NO830669L - Nye glykoproteiner, fremgangsmaater for deres fremstilling og terapeutiske preparater for tumorer som inneholder slike glykoproteiner - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye glykoproteiner fremstilt fra et ekstrakt eller en supernantant av dyrkningsmedium av retikuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller eller fibroblaster av varmblodige dyr, fremgangs- |

måter for fremstilling av disse og terapeutiske midler for i ondsinnede tumorer som inneholder slike glykoproteiner alene, eller i kombinasjon som en aktiv bestanddel. j

Det er ikke kjent noen fullkommen terapi for tumorer, ogj i til tross for at mange terapeutiske midler for tumorer alle-rede er utviklet av mange forskere i verden, har det vært mange forsøk på å bruke nye terapeutiske midler og behand-linger ved kombinasjon av flere midler innenfor det kliniske, området.

i

De terapeutiske midler mot tumorer kan grovt klassifiseres

i to kategorier, kjemoterapeutiske midler og immunoterapeiu-tiske midler. Da de kjemoterapeutiske midler som også er kjent som cytotoksiske substanser utmerker seg ved.å virke ved ikke spesifikk undertrykkelse av celleveksten og følgelig er toksiske ikke bare for tumorcellene, men også for normale; celler, og viser alvorlige uheldige reaksjoner såsom leuko-cytopeni, acyese, alopecia, teratisme, ondsinnede neoplasmer osv., ligger det følgelig en sterk begrensning i doseringen.

Da på den annen side de immunoterapeutiske midler utøver sin terapeutiske effekt ved indirekte å undertrykke tumor-veksten ved å virke på de biofylaktiske funksjoner og ikke ved direkte å inhibere veksten av tumorcellene, er det langt mindre fare for sterkt uheldige reaksjoner sammenlignet med de kjemoterapeutiske midler. Imidlertid har tumorpasienter ofte ikke tilstrekkelige biofylaktiske funksjoner tilbake,

og derfor er den terapeutiske virkning av immunoterapeutiske midler ikke alltid tilfredsstillende sammenlignet med de kjemoterapeutiske midler.

Foreliggende oppfinnere har funnet at de retikuloendoteliale celler som spiller en viktig rolle i biofylaktiske funksjoner produserer en substans som er virksom ved behandling av tumorer og har søkt etter denne substansen. Flere faktorer som er ansett som lovende teraoeutiske midler' mot tumorer, f.eks. lymfotoksin, tumornekrosefaktor, interferon osv., har blitt fremstilt fra retikuloendoteliale celler som publisert av Granger, G. A. et al., Cellular Immunology, Vol. 38, 338-402 (1978), Carswell, E. A. et al.,! Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A., Vol. 72, 3666-33670 (1975)', og Issacs, A. et al., Proe. Roy. Soc. Ser. B., Vol. 147, ! 268 (1975). Videre har foreliggende oppfinnere nylig oppdaget en enkel metode for å isolere en stor mengde karcino-brytende faktor (i det følgende kalt CBF) som en blanding som inneholder det forutnevnte lymfotoksin, tumornekrosefaktor osv. fra en kultur av lymfoblaster dyrket i hamstere hvis immunreaksjon har vært undertrykket, og har funnet at dette CBF

er effektivt mot eksperimentelle tumorer transplantert til et dyr (The Yomiuri, morgenutgave, november 22, 1981). ! ! ii

i Gjennom forskning på CBF har foreliggende oppfinnere funnet at glykoproteiner som er forskjellige fra de forannevnte : cytotoksiske faktorer såsom lymfotoksin, tumornektrosefaktor, CBF osv. foreligger i et ekstrakt eller en supernantant av kulturmedium av retikulo-endoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller eller fibroblaster av varmblodige dyr,karakterisert veden meget sterk og selektiv cytotoksisk virkning på tumorceller, og har funnet flere fremgangsmåter for å fremstille slike glykoproteiner uten vanskeligheter.

Et formål ved foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe

nye glykoproteiner med antitumorvirkning.

Et annet formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe glykoproteiner med en antitumor virkning som isoleres fra et ekstrakt eller en supernantant av dyrkningsmedium av retikuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller eller fibroblaster fra varmblodige dyr.

Et videre formål med foreliggende oppfinnelse er å tilveiebringe fremgangsmåter for å fremstille antitumorproteiner fra et ekstrakt eller en supernantant av dyrkningsmedium fra retikuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller eller fibroblaster fra varmblodige dyr.

Et ytterligere formål ved foreliggende oppfinnelse er å i

tilveiebringe terapeutiske midler for tumorer som inneholder slike antitumorglykoproteiner alene eller i kombinasjon som j en aktiv bestanddel.

i Følgelig vedrører foreliggende oppfinnelse et glykoprotein j med de følgende egenskaper: j '■ i i

a) molekylvekt: i området fra 7000 til 90000 ved SDS gelelektroforese eller Sephadex gelfiltrering; b) fargereaksjoner: det viser en farge som indikerer protei-i ner i Lowry reaksjon, viser en farge som indikerer peptidr-bindiner og aminosyrer ved ninhydrinreaksjonen etter hyd-i rolyse med saltsyre, og har en farge som indikerer sukkere i fenol-svovelsyrereaksjonen, antronsvovelsyrereaksjonen,<1>indol-svovelsyrereaksjonen og i tryptofan-svovelsyrereak-, sjonen; c) utseende og løselighet: hvitt pulver opnløselig i vann, !i vandig natriumklorid og fosfatpuffer og svakt løselig benzen, heksan og kloroform; d) sukkerinnholdet er 8-45%, hvorav 6-28% av alt sukker er heksoser, 1-11% er heksosaminer og 1-6% er sialsyrer; e). stabil i en vandig løsning med pH 2,0, pH 7,0 eller pH 11,0 ved 4°C i 24 timer eller lenger og i en vandig løs-ning med pH 7,0 ved 6 0°C i 3 timer eller lenger; og f), den destruerer selektivt tumorceller uten å skade normale celler vesentlig.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fig. 1 viser IR spekteret av CBx målt i eksempel 10.

Fig. 2 viser IR spekteret av CBx1målt i eksempel 15.

Fig. 3 viser IR spekteret av CBX2målt i eksempel 21.

Fig. 4 viser IR spekteret av CBx^ målt i eksempel 29.

Da glykoproteinene i foreliggende oppfinnelse kan oppdeles

i fire fraksjoner med forskjellige molekylvekter og sukkeir<->innhold, klassifiseres disse glykoproteiner avhengig av forskjellen i molekylvekt i beskrivelsen, og en fraksjon i med en molekylvekt på 12000 - 17000 kalles Carcino-Bryter X

(i det følgende kalt CB ; dette gjelder også resten), en med i en molekylvekt på 70000-90000 kalles CB lf en molekylvekt på 40000-50000 kalles CBv0og en molekylvekt på 7000-9000 kalles CBx3- I .tilfeller hvor både CBX, CBxl, CBX2og CBx3betraktes samtidig, brukes "CB" som en generell betegnelse for disse.

i i

De fysikalske, kjemiske og biologiske egenskapene til glyko-i proteinene i foreliggende oppfinnelse beskrives nærmere i detalj.

I

i

! a) Molekylvekt: Målt ved gelfiltrering ved bruk av "Sephadex" G-100 (Pharmacia Co.) og 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2) som

løsningsmiddel er molekylvekten 12000-17000.

b) , Fargereaks joner: Resultatene fra forsøkene med CBV vandig løsning for fargereaksjoner er vist i tabell 1-1. Lowry reaksjonen og ninhydrinreaksjonen ble utført som beskrevet i Seikagaku Jikken Koza, Vol. 1, Quantitative Method of Proteins, 1971. Fenol-svovelsyrereaksjonen, antron-svovelsyrereaksjonen, naftol-svovelsyrereaksjonen, indol-svovelsyrereaksjonen og tryptofan-svovelsyrereaksjonen ble utført som beskrevet i Seikagaku Jikken Koza, Vol. 4, Quantitative Method of Sugars, 1971 og Holff reaksjonen ble utført som beskrevet i Seikagaku Jikken Kofza, Vol. 3, Quantitative Method of lipids, 1971.

Som man ser ovenfor viser CB^farger som indikerer proteiner og sukkere, men viser ikke en farge som indikerer lipider.

c) Utseende og oppløselighet: Hvitt pulver oppløselig i vann, vandig natriumklorid og fosfatpuffer, og lite oppløselig i

benzen, heksan og kloroform.

dl Sukkerinnhold: Ifølge Spiro (Spiro, H. A., Methods in Enzymology, Vol. 8, 3-26 (1966)), er sukkerinnholdet i CB^27-33%, og sukkersammensetningen er 17-20% heksoser, 5-7% heksosaminer og 5-6% sialsyrer.

e) Isoelektrisk punkt: Målt ved isoelektrofokusering på amfolin er det isoelektriske punkt 4,2-7,3. f) Adsorberbar på Ulex europeus agglutinin-konjugert "Sephadex" i 0,01 M fosfatpuffer (pfi 7,2). g) Stabil med hensyn til molekylvekt ved gelfiltrering og cytotoksisk aktivitet mot tumorceller i en vandig løsning med pH 2,0, pH 7,0 eller pH 11,0 ved 4°C i 24 timer eller lenger og i en vandig løsning med pH 7,0 ved 6 0°C i 3 timer i eller lenger. h) Selektiviteten ødelegger tumorceller uten å ødelegge normale celler vesentlig.

Cytotoksisiteten til CBAVble målt ved å dyrke 10 5 celler av tumorceller eller normale celler i 0,2 ml av et medium i; nærvær av denne substans ved 37°C i 48 timer i en 5% CC^, 95% luftatmosfære, og telle antallet levende celler som ikke farges med tryptanblått, og utrykt med den konsentrasjon ved hvilken økning av cellene i antall ble inhibert med 50%.

En enhet CB defineres som den mengde substans ved hvilken

5

veksten av 10 celler KB celle inhiberes med 50%.

i) Induserer differensiering av tumorceller, dvs. tilbake-fører tumorceller til normale celler i et forsøk beskrevet av Hozumi et al (Hozumi, et al., Cancer Research, Vol. 40, 2919 - 2924 (1980))., ved bruk av myelogene leukemiceller M-l.

<CB>X1

a) Molekylvekt: Målt ved gelfiltrering gjennom "Sephadex" G-100 og 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2) som løsningsmiddel er

molekylvekten 70000-90000.

b) Fargereaksjoner: Resultatene av prøvene på CB^ vandige løsning for fargereaksjoner er vist i tabell 1-2.

