna het totale volume werd ingesteld op 1000 cm^ met gedestilleerd injectiewater. Deze oplossing werd gefiltreerd onder steriele omstandigheden met een membr aanfilter waarbij 35 steeds 2 cm van het filtraat werd aangebracht m gesteriliseerde gla- 8300727 ' Λ \ - uu - zen houders, gevriesdroogd en afgesloten ter bereiding van een gevriesdroogd poeder voor injectiedoeleinden*

Voorbeelden XXXV - XXXVII

Procedures soortgelijk aan die van voorbeeld XXXIV werden uitge-5 voerd voor CB^, CB^ en CB^ ter bereiding van resp. gevriesdroogde injeetiepoeders.

Voorbeeld XXXVIII (oogdruppels) CB^ 100.000 eenheden natriumchloride 5 g 10 chloorbutanol 5 g

O

gedestilleerd injectiewater tot . 1.000 cm

De bovengenoemde ingrediënten werden afgewogen en opgelost in 3 950 cm gedestilleerd injectiewater. Het totale volume werd ingesteld 3 op 1000 cm en de oplossing werd gefiltreerd onder steriele omstandig-15 heden onder toepassing van een membraanfilter voor· het maken van een oogdruppelpreparaat.

Voorbeelden XXXIX - XLI

Procedures .analoog aan die. van voorbeeld XXXVIII werden uitgevoerd voor CB^, CByp en CB^ voor het maken van respectieve oogdruppel-20 preparaten.

Voorbeeld XLII (zetpillen) .... - - 0Βχ 100.000 eenheden polyethyleenglycol 1500 250 g polyethyleenglycol UOOO ca. 750 g 25 1.000 g

De bovengenoemde ingrediënten werden afgewogen en de totale hoeveelheden van het CB^ en polyethyleenglycol 1500 en 500 g polyethyleen-glycol UOOQ werden grondig gemengd waarna het resterende polyethyleenglycol· U00Q werd toegevoegd tot een totaal gewicht van 1000 g, waarna 30 verder krachtig werd geroerd en het geheel werd omgezet in 5000 mg rectale zetpillen volgens de smeltmethode.

Voorbeelden XLIII - XLV

Procedures analoog aan die van voorbeeld XLII werden uitgevoerd voor CB^, CB^2 en CB^ ter bereiding van respectieve zetpillen.

8300727 -^5-

Voorbeeld XLVI (neusdruppels) CB 100.000 eenheden

X

natriumchloride 5 g chloorbutanol 5 g -3 5 gedestilleerd water tot 1.000 cm Dé "bovengenoemde ingrediënten werden afgewogen en opgelost in 950 cm gedestilleerd water. De verkregen oplossing werd met gedestil- 3 leerd water ingesteld op een totaal volume van 1000 cm ter bereiding van een oplossing voor neusdruppels.

10 Voorbeelden XLVII - XLIX

Procedures analoog aan die van voorbeeld XLVI werden uitgevoerd voor CB^» GB^2 ea ®χ3 ^er van een respectieve oplossing voor neusdruppels.

Voorbeeld L (enterisch beklede tabletten) 15 CB 100.000 eenheden lactose 6k g aardappelzetmeel ca. 30 g polyvinylalcohol 3 g magnes iumstearaat 3 g 20 100 g

De bovengenoemde ingrediënten werden afgewogen, de totale hoeveelheden van het CB^. en lactose en ongeveer de halve hoeveelheid van het aardappelzetmeel werden gemengd waarna de resterende aardappelzetmeel aan het mengsel werd toegevoegd tot een totaal gewicht van 9^ g, 25 welk mengsel werd gemengd cm het homogeen te maken. Het verkregen mengsel werd toegevoegd aan een waterige polyvinylalcoholoplossing ea korrels werden bereid volgens de natte pelletiseringsmethode. De korrels werden gedroogd, gemengd met het magnes iumst earaat en samengeperst tot 200 mg tabletten. De tabletten werden bekleed met methylcellulosefta-30 laat ter bereiding van enterisch beklede tabletten.

Voorbeelden LI - Uil

Procedures analoog aan die van voorbeeld L werden uitgevoerd voor CB^, CByp en CB^ bereiding van enterisch beklede tabletten.

-:---- 8300727 . . - 1*6 -Voorbeeld LIV (zalf) CB^ 100.000 eenheden vloeibare paraffine 10 g vaseline ca. 1000 g 5 1000 g

De bovengenoemde ingrediënten werden resp. afgewogen, waarna het CB^ grondig met het vloeibare paraffine werd gekneed, waaraan 500 g vaseline werd toegevoegd en het geheel krachtig geroerd. Aan het mengsel werd geleidelijk, het resterende vaseline toegevoegd tot een totaal 10 gewicht van 1000 g, waarna het mengsel grondig werd gemengd ter berei- _ . __ ding van een zalf.

