JPS6197224A - 新規なリンホカイン - Google Patents
新規なリンホカインInfo
- Publication number
- JPS6197224A JPS6197224A JP59218643A JP21864384A JPS6197224A JP S6197224 A JPS6197224 A JP S6197224A JP 59218643 A JP59218643 A JP 59218643A JP 21864384 A JP21864384 A JP 21864384A JP S6197224 A JPS6197224 A JP S6197224A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- activity
- human
- cell
- cells
- natural killer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Nitrogen And Oxygen Or Sulfur-Condensed Heterocyclic Ring Systems (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はヒトＴ細胞ないしはヒトＴ細胞ハイブリドーマ
が産生じ、新規薯ζ見出されたリンホカインｌζ間する
。
が産生じ、新規薯ζ見出されたリンホカインｌζ間する
。
リンホカインとは、抗原あるいはマイトゲンによって活
性化されたリンパ球より放出される種々の生物学的活性
を有する非抗体性可溶性物質の総称である。リンホカイ
ンは、狭義には、活性化Ｔ細胞から産生され細胞性免疫
の一次的媒体として ゛作用するものを指すが、そ
のほかに免疫応答における細胞間相互作用に関与する一
群の因子があり。
性化されたリンパ球より放出される種々の生物学的活性
を有する非抗体性可溶性物質の総称である。リンホカイ
ンは、狭義には、活性化Ｔ細胞から産生され細胞性免疫
の一次的媒体として ゛作用するものを指すが、そ
のほかに免疫応答における細胞間相互作用に関与する一
群の因子があり。
今日では両者を含めてリンホカインと呼ばれることが多
い。前者には、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）
、マクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）、リンホトキシ
ン、（ＬＴ）などが、後者には抗体産生の抑制因子、ヘ
ルパー因子、Ｔ細胞増殖因子（ＩＬ−２）などが含まれ
る。
い。前者には、マクロファージ遊走阻止因子（ＭＩＦ）
、マクロファージ活性化因子（ＭＡＦ）、リンホトキシ
ン、（ＬＴ）などが、後者には抗体産生の抑制因子、ヘ
ルパー因子、Ｔ細胞増殖因子（ＩＬ−２）などが含まれ
る。
リンホカインは通常のリンパ球培養上清中からはきわめ
て限られた量＃よび純度でしか得られず。
て限られた量＃よび純度でしか得られず。
そのため多くのリンホカインはその役割について確定的
な結果が得られていない。しかしながら。
な結果が得られていない。しかしながら。
リンホカインの中には大量に得られるなら臨床応用の可
能性をもつものがあるため、数多（の研究者がリンホカ
インを産生ずるＴ腫瘍味の検索、Ｔ細胞ハイブリドーマ
の樹立に携わってきている。
能性をもつものがあるため、数多（の研究者がリンホカ
インを産生ずるＴ腫瘍味の検索、Ｔ細胞ハイブリドーマ
の樹立に携わってきている。
その結果１例えば、ＩＬ−２に関してはそれを産生ずる
ヒトＴ腫瘍味（Ｊｕｒｋａｔ−ＦＨＣＲＣ）の発見。
ヒトＴ腫瘍味（Ｊｕｒｋａｔ−ＦＨＣＲＣ）の発見。
モノクローナル抗ＩＬ−２抗体の作成とそれを用いたＴ
細胞増殖、アロキラーＴ細胞分化誘導におけるＩＬ−２
（７）役割の確定、ｍＲＮＡとｃＤＮＡの分離同定がす
でに終了しようとしている。これはインターフェロンと
同様の研究方向であり、このようにして遺伝子工学の助
けを借りて大量かつ純粋基ζ得られたリンホカインを用
いることにより、臨床応用はもとよりその構造と機能の