Man ser ovenfor at CB^ viser farger som indikerer proteiner og sukkere, men ikke viser noen farge som indikerer lipider.

c) . Utseende og oppløselighet: Hvitt pulver oppløselig i vann, vandig natriumklorid og fbsfatpuffer, og lite løselig i

benzen, heksan og kloroform.

d) Sukkerinnhold: Ifølge metoden til Spiro, er sukkerinnholdet av CB^ 35-45%, og sukkersammensetningen er 23-28%

heksoser, 8-11% heksosaminer og 4-6% sialsyrer.

e) Isoelektrisk punkt: Målt ved isoelektrofokusering på amfolin er det isoelektriske punkt 4,3-6,2. f) Adsorberbar på Ulex europeus agglutinin-konjugert "Sephadex" i 0,01 M f osf atpuf f er (pH 7,2).. g) Stabil med hensyn til molekylvekt ved gelfiltrering og cytotoksisk aktivitet mot tumorceller i en vandig løsning

med pH 2,0, pH 7,0 eller pH 11,0 ved 4°C i 24 timer eller

lenger og i en vandig løsning med pH 7,0 ved 6 0°C i 3 timer eller lenger.

i I-h) Det destruerer selektivt tumorceller uten vesentlig åj j ødelegge normale celler. Cytotoksisiteten av CB^ ble målt

ved fremgangsmåter beskrevet i CB .

CBX2 j

a) Molekylvekt: Målt ved gelfiltrering ved bruk av "Sephadex" G-100 og 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2) som løsningsmiddel,

i

er molekylvekten 40000-50000.

b) Fargereaksjoner: Resultatene av prøvene på CB^ vandig løsning av fargereaksjoner er vist i tabell 1-3.

Som vist ovenfor viser CB^ farger som indikerer proteiner og sukkere, men viser ikke en farge som indikerer lipider. c) Utseende og oppløselighet: Hvitt pulver oppløselig i vann, vandig natriumklorid og fosfatpuffer, og lite løselig i benzen, heksan og kloroform.

d) Sukkerinnhold: Ifølge metoden til Spiro er sukkerinnholdet av CB^ 30-37%, og sukkersammensetningen er 20-23%

heksoser, 6-8% heksosaminer og 4-6% sialsyrer.

e) Isoelektrisk punkt: Målt ved isoelektrofokusering på amfolin. er det isoelektriske punkt 4,2-7,3. f) Adsorberbar på Ulex europeus agglutinin-konjugert "Sephadex" i 0,01 M f osf atpuf f er (pH 7,2).. g) Stabil med hensyn til molekylvekt ved gelfiltrering og cytotoksisk aktivitet mot tumorceller i en vandig løsning

med pH 2,0, pH 7,0 og pH 11,0 ved 4°C i 24 timer eller lenger og.i en vandig løsning med pH 7,0 ved 6 0°C i 3 timer eller lenger.

h) Selektiviteten destruerer tumorceller uten å vesentlig ødelegge normale celler. Cytotoksisiteten til ble målt

ved fremgangsmåter . som er beskrevet under CB^.

<CB>X3

a) Molekylvekt: Målt ved SDS gelelektroforese er molekylvekten 7000-9000. b) Fargereaksjoner: Resultatene av prøvene på CB^ vandig løsning for fargereaksjoner er vist i tabell 1-4.

Som man ser ovenfor viser CB-^-j farger som indikerer proteiner og sukkere, men viser ikke en farge som indikerer lipidet.

cl Utseende og oppløselighet: Hvitt pulver oppløselig i vann, vandig natriumklorid og fosfatpuffer og lite oppløselig benzen, heksan og kloroform. d)„ Sukkerinnhold: Ifølge metoden til Spiro er sukkerinnholdet av CBX38-15%, og sukkersammensetningen er 6-10% heksoser,

1-2% heksosaminer og 1-3% sialsyrer.

e). Adsorberbar på karboksymetylcellulose i en ionebytte-kromatografi i 0,05 M fosfatpuffer (pH 6,4). ved bruk av

karboksymetylcellulose.

f). Stabil med hensyn til molekylvekt ved gelfiltrering og cytotoksisk aktivitet mot tumorceller i en vandig løsning med pH

2,0, pH 7,0 eller pH 11,0 ved 4°C i 24 timer eller lenger og i en vandig løsning med pH 7,0 ved 60°C i 3 timer eller lenger.

I

g) Det destruerer selektivt tumorceller uten vesentlig å' ødelegge normale celler. Cytotoksisiteten til kle målt

ved metodene som er beskrevet under CB^A .

I

j i h) Aminosyresekvensen til N-enden av proteindelen er alanin-alanin-.

Glykoproteinene i foreliggende oppfinnelse har felles

karakteristika i fargereaksjoner, utseende, oppløselighet, stabilitet, virkning på tumorceller osv., men de adskiller seg fra hverandre med hensyn til molekylvekt og sukkerinnhold, og derfor kan de forskjellige substanser adskilles fra hverandre.

Glykoproteinene i foreliggende oppfinnelse adskiller seg tydelig fra lymfotoksin, tumornekrosefaktor, en blanding derav, dvs. CBF eller interferon, som alle fremstilles fra retikulo-endoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller eller fibroblaster med hensyn til de følgende trekk og således er de åpenbart forskjellige substanser.

Lymfotoksin er kjent å foreligge som tre forskjellige typer avhengig av molekylvekten, dvs.©C-lymfotoksin med en molekylvekt på 70000-90000 , ( 3> -lymfotoksin med en molekylvekt på 35000-50000 og Y-lymfotoksin med en molekylvekt på 10000-20000 (Eds., Cohen et al., Biology of the Lymphokinase, Academic Press, 1979)..Med hensyn til molekylvekten ligner CB^Y-lymf otoksin, CB^ oC-lymfotoksin og CBx2P ^-lymfotoksin. Lymfotoksin beskrevet av Lucas et al (Lucas, Z. J. et al., J. Immunology, Vol. 109, 1233 (1972).). har liten selektivitet imidlertid ved cytotoksisk virkning og forårsaker skade på normale celler såvel som tumorceller. Derimot er den cytotoksiske virkning av glykoproteinene i foreliggende oppfinnelse selektiv overfor tumorceller og de er således klart forskjellige fra lymfotoksin. Videre er glykoproteinene i foreliggende oppfinnelse forskjellige fra lymfotoksin i adsorberbarhet og stabilitet. Mens lymfotoksin fremstilt ifølge Granger et al (Granger, G. A. et al, Cellular Immunology, Vol. 38, 388-402 (1978)). ikke eller bare svakt

I I

• adsorberes pa Ulex europeus agglutinin-konjugert "Sephadex"I

i 0,01 M fosfatpuffer, adsorberes glykoproteinene i foreliggende oppfinnelse på denne. Videre er glykoproteinene ' i foreliggende oppfinnelse stabile vandige løsninger mecj pH 2,0, pH 7,0 og pK11,0 ved 4°C i 24 timer eller lenger,

■ og er også stabile ved pH 7,0 ved 60°C i 3 timer eller lenger. Derimot taper lymfotoksin sin aktivitet med 60% eller mer etter å ha blitt holdt ved 56°C i 4 timer.

Tumornekrosefaktor viser en selektiv cytotoksisk virkning

, på tumorceller, og den har en molekylvekt på 33000-63000 og et sukkerinnhold på 0% (Carswell, E. A. et al, Proe. | Nati. Acad. Sei. U.S.A., Vol. 72, 3666-3670 (1975)). eller den har en molekylvekt på 39000 og et sukkerinnhold på 40% (The Nippon Keizai Shimbun, morgenutgave, 23. august, 1981), og begge er forskjellig fra CBX, CBxlog CBx3med hensyn til molekylvekt og fra CBx2med hensyn til sukkerinnhold .

Videre har CBF som inneholder disse cytotoksiske faktorer i kombinasjon en molekylvekt på ca. 35000 (The Nippon Keizai Shimbun, morgenutgave, 22. november , 19811 og adskiller seg fra glykoproteinene i foreliggende oppfinnelse med hensyn til molekylvekten.

Tskil jesllluigtt e efr ra gliynktoeprrfoetroen invened e ai t fofrøerlsitgngevenndte e oipkpke finhnar elase ntI fio-r-virus aktivitet.

Cellene som anvendes for å fremstille glykoproteinene i

i foreliggende oppfinnelse skal nå beskrives.

Celler fra mennesker eller andre varmblodige dyr for bruk

i foreliggende oppfinnelse kan være hvilke som helst retikuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller og j fibroblaster, og de kan brukes enten i en primærkultur

eller i en etablert cellelinje. Fortrinnsvis ønskes celler av menneskeopprinnelse og disse er sikre fordi de fremkalle:: mindre antigeninduserte reaksjoner og andre uheldige reåk-...

i . sjoner med hensyn til bruk av CB i behandling av mennesk;e<->: sykdommer. Som slike celler kan alle celler velges fra i:.eks.

' BALL-1 celler, TALL-1 celler og NALL-1 celler beskrevet av i Miyoshi (Miyoshi, I., Nature, Vol. 267, 843-844 (1977)),

i Namalwa celler beskrevet i Journal of Clinical Microbio| logy (J. Clin. Microbiol. , Vol. 1, 116-117 (1975)), M-70l02celler og B-7101 celler beskrevet i Journal of Immunology (Vol. 113, 1334-1345 (1974)), Flow 7000 celler (Flow CO.), JBL celler, EBV-Sa celler, EBV-Wa celler og EBV-HO celler beskrevet i "The Tissue Culture" (Vol. 6, 527-546 (1980)), etablert cellelinje såsom BALM 2 celler, CCRF-SB celler (ATCC CCL 120) etc, og menneskelymfocytter og makrofager, samt celler fra en etablert cellelinje fra menneskelymf6-cytter og makrofager behandlet med forskjellige virus, legemidler, bestråling osv.

Som celler fra andre varmblodige dyr enn mennesker kan hvilke som helst celler velges fra f.eks. mus BALB/C 3T3 celler (Flow Co.), mus leukemiceller såsom L1210 celler)

(J. Nati. Cancer Inst., Vol. 13, 1328 (1953).! og P388 ceiller(Scientific Proceedings, Pathologists&Bacteriologists; Vol. 33, 603 (1957).)., mus melanoma klon M-3 (Flow Co.) , i j rottetumor LLC-WRC 256 (Flow Co.), hamstermelanoma RPMIj 184 6 celler (Flow Co.), og lymfocytter, makrofager etc.' j Det er klart at cellene som kan anvendes i foreliggendei ;

oppfinnelse ikke er begrenset til de ovenfor beskrevne.i

Fremgangsmåten for fremstilling av glykoproteinene (CB). ; i j foreliggende oppfinnelse skal nå forklares.

i Fremgangsmåten for fremstilling av CB av celler fra mennesker eller andre varmblodige dyr kan velges blant kjente metoder for fremstilling av aktive substanser med celler, ! og det kan isoleres enten direkte fra cellene etter at ! JI cellene er dyrket, eller hvis det ønskes større mengde j CB, kan disse celler utsettes for en eller flere inducere. i F.eks. kan celler fra mennesker eller andre varmblodige! \ dyr oppslemmes i et formålstjenlig medium, utsettes direktej for inducer for fremstilling av CB som deretter kan isoleres

, fra mediet.

