JPH0631318B2 - 新リンホカインｉｉｉとその製法 - Google Patents
新リンホカインｉｉｉとその製法Info
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- JPH0631318B2 JPH0631318B2 JP60205537A JP20553785A JPH0631318B2 JP H0631318 B2 JPH0631318 B2 JP H0631318B2 JP 60205537 A JP60205537 A JP 60205537A JP 20553785 A JP20553785 A JP 20553785A JP H0631318 B2 JPH0631318 B2 JP H0631318B2
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、ヒトインターフェロン共存下でＫＢ細胞に対
して細胞増殖抑制活性を有する新リンホカインIIIとそ
の製造方法および用途に関する。
して細胞増殖抑制活性を有する新リンホカインIIIとそ
の製造方法および用途に関する。
腫瘍細胞に対して細胞障害活性を有するリンホカインと
しては、リンホトキシンやツモア ネクロシス ファク
ターなどが知られている。
しては、リンホトキシンやツモア ネクロシス ファク
ターなどが知られている。
リンホトキシンは、青木隆一ほか共著「リンホカイン」
新免疫学叢書６、87−105頁（1957年）医学書院、ブル
ーム ビー アール（Bloom B.R.）とグレイド ピー
アール（Glade P.R.）との共編「イン ビトロ メソッ
ズ イン セルメデイエイテッドイムニテイ（In vitro
methods in cell-mediated immunity）」アカデミック
プレス（Academic Press）（1971年）「セルラ− イ
ムノロジー（Cellular Immunology)Vol.38」388〜402頁
（1978年）などに記載され、ツモアネクロシス ファク
ターは、カースウエル イー エイ（Carswell E.A.）
など、「プロシーディングス オブ ザ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユー エス
エイ（Proceeding of the National Academy of Scie
nce of the U.S.A.),Vol.72」Ｎｏ．９ 3666〜3670頁
（1975年）およびイー ピック（E.Pick）編「ツモア
ネクロシス ファクター イン リンホカインズ（Tumo
r Necrosis Fector in Lymphokines)Vol.II.」235〜272
頁、アカデミック プレス（Academic Press）（1981
年）などに記載されている。
新免疫学叢書６、87−105頁（1957年）医学書院、ブル
ーム ビー アール（Bloom B.R.）とグレイド ピー
アール（Glade P.R.）との共編「イン ビトロ メソッ
ズ イン セルメデイエイテッドイムニテイ（In vitro
methods in cell-mediated immunity）」アカデミック
プレス（Academic Press）（1971年）「セルラ− イ
ムノロジー（Cellular Immunology)Vol.38」388〜402頁
（1978年）などに記載され、ツモアネクロシス ファク
ターは、カースウエル イー エイ（Carswell E.A.）
など、「プロシーディングス オブ ザ ナショナル
アカデミー オブ サイエンス オブ ザ ユー エス
エイ（Proceeding of the National Academy of Scie
nce of the U.S.A.),Vol.72」Ｎｏ．９ 3666〜3670頁
（1975年）およびイー ピック（E.Pick）編「ツモア
ネクロシス ファクター イン リンホカインズ（Tumo
r Necrosis Fector in Lymphokines)Vol.II.」235〜272
頁、アカデミック プレス（Academic Press）（1981
年）などに記載されている。
また、最近、大西治夫らは、特開昭58−146293号公報
で、本発明者らは、特開昭60−126228号公報でリンホカ
インの一種である抗腫瘍性糖蛋白質を明らかにしてい
る。
で、本発明者らは、特開昭60−126228号公報でリンホカ
インの一種である抗腫瘍性糖蛋白質を明らかにしてい
る。
本発明者らは、リンホカインについて多年研究してき
た。その結果、従来知られているこれらリンホカインと
は全く違った理化学的性質を有する新リンホカインIII
の存在を認め、その製造方法を確立し、さらにインター
フェロン共存下での各種悪性腫瘍細胞に対する著しい細
胞障害活性を認め、その用途を確立して本発明を完成し
た。
た。その結果、従来知られているこれらリンホカインと
は全く違った理化学的性質を有する新リンホカインIII
の存在を認め、その製造方法を確立し、さらにインター
フェロン共存下での各種悪性腫瘍細胞に対する著しい細
胞障害活性を認め、その用途を確立して本発明を完成し
た。
すなわち、本発明は、理化学的性質が、 分 子 量 15,000±2,000 等 電 点 pI＝4.5±0.5 易 動 度 Disc-PAGEで、Rf＝0.73±0.05 紫外線吸収スペクトル 280ｎｍ付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶 エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに離溶
乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示す 作 用 ＫＢ細胞に対する細胞増殖抑制活性、Ｌ929細胞に対す
る細胞障害活性、インターロイキン活性およびインター
フェロン活性を実質的にいずれも示さず、ヒトα−イン
ターフェロン共存下でＫＢ細胞に対して細胞増殖抑制活
性を示す 水溶液での活性安定性 pH7.2で30分間保持する条件により60℃まで安定、４℃
で16時間保持する条件によりpH2.0乃至11.０の範囲で安
定 −10℃での凍結貯蔵で１カ月以上安定である新リン
ホカインIII（本明細書を通じて、本物質を新リンホカ
インIIIと云う。）と、その製造方法および用途に関す
る。
乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示す 作 用 ＫＢ細胞に対する細胞増殖抑制活性、Ｌ929細胞に対す
る細胞障害活性、インターロイキン活性およびインター
フェロン活性を実質的にいずれも示さず、ヒトα−イン
ターフェロン共存下でＫＢ細胞に対して細胞増殖抑制活
性を示す 水溶液での活性安定性 pH7.2で30分間保持する条件により60℃まで安定、４℃
で16時間保持する条件によりpH2.0乃至11.０の範囲で安
定 −10℃での凍結貯蔵で１カ月以上安定である新リン
ホカインIII（本明細書を通じて、本物質を新リンホカ
インIIIと云う。）と、その製造方法および用途に関す
る。
新リンホカインIIIの製造方法は、例えば新リンホカイ
ンIII産生能を有するヒト由来の細胞、例えば白血球、
リンパ球、培養株化された細胞などに誘導剤を作用させ
て生成せしめればよい。
ンIII産生能を有するヒト由来の細胞、例えば白血球、
リンパ球、培養株化された細胞などに誘導剤を作用させ
て生成せしめればよい。
ヒト由来の白血球、リンパ球は、ヒトから採取した血液
を分離して調製すればよい。
を分離して調製すればよい。
培養株化されたヒト由来の細胞は、常法に従って、生体
外（in vitro）で増殖させた細胞が使用できる。
外（in vitro）で増殖させた細胞が使用できる。
しかしながら、本発明の場合には、培養株化された細胞
の増殖に際し、ヒト以外の混血動物体内に直接移植する
か、または拡散チャンバー内へ接種して、その混血動物
の体液を受けながら増殖させる方が望ましい。
の増殖に際し、ヒト以外の混血動物体内に直接移植する
か、または拡散チャンバー内へ接種して、その混血動物
の体液を受けながら増殖させる方が望ましい。
即ち、生体外（in vitro）で増殖させる場合とは違っ
て、高価な血清などを含む栄養培地が不要、または大幅
に節約できるばかりではなく、細胞増殖中の維持管理も
極めて容易であり、その上、得られた細胞から誘導生成
される新リンホカインIII活性が高い特徴を有してい
る。
て、高価な血清などを含む栄養培地が不要、または大幅
に節約できるばかりではなく、細胞増殖中の維持管理も
極めて容易であり、その上、得られた細胞から誘導生成
される新リンホカインIII活性が高い特徴を有してい
る。
ヒト以外の混血動物を利用する方法は、培養株化された
ヒト由来の細胞を、ヒト以外の混血動物体内に移植し、
あるいは、その動物の体液の供給を受けることのできる
拡散チャンバーを動物体内埋設して通常の飼育をすれ
ば、混血動物体から供給される栄養物を含有する体液を
利用してその細胞が容易に増殖しうるである。
ヒト由来の細胞を、ヒト以外の混血動物体内に移植し、
あるいは、その動物の体液の供給を受けることのできる
拡散チャンバーを動物体内埋設して通常の飼育をすれ
ば、混血動物体から供給される栄養物を含有する体液を
利用してその細胞が容易に増殖しうるである。
更に、生体外（in vitro）で増殖させる場合と比較し
て、この細胞の増殖が安定であること、その増殖速度が
大きいこと、得られる細胞量が多いこと、更には、細胞
当りの新リンホカインIIIの収量が著しく増加すること
も大きな特徴である。
て、この細胞の増殖が安定であること、その増殖速度が
大きいこと、得られる細胞量が多いこと、更には、細胞
当りの新リンホカインIIIの収量が著しく増加すること
も大きな特徴である。
本発明で使用する培養株化されたヒト由来の細胞は、ヒ
ト以外の混血動物体内に移植して容易に増殖し得て、し
かも新リンホカインIII産生能を有する細胞であればよ