Voorbeelden LV - LVII

Procedures analoog aan. die van voorbeeld LIV werden uitgevoerd voor CB^, CB^2 en CB^ ter bereiding van zalven.

8300727

Claims (32)

1. Een nagenoeg gezuiverde vorm van een glycoproteïne (CB) geproduceerd door de cellen van warmbloedige dieren, met een anti-tumoreffect en met de· volgende eigenschappen: a.) molecuulgewicht: in het gebied van 7.000 tot 90.000 volgens 5 Sephadex gelfiltratie of SDS-gelelektroforese; b) kleurreactie: het vertoont een kleur die proteïnen aangeeft in de Lowry-reactie, een kleur die peptidebindingen en aminozuren aan-geeft in de ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstof chloride, en het vertoont een kleur die suikers aangeeft in fenol-zwavelzuurreactie, 10 de aathron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzunrreactie en de trypto-faan-zwavelzuurreactie; c) uiterlijk en oplosbaarheid: een wit poeder oplosbaar in waty, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer, en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; 15 d) suikergehalte: suikergehalte 8 - k5%, waarbij 6 - 28% van de totale suiker hexoses, 1 - 11% hexosamines en 1 -6% sialinezuren is; e) stabiliteit: stabiel in waterige oplossing met een pH van 2,0, 7»° of 11,0 bij h-°C gedurende 2k uren of langer en in een waterige oplossing met een pH van 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer; en 20 f) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder na genoeg normale cellen aan te tasten.

2. Een nagenoeg geheel zuivere vorm van een glycoproteïne (0Βχ) volgens conclusie 1, met een anti-tumoreffect en met de volgende eigenschappen: 25 a) molecuulgewicht: 12.000 - 17.000; b) kleurreactie: het vertoont een kleur die proteïnen aangeeft in de Lowry-reactie, het vertoont een kleur die peptidebindingen en aminozuren in de ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstof chloride aangeeft en het vertoont een kleur die suikers aangeeft in de fenol- 30 zwavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuur-reactie en de tryptofaan-zwavelzuurreactie; c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, _____ J 8300727 — 48 — •waterig natriumchloride en fosfaatbuffer en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte:, het suikergehalte is 27 - 33%, 'waarbij 17 -20% van de totale suikers hexoses, 5-7% hexosamines en 5 - 6% sialine- 5 zuren zijn; e) 'isoëlektrisch punt: 4,2 - 7,3; f) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op Ulex europeus agglutinine-geconjugeerd Sephadex in 0,01 M fosfaat buff er (pH 7,2); g) stabiliteit: stabiel in een -waterige oplossing met een pH 10 van 2,0,. 7,0 of 11,0 bij 4°C gedurende 2k uren of langer en in een waterige oplossing met een pH van 7,0 bij 6o°C gedurende 3 uren of langer; h) cytotoxieiteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale cellen aan te tasten; en i) differentiatie: induceert differentiatie van tumorcellen*

3. Een nagenoeg geheel gezuiverde vorm van. een glycoproteïne (CB^) volgens conclusie 1, met een anti-tumoreffect en met de volgende eigenschappen: a) molecuulgewicht: 70.000 - 90.000; bj kleurreacties: het vertoont een kleur die proteïnes aangeeft 20 in de Lowry-reactie, een kleur die peptidebindingen en aminozuren in de ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstof chloride aangeeft,, en een kleur die suikers aangeeft, in een fenol-zwavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuurreactie en de tryptofaan-zwavel-zuurreactie; 25 c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, waterig natriumchloride en fosfaat buff er, en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte: het suikergehalte is 35 - 45%, waarbij 23 - 28% van de- totale suikers hexosen, 8 - 11% hexosamines en 4 — 6% sialine- 30 zuren zijn; e) isoëlektrisch punt: 4,3 - 6,2; f) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op Ulex europeus agglutinine-geconjugeerd Sephadex in 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2); g) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH van 35 2,0, 7,0 of 11,0 bij 4°C gedurende 24 uren of langer en in een waterige 8300727 - 1*9 - oplossing met een pH van 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer; en Ii) cytotoxiciteit :· het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale cellen aan te tasten. k. Een nagenoeg geheel gezuiverde vorm van een glycoprotelne (CB^) 5 volgens conclusie 1, met een anti-tumoreffect en met de volgende eigenschappen: a) molecuulgewicht: Uo.000 - 50.000; b) kleurreacties: het vertoont een kleur die proteïnes aanwijst in de Lowry-reactie, een kleur die peptidehindingen en aminozuren in 10 de ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstof chloride aanduidt en het vertoont een kleur die suikers aangeeft in de fenol-zwavelzuurreac-tie, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuurreactie en de tryptofaan-zwavelzuurreactie; c) uiterlijk en oplosbaarheid: -Writ poeder, oplosbaar in water, 15 waterigi-natriumchloride en fosfaatbuffer en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte: het suikergehalte is 30 - 31%, waarbij 20 -23$ van de totale suikers hexoses, 6-8$ hexosamines en h - 6% sialine-zuren Is; 20 e) isoëlektrisch punt: - 7,3; f) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op Ulex europeus agglutinine-geconjugeerd Sephadex in 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2); g) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH van 2,0, 7,0 of 11,0 bij k°C gedurende 2k turen of langer en in een wa- 25 terige oplossing met een pH van 7,0 bij 60°C gedurende 3 turen of langer; en h) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg .normale cellen aan te tasten.