Som inducer for CB kan i allminnelighet en eller flere substanser valgt fra de følgende brukes: lektiner såsom fytp-hemaglutinin, konkanavalin A, kermesbær mitogen, lypopoly-sakkarider, polysakkarider såsom fosfomannan, dekstranfosifat<,>endotoksiner, mikrobielle cellebestanddeler, bakterier, virus, nukleinsyrer, polynukleotider etc. For antigen-sensitiyiserte celler tjener også tilsvarende antigen som en inducer for CB.

i

, Således fremstilt CB kan lett isoleres ved kjente rense-

metoder såsom utsalting, dialyse, filtrering, sentrifugering, konsentrering, lyofilisering osv. Hvis høyere rensing ønskes kan det oppnås ved adsorpsjon og eluering på en ionebytter-harpiks, gelfiltrering, elektroforese eller affinitets- ! kromatografi ved f.eks. å bruke antistoff- eller Ulex europeus agglutinin-konjugert "Sephadex".

Hvis CB skal fremstilles i stor mengde, kan cellene fra den etablerte cellelinje dyrkes i legemet til varmblodige dyr slik det nå skal forklares.

I

De etablerte cellelinjer fra mennesker eller andre varmblodige dyr kan være hvilke som helst retikuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller og fibroblaster, og jfor-trinnsvis cellelinjer fra mennesker er ønsket og sikre fordi de fremkaller mindre antigeninduserte reaksjoner og andre uheldige reaksjoner i forbindelse med bruk av CB i behandling av sykdommer hos mennesker. Som sådanne cellelinjer kan, j alle cellelinjer brukes som ovenfor beskrevet, f.eks. BALL-1 celler, TALL-1 celler, NALL-1 celler, Namalwa celler, M-7002 celler, B-7101 celler, Flow 7000 celler, BALB/C 3T3 celler, L1210 celler, P388 celler, lymfocytter, makrofager

i

etc.

1 i

I

Når disse celler skal dyrkes i varmblodige dyrelegemer, i kan transplantasjon av slike celler utføres direkte eller som nedenfor beskrevet, indirekte ved å inokulere et kammer med disse celler og plassere kammeret i legemet. De varm-i blodige dyr i hvilke slike celler transplanteres kan være 11 i i av de samme eller forskjellige arter så lenge den etablerte i cellelinje fra mennesker eller andre varmblodige dyr kari : vokse i disse. F.eks., fjærkre såsom kyllinger, duer og pattedyr såsom hunder, katter, aper, geiter, griser, hester, storfe, kaniner, marsvin, rotter, hamstere, vanlig mus, , hårløse mus kan brukes.

i Når et av disse dyr transplanteres med dyrkede celler fra et dyr av forskjellige arter, er det en mulighet for uøris-I

kede immunologiske reaksjoner. Derfor anvendes gjerne dyr i mest mulig umoden tilstand, f.eks. egg, foetuser, embryos eller onataler eller dyreunger slik at muligheten for immunb-logiske reaksjoner minimaliseres. Dertil kan de immunologiske reaksjoner også undertrykkes ved forbehandlinger, f.eks. ved å utsette disse dyr for røntgen på 200-600 REM eller injisere dem med immunoundertrykkende midler.

Når dyret som skal brukes som vert er en hårløs mus eller

i de samme arter som cellene skal transplanteres til er immunologiske reaksjoner svake og derfor kan slike celler transplanteres til disse og dyrkes raskt uten noen forbe-handling, og derfor er bruk av slike celler spesielt gunstig.

Alternativt kan konstant vekst av cellene også sikres og mengden av produsert CB fra disse kan økes ved å trans- 1 plantere celler fra et varmblodig dyr til et annet varmblodig dyr, f.eks. ved å transplantere celler fra mennesker eller andre varmblodige dyr til hamstere for vekst og der- j etter retransplantere disse celler til hårløse mus. I slike! tilfeller kan transplantasjonen utføres mellom den samme klasse eller gruppe såvel som mellom samme art eller slekt.]

Stedet cellene fra mennesker eller andre varmblodige dyr skal transplanteres til kan være alle steder hvor de trans-! planterte celler kan vokse og f.eks. det allantoiske hul-rom, vene, mavehule, subkutant etter ønske. I stedet for direkte transplantasjon og dyrking av etablerte cellelinjer fra mennesker eller andre varmblodige dyr i i legemet til varmblodige dyr, kan alle de ovenfor nevnte éta-blerte cellelinjer inokuleres og dyrkes i et vanlig diffv-sjonskammer av forskjellig form og størrelse som f.eks. plasseres i peritoneale kroppshulrom hos varmblodige dyr<i>Diffusjonskammeret er laget for å muliggjøre vekst av disse celler ved å lette opptak av kroppsvæske fra dyret som næringsmiddel, .og kammeret er også forsynt med porøse filtermem-f ibra-n3er, f.eks. membranfilter med en porestørrelse på 10 _7i-,10 m, ultrafilter eller hulfiber, hvilket forhindrerivandring av celler ut fra kammeret og gjør det mulig for kroppsvæske som næringsmiddel å komme inn i kammeret.

Om nødvendig kan diffusjonskammeret lages og plasseres på f.eks. overflaten til dyrelegemet, slik at næringsvæsken i kammeret forbindes med dyrets kroppsvæske og disse sirku-leres, slik at veksten til cellene som er inokulert i dette

. i kammer kan betraktes gjennom et observasjonsvindu. Diffusjonskammeret kan også være slik laget at det kan tas vekk fra dyrelegemet og dermed muliggjøre dyrking av cellene ! gjennom hele dyrets levetid og derved øke utbyttet av cellene pr. dyr. !

Fremgangsmåten som medfører bruk av disse diffusjonskammére har ytterligere fordeler, nemlig fordi cellene til de etåb-

i lerte cellelinjer fra mennesker eller andre varmblodige dyr ikke bringes i direkte kontakt med dyrecellene, kan slike celler lett isoleres og p.g.a. den lave sannsynlighet for å forårsake de ønskede immunologiske reaksjoner kan forskjellige varmblodige dyr brukes uten behov for at dyrene forbehandlesj for immunoundertrykkelse. ! j

Dyrene som cellene transplanteres til kan fores og holdes på vanlig måte for dyret, og det kreves ingen spesiell omhu : i ! selv etter transplanteringen, dette er derfor gunstig.

I i

i

Den nødvendige vekstperiode for cellene til de etablerte ' cellelinjer fra mennesker eller andre varmblodige dyre er i-.

.allminnelighet 1 til 10 uker. Det oppnådde antall celler ' 'er funnet å være ca. 10 7 -10<12>celler eller mer pr. dyr. |Med andre ord er fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse for fremstilling av CB spesielt fordelaktig for fremstilling av CB, fordi de etablerte cellelinjer fra varm-2 7

blodige dyr-økes ca. 10 -10 ganger eller mer sammenlignet ;méd antall celler direkte inokulert i dyret, eller ca. 10-10:gener eller mer av forøkningen sammenlignet med det tilfel-I let hvor cellene ble dyrket i et næringsmedium.

Fremstillingen av CB fra de dyrkede celler fra en etablert cellelinje fra mennesker eller andre varmblodige dyr kan|

utføres på forskjellige måter. De kan også isoleres direkte fra legemet hvori slike celler har blitt dyrket. F.eks. kan CB direkte isolert fra celler fremstilt ved dyrking av dé transplanterte celler fra de etablerte cellelinjer fra mennesker eller andre varmblodige dyr i bukvatersott som sus-pensjon eller dyrking av dem subkutant.

Alternativt kan produksjonen av CB utføres ved å bruke eh

I

,inducer etter å dyrke de etablerte cellelinjer fra mennekser ,eller andre varmblodige dyr i legemet til et dyr ved å til-føre induceren enten direkte in vivo eller in vitro etter å ta cellene ut av legemet. F.eks. kan cellene fra en etablert' cellelinje fra mennesker eller andre varmblodige dyr somj har^ blitt dyrket i bukvatersott og isolert derfra, eller slike isolert og dissosiert fra en subkutan tumor omfattende cél-lene fra en etablert cellelinje fra mennesker eller andre

i varmblodige dyr oppslemmes i et næringsmediu5 m ve8 d ca. 20-1' -40 !C, hvilket gir en cellekonsentrasjon på ca. 10 -10 celler pr.

! I

ml, og deretter eksponeres for en CB inducer, og derved indusere produksjonen av CB som så kan isoleres. |

<!>il Når cellene fra en etablert cellelinje fra mennesker eller i andre varmblodige dyr videre dyrkes i et diffusjonskammer, kan cellene isoleres direkte fra kammeret, eller de kan isoleres etter å ha blitt fjernet fra kammeret enten direkte eller også etter eksponering for en eller flere inducerej. j

! I

Videre kan utbyttet av CB pr. dyr også økes ytterligere ved f.eks. å anvende en metode hvor cellene fra en etablert j cellelinje fra mennesker eller andre varmblodige dyr som er j dyrket i legemet til et annet dyr utsettes for en inducer iI for å inducere produksjonen av CB in situ, og deretter utsettes de ferdige celler som er blitt isolert fra et spesi-i• elt sted eller hele legemet til samme dyr for en inducer I for å inducere fremstilling av CB, - en fremgangsmåte hvor

de anvendte celler igjen utsettes for en inducer for å iidu-j sere produksjonen av CB, en fremgangsmåte hvor et diffusjons-i kammer plassert eller forbundet med dyrelegeme erstattes av ! et nytt for å øke antallet av oppnådde celler og lignende.

; For å indusere produksjonen av CB kan alle de ovenfor be^-, skrevne inducere for CB anvendes, og det således fremstilte i CB kan fraksjoneres i de respektive CB^, CBxi'CBX2°^CBX3'

i med de angitte molekylvekter ved bruk av de ovenfor beskrevne kjente separerings- og rense-fremgangsmåter.

Nå skal virkningen, toksisiteten, bruksmetoden og doseringen

til det derved fremstilte CB beskrives.

<1>1 Eksperiment1: Selektivitet av cytotoksisk virkning.