く、例えば「蛋白質核酸酵素Vol.20、Ｎｏ．６」616〜64
3頁（1975年）に記載されているヒト由来の各種株化細
胞を用いることができる。とりわけ、「ジヤーナル オ
ブ クリニカル マイクロバイオロジー（Journal of C
linical Microbiology）Vol.1」116〜117頁（1975年）に
記載されているNamalva細胞、アイ ミヨシ（Ｉ，Miyos
hi）著「ネイチャ(Nature)Vol.267」843〜844頁（1977
年）に記載されているＢＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬＬ−１
細胞、ＮＡＬＬ−１細胞、「ザ ジャーナル オブ イ
ムノロジー（The Journal of Immunology)Vol.113」1334
〜1345頁（1974年）記載のＭ−7002細胞、Ｂ−7101細
胞、「組織培養」第６巻、第13号、527〜546頁（1980
年）に記載されているＪＢＬ細胞、ＥＢＶ−Sa細胞、Ｅ
ＢＶ−wa細胞、ＥＢＶ−HO細胞、ＭＯＬＴ−３細胞や、
その他ＢＡＬＭ−２細胞、ＣＣＲＦ−SB細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ 120）、ＣＣＲＦ−CEM、DND-41細胞などの株
化されたリンパ芽球様細胞や、また、正常な単核細胞、
顆粒性白血球細胞などを各種ウィルス、薬剤、放射線な
どで処理し培養株化させた細胞などが好適である。
ト以外の混血動物体内に移植して容易に増殖し得て、し
かも新リンホカインIII産生能を有する細胞であればよ
く、例えば「蛋白質核酸酵素Vol.20、Ｎｏ．６」616〜64
3頁（1975年）に記載されているヒト由来の各種株化細
胞を用いることができる。とりわけ、「ジヤーナル オ
ブ クリニカル マイクロバイオロジー（Journal of C
linical Microbiology）Vol.1」116〜117頁（1975年）に
記載されているNamalva細胞、アイ ミヨシ（Ｉ，Miyos
hi）著「ネイチャ(Nature)Vol.267」843〜844頁（1977
年）に記載されているＢＡＬＬ−１細胞、ＴＡＬＬ−１
細胞、ＮＡＬＬ−１細胞、「ザ ジャーナル オブ イ
ムノロジー（The Journal of Immunology)Vol.113」1334
〜1345頁（1974年）記載のＭ−7002細胞、Ｂ−7101細
胞、「組織培養」第６巻、第13号、527〜546頁（1980
年）に記載されているＪＢＬ細胞、ＥＢＶ−Sa細胞、Ｅ
ＢＶ−wa細胞、ＥＢＶ−HO細胞、ＭＯＬＴ−３細胞や、
その他ＢＡＬＭ−２細胞、ＣＣＲＦ−SB細胞（ＡＴＣＣ
ＣＣＬ 120）、ＣＣＲＦ−CEM、DND-41細胞などの株
化されたリンパ芽球様細胞や、また、正常な単核細胞、
顆粒性白血球細胞などを各種ウィルス、薬剤、放射線な
どで処理し培養株化させた細胞などが好適である。
また、これらヒト由来の細胞の新リンホカインIII産生
能を有する遺伝子を、例えば、ポリエチレングリコール
やセンダイウィルスなどを利用する細胞融合の手段、Ｄ
ＮＡリガーゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリ
メラーゼなどの酵素を利用する遺伝子組み換えの手段な
どによって処理し、その増殖速度を高めたり、細胞当り
の新リンホカインIII産生能を高めたりして使用しても
よく、本明細書に記載する株化細胞のみに限定されるも
のではない。これらの細胞は、後に述べる新リンホカイ
ンIIIを誘導生成させるまでの過程で、単独、または２
種以上を混合して自由に利用される。必要ならば、これ
に、例えばヒトから採取し調製される白血球、リンパ球
などを併用することもできる。
能を有する遺伝子を、例えば、ポリエチレングリコール
やセンダイウィルスなどを利用する細胞融合の手段、Ｄ
ＮＡリガーゼ、制限酵素（ヌクレアーゼ）、ＤＮＡポリ
メラーゼなどの酵素を利用する遺伝子組み換えの手段な
どによって処理し、その増殖速度を高めたり、細胞当り
の新リンホカインIII産生能を高めたりして使用しても
よく、本明細書に記載する株化細胞のみに限定されるも
のではない。これらの細胞は、後に述べる新リンホカイ
ンIIIを誘導生成させるまでの過程で、単独、または２
種以上を混合して自由に利用される。必要ならば、これ
に、例えばヒトから採取し調製される白血球、リンパ球
などを併用することもできる。
本発明で使用する温血動物は、ヒト由来の細胞が増殖し
得るものであればよく、例えばニワトリ、ハトなどの鳥
類、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウ
シ、モルモット、ラット、ヌードラット、ハムスター、
普通マウス、ヌードマウスなどの哺乳類が使用できる。
得るものであればよく、例えばニワトリ、ハトなどの鳥
類、イヌ、ネコ、サル、ウサギ、ヤギ、ブタ、ウマ、ウ
シ、モルモット、ラット、ヌードラット、ハムスター、
普通マウス、ヌードマウスなどの哺乳類が使用できる。
これらの動物にヒト由来の細胞を移植すると好ましくな
い免疫反応を起すおもれがあるので、その反応をできる
だけ抑えるため、使用する動物はできるだけ幼若な状
態、即ち卵、胚、胎児、または新生期、幼少期のものの
方が好ましい。
い免疫反応を起すおもれがあるので、その反応をできる
だけ抑えるため、使用する動物はできるだけ幼若な状
態、即ち卵、胚、胎児、または新生期、幼少期のものの
方が好ましい。
また、これら動物に例えば200〜600レム程度のエックス
線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清若しく
は免疫抑制剤などを注射するなどの前処理をほどこし
て、免疫反応を弱めて移植してもよい。
線若しくはガンマ線を照射するか、または抗血清若しく
は免疫抑制剤などを注射するなどの前処理をほどこし
て、免疫反応を弱めて移植してもよい。
使用する動物がヌードマウスあるはヌードラットの場合
には、成長したものであっても免疫反応が弱いので、こ
れらの前処理を必要とすることもなく、培養株化された
ヒト由来の細胞が移植でき、急速に増殖できるので特に
好都合である。
には、成長したものであっても免疫反応が弱いので、こ
れらの前処理を必要とすることもなく、培養株化された
ヒト由来の細胞が移植でき、急速に増殖できるので特に
好都合である。
また、培養株化されたヒト由来の細胞を例えば先づハム
スターに移植し増殖させた後、この細胞を更にヌードマ
ウスに移植するなどのように、ヒト以外の混血動物間で
移植してヒト由来の細胞の増殖をより安定化したり、更
にそれから誘導生成される新リンホカインIII量を増加
させることも自由である。
スターに移植し増殖させた後、この細胞を更にヌードマ
ウスに移植するなどのように、ヒト以外の混血動物間で
移植してヒト由来の細胞の増殖をより安定化したり、更
にそれから誘導生成される新リンホカインIII量を増加
させることも自由である。
この場合、同種間、同属間は勿論のこと、同鋼間、同門
間移植であってもよい。ヒト由来の細胞を移植する動物
体内の部位は、移植した細胞が増殖しうる部位であれば
よく、例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に選ば
れる。
間移植であってもよい。ヒト由来の細胞を移植する動物
体内の部位は、移植した細胞が増殖しうる部位であれば
よく、例えば尿液腔、静脈、腹腔、皮下など自由に選ば
れる。
また、動物体内にヒト由来の細胞を移植することなく、
動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾過膜、例えば孔
径約10-7〜10-5ｍを有するメンブランフィルター、限外
濾過膜またはフォローファイバーなどを設けた公知の各
種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体内、例えば腹
腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含む体液の供給
を受けつつ、そのチャンバー内で前述の培養株化された
ヒト由来の細胞を加れも増殖させることができる。
動物細胞の通過を阻止し得る多孔性の濾過膜、例えば孔
径約10-7〜10-5ｍを有するメンブランフィルター、限外
濾過膜またはフォローファイバーなどを設けた公知の各
種形状、大きさの拡散チャンバーを動物体内、例えば腹
腔内に埋設して、動物体からの栄養物を含む体液の供給
を受けつつ、そのチャンバー内で前述の培養株化された
ヒト由来の細胞を加れも増殖させることができる。
また必要に応じて、このチャンバー内の栄養物を含む溶
液を動物体内の体液と接続し、潅流させるようにしたチ
ャンバーを、例えば動物体表に取付け、チャンバー内の
ヒト由来の細胞の増殖状態をその表面に設けた窓を通じ
て透視できるようにすることも、また、このチャンバー
部分のみを着脱交換できるようにして動物を屠殺せずに
寿命一杯細胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生産量
を更に高めることもできる。
液を動物体内の体液と接続し、潅流させるようにしたチ
ャンバーを、例えば動物体表に取付け、チャンバー内の
ヒト由来の細胞の増殖状態をその表面に設けた窓を通じ
て透視できるようにすることも、また、このチャンバー
部分のみを着脱交換できるようにして動物を屠殺せずに
寿命一杯細胞を増殖させて、動物個体当りの細胞生産量
を更に高めることもできる。
これらの拡散チャンバーを利用する方法は、ヒト由来の
細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト由来の細胞
のみが容易に採取できるだけでなく、好ましくない免疫
反応を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制する前処
理の必要もなく、各種温血動物を自由に利用できる特徴