5. Een nagenoeg geheel gezuiverde vorm van een glycoproteïne (CB^) 30 volgens conclusie 1, met een anti-tumoreffect en de volgende eigenschappen: a) molecuulgewicht: 7.000 - 9.000; b) kleurreacties: het vertoont een kleur die proteïnes aangeeft in de Lowry-reactie, een kleur die peptidebindingen en aminozuren in 35 ie ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstofchloride aangeeft en het 8300727 - 50 - vertoont een kleur die suikers aangeeft in de fenol-zwavelzuurreacti'e, de anthron-zwavelzuurreact ie, de indool-zwavelzuurreactie en de trypto-faan-zwavelzuurreactie;, e) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, 5 waterig natriumchloride en fosfaatbuffer en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte: het suikergehalte 8 - 15$, waarbij 6 - 10$ van de totale suikers hexoses, 1 - 2$ hexosamines en 1 - 3$ sialinezuren zijn; 10 e) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op carboxymethylcellulose in een ionenuitwisselingschromatografie in 0,05 M fosfaatbuffer (pH 6 ,J+) onder toepassing van carboxymethylcellulose; f) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing, met een pH van 2,0, 7,0 of 11,0 bij k°C gedurende 2b- uren of langer en in een waterige 15 oplossing met een pH van 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer; g) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale cellen aan te tasten; en h) de aminozuurvolgorde van de eindstandige N van het proteïne-deel is alanine-alanine-,

6. Werkwijze voor het bereiden van een glycoproteine (CB) met een anti-tumoreffect omvattende het laten groeien van uitgangscellen afkomstig van warmbloedige dieren, en het van genoemde uitgangscellen of een gekweekte bovenlaag daarvan extraheren van een nagenoeg gezuiverde vorm van een glycoproteine met de volgende eigenschappen: 25 a) molecuulgewicht: in het gebied van 7*000 tot 90.000 volgens Sephadex-gelfiltratie of SDS-gelelektroforese; b) kleurreacties: het vertoont een kleur die proteïnes aangeeft in de Lowry-reactie, een kleur die peptidebindingen en aminozuren in de ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstofchloride aangeeft, en het 30 vertoont een kleur die suikers aangeeft in de .fenol-zwavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuurreactie en de trypto-faan-zwavelzuurreact ie; c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer, en slecht oplosbaar in ben- 35 zeen, hexaan en chloroform; 8300727 - 51 - d) suikergehalte: het suikergehalte is 8 - b^%, waarbij 6 - 28# van de totale suikers hexoses, 1 - 11# hexosamines en 1 - 6# sialine-zuren is; e) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH 5 van 2,0, 7,0 of 11,0 bij k°C gedurende 2b uren of langer en in een waterige oplossing met een pH van 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer; en f) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale cellen aan te tasten.