Prøver på 10 celler av hver tumorcellelinje inneholdende :

i KB celler (nasofarynx kreft), MX-1 celler (brystkreft, j i fra Dr. Shigeru Tsukagoshi, Kreftinstituttet), HEp-2 celler! (strupekreft) og HEL celler (hepatoma, Flow Co.) og av nor- 1 male cellelinjer inneholdende fordøyelsestrakt 402 celler, Girardi hjerteceller, Chang leverceller, Vero celler (ape-nyre) og MDCK celler (hundenyr) (Flow Co.), som alle varj blitt fordyrket i 24 timer, og 10 5 celler av hver P388 og L1210 celler (leukemi, fra Dr. Shigeru Tsukagoshi, Kreftj-instituttet), som ble brukt straks, ble alle dyrket i 1 ml Eagle's medium inneholdende 10% kalveserum og hver forsøks-]substans ved 37°C i 48 timer i en 5% CO.,, 95% luftatmosfære.! . Deretter ble antallet levende celler ikke farget med Trypi an-I blått talt under et lysmikroskop, og konsentrasjonen av.J

I I forsøkssubstansen ved hvilken 50% av cellene drepes ble be-jregnet i forhold til kontroll tatt som 100. Som forsøks-| substanser anvendtes CB fra eksempel 10, CBvlfra eksempel

i A XI j 16, CBx2fra eksempel 20, CB^ fra eksempel 26 eller 29 +/, oC-, ( 3- og y-lymf otoksiner fremstilt ved en kjent metode .(Granger, G. A. et al, Cellular Immunology, Vol. 38 , 388-j-■402 (1978)), CBF adskilt fra CB ÅV . i eksempel 1 og Mitom<y>cijn C. En enhet lymfotoksiner og CBF uttrykkes ved en konvensjonell jindeks som er basert på cytotoksisiteten på mus L celler J !(Eds., Bloom, B. R.&Grade, P. R. "In Vitro Methods in Cell-mediated Immunity", Academic Press, 1979).. Resultatene er , viist i tabellen 2-1 til 2-4.

i

i

',+/ blanding av CBXog CB blanding av CBX, CBxl, CBX2

! og CBx3, blanding av CBX2og CBx3.

i

Som det fremgår av de ovenstående resultater har CB i li<i>k-

I

i ! het med CBF selektivt ødelagt tumorcellene uten å forårsaike ;vesentlig skade på de normale celler. Imidlertid, var graden i av den cytotoksiske virkning på de respektive tumorer forskjellig for CB og CBF. Derimot viste både - og -lymfo-j ' toksin og mitomycin C en ikke selektiv cytotoksisitet overfor normale celler og tumorceller.

i

i Eksperiment 2 j Innflytelse på mus transplantert med Sarcoma ISOeller Ehrlich;tumor

Hanmus (ddY-stamme) som veide 25-30 g ble intraperitonealt

6 ' transplantert med 3 x 10 celler pr. dyr Sarcoma 180 eller Ehrlich ascites tumor og overlevelsesdagene ble observert. ! CB^ fremstilt i eksempel 6, CB^ fremstilt i eksempel 15y

CBv0 fremstilt i eksempel 20 og CBv0 fremstilt i eksempel

A Z AJ j

26 eller 29 ble gitt intravenøst til grupper på 5 mus hver dag fra en dag etter transplantasjonen frem til død. J Resultatene er uttrykt i prosent av de gjennomsnittlige overlevelsesdager i forhold til kontrollgruppen og vist i

tabellene 3^-1 til 3-3. i

I I

Bemerk) CB erholdt i eksempel 26 i IIi

<*>2). CBX3erholdt i eksempel 29 i

Som man tydelig ser fra de ovenstående resultater, viste<j>CB en tydelig anti-tumor virkning på både mus som hadde fått transplantert Sarcoma 18 0 og henholdsvis Ehrlich tumor. |

Eksperiment 3 i Innflytelse på Overlevelsesdager hos mus med leukemi.

i BDF-,-stamme hanmus som veide 20-25 g ble transplantert j

' intraperitonealt med 10 5 celler pr. dyr av museleukemi j'

116 ! Li1210 eller 10 celler pr. dyr av museleukemi P388 , og qver-l! evelsesdagene ble observert. CB Afremstilt i eksempel 10, GB^^ fremstilt i eksempel 16, CB^ fremstilt i eksempel 20 og CB t fremstilt i eksempel 26 eller 29 ble gitt intra-

I aj

peritonealt til grupper på 5 mus, enten daglig fra en dag étter transplantasjonen inntil død (for CB^, CB^q og CB^)

eller en gang på den etterfølgende dag fra transplantasjjoneh (for CBx3)• Resultatene er uttrykt i prosentdeler av gjennomsnittlige overlevelsesdager i forhold til kontrollgruppen og oppført i tabell 4-1 til 4-3.

i Som man tydelig ser i resultatene ovenfor viste CB en signi-j fikant anti-tumor virkning på både mus med tumor av typen j l\ eukemi L1210 henholdsvis P388.<I\

Eksperiment 4 Innflytelse på Overlevelsesdager av mus med lungecarcinoma.

Hanmus av BDF,-stammen som veide 20-25 g ble intramu sku lært i<6>I transplantert på høyre lår med 2 x 10 celler av Lewis1Sj

jlungecarcinoma, og overlevelsesdagene ble observert. CBV|

! I .Al I fremstilt i eksempel 7, CB^ fremstilt i eksempel 17, CB^ ! fremstilt i eksempel 22 og CBV-, fremstilt i eksempel 26 bg ij 29 ble gitt intramuskulært til grupper på 6 mus hver dag fra: I !en dag etter transplantasjonen frem til dødsdagen. Result'atene I er uttrykt i prosentdeler av de gjennomsnittlige overlevelsés-j dager i forhold til kontrollgruppen og oppført i tabellene I 5,-1 til 5-2.

i

i

Eksperiment 5

Innflytelse på Overlevelsesdager av mus med melanoma

Htraanmnusps laav ntBerDFt ,-i srtyamgmgeen n msoem d v1e0 idce el2l0e-r 25 prg . bdlye r suav bkmuutasnemtelanon

B 16, og overlevelsesdagene ble observert. CB__ fremstilt i eksempel 10 og CB^ fremstilt i eksempel 26 eller 29 ble gitt intravenøst til grupper av 7 mus hver dag fra. en dag etter transplantasjonen frem til dødsdagen. Resultatene

er uttrykt i prosentdeler av de gjennomsnittlige overlevelses-

dI ager av kontrollgruppen og oppført i tabell 6-1 til 6-2I.

I

Som det klart fremgår av de ovenstående resultater viste •I CB tydelig en antitumor virkning på mus med musemelanom I B 16.

Eksperiment 6 ' Inflytelse på lungemetastase av kreft

Hanmus av BDF-,-stammen som veide 20-3 0 g, 6 dyr i hver g!rup<p>e, ble subkutant transplantert i ryggen med 2 mm kvad-fatiske segmenter av Lev/is's lungekreft. CB fremstilt il eksempel 6, CB^^fremstilt i eksempel 15, CBX2fremstilt i eksempel 20 og fremstilt CBF ble gitt intravenøst en gang om dagen i 12 dager fra 9. dag etter transplantasjon. På den 21. dag etter transplantasjonen ble massen av primær-tumor isolert og veiet, og antallet knuter med metastase i iungene ble beregnet ifølge Wexler metode, H. (J. Nati.

j Cancer Institute, Vol. 36 641 (1966)). Resultatene er opp-

I ■ firøti tabell 7-1 til 7-2.

I

<I>Som de ovenstående resultater tydelig viser nedsatte CB^ Lffektiv primær lungekreft og dens lungemetastaser, mens CBF nesten ikke hadde noen virkning på lungemetastasene.

Eksperiment 7 Virkning på indusering av differensiering av tumorceller

I

i Ifølge M. Hozumi et al's metode (Cancer Research, Vol, .40, 2919-2924 (1980)), ble 5 x 10 celler av akutt myelogenjleukemiceller M-l (fra Dr. Motoo Hozumi, Saitama Cancerl Center) oppslemmet i 1 ml Eagle's medium inneholdende 10% kalveserum og også inneholdende aminosyrer og vitaminer i<>>

li det dobbelte av vanlige mengder, til hvilke hver forsøks-1 substans var blitt tilsatt, og dyrket ved 37 oC i 48 timer

! ;i en 5% CO^ -, 95% luftatmosfære. Deretter ble cellene reoipp-Islemmet i et medium inneholdende 0,2% polystyren latex | partikler (Dow Chemical Co.), inkubert ved 37 oC i 4 timer,<1>

sptjtradå jattdbaenelln e e e abcenr lete loalbpler pleerft tøegarcnt let et li ulentfr radba er esolfm oel rt hf8oal.gylodsmceyt iktrtiosiesl rkdtope is, psaoe rg ctdeikilllf eef nrere . eRong esisuaenlrt-ianglls-

speriment 8

Pyrogenforsøk

Ifølge den metoden som er beskrevet i Japanese Pharmacopeia, ble CBX fremstilt i eksempel 3 intravenøst til hvite kaniner i en dose på 100 enheter pr. dyr. Resultatene av målingen av den rektale temperatur opptil 3 timer senere ved bruk av et termokuppeltermometer er angitt i tabell 9.

l Eksperiment 9 I ji lni!nflytelse på mus med brystkreft. i.Hårløse mus av BALB/C stammen som veide 2 0-2 5 g, 6 dyr i Jhver gruppe, ble subkutant transplantert i ryggen med 2 mm ikvadratiske segmenter av menneskebrystkreft MX-1. CB^ frem-jstilt i eksempel 26 eller 29 ble gitt intravenøst til mus !i 114 dager fra den 14. dag etter transplantasjonen. På den !15. dag.etter den 1. administrering ble volumet til den Ii<p>riimæretumor målt. Resultatene er oppført i tabell 10.

^, EI knf sply erte iml ese nt på 10 metylkolantren-indusert tumor

I!

! 3-j-metylkolantren oppløst i olivenolje ble injisert subkutant j<i>jlateral abdomen til ddY-stamme mus som veide 20-25 g, 8 dyr 'ijhver gruppe, 0,5 mg pr. mus. fremstilt i eksempel 26

'eller 29 ble gitt intravenøst til musen en gang om dagen i<!>21 dager fra ca. 60 dager etter 3-metylkolantreninjeksjonen.!Den 21. dag etter den første CBx3administrering ble tumorens volum målt. Resultatene er oppført i tabell 11.

i

Som det tydelig fremgår av de ovennevnte resultater, ' visti e !j' CB^^ tydelig en anti-tumor effekt på den spontane tumor. ji 1 : Eksperiment 11 : .Tpiksisitetsprøve (Engangs administrering) jHanmus av BDF^-stammen som veide 20-25 g, 10 dyr i hver Jgruppe, fikk intravenøst CB og antallet døde dyr ble observert gjennom 7 dager. Som et resultat derav overlevet alle ! i

i de 10 dyr uten å vise noen forandring av kroppsvekt og all^i menn tilstand, selv når de fikk 10000 enheter pr. kg CB ', jCBxleller CBx2eller 100000 enheter/kg CBx3.