を有している。
細胞が動物細胞と直接接触しないので、ヒト由来の細胞
のみが容易に採取できるだけでなく、好ましくない免疫
反応を起す心配も少ないので、免疫反応を抑制する前処
理の必要もなく、各種温血動物を自由に利用できる特徴
を有している。
移植した動物の維持管理は、その動物の通常の飼育管理
を続ければよく、移植後といえども特別の取扱いは何ら
必要としないので好都合である。
を続ければよく、移植後といえども特別の取扱いは何ら
必要としないので好都合である。
ヒト由来の細胞を増殖させるための期間は通常１〜10週
の期間で目的を達成することができる。このようにして
得られるヒト由来の細胞数は動物個体当り約107〜1012
個、またはそれ以上に達することも見出した。
の期間で目的を達成することができる。このようにして
得られるヒト由来の細胞数は動物個体当り約107〜1012
個、またはそれ以上に達することも見出した。
換言すれば、動物生体内で増殖させたヒト由来の細胞数
は、動物個体当り移植した細胞数の約102〜107倍は、ま
たはそれ以上にも達し、生体外の栄養培地に接種して増
殖させる場合の約101〜106倍、またはそれ以上にも達し
て、新リンホカインIIIの製造のために極めて好都合で
ある。
は、動物個体当り移植した細胞数の約102〜107倍は、ま
たはそれ以上にも達し、生体外の栄養培地に接種して増
殖させる場合の約101〜106倍、またはそれ以上にも達し
て、新リンホカインIIIの製造のために極めて好都合で
ある。
このようにして増殖させてヒト由来の細胞から新リンホ
カインIIIを誘導生成させる方法は自由である。それ
が、増殖した動物体内のままで新リンホカインIII誘導
剤を作用させることもできる。例えば、腹腔内の腹水に
浮遊状で増殖したヒト由来の細胞に、また皮下に生じた
腫瘍細胞に、新リンホカインIII誘導剤を直接作用させ
て新リンホカインIIIを誘導生成させ、次いで、その血
清、腹水または腫瘍から新リンホカインIIIを精製採取
すればよい。
カインIIIを誘導生成させる方法は自由である。それ
が、増殖した動物体内のままで新リンホカインIII誘導
剤を作用させることもできる。例えば、腹腔内の腹水に
浮遊状で増殖したヒト由来の細胞に、また皮下に生じた
腫瘍細胞に、新リンホカインIII誘導剤を直接作用させ
て新リンホカインIIIを誘導生成させ、次いで、その血
清、腹水または腫瘍から新リンホカインIIIを精製採取
すればよい。
また、ヒト由来の増殖細胞をヒト以外の動物体内から取
り出し、生体外で新リンホカインIII誘導剤を作用させ
て新リンホカインIIIを誘導生成させることもできる。
例えば、腹水中で増殖したヒト由来の細胞を採取し、ま
た皮下に生じたヒト由来の細胞を含む腫瘍を摘出、分散
し、得られる細胞を約20〜40℃に保った栄養培地に細胞
濃度が約105〜108/mlになるよう浮遊させ、これに新リ
ンホカインIII誘導剤を作用させることによって新リン
ホカインIIIを誘導生成させ、これを精製採取すればよ
い。
り出し、生体外で新リンホカインIII誘導剤を作用させ
て新リンホカインIIIを誘導生成させることもできる。
例えば、腹水中で増殖したヒト由来の細胞を採取し、ま
た皮下に生じたヒト由来の細胞を含む腫瘍を摘出、分散
し、得られる細胞を約20〜40℃に保った栄養培地に細胞
濃度が約105〜108/mlになるよう浮遊させ、これに新リ
ンホカインIII誘導剤を作用させることによって新リン
ホカインIIIを誘導生成させ、これを精製採取すればよ
い。
更に、ヒト由来の細胞を拡散チャンバー内で増殖させた
場合は、増殖させた細胞をチャンバー内のままで、また
はチャンバーから取り出して、新リンホカインIII誘導
剤を作用させ、新リンホカインIIIを誘導生成させるこ
ともできる。
場合は、増殖させた細胞をチャンバー内のままで、また
はチャンバーから取り出して、新リンホカインIII誘導
剤を作用させ、新リンホカインIIIを誘導生成させるこ
ともできる。
また、前述のようにヒト以外の温血動物を利用して得ら
れるヒト由来の細胞を、必要ならば、更にインビトロで
１〜４日間程度培養し細胞の増殖世代を同調させるなど
した後、新リンホカインIII誘導剤を作用させ新リンホ
カインIIIを誘導生成させることも自由である。
れるヒト由来の細胞を、必要ならば、更にインビトロで
１〜４日間程度培養し細胞の増殖世代を同調させるなど
した後、新リンホカインIII誘導剤を作用させ新リンホ
カインIIIを誘導生成させることも自由である。
また、例えば、増殖させたヒト由来の細胞に先づ動物体
内のままで新リンホカインIIIを誘導生成させた後、次
いで、同一動物個体の特定の部位または全体から採取し
たヒト由来の細胞に動物体外で新リンホカインIIIを誘
導生成させる方法、また、一度新リンホカインIIIの誘
導生成に使用した細胞を、更に２度以上新リンホカイン
IIIの誘導生成に使用する方法、または動物体内に埋
設、若しくは接続するチャンバーを交換して得られる細
胞数を増加させる方法などによって、使用する動物個体
当りの新リンホカインIII生成量を更に高めることも自
由である。
内のままで新リンホカインIIIを誘導生成させた後、次
いで、同一動物個体の特定の部位または全体から採取し
たヒト由来の細胞に動物体外で新リンホカインIIIを誘
導生成させる方法、また、一度新リンホカインIIIの誘
導生成に使用した細胞を、更に２度以上新リンホカイン
IIIの誘導生成に使用する方法、または動物体内に埋
設、若しくは接続するチャンバーを交換して得られる細
胞数を増加させる方法などによって、使用する動物個体
当りの新リンホカインIII生成量を更に高めることも自
由である。
本発明の新リンホカインIII誘導剤としては、α−イン
ターフェロン誘導剤として知られているウィルス、核
酸、ヌクレオチドなどやγ−インターフェロン誘導剤と
して知られているフィトヘマグルチニン、コンカナバリ
ンＡ、ポークウィードミトーゲン、リポポリサッカリ
ド、エンドトキシン、多糖類、細菌などが適宜用いられ
る。また、感作化された細胞にとっては、抗原も新リン
ホカインIIIの誘導剤である。
ターフェロン誘導剤として知られているウィルス、核
酸、ヌクレオチドなどやγ−インターフェロン誘導剤と
して知られているフィトヘマグルチニン、コンカナバリ
ンＡ、ポークウィードミトーゲン、リポポリサッカリ
ド、エンドトキシン、多糖類、細菌などが適宜用いられ
る。また、感作化された細胞にとっては、抗原も新リン
ホカインIIIの誘導剤である。
更に、ヒト由来の細胞から新リンホカインIIIを誘導生
成させるに際し、新リンホカインIII誘導剤として、α
−インターフェロン誘導剤とγ−インターフェロン誘導
剤とを併用することにより新リンホカインIIIの生産量
を高めることも自由である。
成させるに際し、新リンホカインIII誘導剤として、α
−インターフェロン誘導剤とγ−インターフェロン誘導
剤とを併用することにより新リンホカインIIIの生産量
を高めることも自由である。
また、これら誘導生成によって新リンホカインIIIが産
生されるだけでなく、種特異性の高いヒトインターフェ
ロンも同時に産生されることが判明した。
生されるだけでなく、種特異性の高いヒトインターフェ
ロンも同時に産生されることが判明した。
このことは、貴重な２種以上のヒト生理活性物質の同時
生産を可能にし、更に、ヒト由来の細胞の高度利用を可
能にし、新リンホカインIII及びヒトインターフェロン
を大量に安価に供給する点からきわめて好都合である。
生産を可能にし、更に、ヒト由来の細胞の高度利用を可
能にし、新リンホカインIII及びヒトインターフェロン
を大量に安価に供給する点からきわめて好都合である。
このようにして誘導生成された新リンホカインIIIは、
公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分
離、濃縮、凍結乾燥などを行うことによって容易に精製
分離し、採取することができる。更に高度の精製を必要
とする場合には、例えば、イオン交換体への吸着−溶
出、ゲル濾過および等電点分画、電気泳動、イオン交換
クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、カ
ラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ
ィーなどの公知の方法を組合せれば、最高純度の新リン
ホカインIIIを採取することも可能である。
公知の精製分離法、例えば、塩析、透析、濾過、遠心分
離、濃縮、凍結乾燥などを行うことによって容易に精製
分離し、採取することができる。更に高度の精製を必要
とする場合には、例えば、イオン交換体への吸着−溶
出、ゲル濾過および等電点分画、電気泳動、イオン交換
クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、カ
ラムクロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフ
ィーなどの公知の方法を組合せれば、最高純度の新リン
ホカインIIIを採取することも可能である。
また、このようにして得られた新リンホカインIIIを、
抗原としてヒト以外の温血動物を免疫し、該動物から抗
体産生細胞を採取して、この細胞と骨髄腫細胞とを融合
せしめ、得られる融合細胞から抗新リンホカインIII抗
体産生能を有する融合細胞を選択し、この選択細胞を増
殖させ、生成したモノクローナル抗体を、例えば、ブロ
ムシアン活性化セファロースと反応させて得られる固定
化モノクローナル抗体を用いて精製し、高純度の新リン
ホカインIIIを高収率で採取することも有利に用いるこ
とができる。
抗原としてヒト以外の温血動物を免疫し、該動物から抗
体産生細胞を採取して、この細胞と骨髄腫細胞とを融合
せしめ、得られる融合細胞から抗新リンホカインIII抗
体産生能を有する融合細胞を選択し、この選択細胞を増
殖させ、生成したモノクローナル抗体を、例えば、ブロ
ムシアン活性化セファロースと反応させて得られる固定