7. Werkwijze volgens conclusie 6, waarbij genoemd glycoprotexne (CB^) de volgende eigenschappen heeft: a) molecuulgewicht: 12.000 - 17.000; b) kleurreacties: het vertoont een kleur die proteïnes aangeeft in de Lowry-reactie, een kleur die peptidebindingea en aminozuren aan- 15 geeft in de ninhydrienreactie na hydrolyse met wat er stof chloride, en het vertoont een kleur die suikers aanwijst in de fenol-zwavelzuurreac-tie, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuurreactie en de trypt ofaan-zwavelzuurreact i e; c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, 20 waterig natriumchloride en fosfaatbuffer, en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte: het suikergehalte is 27 - 33#, waarbij 17 -20# van de totale suikers hexoses, 5 - T# hexosamines en 5 - 6% sialine-zuren zijn; 25 e) isoelektrisch punt: ks2 - 7,3; f) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op ülex europeus agglutinine-geconjugeerd Sephadex in 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2); g) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH van 2,0, 7,0 of 11,0 bij h-°G gedurende 2b uren of langer en in een wa- 30 terige oplossing met een pH van 7,0 bij 6θ°C gedurende 3 uren of langer; h) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale cellen aan te tasten; en i) differentiatie: induceert differentiatie van tumorcellen.

8. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat genoemd gly- 8300727 /r r ____ * > k - 52 - coprotelne (CBY1) de volgende eigens etappen heeft:*» jL\ a) molecuuïgewicht: 70.000 - 90.000; b) kleurreacties: het vertoont een kleur die proteïnes aangeeft in de Lowry-reactie, een kleur die de peptidehindingen en aminozuren 5 aangeeft in de ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstofchloride, en het vertoont een kleur die suikers aangeeft in de fenol-zvavelzuur- reactie,, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuurreactie en de tryptofaan-zwavelzuurreactie; c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, 10 waterig natriumchloride en fosfaatbuffer en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte: het suikergehalte is 35 - ^5%, waarbij 23 -28% van de totale suikers hexoses, 8 - 11% hexosamines en 1+ - 6% sia-linezuren zijn; 15 e) isoëlektrisch punt: k,3 - 6,2; f) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op Ulex europeus agglutinine-geconjugeerd Sephadex in 0,01 M fosfaatbuffer (pïï 7,2);" g) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH van 2,0, 7,0 of 11,0 bij 1+°C gedurende 2k uren of langer en in een ^a- 20 terige oplossing met een pH van 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer; en h) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale cellen aan te tasten.

9. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat genoemd gly- 25 coprotelne (CB ) de volgende eigenschappen heeft: a) molecuulgewicht: UO.OOO - 50.000; b) kleurreacties: het vertoont een kleur die proteïnes aangeeft in de Lowry-reactie,, een kleur die peptidehindingen en aminozuren aangeeft in de ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstofchloride en het 30 vertoont een kleur die suikers aangeeft in de fenol-zwavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuurreactie en de trypto-faan-zwavelzuurreactie; c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer en slecht oplosbaar in benzeen, 35 hexaan en chloroform; 8300727 - 53 - d) suikergehalte: het suikergehalte is 30 - 37#» waarbij 20 -23# van de totale suikers hexoses, 6-8# hexosaoines en 4 - 6# sialine-zuren zijn; e) isoëlektrisch punt: 4,2 - 7,3; 5 f) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op Ulex europeus agglutinine- geconjugeerd Sephadex in 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2); g) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH van 2,0, 7,0 of 11,0 bij 40<2 gedurende 24 uren of langer en in een waterige oplossing met een pH van 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of lan- 10 ger; en h) cytotoxieiteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale cellen aan te tasten.

10. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat genoemd gly-coprotelne (CB^) de volgende eigenschappen heeft: 15 a) molecuulgewicht: 7.000 - 9.000; b) kleurreacties: het vertoont een kleur die proteïnes aangeeft in de Lowry-reactie, een kleur die peptidebindingen en aminozuren aanwipt in de ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstof chloride, en het vertoont een kleur die suikers aanwijst in de fenol-zwavelzuurreac- 20 tie, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuurreactie en de tryptofaan-zwavelzuurreact ie; c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer en slecht oplosbaar in benzeen, hex aan en chloroform; 25 d) suikergehalte: het suikergehalte is 8 - 15#, waarbij 6 - 10# van de totale suikers hexoses, ! - 2# hexosamines en 1 - 3# sialine-zuren zijn; e) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op carboxymethylcellulose in een ionenuitwisselingschromatografie in 0,05 M fosfaatbuffer (pïï 30 6,4) onder toepassing van carboxymethylcellulose; f) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH van 2,0, 7,0 of 11,0 bij 4°C gedurende 24 uren of langer, en in een waterige oplossing met een pHvvan 7,0 bij 6o°C gedurende 3 uren of langer; 35 g) cytotoxieiteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder na- ___-Λ 8300727 • i ' k -5^- genoeg normale cellen aan te tasten; en h) de aminozuurvolgorde van de eindstandige N van het proteïne-deel daarvan is alanine-alanine-* 11* Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de uitgangs-5 cellen worden gekozen uit de groep "bestaande uit reticulo-endothele cellen, lymf oblast en, leukemiec ellen en fibroblasten, welke uitgangs-cellen niet-tot stand gebrachte cellen of cellen van tot stand gebrachte cellijnen kunnen zijn. 12* Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de tot 10 stand gebrachte cellijnen worden gekozen uit de groep bestaande uit BALB-1, TALL-1, ÏÏALL-1, Namalwa, M-7002, B-7101, Plow 7000, JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, EBV-HO, BAIM2 en CCRF-SB, die alle van humane oorsprong zijn. 13.· Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de tot • 15 stand gebrachte cellijnen worden gekozen uit de groep bestaande uit muis BALB/C 3T3» muizenleukemiecellen L1210, P388, muizen-melanomacloon M-3, rattetumor L1C-WRC 256, en hamster-melamona EPMI 18U6, die alle van niet-humane warmbloedige dierlijke oorsprong zijn. 1^. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de niet-20 tot stand gebrachte cellen worden gekozen uit de groep bestaande uit humane macrofagen en humane lymfocytenv

15. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de niet-tot stand gebrachte cellen worden gekozen uit de groep bestaande uit lymfo-cyten en macrofagen van niet-humane warmbloedige dierlijke oorsprong. 25 16* Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat direct cel len van een tot stand gebrachte cellijn van humane of niet-humane warmbloedige dierlijke oorsprong direct worden getransplanteerd in de lichamen van. warmbloedige dieren van dezelfde of verschillende soorten en genoemde glycoproteïne uit de tumors gevormd door de getransplanteer-30 de cellen wordt” geëxtraheerd hetzij direct of nadat de tumor is gekweekt en verder in vitro gegroeid.

17. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat diffusiekamers , die zijn geïnocculeerd met uitgangscellen van een tot stand gebrachte cellijn van humane of niet-humane warmbloedige dierlijke oor— 35 sprong, in warmbloedige dieren worden aangebracht op zodanige wijze, 8300727 - 55 - dat de toevoer van. een lichaamsvloeistof van genoemde dieren wordt op-genamen, genoemde uitgangscellen worden gekweeld: en genoemd glycoprote-ine uit de gekweekte uitgangscellen worden geëxtraheerd hetzij direct of nadat zij zijn gekweekt en verder in vitro gegroeid.

18. Werkwijze volgens conclusie 6, met het kenmerk, dat de uitgangs cellen worden onderworpen aan de inwerking van een of meer promotors.

19. Glycoproteïne met een anti-tumoreffect, dat is bereid volgens de werkwijze van conclusie 6.

20. Glycoproteïne met een anti-tumoreffect, bereid volgens de werk-10 wijze van conclusie 7.

21. Glycoproteïne met een anti-tumoreffect, bereid volgens de werkwijze van conclusie 8.

22. Glycoproteïne met een anti-tumoreffect, bereid volgens de werkwijze van conclusie 9* 15 23* Glycoproteïne met een anti-tumoreffect, bereid volgens de werk wijze van conclusie 10. 2b, Glycoproteïne met een anti-tumoreffect, bereid volgens de werkwijze van conclusie 11.

25. Glycoproteïne met een anti-tumoreffect, bereid volgens de werk-20 wijze van conclusie 12.

26. Glycoproteïne met een anti-tumoreffect, bereid volgens de werkwijze van conclusie 13.

27· Glycoproteïne met een anti-tumoreffect, bereid volgens de werkwijze van conclusie l4.