I Eksperiment 12

:Toksisitetsforsøk (30 dagers kontinuerig administrering) j

!Hanmus av BDF^-stammen som veide 20-25 g, 10 dyr i hver !<:>i gruppe, fikk intravenøst CB i 30 dager, og antallet av døde!'dyr, forandring i kroppsvekt og allmenn tilstand ble obspr-,vert. Kroppsvekten ble målt mellom kl. 9 og 10, og obserya-j sjonen av allmenntilstanden ble utført den 10., 20. og 30. | dag ifølge Arvien' s metode (Science, Vol. 36, 123 (1962).). ! Som et resultat derav var det ingen døde dyr i løpet av disse dager selv med 1000 enheter/kg/dag CBX, CBxleller CBx2 j

eller 10000 enheter/kg/dag CBx3, og vektøkningskurven var mer eller mindre den samme som for kontrollgruppen. Videre ! ble allmenntilstanden funnet å være normal som i kontroll-

, i I gruppen.

i Som man kan se av de ovenfor beskrevne eksperimenter, under-trykker CB selektivt veksten av tumorceller, og videre under-trykker de ikke bare betydelig kreftmetastasen, men er også'

ekstremt effektive mot forskjellige tumorer og likevel meget sikre selv i høyere doser enn den dose som ville gi farma-søytisk virkning. Derfor er CB ekstremt anvendelig for terapi av forskjellige tumorer sånn som magekreft, lungekreft, hepatoma, tykktarmskreft, brystkreft, uteruskreft, leukemi osv.

CB kan gis i form av konvensjonelle formuleringer såsom in-j jeksjoner, øyedråper, nesedråper, inhalasjoner, topiske pre7

i i parater, orale preparater, rektale preparater, vaginale i: 'i p! reparater osv. Den daglige terapeutiske dose av CB tilljen

<!>I

voksen er ikke spesielt begrenset p.g.a. den høye sikkerhets-margin, men vil i allminnelighet være 0,5 til. 50000 enheter,

I fortrinnsvis 0,5 til 5000 enheter for topisk applikasjon,

! 20-100000 enheter for systemisk administrering såsom intra-venøs injeksjon, intramuskulær injeksjon osv., og 50-500000 enheter for oral administrering, og dosen kan justeres ; i

I passende avhengig av bruksmetoden eller sykdomsgraden. ; Formuleringen kan inneholde hver enkelt av CBX, CBxl, CBX2; og CBX^alene eller i kombinasjon med hverandre i hvilket I som helst ønsket forhold.

CB kan formuleres i farmasøytiske preparater ved alle vanlige metoder ved bruk av farmasøytisk fordragelige bær em id 1 er j, baser, eksipienter osv. Fortrinnsvis anvendes de som orajle preparater såsom enteriske preparater, f.eks. kapsler, i tabletter, pulvere osv., rektale preparater såsom rektalj-: suppositorier, injeksjoner såsom vandige injeksjoner, rekon-stituerbare preparater av frysetørket pulver for oppløsning

i destillert vann for injeksjon før bruk, og topiske preparater såsom salver, lotions osv. Dertil kan de tilpasses

. som øyedråper, nesedråper eller inhalasjoner.

j i I Eksempel på faste bærer og eksipienter som med fordel her ] kan brukes- innebefatter vanlige eksipienter såsom laktose,

•mannitol, maisstivelse og potetstivelse, bindemidler såsom ' krystallinsk cellulose, cellulosederivater, gummiarabikum, maisstivelse og gelatin; sprengningsmidler såsom maisstivelse, potetstivelse og kalsiumkarbohydroksymetylcellulose; og smøremidler såsom talkum og magnesiumstearat. Eksempler på

i flytende bærere som med fordel her kan brukes innebefatter J destillert vann for injeksjon, fysiologisk saltløsning, vegetabilske oljer for injeksjon og glykoler såsom propylen-glykol og polyetylenglykol.

i Eksempler er gitt nedenfor, men oppfinnelsen skal ikke være j bearenset til disse. i

1 10

Eksempel 1 Lymfocytter fra mennesker (2 x 10 celler) ble oppslemmet ii<4000 mlEagle's medium inneholdende 10% kalveserum og ble idyrket ved 37°C i 48 timer i en 5% C02, 95% luftatmosfære.

[Deretter ble supernantanten av dyrkningsmediet dialysert

'mot 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2) og en fraksjon utsaltetj imed 40 - 80% ammoniumsulfat erholdtes fra dialysatet. Denne |fraksjon ble dialysert pa nytt mot fosfatpufferen og sa gel-

i

jf Utrert ved bruk av "Sephadex" G-100 (Pharmacia Co.).

jEn fraksjon med molvekt 12000 - 17000 ble oppsamlet, som ble .betegnet som rå CB^ fraksjon, mens den tidligere eluerte 'fraksjon ble betegnet som rå CBF fraksjon. Den rå CB^fraksjonen ble adsorbert på Ulex auropeus agglutinin( (Maruzen •Oil Co. ) -konjugert "Sephadex", eluert med 0,01 M f osf atpuf f e:: i. 'inneholdende 0,5 M fukose. Etter fjerning av fukose ved j

' 'dialyse, ble CBX V igjen adsorbert på Ulex europeus agglutiinin- . konjugert "Sephadex", etterfulgt av eluering ved gradient-i jnetode ved bruk av fosfatpuffer (pH 7,2), hvorved rensetj<I>CBA V ble eluert. Totalt 0,02 mg CBA V ble oppnådd. Den totalie aktivitet av det erholdt CB^ var 150 enheter bestemt ved j pvenfor beskrevne metode. Således var den spesifikke aktivi-jte1 t av det rensede CB A 7500 enheter/mg.

i 1 . Eksempel 2<i>) i Storfelymfocytter (2 x 10<9>celler), ble oppslemmet i 1000 'ml Eagle's medium inneholdende 10% kalveserum og dyrket ved,

37°C i 48 timer i en 5% CO„, 95% luftatmosfære. Deretter, i i I ble supernatanten fra dyrkningsmediet renset etter frem- , gangsmåten i eksempel 1 for CB^ og 0,01 mg CBX erholdtes. Totalaktiviteten til det erholdt CBV var 20 enheter, og den i spesifikke aktiviteten til det rensede CBXvar således 2 0 00 enheter/mg.

i Eksempel 3 Muselymfocytter (5 x 10<10>celler) ble oppslemmet i 5000 ml Eagle's medium inneholdende 10% kalveserum og dyrket ved'37°C i 48 timer i en 5% C02, 95% luf tatmosf ære. Deretter'! Jble supernatanten av dyrkningsmediet renset etter fremgangsmåten i eksempel 1 for CBX, og 0,12 mg CBX.erholdtes. Total-'

aktiviteten til det erholdte CB X var 400 enheter, og den spesifikke aktiviteten til det rensede CB x var således

13333 enheter/mg.

; Eksempel 4

;BALL-1 celler (humancellelinje, 1 x 10^^ celler) som var blitt fpi rdyrket, ble op' pslemmet i 2000 ml Eaglo<e>'smedium inne-ho; ldende 10% kalveserum og y dyrket ved 37 C i 48 timer i é[n 15% C02,.95% luftatmosfære. Deretter ble CB^ i supernantanten , jav dyrkningsmediet renset som i eksempel 1 og 0,7 mg CBVx erholdtes. Totalaktiviteten til det erholdte CB xvar 4000 en-,heter, og den spesifikke aktiviteten til det rensede CB^ var således 5714 enheter/mg.

!

: Eksempel 5

ii Flow 7000 celler (human fibroblastlinje, 3 x 10 g celler)

!som var blitt dyrket ved cellekultur,ble oppslemmet i 600

ml Eagle's medium inneholdende 10% kalveserum og dyrket ;ved 37°C i 48 timer i en 5% CC^, 95% luftatmosfære. Deretter :ble supernantanten av dyrkningsmediet renset med hensyn til CBVsom i eksempel 1, og man fikk 0,005 mg CB . Totalakti-■viteten til det erholdte CBX var 10 enheter, og den spesifikke ;aktiviteten av det rensede CBVvar således 2000 enheter/mg.

Eksempel 6 ;L<y>mfoc<y>tterfra mennesker (2 x 10"^ celler) ble oppslemmet i'4000 ml Eagle's medium inneholdende 10% kalveserum, og etter tilsetning av fytohemagglutinin (Difco Co.) til en sluttkonsentrasjon på 50 ug/ml, dyrket ved 37°C i 48 timer i en 5% CC^r95% luftatmosfære. Deretter ble supernantanten av dyrkningsmediet renset med hensyn til CB^ som i eksempel 1, og 1,0 mg CBX V erholdtes. Totalaktiviteten til det oppnåddIeCB x var 10000 enheter, og den spesifikke aktiviteten til ; det rensede CB^ var således 10000 enheter/mg.

I

Eksempel 7 Flow 7000 celler (humanfibroblastlinje, 3 x 10 9 celler)

'bel oppslemmet i 600 ml Eagle's medium inneholdende 10%

1 , i '.kalveserum, og etter tilsetning av fytohamagglutinin tiljen i oll;sluttkonsentrasjon på 50 ug/ml, dyrket ved 37 C i 48 timer iijen 5% CO~, 95% luftatmosfære. Deretter ble supernantanten

' ■ i 1 II jav.dyrkningsmediet renset med hensyn til CB som i eksempel i ! Ai j! l> , og man fikk 60 ug CBA V. Totalaktiviteten til det erhold:tei CBiV var 480 enheter, og den spesifikke aktiviteten til dét 1 re! nsede CBxV var således 8000 enheter/mg.

i i

Eksempel 8

; ■ TALL-1 celler (humancellelinje, 9 x 10 9) som var blitt dyrket 1 ived cellekultur, ble oppslemmet i 800 ml Eagle' s medium iII nnejI-holdende 10% kalveserum, og etter tilsetning av fytohema-j- | ;gglutinin til en sluttkonsentrasjon på 50 ug/ml, dyrket ved ,37°C i 48 timer i en 5% C02, 95% luftatmosfære. Deretter ;ble supernantanten av dyrkningsmediet renset med hensyn til

i CB etter fremgangsmåtene i eksempel 1, og man fikk 0,8 mg ;CBX. Totalaktiviteten til det oppnådde CBX var 7 500 enheter, og den spesifikke aktiviteten av det rensede CBVvar således

.9375 enheter/mg. !j

Eksempel 9 Voksne mus ble forbehandlet ved bestråling med røntgenstråler på ca. 400 REM for å undertrykke deres immunreaksjon, og|så I transplantert subkutant med TALL-1 celler (humanopprinnelse).