化モノクローナル抗体を用いて精製し、高純度の新リン
ホカインIIIを高収率で採取することも有利に用いるこ
とができる。
このようにして精製し製造された新リンホカインIII
は、理化学的性質が、 分 子 量 15,000±2,000 等 電 点 pI＝4.5±0.5 易 動 度 Disc-PAGEで、Rf＝0.73±0.05 紫外線吸収スペクトル 280ｎｍ付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶 エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに離溶
乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示す 作 用 ＫＢ細胞に対する細胞増殖抑制活性、Ｌ929細胞に対す
る細胞障害活性、インターロイキン活性およびインター
フェロン活性を実質的にいずれも示さず、ヒトα−イン
ターフェロン共存下でＫＢ細胞に対して細胞増殖抑制活
性を示す 水溶液での活性安定性 pH7.2で30分間保持する条件により60℃まで安定、４℃
で16時間保持する条件によりpH2.0乃至11.0の範囲で安
定 −10℃での凍結貯蔵で１カ月以上安定 であることが判明した。
は、理化学的性質が、 分 子 量 15,000±2,000 等 電 点 pI＝4.5±0.5 易 動 度 Disc-PAGEで、Rf＝0.73±0.05 紫外線吸収スペクトル 280ｎｍ付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶 エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに離溶
乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示す 作 用 ＫＢ細胞に対する細胞増殖抑制活性、Ｌ929細胞に対す
る細胞障害活性、インターロイキン活性およびインター
フェロン活性を実質的にいずれも示さず、ヒトα−イン
ターフェロン共存下でＫＢ細胞に対して細胞増殖抑制活
性を示す 水溶液での活性安定性 pH7.2で30分間保持する条件により60℃まで安定、４℃
で16時間保持する条件によりpH2.0乃至11.0の範囲で安
定 −10℃での凍結貯蔵で１カ月以上安定 であることが判明した。
また、新リンホカインIIIは、インターフェロン共存下
で多くのヒト腫瘍細胞に障害を与え死滅させる能力を有
しているが、ヒト正常細胞には実質的に障害を与えない
ことも判明した。
で多くのヒト腫瘍細胞に障害を与え死滅させる能力を有
しているが、ヒト正常細胞には実質的に障害を与えない
ことも判明した。
従って、新リンホカインIIIは、これを含有する組成物
などとして、新リンホカインIII感受性疾患、例えば、
悪性腫瘍の予防剤、治療剤なかでも、従来、治療がきわ
めて困難とされていたヒトの各種悪性腫瘍治療剤として
インターフェロンなど他のリンホカインと共に有利に用
いることができる。
などとして、新リンホカインIII感受性疾患、例えば、
悪性腫瘍の予防剤、治療剤なかでも、従来、治療がきわ
めて困難とされていたヒトの各種悪性腫瘍治療剤として
インターフェロンなど他のリンホカインと共に有利に用
いることができる。
作用は、標的細胞としてＫＢ細胞、またはＬ929細胞を
用いて調べた。
用いて調べた。
即ち、ＫＢ細胞を用いる場合には、キヤンサー ケモテ
ラピー リポーツ（Cancer Chemotherapy Reports）パ
ーツ（Parts）３、Vol.3、Ｎｏ．２、September 1972の
記載に準じて、ＫＢ細胞の増殖抑制活性を測定し、また
は、この測定に際し、高純度のヒトα−インターフェロ
ン（比活性２×108単位／mg）をml当り、20,000単位共
存させてＫＢ細胞の増殖抑制活性を測定した。
ラピー リポーツ（Cancer Chemotherapy Reports）パ
ーツ（Parts）３、Vol.3、Ｎｏ．２、September 1972の
記載に準じて、ＫＢ細胞の増殖抑制活性を測定し、また
は、この測定に際し、高純度のヒトα−インターフェロ
ン（比活性２×108単位／mg）をml当り、20,000単位共
存させてＫＢ細胞の増殖抑制活性を測定した。
Ｌ929細胞を用いる場合には、イー ピック（Ｅ．Pic
k）編、ツモア ネクロシス ファクター イン リン
ホカインズ（Tumor Necrosis Fector in Lymphokines）
Vol.II.、245〜249頁、アカデミック プレス（Academi
c Press）（1981年）の記載に準じて、アクチノマイシ
ンＤ存在下でのＬ929細胞に与える細胞障害活性を測定
した。
k）編、ツモア ネクロシス ファクター イン リン
ホカインズ（Tumor Necrosis Fector in Lymphokines）
Vol.II.、245〜249頁、アカデミック プレス（Academi
c Press）（1981年）の記載に準じて、アクチノマイシ
ンＤ存在下でのＬ929細胞に与える細胞障害活性を測定
した。
新リンホカインIIIの活性は、本明細書を通じて特にこ
とわらない限り、ヒトα−インターフェロンを共存させ
たＫＢ細胞の増殖抑制活性を測定する方法を採用した。
とわらない限り、ヒトα−インターフェロンを共存させ
たＫＢ細胞の増殖抑制活性を測定する方法を採用した。
インターロイキン活性については、ダイアナ ボラッシ
（Diana Boraschi）らによる ザ ジャーナル オブ
イムノロジー（The Journal of Immunology）Vol.133、
Ｎｏ．２、August 1984の記載に準じてインターロイキ
ン−１の活性を測定し、また、ステベン ギリス（Stev
en Gillis）らによるザ ジャーナル オブ イムノロ
ジー（The Journal of Immunology）Vol.120、Ｎｏ．
６、June 1978の記載に準じてインターロイキン−２の
活性を測定した。
（Diana Boraschi）らによる ザ ジャーナル オブ
イムノロジー（The Journal of Immunology）Vol.133、
Ｎｏ．２、August 1984の記載に準じてインターロイキ
ン−１の活性を測定し、また、ステベン ギリス（Stev
en Gillis）らによるザ ジャーナル オブ イムノロ
ジー（The Journal of Immunology）Vol.120、Ｎｏ．
６、June 1978の記載に準じてインターロイキン−２の
活性を測定した。
ヒトに種特異性の高いインターフェロンの活性は「蛋白
質核酸酵素」Vol.20、Ｎｏ．６、616〜643頁（1975年）
に報告されているヒト羊膜由来のFL細胞を使用して公知
のプラーク半減法で測定した。
質核酸酵素」Vol.20、Ｎｏ．６、616〜643頁（1975年）
に報告されているヒト羊膜由来のFL細胞を使用して公知
のプラーク半減法で測定した。
赤血球凝集価は、ゼイ イー サーク（Ｊ．Ｅ．Salk）
著、ザ ジャーナル オブ イムノロジー（The Journa
l of Immunology）Vol.49、87頁（1944年）の方法に準
じて測定した。
著、ザ ジャーナル オブ イムノロジー（The Journa
l of Immunology）Vol.49、87頁（1944年）の方法に準
じて測定した。
次に、本発明を実験で説明する。
実験Ａ−１ 部分精製した新リンホカインIIIの調製 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製し
た抗血清を注射して、ハムスターの免疫反応を弱めた
後、その皮下にＢＡＬＬ−１細胞を移植し、その後通常
の方法で３週間飼育した。皮下に生じた腫瘤を摘出して
細切し、生理食塩水中で分散させほぐした。得られた細
胞を血清添加のRPMI 1640培地（pH 7.2）で洗浄し、同
培地に約２×106／mlになるよう懸濁した。本細胞懸濁
液に対して、ml当り約400赤血球凝集価のセンダイウィ
ルスを添加し、37℃で24時間保って新リンホカインIII
を誘導生成させた。
た抗血清を注射して、ハムスターの免疫反応を弱めた
後、その皮下にＢＡＬＬ−１細胞を移植し、その後通常
の方法で３週間飼育した。皮下に生じた腫瘤を摘出して
細切し、生理食塩水中で分散させほぐした。得られた細
胞を血清添加のRPMI 1640培地（pH 7.2）で洗浄し、同
培地に約２×106／mlになるよう懸濁した。本細胞懸濁
液に対して、ml当り約400赤血球凝集価のセンダイウィ
ルスを添加し、37℃で24時間保って新リンホカインIII
を誘導生成させた。
これを約４℃、約1,000ｇで遠心分離し、沈澱物を除去
し、得られた上清をpH7.2、0.01Ｍリン酸塩緩衝液を含
有する生理的食塩水で20時間透析し、更に、精密濾過し
て得た濾液を、抗インターフェロン抗体を固定化してい
る抗体カラムに流し、その非吸着画分を採取し、更に、
これをクロマトフォーカッシング法により活性画分を採
取し、濃縮し、凍結乾燥して新リンホカインIII活性を
含有する粉末を得た。
し、得られた上清をpH7.2、0.01Ｍリン酸塩緩衝液を含
有する生理的食塩水で20時間透析し、更に、精密濾過し
て得た濾液を、抗インターフェロン抗体を固定化してい
る抗体カラムに流し、その非吸着画分を採取し、更に、
これをクロマトフォーカッシング法により活性画分を採
取し、濃縮し、凍結乾燥して新リンホカインIII活性を
含有する粉末を得た。
本粉末の比活性は、約105単位／mg蛋白質であった。ま
た、新リンホカインIIIの収量は、ハムスター１匹当り
約1,000,000単位であった。
た、新リンホカインIIIの収量は、ハムスター１匹当り
約1,000,000単位であった。
実験Ａ−２ 抗新リンホカインIII抗体の調製 実験Ａ−１の方法で得た新リンホカインIIIを生理食塩
水に蛋白質濃度として約0.05w/w％になるように溶解
し、これとフロイント完全アジュバント乳化液とを等量
混合して、この混合液の0.2mlをマウスの皮下に注射