28. Glycoproteïne met een anti-tumoreffect, bereid volgens de werk wijze van conclusie 15.

29. Glycoproteïne met een anti-tumoreffect, bereid volgens de werkwijze van conclusie 16.

30. Glycoproteïne met een anti-tumoreffect, bereid volgens de werk-30 wijze van conclusie 17.

31. Glycoproteïne met een anti-tumoreffect, bereid volgens de werkwijze van conclusie 18.

32. Therapeutisch middel voor tumors dat als actieve component een voor anti-tumordoeleinden effectieve hoeveelheid van tenminste één van 35 de glycoproteïnen 0Βχ, CB^ , CB^ en CB^ met een anti-tumoreffect . .....i 8300727 • V * ' -56- en met de volgende eigenschappen: a) molecuulgewicht: in het gehied van 7-000 tot 90.000; volgens Sephadex gelfiltratie of SDS gelelektroforese; b) kleurreacties: het vertoont een kleur die een aanwijzing is. 5 voor proteïnes in de Lowry-reactie, een kleur die een aanwijzing is van peptidebindingen en aminozuren in de ninhydrienreactie na hydrolyse met. waterstof chloride, en het vertoont een kleur die een aanwijzing is van suikers in de fenol-zwavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurre-actie, de indool-zwavelzuurreactie en de tryptofaan-zwavelzuurreactiej 10 c) uiterlijk en. oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, waterig, natriumchloride en. fosfaat buff er en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte; het suikergehalte is 8 - U5$, waarbij 6 - 28$ van de totale suikers hexoses, 1 - 11$ hexosamines en 1 - 6$ sialine- 15 zuren zijn; e) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH van 2,0, 7,0 of 11,0 bij 4°C gedurende 2k uren of langer en in een waterige oplossing met een pH van 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer; en 20 f) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan maar na genoeg geen normale cellen.

33. Middel volgens conclusie 32, met het kenmerk, dat het glycopro-teïne (CB^.) de volgende eigenschappen heeft: a) molecuulgewicht: 12.000 - 17.000; 25 b) kleurreacties: het vertoont een kleur die een aanwijzing is van proteïnes in de Lowry-reactie,. een kleur die een aanwijzing is van peptidebindingen en aminozuren in de ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstofchloride, en het vertoont een kleur die een aanwijzing is van suikers in de fenol-zwavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurreactie, 30 de indool-zwavelzuurreactie en de tryptofaan-zwavelzuurreactie; c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte: het suikergehalte is 27 - 33$, waarbij 17 - 35 20$ van de totale suikers hexoses, 5-7$ hexosamines en 5 - 6$ sialine- 8300727 - 57 - zuren zijn; e) isoëlektrisch punt: 4,2 - 7*3; f) adsorbeerbaarheid: adsorb eerbaar op Ulex europeus agglutinine-geconjugeerd Sephadex in 0,01 M fosfaatbuffer (pH T»2); 5 g) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH van 2,0, 7,0 of 11,0 bij* 4°C gedurende 24 uren of langer en in een waterige oplossing met een pH van 7,0 bij 6o°C gedurende 3 uren of langer; . h) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder na-10 genoeg normale cellen aan te tasten; en i) differentiatie: induceert differentiatie van tumorcellen.

34. Middel volgens conclusie 32, met het kenmerk, dat het glycopro-teïne (CB^) de volgende eigenschappen heeft: a) molecuulgewicht: 70.000 - 90.000; 15 b) kleurreacties: het vertoont een kleur die een aanwijzing is voor proteïnes in de Lowry-reactie, een kleur die een aanwijzing is van peptidebindingen en aminozuren in de ninhydrienreactie na hydrolyse met wat er stof chloride, en het vertoont een kleur die een aanwijzing is van suikers in de fenol-zwavelauurreactie, de anthron-zwavelzuurreac-20 tie, de indool-zwavelzuurreactie en de tryptofaan-zwavelzuurreactie; c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte: het suikergehalte is 35 - 45$, waarbij 23 - 25 28% van de totale suikers hexoses, 8 - 11# hexosamines, en 4 - 6% sia- linezuren zijn; e) isoëlektrisch punt: 4,3 - 6,2; f) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op UIex europeus agglutinine-geconjugeerd Sephadex in 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2); 30 g) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH van 2,0, 7,0 of 11,0 bij 4°C gedurende 24 uren of langer, en in een waterige oplossing met een pH van 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer; en h) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder na-35 genoeg normale cellen aan te tasten. . J 8300727 -58- » * ¢- *

35· Middel volgens conclusie 32, met het kenmerk, dat het glycopro-telne (CB^) de volgende eigenschappen heeft: a) molecuulgewicht: UO.OOO - 50.000; b) kleurreacties: het vertoont een kleur die een aanwijzing is 5 van proteïnes in.de Lowry-reactie, een kleur die een aanwijzing is van peptidebindingen en aminozuren in de ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstofchloride, en het vertoont een kleur die suikers aanwijst in de fenol-zwavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuurreactie en de tryptofaan-zwavelzuurreactie; 10 c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte: het suikergehalte is 30 - 37$, waarbij 20 -23$ van de totale suikers hexoses, 6-8% hexosamines en \ - 6% sialine- 15 zuren zijn; e) isoëlektrisch punt: kt2 - 7,3; f) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op Ulex europeus agglutinine-geconjugeerd Sephadex in 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2); g) stabiliteit: stabiel in waterige oplossing met een pH van 2,0, 20 7,0 of 11,0 bij it-°C gedurende 2k uren of langer, en in een waterige op lossing met een pH van 7,0 bij 6q°C gedurende 3 uren of langer; en h) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale cellen aan te tasten.