[Deretter ble musene foret i 3 uker. Tumormassen som dannet seg ! subkutant og veide ca. 10 g ble isolert, finhakket og oppdelet

■i;en fysiologisk saltløsning inneholdende trypsin, og der- i etter ble de dispergerte celler oppsamlet. Disse celler ble

i behandlet ved metoden fra eksempel 1 for å gi CBX. Utbyttet av CBVvar cal 190 enheter pr. mus.

x i Eksempel 10

BALL-1 celler (humancellelinje, 9 x 10 9 celler) ble oppslemmet i 1800 ml Eagle<1>s medium inneholdende 10% kalveserum,

og etter tilsetning av 9 x 10 g pfu (plaque forming units) Sendai virus (HVJ) dyrket ved 37°C i 48 timer i en 5% CC^, 95% luftatmosfære. Deretter ble supernantanten fra dyrkningsmediet renset med hensyn til CBX etter fremgangsmåten i ' i !i ek: sempel 1, og man fikk 720 ug CBA V. Totalaktiviteten av d,et 'oppnådd CB Avar 7920.enheter, og den spesifikke aktiviteten.

ay det rensede CBX var således 11000 enheter/mg.

I

Cpx fremstilt ovenfor ble oppløst i fysiologisk saltvann til en konsentrasjon på 1 mg/ml og den optiske dreining av løs-ningen ved 598 nm (Na. D linje) ble målt ved 26,5 til 281,5°Cj med et polarimeter (Nihon Bunko DIP-181) ved bruk av en mikrocelle på 10 mm i lysveien. Den optiske dreining av fysiologisk saltvann som en kontroll ble satt til null. CB xviste veinstre dreining.

i

I

CB 1 x (10 ug) fremstilt ovenfor ble presset til en mikrotabletIt med kaliumbromidpulver for å måle IR spektra av CB^. Den inte-grerte måling (60 gener) ble utført med Fourier transform infrarødt spektrofotometer FX-6201 (Analect Instruments Co.). Resultatet er vist i fig. 1.

i

i

Eksempel 11 Voksne hårløse mus ble transplantert subkutant med BALL-1 celler (human opprinnelse) og deretter foret i 3 uker. Den resulterende tumormasse som dannet seg subkutant og veide ca. 10 g hos hver ble isolert, finmalt og deretter fordelt i fysiologisk saltvannsløsning inneholdende trypsin, og de dispergerte celler ble så oppsamlet. Disse celler Jble vasket med Eagle's medium inneholdende 5% humanserum, der-

9 etter ble 2 x 10 celler derav oppslemmet i 2000 ml av samme medium og dyrket ved 37°C i 48 timer i en 5% C02, 95% luft-j atmosfære. Deretter ble supernantanten i kulturmediet behandlet ved fremgangsmåtene i eksempel 1 hvilket ga CBX>| CB^ utbyttet var ca. 200 enheter pr. hårløs mus. ' !

I

Eksempel 12 j JBL celler (human cellelinje) ble oppslemmet i fysiologisk saltvann, og suspensjonen ble plassert i et plastisk sylind-risk diffusjonskammer med en kapasitet på ca. 10 ml og . i utstyrt med et membranfilter med en porestørrelse på ca.j 0,5 u, og dette kammeret ble plassert i peritonealhulrommet !til en voksen rotte. Rotten ble foret i 4 uker, og kammeret ble fjernet igjen. '

Cellekonsentrasjonen av humancellene man derved fikk blej

; 9 i funnet å være ca. 5 x 10 celler pr. ml, hvilket betyr ca.

11 0 3 ganger eller mer enn det man får ved dyrkning in vitr<I>o

11 et næring smedium i en 5% CC^, 95% luf tatmosf ære.

1 x 10"^. JBL celler fremstilt ved den ovenfor beskrevne I

! I

metode ble oppslemmet i 4000 ml Eagle's medium inneholdendeI 10% kalveserum og dyrket ved 37°C i 48 timer i én 5% CO^, 95%luftatm.osfære. Deretter ble supernantanten av dyrkningsmediet behandlet etter fremgangsmåtene i eksempel 1 og ga CB^. Ut-bytte av CB^ var ca. 350 enheter pr. rotte,

i Eksempel 13 Voksne hårløse mus ble transplantert subkutant med BALL+1 ! celler (humanopprinnelse) og deretter foret i 5 uker. Så1 blé hver mus intraperitonealt injisert med 1 mg fytohemagglujtinin og avlivet 24 timer etter injeksjonen og bukvatersopp ble oppsamlet. Bukvatersoppen ble sentrifugert ved 4°C og 10,00 g og den erholdte supernantant ble dialysert mot en fysiolo- ! 1gisk saltvannsløsning inneholdende 0,01 M fosfatpuffer (pH I 7,2) i 15 timer. Løsningen ble videre ultrafiltrert med et ; i membranfilter og filtratet ble konsentrert til en løsning

I inneholdende CBV. CBV mengden var ca. 800 0 enheter pr. hårløs X A j mus.

i Eksempel 14 ' BALL-1 celler (humancellelinje) ble oppslemmet i fysiologisk saltvann og helt i et plastisk sylindriske dif f us jonskammer med en kapasitet på ca. 10 ml og utstyrt med et membranfilter med en porestørrelse på ca. 0,5 u, og dette kammeret ble plassert i peritonealhulrommet til en voksen rotte. Denne rotten ble foret i 4 uker, og deretter ble kammeret fjernet. De således dyrkede celler ble vasket med Eagle's medium inneholdende 5% humanserum, og oppslemmet på nytt i samm' e medium i en cellekonsentrasjon på ca. 5 x 10 celler pr. ml;

Suspensjonen ble satt til ca. 200 ug/ml fytohemagglutinin, i og blandingen inkubert ved 37°C i 2 timer for å indusere

produksjonen av CBV. Således fremstilt CBVble renset og

A A

konsentrert som beskrevet i eksempel 1, og det ble videre

; frysetørket til et pulver av CB . CB utbyttet var ca.I i 15000 enheter pr. rotte.

Eksempel 15 Ifølge de fremgangsmåter som er beskrevet i eksempel 6 ble

:1 i i humanlymfocytter dyrket, og supernantanten av dyrknings-j mediet ble renset hvilket ga en renset fraksjon med en ! molekylvekt på 70000 - 90000 . Denne fraksjon ble betegnet i som CB^. Totalaktiviteten av de 0,1 mg renset CB^ var I 5000 enheter, og den spesifikke aktiviteten til det rensede i CBX1 var kledes 50000 enheter/mg.

: Optiske dreining for CB^ fremstilt ovenfor ble målt sorn i I xx

beskrevet i eksempel 10. CBV, viste høyre dreining.

J IR måling av CBX^ fremstilt ovenfor ble utført som beskrevet I i eksempel 10. Resultatet er vist i fig. 2. I

i i

Eksempel/ 16

•Ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 10 ble BALL-1 celler dyrket, og supernantanten av dyrkningsmediet : ble renset hvilket ga et renset CBX^. Totalaktiviteten t^iljde 100 ug renset CB^ var 4200 enheter, og den spesifikke ! aktiviteten av det rensede CBvl var således 42000 enheter ! :p, r. mg. !i<1>

i

i ; Eksempel 17 j ;Ifølge de i eksempel 7 beskrevne fremgangsmåter ble Flow 7000 celler dyrket, og supernantanten av dyrkningsmediet ble renset og ga 10 ug renset CB^. Totalaktiviteten til dette CB^^var 250 enheter, og den spesifikke aktiviteten til det rensede CBxlvar således 25000 enheter pr. ng.

■ Eksempel 18

Ifølge de fremgangsmåter som er beskrevet i eksempel 2 ble , bovinlymfocytter dyrket og supernantanten av dyrkningsmediet ble renset og ga 0,002 mg renset CB^. Totalaktivi-

j teten til det fremstilte CBV, var 14 enheter, og den spesi-I XI

! fikke aktiviteten til det rensede CB var således 7000 !

XI

eInheterpr. mg.

Ei ksempel 19 Ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 4 ble BbAlLe Lr-1 encseet lloer g gda yrk0e,t2 , mg og resnupseert naCnB^tan. tTeon taav ladkytrivknitinegtesmn edaviet

det fremstilte CBX^ var 2300 enheter, og den spesifikke

aktiviteten til det rensede CB , var 11500 enheter pr. mg.

i Al

Eksempel 2 0

Ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 6 ble humanlymfocytter dyrket og supernantanten av dyrkningsmediet ble renset til en fraksjon med en molekylvekt på 40000 - 50000. Denne fraksjon ble betegnet som CBx2. Totalaktiviteten av de 0,25 mg renset CBx2var 5200 enheter,

og den spesifikke aktiviteten av det rensede CBx2 var siiåledes 20800 enheter/mg.

Eksempel 21

Ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 10, ble BALL-1 celler dyrket og supernantanten av dyrkningsmediet renset hvilket ga 75 ug renset CBx2- Totalaktiviteten avj 1 det erholdte CBVA c~ . var 10000 enheter, og den spesifikke aktiviteten til det rensede CBx2var således 133333 enheter/mg.

Optisk dreining for ovenfor fremstilt CBX2ble målt som beskrevet i eksempel 10. CBx2viste høyredreining.

i IR måling av CBV~fremstilt ovenfor ble utført som beskrevet i i eksempel 10. Resultatet er vist i fig. 3. jI

Eksempel 22

Ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 7, ble Flow 7000 celler dyrket, og supernantanten av dyrknings- j mediet ble renset og ga 20 ug renset CBx2. TotalaktivitetenJ til det fremstilte CBX2var 500 enheter, og den spesifikke aktiviteten av det rensede CBx2var således 25000 enheter i I pr. mg. I

i ... j .

Eksempel 23

Ifølge fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 2 ble bovinlymfocytter dyrket, og supernantanten av dyrkningsmediet ble renset og ga 0,001 mg'renset CBx2«Totalaktiviteten til dette CBX2var 40 enheter og den spesifikke aktiviteten til det rensede CBx2 var således 40000 enheter pr. mg.

i

Eksempel 24

BALL-1 celler ble dyrket ifølge fremgangsmåtene som er

beskrevet i eksempel 4, og supernantanten av dyrkningsmeidiet ble renset og ga 0,25 mg renset CB^. Totalaktiviteten til det fremstilte CBx2var 2900 enheter, og den spesifikke! aktiviteten til det rensede CBX2var således 11600 einheter pr. mg.