し、７日後再び同様に注射してマウスを免疫した。その
抗体産生能を有する細胞に抗新リンホカインIII抗体を
誘導生成せしめ、このマウスからひ臓を摘出し、細切分
散して得られるひ臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ3−X63−
Ag8「フロー ラボラトリーズ（Flow Laboratories）社
製とを、血清無含有Eagleの最少基本培地で調製した50
ｗ／ｖ％ポリエチレングリコール−1000溶液（pH7.2、
温度37℃）に、それぞれ104／mlになるように浮遊させ
て５分間保った後、前記基本培地で20培に希釈し、ダビ
ソン（Davison）などがソマティック セル ゼネティ
ックス （Somatic Cell Genetics）Vol.２、175〜176
頁（1976年）に報告している方法に準じてヒポキサンチ
ン−アミノブテリン−チミジン培養液で増殖しうる融合
細胞に採取し、この融合細胞から抗新リンホカインIII
抗体産生能を有する融合細胞を選択した。得られた融合
細胞をマウス腹腔内に１匹当り約106個移植して２週間
飼育した後、これを屠殺して腹水、血液などの体液を集
め、遠心分離し、この上清を硫安塩析して飽和度30〜50
％の沈澱画分を集め、次いで透析し、更に、この液を、
実験Ａ−１の方法で得た新リンホカインIIIをブロムシ
アン活性化セファロースと室温下で反応させて得られる
固定化新リンホカインIIIゲルを用いてアフィニティク
ロマトグラフィーを行ない、抗新リンホカインIII抗体
画分を得、透析した後濃縮し、凍結乾燥して新リンホカ
インIIIのモノクローナル抗体粉末を採取した。
水に蛋白質濃度として約0.05w/w％になるように溶解
し、これとフロイント完全アジュバント乳化液とを等量
混合して、この混合液の0.2mlをマウスの皮下に注射
し、７日後再び同様に注射してマウスを免疫した。その
抗体産生能を有する細胞に抗新リンホカインIII抗体を
誘導生成せしめ、このマウスからひ臓を摘出し、細切分
散して得られるひ臓細胞とマウス骨髄腫細胞Ｐ3−X63−
Ag8「フロー ラボラトリーズ（Flow Laboratories）社
製とを、血清無含有Eagleの最少基本培地で調製した50
ｗ／ｖ％ポリエチレングリコール−1000溶液（pH7.2、
温度37℃）に、それぞれ104／mlになるように浮遊させ
て５分間保った後、前記基本培地で20培に希釈し、ダビ
ソン（Davison）などがソマティック セル ゼネティ
ックス （Somatic Cell Genetics）Vol.２、175〜176
頁（1976年）に報告している方法に準じてヒポキサンチ
ン−アミノブテリン−チミジン培養液で増殖しうる融合
細胞に採取し、この融合細胞から抗新リンホカインIII
抗体産生能を有する融合細胞を選択した。得られた融合
細胞をマウス腹腔内に１匹当り約106個移植して２週間
飼育した後、これを屠殺して腹水、血液などの体液を集
め、遠心分離し、この上清を硫安塩析して飽和度30〜50
％の沈澱画分を集め、次いで透析し、更に、この液を、
実験Ａ−１の方法で得た新リンホカインIIIをブロムシ
アン活性化セファロースと室温下で反応させて得られる
固定化新リンホカインIIIゲルを用いてアフィニティク
ロマトグラフィーを行ない、抗新リンホカインIII抗体
画分を得、透析した後濃縮し、凍結乾燥して新リンホカ
インIIIのモノクローナル抗体粉末を採取した。
本品は、新リンホカインIIIの活性に対して免疫学的に
特異的な中和活性を示した。
特異的な中和活性を示した。
実験Ａ−３ 高純度に精製した新リンホカインIIIの調
製とその理化学的性質 実験Ａ−１の方法で調製した新リンホカインIIIの部分
精製品を、実験Ａ−２の方法で調製したモノクローナル
抗体を固定化したゲルを用いてアフィニティクロマトグ
ラフィーを行ない新リンホカインIIIの活性画分を採取
し、透析し、濃縮して凍結乾燥した。
製とその理化学的性質 実験Ａ−１の方法で調製した新リンホカインIIIの部分
精製品を、実験Ａ−２の方法で調製したモノクローナル
抗体を固定化したゲルを用いてアフィニティクロマトグ
ラフィーを行ない新リンホカインIIIの活性画分を採取
し、透析し、濃縮して凍結乾燥した。
本品は、高純度に精製された新リンホカインIIIであっ
て、その比活性は、約107単位／mg蛋白質であった。
て、その比活性は、約107単位／mg蛋白質であった。
本品を用いて、理化学的性質を調査した。
分 子 量 ケイ ウェーバー アンド エム オズボーン（Ｋ．We
ber and M.Osborn）、ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリイ（Journal of Biological Cnemistr
y）、Vol.244、4406頁（1969年）の記載に準じて、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動により調べた。即ち、
0.１％SDS存在下、10％アクリルアミドゲルカラムに試
料約10μｇを負荷し、カラム当り８mAで４時間泳動後、
抽出し、その活性測定から分子量を求めたところ、15,0
00±2,000であった。
ber and M.Osborn）、ジャーナル オブ バイオロジカ
ル ケミストリイ（Journal of Biological Cnemistr
y）、Vol.244、4406頁（1969年）の記載に準じて、ＳＤ
Ｓ−ポリアクリルアミド電気泳動により調べた。即ち、
0.１％SDS存在下、10％アクリルアミドゲルカラムに試
料約10μｇを負荷し、カラム当り８mAで４時間泳動後、
抽出し、その活性測定から分子量を求めたところ、15,0
00±2,000であった。
等 電 点 スウェーデン、ＬＫＢ社製、等電点電気泳動用ゲル、商
品AMPHOLINE PAGPLATE（pH3.5〜9.5）を用いて、25Ｗ、
２時間泳動した結果、等電点pIは4.5±0.5であった。
品AMPHOLINE PAGPLATE（pH3.5〜9.5）を用いて、25Ｗ、
２時間泳動した結果、等電点pIは4.5±0.5であった。
電気易動度 ビー ゼイ デービス（Ｂ．Ｊ．Davis）、アニュアル
ズ オブ ザ ニューヨーク アカデミー オブ サイ
エンシズ（Annuals of the New York Academy of Scien
ces）Vol.121、404頁（1964年）の記載に準じて、7.5％
アクリルアミドゲルカラムに試料約10μｇ負荷し、pH8.
3、カラム当り３mAで２時間泳動後、抽出してその活性
測定から電気易動度を求めたところ、Ｒfは0.73±0.05
であった。
ズ オブ ザ ニューヨーク アカデミー オブ サイ
エンシズ（Annuals of the New York Academy of Scien
ces）Vol.121、404頁（1964年）の記載に準じて、7.5％
アクリルアミドゲルカラムに試料約10μｇ負荷し、pH8.
3、カラム当り３mAで２時間泳動後、抽出してその活性
測定から電気易動度を求めたところ、Ｒfは0.73±0.05
であった。
紫外線吸収スペクトル 株式会社島津製作所の分光光度計、商品名ＵＶ−250を
用いて紫外部での吸収スペクトルを調べた結果、280ｎ
ｍ付近に最大吸収を示した。
用いて紫外部での吸収スペクトルを調べた結果、280ｎ
ｍ付近に最大吸収を示した。
溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶エチルエー
テル、酢酸エチルまたはクロロホルムに難溶乃至不溶で
あった。
テル、酢酸エチルまたはクロロホルムに難溶乃至不溶で
あった。
呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示した。
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示した。
作 用 単独では、ＫＢ細胞に対する細胞増殖抑制活性、Ｌ929
細胞に対する細胞障害活性、インターロイキン活性およ
びインターフェロン活性は実質的にいずれも示さなかっ
た。ヒトα−インターフェロン共存下で、ＫＢ細胞に対
して細胞増殖抑制活性を示した。
細胞に対する細胞障害活性、インターロイキン活性およ
びインターフェロン活性は実質的にいずれも示さなかっ
た。ヒトα−インターフェロン共存下で、ＫＢ細胞に対
して細胞増殖抑制活性を示した。
水溶液での活性安定性 1) 熱安定性 約１×103単位／mlの試料を各温度によりpH7.2で30分間
保持した後、残存する活性を測定した結果、60℃まで安
定であった。
保持した後、残存する活性を測定した結果、60℃まで安
定であった。
2) pH安定性 約１×104単位／mlの試料0.1mlを各pH緩衝液（pH２〜７
…マックルベイン緩衝液（Mcllvaine buffer）、pH７〜
８…リン酸塩緩衝液（Phosphate buffer）、pH８〜11…
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（Glycine-NaOH buf
fer））１mlに加え、４℃で16時間保持した後、この0.1
mlをpH7.2、0.05Ｍリン酸塩緩衝液で、pH7.2に調整して
残存する活性を測定した結果、pH2.0乃至11.0の範囲で
安定であった。
…マックルベイン緩衝液（Mcllvaine buffer）、pH７〜
８…リン酸塩緩衝液（Phosphate buffer）、pH８〜11…
グリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（Glycine-NaOH buf
fer））１mlに加え、４℃で16時間保持した後、この0.1
mlをpH7.2、0.05Ｍリン酸塩緩衝液で、pH7.2に調整して
残存する活性を測定した結果、pH2.0乃至11.0の範囲で
安定であった。
凍結貯蔵による安定性 pH7.2の水溶液を−10℃で凍結し１ケ月間貯蔵した後、
融解し、活性を測定した結果、活性の低下は見られなか