36. Middel volgens conclusie 32, met het kenmerk, dat het glycopro-25 terne (CBV_) de volgende eigenschappen heeft: a) molecuulgewicht: 7.000 - 9.000; b) kleurreacties: het. vertoont een kleur die een aanwijzing is van proteïnes in de Lowry-reactie, een kleur die een aanwijzing is van peptidebindingen en aminozuren in de ninhydrienreactie na hydrolyse 30 met waterstofchloride, en het vertoont een kleur die een aanwijzing is van suikers in de fenol-zwavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuurreactie en de tryptofaan-zwavelzuurreactie; c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer en slecht oplosbaar in ben- 35 zeen, hexaan en chloroform; 8300727 * - 59 - d) suikergehalte: het suikergehalte is 8 - 15$, waarbij 5 - 10% wan de totale suikers hexoses, 1-2$ hexosamines en 1 - 3$ sialine-zuren zijn; e) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op carboxymethylcellulose 5 in een ionenidtwisselingschramatografie in 0,05 M fosfaatbuffer (pH 6,k) onder toepassing van carboxymethylcellulose; f) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH van 2,0, T,0 of 11,0 bij h°C gedurende 2h uren of langer, en in een waterige oplossing met een pH van 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer; 10 g) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder na genoeg normale cellen aan te tasten; en h) de aminozuurvolgorde van de eindstandige N van het protexne-deel is alanine-alanine-.

37. Middel volgens conclusie 32, met het kenmerk, dat de actieve com-15 ponent een mengsel van tenminste twee leden van de groep is bestaande uit 0Βχ, 0Βχι, 0Βχ2 en CB^ in elke gewenste combinatie.

38. Therapeutisch middel voor tumors die een farmaceutisch aanvaardbare drager bevat en als actieve component een voor anti-tumordoelein-den effectieve hoeveelheid van tenminste êén van de glycoprotexnen

20 CB^., CB.^, CB^g en CB^ met een anti-tumoreffect en die de volgende eigenschappen hebben: a) molecuulgewicht: in het gebied van 7.000 - 90.000 volgens Sephadex gelfiltratie of SDS gelelektroforese; b) kleurreacties: het vertoont een kleur die een aanwijzing is 25 van proteïnes in de Lowry-reactie, een kleur die een aanwijzing is van peptidebindingen en aminozuren in de ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstofchloride, en het vertoont een kleur die een aanwijzing is van suikers in de fenol-zwavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuurreactie en in de tryptofaan-zwavelzuurreactie; 30 c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte: het suikergehalte is 8 - k5%, waarbij 6 - 28% van de totale suikers hexoses, 1 - 11$ hexosamines en 1 - 6% sialinezu-35 ren zijn; __ 8300727 - 6o - e) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH van 2,0, 7,0, of 11,0 bij H°C gedurende 2b uren of langer, en in een waterige oplossing met pen pH van 7,0 bij 6o°C gedurende 3 uren of langer; en 5 f) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder na genoeg normale cellen aan te tasten.