" Eksempel 25 Menneskelymf ocytter (2 x 10^~ ® celler) ble oppslemmet i j 400 ml Eagle<1>s medium inneholdende 10% kalveserum, og etter tilsetning av fytohemagglutinin til en konsentrasjon på J 50 ug pr. ml ble suspensjonen dyrket ved 37°C i 48 timer i en 5% C02, 95% luftatmosfære. Deretter ble supernantantén av dyrkningsmediet dialysert mot 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2), og en fraksjon som ble utsaltet med 40 til 80% ammoniumsul-1 fat erholdtes fra dialysatet. Denne fraksjonen ble dialysert igjen mot samme fosfatpuffer og så gelfiltrert ved bruk' i av "Sephadex" G-100, hvilket ga en fraksjon med en molekyl-i vekt på 7000 - 9000 som ble betegnet som rå CB^ fraksjon.

Den rå CB _ fraksjon ble adsorbert på fytohemagglutinin7

AJ I I

konjugert Sephalose, eluert med 0,01 M fosfatpuffer (pHj7,2) inneholdende 0,5 M N-acetyl-D-galaktosamin. Etter fjerning av N-acetyl-D-galaktosamin ved dialyse, ble den resulterende løsning anvendt til karboksymetylcellulose ekvilibrert med 0,05 M fosfatpuffer (pH 6,4), etterfulgt av eluering med 0,05 M fosfatpuffer (pH 6,4) inneholdende 0,5 M natriumy klorid. Således fikk man 0,1 mg CB^• Totalaktiviteten j til det erholdte CB var 5000 untis.

i i

Eksempel 2 6 Nyfødte hamstere ble forbehandlet ved injeksjon av antiserum ' fremstilt fra kanin på konvensjonell måte for å redusereI

! I

deres immunrespons så mye som mulig , og de ble så transplantert subkutant med BALL-1 celler og deretter foret x 3 uker. Tumormassen som dannes subkutant og veier ca. 15 g ible isolert, oppmalt og fordelt i fysiologisk saltvann. Etter å ha vasket de erholdte celler med serumfritt Eagle's medium ble 1 x lO"^ celler av disse oppslemmet i 150 1 Eagle's medium inneholdende 10% kalveserum, og etter tilsetning av 9 x 10^ pfu Sendai virus (HJV) , dyrket ved 3|7°C i ]48 timer i en 5% C02, 95% luf tatmosf ære. Supernantanten<!>av dyrkningsmediet ble dialysert mot 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2) og en fraksjon som ble utsaltet med 40 - 80% ammonium-f sulfat erholdtes fra dialysatet. Denne fraksjon ble dialysert igjen mot fosfatpufferen og deretter gelfiltrert ved bru<i>k av "Sephadex" G-100, hvilket ga en fraksjon med en molekyl-f vekt på 7000 - 9000 som ble betegnet som rå CB^ fraksjon. Denne rå CB^ fraksjon var adsorbert på konkanavalin A-kon-f jugert Sephalose, eluert med 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2) inneholdende 0,5 M -metyl-D-mannosid. Etter fjerning av ij -metyl-D-mannosidet ved dialyse, ble løsningen satt påj karboksymetylcellulose ekvilibrert med 0,05 M fosfatpuffer j j(pH 6,0), etterfulgt av eluering med 0,05 M fosfatpuffer !(pH 7,8). Totalaktiviteten til de 0,2 mg fremstilte CBx3<y>ar 12000 enheter, og dets isoelektriske punkt var 6,3 til 7,8. i

Eksempel 27

Flow 7000 celler (3 x 10"^ celler) ble oppslemmet i 1,0 1 Eagle's medium inneholdende 10% kalveserum, og etter tilsetning av fytohemagglutinin til en sluttkonsentrasjon på 50 ug/ml, dyrket ved 37°C i 48 timer i en 5% CC>2, 95% luftTatmosfære. Supernantanten fra dyrkningsmediet ble behandlet ved fremgangsmåten i eksempel 26 for rensning av CB ,, og \

XJ < j man fikk 0,1 mg CB^. Totalaktiviteten til det fremstilte CBX^ var 3100 enheter.

! Ii

I

Eksempel 28 Storfelymfocytter (5 x 10 0 celler) ble oppslemmet i 10 L Eagle's medium inneholdende 10% kalveserum og dyrket ved 3;7 C i 48 timer i en 5% CC^, 95% luf tatmosf ære. Deretter ble supernantanten fra dyrkningsmediet renset etter fremj-gangsmåtene i eksempel 2 6 med hensyn på CB^, og man fikk 0,1 mg renset CB^^. Totalaktiviteten til det fremstilte CBx3var 17 00 enheter.

i

Eksempel 29

BALL-1 celler (5 x 10"^ celler) som var blitt dyrket ved en cellekultur ble oppslemmet i 100 1 Eagle's medium inneholdende 10% kalveserum og dyrket ved 37°C i 48 timer i en 5% < i C09, 95% luf tatmosf ære. Deretter ble supernantanten og dyrk-j ningsmediet dialysert mot 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2)., j og i en fraksjon som ble utsaltet med 40-80 % ammoniumsulfaiterholdtes. Denne fraksjonen ble dialysert igjen mot fosfatpufferen og så gelfiltrert ved bruk av "Sephadex" G-100,j hvilket ga en fraksjon med en molekylvekt på 7000 - 9000;. Denne fraksjonen ble adsorbert på fytohemagglutinin-konjUgert Sephalose, eluert med 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2). inneholdende 0,5 M N-acetyl-D-galaktosamin. Etter fjerning av N-! acetyl-D-galaktosamin ved dialyse, ble den dialyserte løsning psuatft fer på 8pkaH rb8o,k0s).y, meettytelcrefulllugt loasv e eeklvueirliibng remrt ed me0d ,05 0,M 05 tM ritspruiifs--,

fer (pH 8,0) inneholdende 0,5 M natriumklorid, hvormed man fikk 0,1 mg renset CBx3. Totalaktiviteten av fremstilt CB^ avr 8200 enheter og dets isoelektriske punkt var 8,0 til, 9,2.

Otisk rotasjon av fremstilt CB^ ovenfor ble målt som j beskrevet i eksempel 10. CB^ viste ikke optisk dreining.

i i IR måling av CB^-j erholdt ovenfor ble utført som beskrevet i eksempel 10. Resultatet er vist i fig. 4.

i Eksempel 3 0 ^Vandige injeksjoner) i i

i

' I

CBVog natriumklorid ble veiet og blandet, deretter oppløst

i ,500 ml destillert vann for injeksjon, totalvolumet ble justert til 1000 ml med destillert vann for injeksjon. Denne vandige løsning ble filtrert under sterile betingelser ved br! uk av et membranfilter, 2 ml filtrat ble plassert i hver! sterilisert glassbeholder og forseglet for fremstilling av vandige injeksjoner.

; i

i i

Eksempel 31- 33 Lignende fremstillinger som i eksempel 30 ble utført med CB^, CB^20<3 ^Bx3for ^ fremstille vandige injeksjoner.

Eksempel 3 4

.(Frysetørkede injeksjoner)

i Destillert vann for injeksjon ad 1000 ml i !

CI BiV A og natriumklorid ble veiet og blandet, deretter opplø1 st i ,en løsning fremstilt ved å sette den forut bestemte mengde | av, humanalbuminet til 500 ml destillert vann for injeksjon og; totalvolumet ble justert til 1000 ml med destillert vann for injeksjon. Denne oppløsning ble filtrert under sterile betingelser med et membranf ilter, 2 ml av filtratet ble pias-1 i sert i hver sterilisert glassbeholder, frysetørket og forseglet for fremstilling av lyofilisert pulver for injeksjon.

I I

Eksempel 35- 37 Lignende fremstillinger, som i eksempel 34 ble utført med

CBxl, CBx2og CBx3for å fremstille frysetørkede pulvere for injeksjon. i

I

Eksempel 38

(Øyedråper) j

De ovennevnte bestanddeler ble veiet og oppløst i 950 ml des--, txllert vann for injeksjon. Totalvolumet ble justert til 1000 ml og løsningen ble filtrert under sterile betingelser ved bruk av et membranfilter for å lage øyedr<åp>efremstill<i>n<g,>I

Eksempel 39- 41

Lignende fremstillinger som i eksempel 38 ble utført for 1 ,CB!X^, CBX20<3 CBx3^or a fremstille øyedråpepreparater.

Eksempel 4 2

i( Suppositorier)

De ovennevnte bestanddeler ble veiet og hele mengden av CBX og polyetylenglykol 150 0 og 500 g polyetylenglykol 4 000 ble blandet grundig, hvoretter resten av polyetylen-j glykol 4000 ble tilsatt så man fikk totalvekt 1000 g, videre blandet grundig og formet til 5000 mg rektalsuppositorier ivéd smeltemetoden.

!I

I I

Eksempel 43- 45

Lignende fremstillinger som i eksempel 4 2 ble utført med<i>CBxl, CBX2og CBx3for å fremstille rektalsuppositorier.

Eksempel 4 6

(Nesedråper)

De ovennevnte bestanddeler ble veiet og oppløst i 950 ml i

.destillert vann. Den resulterende løsning ble justert til

! ,et totalvolum på 1000 ml med destillert vann for å fremstI illé'

i

jen løsning for nesedråper.

;Eksempel 47- 49

Lignende fremstillinger som i eksempel 4 6 ble utført for CBX^,<CB>X2og CBx3^or ^ fremstille en løsning for nesedråpe]:.

Eksempel 50

[(Enterisk overtrukne tabletter)

I i

' >Dé i ovennevnte bestanddeler» ble veiet, hele mengden av CBAV og;laktose og ca. halve mengden av potetstivelse ble blandet, !så ble den gjenværende potetstivelse satt til blandingen jslik at man fikk samlet vekt på 94 g, og blandingen ble

-landet til den ble homogen. Den resulterende blanding ble tilsatt en vandig polyvinylalkoholoppløsning, og granulat

ble fremstilt ved våtpelleteringsmetoden. Granulatet ble| tørket, blandet med magnesiumstearat og komprimert til 200 mg taibletter. Tablettene ble overtrukket med metylcellulose--■ftalat for å fremstille enterisk overtrukne tabletter.

' Eksempel 51- 53 Lignende fremstillinger som i eksempel 50 ble utført med | ^Xl' (~BX2°^^BX3f° r ^ fremstille enterisk overtrukne t<;>ab-j letter. i ' i ! , i

. Eksempel 54 ; (Salve)

I I

De ovennevnte bestanddeler ble veiet, deretter ble CBXgrundig knadd med flytende parafin, 500 g vaselin ble satt til dette og dette ble blandet grundig. Blandingen ble gradvis tiliatt dét gjenværende vaselin hvilket ga totalvekt på 1000 g, og (blandingen ble grundig blandet til en salve.

i

i i

l Eksempel 55-^ 57

Lignende fremstillinger som i eksempel 54 ble utført med CBXl'CBX2°^CBX3^or ^ fremstille salver.