った。
融解し、活性を測定した結果、活性の低下は見られなか
った。
以上の結果から、新リンホカインIIIは、従来知られて
いるリンホトキシン、ツモア ネクロシスファクター、
インターロイキン、インターフェロンなどのリンホカイ
ンとは、明らかに違った理化学的性質を有する。
いるリンホトキシン、ツモア ネクロシスファクター、
インターロイキン、インターフェロンなどのリンホカイ
ンとは、明らかに違った理化学的性質を有する。
実験Ｂ−１ 悪性腫瘍細胞に対する増殖抑制作用 実験Ａ−３の方法で得た新リンホカインIIIを用いて、
ヒト由来の各種細胞に対する増殖抑制作用を調べた。
ヒト由来の各種細胞に対する増殖抑制作用を調べた。
牛胎児血清を補足した公知の栄養培地１mlにヒト由来の
各種細胞を106個ずつとり、１日培養した後、これに実
験Ａ−３の方法で調製した新リンホカインIIIを20単位
またはこの20単位とともにヒトα−インターフェロン
（比活性２×108単位／mg）、2,000単位含有する生理食
塩水0.1mlを加え、37℃で２日間培養した。培養終了
後、アプライド マイクロバイオロジー（Applied Micr
obiology）Vol.22、Ｎｏ．４、671〜677頁（1971年）に
記載されている方法に準じて、染色剤ニュートラルレッ
ドで生細胞を染色し、続いて、この染色剤をアシドエタ
ノールで溶出し、溶出液の540ｎｍにおける吸光度から
生細胞量を測定した。
各種細胞を106個ずつとり、１日培養した後、これに実
験Ａ−３の方法で調製した新リンホカインIIIを20単位
またはこの20単位とともにヒトα−インターフェロン
（比活性２×108単位／mg）、2,000単位含有する生理食
塩水0.1mlを加え、37℃で２日間培養した。培養終了
後、アプライド マイクロバイオロジー（Applied Micr
obiology）Vol.22、Ｎｏ．４、671〜677頁（1971年）に
記載されている方法に準じて、染色剤ニュートラルレッ
ドで生細胞を染色し、続いて、この染色剤をアシドエタ
ノールで溶出し、溶出液の540ｎｍにおける吸光度から
生細胞量を測定した。
なお、対照実験には、新リンホカインIIIを含まない生
理食塩水0.1mlを用いた。
理食塩水0.1mlを用いた。
細胞の増殖抑制率(%)は、次の式から算出した。
その結果を、第１表に示した。
第１表の結果から明らかなように、新リンホカインIII
は、各種の悪性腫瘍細胞対しては、ヒトインターフェロ
ン共存下でその増殖を著るしく抑制することが判明し
た。また、新リンホカインIIIまたは高純度のヒトα−
インターフェロンは、それぞれ単独では、正常細胞、悪
性腫瘍細胞に対してほとんど影響を与えないことも判明
した。
は、各種の悪性腫瘍細胞対しては、ヒトインターフェロ
ン共存下でその増殖を著るしく抑制することが判明し
た。また、新リンホカインIIIまたは高純度のヒトα−
インターフェロンは、それぞれ単独では、正常細胞、悪
性腫瘍細胞に対してほとんど影響を与えないことも判明
した。
実験Ｂ−２ ＢＡＬＢ／Ｃ由来ヌードマウスにヒト乳癌組織片を背部
皮下に移植し、その腫瘍体積が約200mm3になった時期か
ら、実験Ａ−１、または実験Ａ−３の方法で得られた新
リンホカインIIIを生理食塩水に溶解した状態で、毎日
１回、ヒトα−インターフェロン（比活性２×108単位
／mg）5,000単位とともに50または500単位／Kgずつ20日
間静脈注射を行った。その後、ヌードマウスを屠殺して
腫瘍の重量を測定した。
皮下に移植し、その腫瘍体積が約200mm3になった時期か
ら、実験Ａ−１、または実験Ａ−３の方法で得られた新
リンホカインIIIを生理食塩水に溶解した状態で、毎日
１回、ヒトα−インターフェロン（比活性２×108単位
／mg）5,000単位とともに50または500単位／Kgずつ20日
間静脈注射を行った。その後、ヌードマウスを屠殺して
腫瘍の重量を測定した。
その結果を、第２表に示した。
実験Ｂ−３ 生後20日のマウスを使用して、実験Ａ−３の方法で得ら
れた新リンホカインIIIの急性毒性試験をしたところ、
新リンホカインIIIの毒性は極めて低く、腹腔内に注射
した時のLD50は、108単位以上であることが判明した。
れた新リンホカインIIIの急性毒性試験をしたところ、
新リンホカインIIIの毒性は極めて低く、腹腔内に注射
した時のLD50は、108単位以上であることが判明した。
以上の実験からも明らかなように、本発明の新リンホカ
インIIIは、インターフェロンと併用して、生体外（in
vitro）のみならず、生体内においても悪性腫瘍の増殖
抑制にきわめて有効であり、その有効用量から見て安定
性は極めて高い。
インIIIは、インターフェロンと併用して、生体外（in
vitro）のみならず、生体内においても悪性腫瘍の増殖
抑制にきわめて有効であり、その有効用量から見て安定
性は極めて高い。
本発明の新リンホカインIIIの成人１日当りの用量は１
〜100,000,000単位であり、好ましくは局所注射および
点眼などの局所適用用量は１〜1,000,000単位、軟膏ま
たは坐剤などの経皮または経粘皮適用の場合10〜50,00
0,000単位、静注および筋注など全身注射の場合10〜10,
000,000単位、経口投与の場合50〜100,000,000単位であ
るが、用法あるいは症状に応じて適宜増減することがで
きる。必要に応じて任意、慣用の製薬用担体、基剤ある
いは賦形剤とともに慣用の方法で医薬用製剤に調製する
ことができる。その使用量は、新リンホカインIIIの毒
性、有効量および安全性を考慮すると医薬用製剤グラム
１単位以上の新リンホカインIIIを含有せしめるのが望
ましい。
〜100,000,000単位であり、好ましくは局所注射および
点眼などの局所適用用量は１〜1,000,000単位、軟膏ま
たは坐剤などの経皮または経粘皮適用の場合10〜50,00
0,000単位、静注および筋注など全身注射の場合10〜10,
000,000単位、経口投与の場合50〜100,000,000単位であ
るが、用法あるいは症状に応じて適宜増減することがで
きる。必要に応じて任意、慣用の製薬用担体、基剤ある
いは賦形剤とともに慣用の方法で医薬用製剤に調製する
ことができる。その使用量は、新リンホカインIIIの毒
性、有効量および安全性を考慮すると医薬用製剤グラム
１単位以上の新リンホカインIIIを含有せしめるのが望
ましい。
新リンホカインIIIを含有する新リンホカインIII感受性
疾患予防剤、若しくは治療剤は、その目的に応じてその
形状を自由に選択できる。
疾患予防剤、若しくは治療剤は、その目的に応じてその
形状を自由に選択できる。
経口投与剤としては、カプセル剤、錠剤、散剤などの腸
溶製剤、直腸内投与剤としては直腸座剤、注射剤として
は、例えば、用時に注射用蒸溜水に溶解して使用する凍
結乾燥注射剤、その他点鼻もしくは点眼、軟膏剤として
用いることもできる。
溶製剤、直腸内投与剤としては直腸座剤、注射剤として
は、例えば、用時に注射用蒸溜水に溶解して使用する凍
結乾燥注射剤、その他点鼻もしくは点眼、軟膏剤として
用いることもできる。
また、新リンホカインIIIとともにインターフェロンを
用いて悪性腫瘍を治療するに際し、例えば、患者の腫瘍
の一部を取り、これを新リンホカインIIIで処理するこ
とによって、その腫瘍の免疫原性を高めた後、腫瘍患者
の体内に戻し、次いで、インターフェロンを投与するな
どの方法により、この悪性腫瘍の治療をよく効果的に行
うこともできる。新リンホカインIIIとともに用いるイ
ンターフェロンとしては、α−インターフェロン、β−
インターフェロン、γ−インターフェロンのいずれでも
よく、また、ヒト由来の細胞が産生した天然型のインタ
ーフェロンであっても、微生物が産生した遺伝子組換型
のインターフェロンであってもよい。また、新リンホカ
インIIIと共に他の各種抗腫瘍剤、例えばツモア ネク
ロシス ファクター、リンホトキシン、インターロイキ
ンなどの他のリンホカイン、β−1,3グルカン、アラビ
ノマンナン、リポポサッカリド、OK-432（ビシバニー
ル）、ＰＳＫ（クレスチン）、レンチナンなどの抗腫瘍
性多糖類、メソトレキサート（ＭＴＸ）、フルオロウラ
シル（５−FU）などの代謝拮抗剤、ドキソルビシン（Ａ
ＤＭ）、マイトマイシンＣ(MMC)などの抗生物質などと
併用することも有利に実施できる。
用いて悪性腫瘍を治療するに際し、例えば、患者の腫瘍
の一部を取り、これを新リンホカインIIIで処理するこ
とによって、その腫瘍の免疫原性を高めた後、腫瘍患者
の体内に戻し、次いで、インターフェロンを投与するな
どの方法により、この悪性腫瘍の治療をよく効果的に行
うこともできる。新リンホカインIIIとともに用いるイ
ンターフェロンとしては、α−インターフェロン、β−
インターフェロン、γ−インターフェロンのいずれでも
よく、また、ヒト由来の細胞が産生した天然型のインタ
ーフェロンであっても、微生物が産生した遺伝子組換型
のインターフェロンであってもよい。また、新リンホカ
インIIIと共に他の各種抗腫瘍剤、例えばツモア ネク
ロシス ファクター、リンホトキシン、インターロイキ
ンなどの他のリンホカイン、β−1,3グルカン、アラビ
ノマンナン、リポポサッカリド、OK-432（ビシバニー
ル）、ＰＳＫ（クレスチン）、レンチナンなどの抗腫瘍
性多糖類、メソトレキサート（ＭＴＸ）、フルオロウラ
シル（５−FU）などの代謝拮抗剤、ドキソルビシン（Ａ
ＤＭ）、マイトマイシンＣ(MMC)などの抗生物質などと
併用することも有利に実施できる。
以下、実施例Ａで本発明における新リンホカインIIIの
製造例を、また参考例で本発明の新リンホカインIIIの
用途例を述べる。
製造例を、また参考例で本発明の新リンホカインIIIの
用途例を述べる。
実施例Ａ−１ ヒト由来のリンパ芽球様細胞BALL-1細胞牛胎児血清を20
％補足したEagleの最少基本培地（pH7.4）に接種し、37
℃で常法に従い生体外（in vitro）に浮遊培養した。得
られた細胞を血清無添加のEagleの最少基本培地（pH7.