39· Middel volgens conclusie 38, met het kenmerk, dat het glycopro-teïne (GB^) de volgende eigenschappen heeft: a) molecuulgewicht: 12.000 - 17.000; X0 b) kleurreacties: het vertoont een kleur die een aanwijzing is van proteïnes in de Lowry-reactie, een kleur die een aanwijzing is van peptidebindingen en aminozuren in de ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstofchloride en het vertoont een kleur die een aanwijzing is van suikers in de fenol-zwavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurreactie, 15 de indool-zwavelzuurreactie en de tryptofaan-zwavelzuurreactie; c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer, en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan. en chloroform; d) suikergehalte: het suikergehalte is 27 - 33$, waarbij 17 - 20 20$ van de totale suikers hexoses, 5-7$ hexosamines en 5 - 8$ saline- zuren zijn; e) isoëlektrisch punt: bt2 - 7,3; f) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op Ulex europeus agglutinine-geconjugeerd Sephadex in 0,01 M fosfaatbuffer (pH 7,2); 25 g) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH van 2,0, 7,0 of 11,0 bij b°C gedurende 2b uren of langer, en in een waterige oplossing met een pH van 7,0 bij 6o°C gedurende 3 uren of langer; h) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale cellen aan te tasten; en 30 i) differentiatie: induceert differentiatie van tumorcellen. HO. Middel volgens conclusie 38, met het kenmerk, dat het glycopro-teïne (CB^) de volgende eigenschappen heeft: a) molecuulgewicht: 70.000 - 90.000; b) kleurreacties: het vertoont een kleur die een aanwijzing is 35 van proteïnes in de Lowry-reactie, een kleur die een aanwijzing is van 8300727 % - 6ι - peptidebindingen en aminozuren in de ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstofchloride, en het vertoont een kleur die een aanwijzing is van suikers in de fenol-zwavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuurreactie en de tryptof aan-zwavelzuurreactie; 5 c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte: het suikergehalte is 35 - 45#, waarbij 23 -28# van de totale suikers hexoses, 8 - 11# hexosamines en 4-6# siali- 10 nezuren zijn; e) isoëlektrisch. punt: 4,3 - 6,2; f) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op Ulex europeus agglutinine-geconjugeerd Sephadex in een 0,01 M fosfaatbuffer (pH T,2); g) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH van 15 2,0, 7,0 of 11,0 bij 4°C gedurende 24 uren of langer, en in een wateri ge oplossing met een pH van 7,0 tij 60°C gedurende 3 uren of langer; en h) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale cellen aan te tasten. 20 4l, Middel volgens conclusie 38, met het kenmerk, dat het glycopro- teihe (CByp) de volgende eigenschappen heeft: a) molecuulgewicht: 40.000 - 50.000; b) kleurreacties: het vertoont een kleur die een aanwijzing is van proteïnes in de Lowry-reactie, een kleur die een aanwijzing is van 25 peptidebindingen en aminozuren in een ninhydrienreactie na hydrolyse met waterstofchloride, en het vertoont een kleur die een aanwijzing is van suikers in de fenol-zwavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurreactie, de indool-zwavelzuurreactie en de tryptofaan-zwavelzuurreaetie; c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, 30 waterig natriumchloride en fosfaatbuffer, en slecht oplosbaar in benzeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte: het suikergehalte is 30 - 37#, waarbij 20 -23# van de totale suikers hexoses, 6-8% hexosamines en 4 -6% sialine-zuren zijn; 35 e) isoëlektrisch punt: 4,2 - 7,3; ____ :,J 8300727 i * * i - 62 - f) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op Ulex europeus agglutinine-geconjugeerd Sephadex in een 0,01 M fosfaat buff er (pH 7,2); g) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH ran 2.0, 7,0 of 11,0 bij U°C gedurende 2h uren of langer, en in een wat eri-5 ge oplossing met een pH van 7,0 bij 6o°C gedurende 3 uren of langer; en h) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder nagenoeg normale cellen aan te tasten. k2. Middel volgens conclusie 38, met het kenmerk, dat het glycopro-10 teïne (CB.^) de volgende eigenschappen heeft: a) molecuulgewicht: 7.000 - 9.000; b) ELeurreacties: het vertoont een kleur die een aanwijzing is van proteïnes in de Lowry-reactie, een kleur die een aanwijzing is van peptidebindingen en aminozuren in de nihhydrienreactie na hydrolyse 15 met waterstof chloride, en het vertoont een kleur die een aanwijzing is van suikers in de fenol-zwavelzuurreactie, de anthron-zwavelzuurreac-tie, de indool-zwavelzuurreactie en de tryptofaan-zwavelzuurreactie; c) uiterlijk en oplosbaarheid: wit poeder, oplosbaar in water, waterig natriumchloride en fosfaatbuffer en slecht oplosbaar in. ben- 20 zeen, hexaan en chloroform; d) suikergehalte: het suikergehalte is 8 - 15%, waarbij 6 - 1Q% van de totale suikers hexoses, 1 - 2% hexosamines en 1 - 3% sialine-zuren zijn; e) adsorbeerbaarheid: adsorbeerbaar op carboxymethylcellulose 25 in een ionenuitwisselingschromatografie in 0,05 M fosfaatbuffer (pH β,1*) onder toepassing van carboxymethylcellulose; f) stabiliteit: stabiel in een waterige oplossing met een pH van 2.0, 7,-0 of 11,0 bij 4°C gedurende 2h uren of langer, en in een waterige oplossing met een pH van 7,0 bij 60°C gedurende 3 uren of langer; 30 g) cytotoxiciteit: het tast selectief tumorcellen aan zonder na genoeg normale cellen aan te tasten; en h) de aminozuurvolgorde van de eindstandige H van het protexne-deel daarvan is alanine-alanine-, 1+3. Middel volgens conclusie 38, met het kenmerk, dat de actieve 35 component een mengsel van tenminste twee leden van de groep bestaande uit CB^., CB.^, ΟΒ^ρ en in elke gewenste combinatie. 8300727