Claims (1)

1. lj. Fremgangsmåte ved fremstilling av et glykoprotein (CBi) med en antitumorvirkning, karakterisertV| e d at man dyrker kildeceller fra varmblodige dyr og

   fra disse kildeceller eller en supernantant derav ekstraherer en hovedsakelig renset form av et glykoprotein med følgende egenskaper:

   a) molekylvekt: i området fra 7000-90000 ved "Sephadex" gelfiltrering eller SDS gelelektroforese;

   j b) fargereaks joner: det viser en farge som indikerer projI teiri]e"r i' Lowry reaksjonen, viser en farge som indikerer peptidbjind-j inger og aminosyrer i ninhydrinreaksjonen etter hydrolysje med saltsyre, og viser en farge som indikerer sukkere med

   fenol-svovelsyrereaksjonen, antron-svovelsyrereaksjonen,| indolsvovelsyrereaksjonen og tryptofan-svovelsyrereaksjon! en;i

   c) utseende og lø selighet: hvitt pulver oppløselig i vann, vandig natriumklorid og fosfatpuffer, og lite løselig i j benzen, heksan og kloroform;

   l >

   <!> d) sukkerinnhold: sukkerinnholdet er 8-45%, 6-28% av det I totale sukker er heksoser, 1-11% er heksosaminer og 1-6% I er sialsyrer;

   I e). stabilitet: stabil i en vandig løsning ved pH 2,0, pH 7,0 (eller pH 11,0 ved 4°C i 24 timer eller lenger og en vandig j 1 (i løsning med pH 7,0 ved 60 o C i 3 timer eller lenger; og iiI i ,

   ji f) cytotoksisitet: selektivt destruerer tumorceller uten I vesentlig å ødelegge normale celler. i I

   2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakteriseri t i vaI ) emd olekyat lvgeklytk: op1r2o0t0e0-in1e7t 000(C; B^) har følge- nde egensk- aper:I!~ Ji !d ) fargereaksjoner: det utviser en farge som indikerer proteiner i Lowry reaksjonen, viser en farge som indikerer i Deiptidbindinger og aminosyrer i ninhydrinreaksjonen etter hydrolyse med saltsyre, og viser en farge som indikerer suk-ksi ejIornet eni , finednooll--ssvvoovveellssyyrreerreeaakkssjjoonneenn , oag nttrryopnt-osvfoanv-eslvsoyvreerlesyarkL2-::eaks j onen;

   c) utseende og løselighet: hvitt pulver oppløselig i vann, v <I> andig natriumklorid og fosfatpuffer og lite oppløselig i benzen, heksan og kloroform;

   d) sukkerinnhold: sukkerinnholdet er 27-33%, 17-20% av dejt t1 oti ale sukker er heksoser, 5-7% er heksosaminer og 5-6% etr sijalsyrer;

   e) isoelektrisk punkt: 4,2-7,3;

   f) adsorberbarhet: adsorberbar på Ulex europeus agglutinin-konjugert Sephadex i 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2);

   g) stabilitet: stabil i en vandig løsning ved pH 2,0, pH j7,0 eller pH 11,0 ved 4 C i 24 timer eller lenger og i en vandig løsning med pH 7,0 ved 6 0°C i 3 timer eller lenger;

   h) J cytotoksisitet: selektivtø delegger tumorceller uten ve-

   sentlig å ødelegge normale celler; og

   j

   i) ] differensiering: induserer differensiering av tumorceller.;

   3. i Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakteriser^ v! i 1 f i ed at glykoproteinet (CB A _,L ) har de følgende egenskaper: Ij1j a) ! molekylvekt: 70000-90000;

   I b) | fargereaksjoner: det viser en farge som indikerer proteiner i 5 i Lowryreaksjonen, viser en farge som indikerer peptidbind: - i;

   ij ng, er og aminosyrer i ninhydrinreaksjonen etter hydrolyse1! meid saltsyre, og viser en farge som indikerer sukkere i fenojJ- svovelsyrereaksjonen, antron-svovelsyrereaksjonen, indol-syovelsyrereaksjonen og tryptofan-svovelsyrereaksjonen;

   I c) iutseende og lø selighet: hvitt pulver oppløselig i vann,

   vandig natriumklorid og fosfatpuffer, og lite oppløselig i oenzen, heksan og kloroform;

   d) sukkerinnhold: sukkerinnholdet er 35-45%, 23-28% av det to/ tale sukker er heksoser, 8-11% er heksosaminer og 4-6% erj sialsyrer;

   S e) j isoelektrisk punkt: 4,3-6,2;

   f) ! adsorberbarhet: adsorberbar på Ulex europeus agglutinin-:conjugert "Sephadex" i 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2).;

   g) i stabilitet: stabil i en vandig løsning ved pH 2,0, pH 7i ,! 0 eller pH 11,0 ved 4 oC i 24 timer eller lenger og i en vandig løsning med pH 7,0 ved 6 0°C i 3 timer eller lenger;

   og

   i i i h).; cytotoksisitet: selektivt ødelegger tumorceller uten vesentlig å ødelegge normale celler.

   4!. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakteriser! t.

   v! I I ;!ed at glykoproteinet (CB X z~.). har de følgende egenskaper:

   a) molekylvekt: 40000-50000;

   b) fargereaksjoner: viser en farge som indikerer proteiner i Lowry reaksjonen/viser en farge som indikerer peptidbindinger og aminosyrer i ninhydrinreaksjonen eller hydrolyse mec saltsyre, og viser en farge som indikerer sukkere i fenol <pi> I svovelsyrereaksjonen, antron-svovelsyrereaksjonen og indol-si vovelreaksjonen og tryptofan-svovelsyrereaksjonen; ji i I

   c) utseende og løselighet; hvitt pulver oppløselig i vann!, vandig natriumklorid og fosfatpuffer, og lite løselig benzen, Aeksan og kloroform;

   <d> .) sukkerinnhold: sukkerinnholdet er 30-37%, 20-23% av djet tptale sukkerinnhold er heksoser, 6-8% er heksosaminer oj 4-6% er sialsyrer;

   e) isoelektrisk punkt: 4,2-7,3;

   i i f; <i> ) adsorberbarhet: adsorberbar på Ulex europeus agglutinin-Skbnjugert "Sephadex" i 0,01 M fosfatpuffer (pH 7,2);

   i

   i g,) stabilitet: stabil i en vandig løsning med pH 2,0, pH

   I I i v7! ;a, n0 deig lller øspnH ing 11m,e0 d vped H 74 o,C 0 vi ed 24 6t0°imC er i e3 ltleimr er leneglelr er og leni geern;

   i I i! j I h.i) cytotoksisitet: selektivt ødelegger tumorceller uten ve-

   ] sentlig å ødelegge normalceller.

   I

   J

   • 5j. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert : vj i e d at glykoproteinet (CBx3 ) har de følgende egenskaper:

   I a) molekylvekt: 7000 - 9000

   i b) fargereaksjoner: det viser en farge som indikerer proteir.er I i Lowry reaksjonen, viser en farge som indikerer peptidbind-j inger og aminosyrer i ninhydrinreaksjonen etter hydrolyse ;med saltsyre, og viser en farge som indikerer sukkere i fenolsvovelsyrereaksjonen, antron-svovelsyrereaksjonen,

   ■ 'i 'indolsvovelsyrereaksjonen og tryptofan-svovelsyrereaksjonen;

   I

   .c). utseende og oppløselighet: hvitt pulver oppløselig i vann, I vandig natriumklorid og fosfatpuffer, og lite løselig i benzen, heksan og kloroform; j i

   d) sukkerinnhold: sukkerinnholdet er 8-15%, 6-10% av det i [ totale sukker er heksoser, 1-2% er heksosaminer og 1-3% j sialsyrer;

   ; [ e■ ) adsorberbarhet: adsorberbar på karboksymetylcellulosei ved ionebytterkromatografi x 0,05 M fosfatpuffer (pH 6,4).

   ved bruk av karboksymetylcellulose;

   fi) stabilitet: stabil i en vandig løsning med pH 2,0,

   pH 7,0 eller pH 11,0 ved 4°C i 24 timer eller lenger og i en vandig løsning med pH 7> 0 ved 60°C i 3 timer eller lenger;

   g) cytotoksisitet: selektivt ødelegger tumorceller uten vi esentlig a „ ødelegge normale celler; og

   h) aminpsyresekvensen til N-enden av dets proteindel er alanin-alanin-.

   6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert Vj e d at kildecellene velges fra gruppen bestående av

   retikuloendoteliale celler, lymfoblaster, leukemiceller og1 fi ibroblaster, hvilke kildeceller kan være ikke etablerte ! celler eller celler fra etablerte cellelinjer.

   i

   7. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert I v e d at de etablerte cellelinjer velges fra gruppen bje-stående av BALL-1, TALL-1, NA LL-1, Namalwa, M-7002, B-7lj01,

   I Flow 7 000, JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, EEV-HO, BALM2 og CCRF-SB,

   ! i hvorav alle stammer fra mennesker.

   <I> j 8. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert i v e d at de etablerte cellelinjer velges fra gruppen bestå-I ende av mus BALB/C 3T3, museleukemiceller L1210, P388,

   i musemelanomaklon M-3, rottetumor LLC-WRC 256 bg hamster melanom RPMI 184 6, hvorav alle stammer fra andre varmblodige dyr enn mennesker. jj

   I 9. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert

   ved at de ikke etablerte celler velges fra gruppen be-

   : i si tående av menneskemakrofager og menneskelymfocytter.

   i ( j 10. Fremgangsmåte ifølge krav 6, karakterisert ' I v e d at de ikke etablerte celler velges fra gruppen be-1 stående av lymfocytter og makrofager fra varmblodige dyit fI orskjellige fra andre varmblodige dyr enn mennesker. I! _1! 1. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakteri-sl ert ved at man direkte transplanterer celler fIra én etablert cellelinje fra mennesker eller andre varmblodige dyr til legemer av varmblodige dyr av samme eller annen art og ekstraherer glykoproteinet fra de tumorer som dannes av de transplanterte celler enten direkte eller etter tumoren er dyrket og har fått vokse videre in vitro.

   12. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakteris r ved at man plasserer diffusjonskammere som har blitt ilnokkulert med kildeceller fra en etablert cellelinje fra mennesker eller andre varmblodige dyr, i varmblodige dyr slik at de får tilførsel av kroppsvæske fra dyrene, dyrker kildecellene og ekstraherer glykoproteinet fra de dyrkede kildeceller enten direkte eller etter de er blitt dyrket og har fått vokse videre in vitro.

   1i3 <.> Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at kildecellene utsettes for virkningen av en el].er "fil ere inducere.