4）で洗浄し、同培地に約１×107／mlになるように懸濁
した。この懸濁液にセンダイウィルスをml当り約1,000
赤血球凝集価添加し、38℃で１日保って新リンホカイン
IIIを誘導生成させた。これを４℃、約1,000ｇで遠心分
離し、得られた上清をpH7.2、0.01Ｍリン酸塩緩衝液を
含有する生理食塩水で15時間透析し、更に精密濾過して
得た濾液を実験Ａ−１と同様に抗インターフェロン抗体
のカラムに流し、その非吸着画分を、実験Ａ−３で述べ
た方法でモノクローナル抗体のゲルカラムを用いてアフ
ィニティクロマトグラフィーにより精製し、濃縮して比
活性約107単位／mg蛋白質を有する新リンホカインIIIの
濃縮液を得た。
％補足したEagleの最少基本培地（pH7.4）に接種し、37
℃で常法に従い生体外（in vitro）に浮遊培養した。得
られた細胞を血清無添加のEagleの最少基本培地（pH7.
4）で洗浄し、同培地に約１×107／mlになるように懸濁
した。この懸濁液にセンダイウィルスをml当り約1,000
赤血球凝集価添加し、38℃で１日保って新リンホカイン
IIIを誘導生成させた。これを４℃、約1,000ｇで遠心分
離し、得られた上清をpH7.2、0.01Ｍリン酸塩緩衝液を
含有する生理食塩水で15時間透析し、更に精密濾過して
得た濾液を実験Ａ−１と同様に抗インターフェロン抗体
のカラムに流し、その非吸着画分を、実験Ａ−３で述べ
た方法でモノクローナル抗体のゲルカラムを用いてアフ
ィニティクロマトグラフィーにより精製し、濃縮して比
活性約107単位／mg蛋白質を有する新リンホカインIIIの
濃縮液を得た。
活性収率は、誘導生成時の懸濁液１当り約20,000単位
であった。
であった。
実施例Ａ−２ 新生児のハムスターに、ウサギから公知の方法で調製し
た抗血清を注射してハムスターの免疫反応を弱めた後、
その皮下に培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞
BALL-1細胞を移植し、その後通常の方法で３週間飼育し
た。皮下に生じた約15ｇの腫瘤を摘出し細切し、生理食
塩水中で分散させほぐした。得られた細胞を血清無添加
のRPMI 1640培地（pH7.2）で洗浄し、同培地に約５×10
6／mlに懸濁した。この懸濁液に、センダイウィルスをm
l当り約1,000赤血球凝集価及びE.coli由来のエンドトキ
シンをml当り約10μｇを添加し、37℃で１日間保って新
リンホカインIIIを誘剤生成させた。これを約４℃、約
1,000ｇで遠心分離し、沈澱物を除去し、得られた上清
をpH7.2、0.01Ｍリン酸塩緩衝液を含有する生理食塩水
で21時間透析し、更に精密濾過して得た濾液を、実施例
Ａ−１と同様に抗体カラムを用いて精製し、得られる溶
液を濃縮し、凍結乾燥して比活性約107単位／mg蛋白質
を有する新リンホカインIIIの粉末を得た。
た抗血清を注射してハムスターの免疫反応を弱めた後、
その皮下に培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞
BALL-1細胞を移植し、その後通常の方法で３週間飼育し
た。皮下に生じた約15ｇの腫瘤を摘出し細切し、生理食
塩水中で分散させほぐした。得られた細胞を血清無添加
のRPMI 1640培地（pH7.2）で洗浄し、同培地に約５×10
6／mlに懸濁した。この懸濁液に、センダイウィルスをm
l当り約1,000赤血球凝集価及びE.coli由来のエンドトキ
シンをml当り約10μｇを添加し、37℃で１日間保って新
リンホカインIIIを誘剤生成させた。これを約４℃、約
1,000ｇで遠心分離し、沈澱物を除去し、得られた上清
をpH7.2、0.01Ｍリン酸塩緩衝液を含有する生理食塩水
で21時間透析し、更に精密濾過して得た濾液を、実施例
Ａ−１と同様に抗体カラムを用いて精製し、得られる溶
液を濃縮し、凍結乾燥して比活性約107単位／mg蛋白質
を有する新リンホカインIIIの粉末を得た。
活性収率は、約1,500,000単位であった。
実施例Ａ−３ 成長したヌードマウスの腹腔内に、培養株化されたヒト
由来のリンパ芽球様細胞TALL-1細胞の移植後、通常の方
法で５週間飼育した。この腹腔内へ、約3,000赤血球凝
集価のニューカッスル病ウィルスを紫外線によって予め
ほとんど失活させて注入し、24時間後に屠殺して腹水を
採取した。以後、実施例Ａ−２と同様に精製し濃縮乾燥
して新リンホカインIIIの粉末を得た。
由来のリンパ芽球様細胞TALL-1細胞の移植後、通常の方
法で５週間飼育した。この腹腔内へ、約3,000赤血球凝
集価のニューカッスル病ウィルスを紫外線によって予め
ほとんど失活させて注入し、24時間後に屠殺して腹水を
採取した。以後、実施例Ａ−２と同様に精製し濃縮乾燥
して新リンホカインIIIの粉末を得た。
活性収率は、ヌードマウス１匹当り約300,000単位であ
った。
った。
実施例Ａ−４ 成長した普通マウスに約400レムのエックス線を予め照
射してマウスの免疫能を弱めた後、そのマウスの皮下に
培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞Mono-1細胞
を移植し、その後通常の方法で３週間飼育した。皮下に
生じた約10ｇの腫瘤を摘出した後、実施例Ａ−２と同様
にして細胞を分散させた。この細胞を実施例Ａ−２と同
様に懸濁した後、この懸濁液に、センダイウィルスをml
当り約500赤血球凝集価及びコンカナバリンＡをml当り
0.8μｇを添加し、37℃で１日間保って新リンホカインI
IIを誘導生成させた。以後、実施例Ａ−２と同様に精
製、濃縮、乾燥して新リンホカインIIIの粉末を得た。
射してマウスの免疫能を弱めた後、そのマウスの皮下に
培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞Mono-1細胞
を移植し、その後通常の方法で３週間飼育した。皮下に
生じた約10ｇの腫瘤を摘出した後、実施例Ａ−２と同様
にして細胞を分散させた。この細胞を実施例Ａ−２と同
様に懸濁した後、この懸濁液に、センダイウィルスをml
当り約500赤血球凝集価及びコンカナバリンＡをml当り
0.8μｇを添加し、37℃で１日間保って新リンホカインI
IIを誘導生成させた。以後、実施例Ａ−２と同様に精
製、濃縮、乾燥して新リンホカインIIIの粉末を得た。
活性収率は、マウス１匹当り1,000,000単位であった。
実施例Ａ−５ 新生児のハムスターに実施例Ａ−２と同様にして培養株
化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞Namalva細胞を移
植し、その後通常の方法で４週間飼育した。皮下に生じ
た約20ｇの腫瘤を実施例Ａ−２と同様にほぐして約３×
106／mlの細胞懸濁液を得た。本懸濁液にセンダイウィ
ルスをml当り約1,000赤血球凝集価を添加し36℃で２日
間保って新リンホカインIIIを誘導生成させ、次いで実
施例Ａ−１と同様に精製濃縮して新リンホカインIIIの
濃縮液を得た。
化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞Namalva細胞を移
植し、その後通常の方法で４週間飼育した。皮下に生じ
た約20ｇの腫瘤を実施例Ａ−２と同様にほぐして約３×
106／mlの細胞懸濁液を得た。本懸濁液にセンダイウィ
ルスをml当り約1,000赤血球凝集価を添加し36℃で２日
間保って新リンホカインIIIを誘導生成させ、次いで実
施例Ａ−１と同様に精製濃縮して新リンホカインIIIの
濃縮液を得た。
活性収率は、ハムスター１匹当り約1,300,000単位であ
った。
った。
実施例Ａ−６ 孔径0.5ミクロンのメンブランフィルターを設けた内容
量約10mlのプラスチック製円筒型拡散チャンバー内に、
培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞NALL-1細胞
を生理食塩水で浮遊させ、これを成長したラットの腹腔
内に埋設した。このラットを通常の方法で４週間飼育し
た後、この拡散チャンバーを取り出した。これにより得
られたヒト由来の細胞の濃度は約５×108／mlであっ
て、生体外の栄養培地に炭酸ガスインキュベーター中で
増殖させる場合の約102倍以上にも達することがわかっ
た。この細胞を実施例Ａ−２と同様に懸濁し、この懸濁
液に、ml当り約500赤血球凝集価のニューカッスル病ウ
ィルスを紫外線で予めほとんど失活させて加え、さらに
フィトヘマグルチニンをml当り約50μｇ加え37℃で１日
間保って新リンホカインIIIを誘導生成させた。以後、
実施例Ａ−２と同様に精製し、濃縮、乾燥して新リンホ
カインIIIの粉末を得た。
量約10mlのプラスチック製円筒型拡散チャンバー内に、
培養株化されたヒト由来のリンパ芽球様細胞NALL-1細胞
を生理食塩水で浮遊させ、これを成長したラットの腹腔
内に埋設した。このラットを通常の方法で４週間飼育し
た後、この拡散チャンバーを取り出した。これにより得
られたヒト由来の細胞の濃度は約５×108／mlであっ
て、生体外の栄養培地に炭酸ガスインキュベーター中で
増殖させる場合の約102倍以上にも達することがわかっ
た。この細胞を実施例Ａ−２と同様に懸濁し、この懸濁
液に、ml当り約500赤血球凝集価のニューカッスル病ウ
ィルスを紫外線で予めほとんど失活させて加え、さらに
フィトヘマグルチニンをml当り約50μｇ加え37℃で１日
間保って新リンホカインIIIを誘導生成させた。以後、
実施例Ａ−２と同様に精製し、濃縮、乾燥して新リンホ
カインIIIの粉末を得た。
活性収率は、ラット１匹当り約400,000単位であった。
実施例Ａ−７ 37℃で５日間保ったニワトリの受精卵に、ヒト由来の株
化細胞CCRF-CEM細胞を移植した後、37℃で１週間保っ
た。この卵を割卵した後、増殖細胞を採取した。この細
胞を実施例Ａ−１と同様に５×106／mlに懸濁した。こ
の懸濁液にml当り約500赤血球凝集価のセンダイウィル
スを添加し、37℃で１日間保って新リンホカインIIIを
誘導生成させ、次いで実施例Ａ−２と同様に精製し、濃
縮乾燥して新リンホカインIIIの粉末を得た。
化細胞CCRF-CEM細胞を移植した後、37℃で１週間保っ
た。この卵を割卵した後、増殖細胞を採取した。この細
胞を実施例Ａ−１と同様に５×106／mlに懸濁した。こ
の懸濁液にml当り約500赤血球凝集価のセンダイウィル
スを添加し、37℃で１日間保って新リンホカインIIIを
誘導生成させ、次いで実施例Ａ−２と同様に精製し、濃
縮乾燥して新リンホカインIIIの粉末を得た。
活性収率は、受精卵10個当り約50,000単位であった。
参考例１ 注 射 液 実施例Ａ−２の方法で調製した新リンホカインIII500,0
00単位を200mlの生理食塩水に溶解し、メンブランフィ
ルターを用いて無菌的に濾過する。濾液を滅菌したガラ
ス容器に２mlずつ充填して凍結乾燥し、これを密栓し
て、凍結乾燥粉末製剤とする。
00単位を200mlの生理食塩水に溶解し、メンブランフィ
ルターを用いて無菌的に濾過する。濾液を滅菌したガラ
ス容器に２mlずつ充填して凍結乾燥し、これを密栓し
て、凍結乾燥粉末製剤とする。
本品は、ヒトα−インターフェロン注射剤、ヒトβ−イ
ンターフェロン注射剤などとともに用いることにより乳
癌、肺癌、肝癌、白血病などの治療に好適である。
ンターフェロン注射剤などとともに用いることにより乳
癌、肺癌、肝癌、白血病などの治療に好適である。
参考例２ 注 射 剤 参考例１の注射剤の製造において、新リンホカインIII2
00,000単位と共に、リンパ芽球様細胞由来のヒトα−イ
ンターフェロン300,000,000単位を生理食塩水200mlに溶
解したほかは、参考例１と同様に製造して凍結乾燥粉末
製剤を得た。
00,000単位と共に、リンパ芽球様細胞由来のヒトα−イ
ンターフェロン300,000,000単位を生理食塩水200mlに溶
解したほかは、参考例１と同様に製造して凍結乾燥粉末
製剤を得た。
本品は、乳癌、肺癌、肝癌、胃癌、白血病などの治療に
好適である。
好適である。
参考例３ 軟 膏 剤 実施例Ａ−３の方法で調製した新リンホカインIIIおよ
びヒトα−インターフェロンを常法に従い少量の流動パ
ラフィンに研和した後、ワセリンを加えｇ当りそれぞれ
1,000単位、100,000単位含有する軟膏薬とした。
びヒトα−インターフェロンを常法に従い少量の流動パ
ラフィンに研和した後、ワセリンを加えｇ当りそれぞれ
1,000単位、100,000単位含有する軟膏薬とした。
本品は、皮膚癌、乳癌、リンパ腫などの治療に好適であ
る。
る。
参考例４ 点 眼 剤 蒸溜水800mlに、β−フェニルエチルアルコール５ml、
実施例Ａ−４の方法で調製した新リンホカインIII100,0
00単位、ヒトα−インターフェロン10,000,000単位およ
び食塩を加な等張化するよう蒸溜水で1,000mlとし点眼
剤とした。
実施例Ａ−４の方法で調製した新リンホカインIII100,0
00単位、ヒトα−インターフェロン10,000,000単位およ
び食塩を加な等張化するよう蒸溜水で1,000mlとし点眼
剤とした。
本品は、網膜芽細胞腫などの治療に好適である。
参考例５ 腸溶性錠剤 実施例Ａ−７の方法で調製した新リンホカインIIIを常
法に従って澱粉とマルトースとを混合使用して打錠する
に際し、新リンホカインIIIを製品１錠（100mg）当り20
0,000単位になるように含有せしめて錠剤を製造し、こ
れにメチルセルロースフタレートをコーティグして腸溶
性錠剤とした。
法に従って澱粉とマルトースとを混合使用して打錠する
に際し、新リンホカインIIIを製品１錠（100mg）当り20
0,000単位になるように含有せしめて錠剤を製造し、こ
れにメチルセルロースフタレートをコーティグして腸溶
性錠剤とした。
本品は、ヒトα−インターフェロンまたはヒトγ−イン
ターフェロンを含有する各種投与経路の薬剤などと併用
して大腸癌、結腸癌、肝癌などの治療に好適である。
ターフェロンを含有する各種投与経路の薬剤などと併用
して大腸癌、結腸癌、肝癌などの治療に好適である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 15/06 Ｃ１２Ｐ 21/08 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (4)
- 【請求項１】理化学的性質が、 分 子 量 １５，０００±２，０００ 等 電 点 ｐＩ＝４．５±０．５ 易 動 度 Disc-PAGEで、Rf＝０．７３±０．０５ 紫外線吸収スペクトル ２８０ｎｍ付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶 エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに離溶
乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示す ＫＢ細胞に対する細胞増殖抑制活性、Ｌ929細胞に
対する細胞障害活性、インターロイキン活性およびイン
ターフェロン活性を実質的にいずれも示さず、ヒトα−
インターフェロン共存下でＫＢ細胞に対して細胞増殖抑
制活性を示す 水溶液での活性安定性 ｐＨ７．２で３０分間保持する条件により６０℃まで安
定、４℃で１６時間保持する条件によりｐＨ２．０乃至
１１．０の範囲で安定 −１０℃での凍結貯蔵で１カ月以上安定である新リ
ンホカインIII。 - 【請求項２】下記の理化学的性質を有する新リンホカイ
ンIII産生能を有するヒト由来の細胞に誘導剤を作用さ
せて生成した理化学的性質が、 分 子 量 １５，０００±２，０００ 等 電 点 ｐＩ＝４．５±０．５ 易 動 度 Disc-PAGEで、Rf＝０．７３±０．０５ 紫外線吸収スペクトル ２８０ｎｍ付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶 エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに離溶
乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示す ＫＢ細胞に対する細胞増殖抑制活性、Ｌ929細胞に
対する細胞障害活性、インターロイキン活性およびイン
ターフェロン活性を実質的にいずれも示さず、ヒトα−
インターフェロン共存下でＫＢ細胞に対して細胞増殖抑
制活性を示す 水溶液での活性安定性 ｐＨ７．２で３０分間保持する条件により６０℃まで安
定、４℃で１６時間保持する条件によりｐＨ２．０乃至
１１．０の範囲で安定 −１０℃での凍結貯蔵で１カ月以上安定である新リ
ンホカインIIIの製造方法。 - 【請求項３】ヒト由来の細胞が、ヒト以外の温血動物体
内に移植され増殖するか、またはその温血動物の体液の
供給を受けながら増殖して得られる細胞であることを特
徴とする特許請求の範囲第（２）項記載の新リンホカイ
ンIIIの製造方法。 - 【請求項４】理化学的性質が、 分 子 量 １５，０００±２，０００ 等 電 点 ｐＩ＝４．５±０．５ 易 動 度 Disc-PAGEで、Rf＝０．７３±０．０５ 紫外線吸収スペクトル ２８０ｎｍ付近に最大吸収 溶剤に対する溶解性 水、生理食塩水またはリン酸塩緩衝液に可溶 エチルエーテル、酢酸エチルまたはクロロホルムに離溶
乃至不溶 呈色反応 ローリー法またはミクロビューレット法で蛋白質陽性反
応を示し、フェノール硫酸法またはアントロン硫酸法で
糖質陽性反応を示す ＫＢ細胞に対する細胞増殖抑制活性、Ｌ929細胞に
対する細胞障害活性、インターロイキン活性およびイン
ターフェロン活性を実質的にいずれも示さず、ヒトα−
インターフェロン共存下でＫＢ細胞に対して細胞増殖抑
制活性を示す 水溶液での活性安定性 ｐＨ７．２で３０分間保持する条件により６０℃まで安
定、４℃で１６時間保持する条件によりｐＨ２．０乃至
１１．０の範囲で安定 −１０℃での凍結貯蔵で１カ月以上安定である新リ
ンホカインIIIを、これに特異性を示すモノクローナル
抗体を用いて精製し、採取することを特徴とした特許請
求の範囲第（２）項または第（３）項記載の新リンホカ
インIIIの製造方法。
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