関係２作用機構の解析、 １８σｉ＃Ｏでの役割の確
定が順次可能となることが十分に予想される。
細胞増殖、アロキラーＴ細胞分化誘導におけるＩＬ−２
（７）役割の確定、ｍＲＮＡとｃＤＮＡの分離同定がす
でに終了しようとしている。これはインターフェロンと
同様の研究方向であり、このようにして遺伝子工学の助
けを借りて大量かつ純粋基ζ得られたリンホカインを用
いることにより、臨床応用はもとよりその構造と機能の
関係２作用機構の解析、 １８σｉ＃Ｏでの役割の確
定が順次可能となることが十分に予想される。
さて、ある種の癌細胞に対して破壊的に作用する細胞と
してナチュラルキラー細胞の存在が知られており、当該
細胞の活性に影響のあるリンホカインに関心が寄せられ
ている。例えばインターロイキン−２詔よびインターフ
ェロンはナチュラルキラー細胞の活性の増大を誘導する
ことが示されている。またナチュラルキラー細胞から癌
細胞に対して毒性のある因子が産生され、これがナチュ
ラルキラー細胞の活性を発揮している可能性が大きいと
いうことが提示されており、そしてこの因子が実はリン
ホトキシンの成る形態であるかもしれないということが
示されている。他方、ヒトリンパ球と癌細胞とを接触せ
しめるとリンパ球の細胞毒性を強化する因子が遊離され
てきて、この因子が一種のリンホトキシンであると考え
られた。
してナチュラルキラー細胞の存在が知られており、当該
細胞の活性に影響のあるリンホカインに関心が寄せられ
ている。例えばインターロイキン−２詔よびインターフ
ェロンはナチュラルキラー細胞の活性の増大を誘導する
ことが示されている。またナチュラルキラー細胞から癌
細胞に対して毒性のある因子が産生され、これがナチュ
ラルキラー細胞の活性を発揮している可能性が大きいと
いうことが提示されており、そしてこの因子が実はリン
ホトキシンの成る形態であるかもしれないということが
示されている。他方、ヒトリンパ球と癌細胞とを接触せ
しめるとリンパ球の細胞毒性を強化する因子が遊離され
てきて、この因子が一種のリンホトキシンであると考え
られた。
さらにまたリンホトキシンは癌細胞のナチュラルキラー
細胞に対する感受性を高めることも報告されている。こ
れらの結果を総合するとナチュラルキラー細胞の活性に
影響のあるリンホカインとしてりンホトキシンが直接的
にも間接的にも重要な役割を演じている可能性があるこ
とが示唆されるのである。
細胞に対する感受性を高めることも報告されている。こ
れらの結果を総合するとナチュラルキラー細胞の活性に
影響のあるリンホカインとしてりンホトキシンが直接的
にも間接的にも重要な役割を演じている可能性があるこ
とが示唆されるのである。
ナチュラルキラー細胞およびリンホトキシンについての
以上の知見をさらに詳細に説明するための資料として下
記文献１）〜８）を列挙する。
以上の知見をさらに詳細に説明するための資料として下
記文献１）〜８）を列挙する。
１） Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ、 Ｒ，Ｂ、、 Ｄｊｅｕ、
Ｊ、Ｙ、 、 Ｋａｙ、 Ｈ，Ｄ、。
Ｊ、Ｙ、 、 Ｋａｙ、 Ｈ，Ｄ、。
０ｒｔａｌｄｏ、 Ｊ、 Ｒ，、Ｒｉｃｃａｒｄｉ 、
Ｃ，、Ｂｏｎｎａｒｄ、 Ｇ、 Ｄ、 、 Ｈｏ１−
ｄｅｎ、 Ｈ，Ｔ、 、 Ｆａｇｎａｎｉ 、 Ｒ，、
５ａｎｔｏｎｉ 、 Ａ、 ａｎｄ Ｐｕｃｃｅｔ−ｔ
ｉ、Ｐ、 、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｒｅｖ、 １９７９
．４４： ４３゜２） Ｖｏｊｅ、 Ｂ、 Ｍ、 、
Ｒｉｃｃａｒｄｉ、 Ｃ，、Ｂｏｎｎａｒｄ、Ｇ、 Ｄ
。
Ｃ，、Ｂｏｎｎａｒｄ、 Ｇ、 Ｄ、 、 Ｈｏ１−
ｄｅｎ、 Ｈ，Ｔ、 、 Ｆａｇｎａｎｉ 、 Ｒ，、
５ａｎｔｏｎｉ 、 Ａ、 ａｎｄ Ｐｕｃｃｅｔ−ｔ
ｉ、Ｐ、 、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｒｅｖ、 １９７９
．４４： ４３゜２） Ｖｏｊｅ、 Ｂ、 Ｍ、 、
Ｒｉｃｃａｒｄｉ、 Ｃ，、Ｂｏｎｎａｒｄ、Ｇ、 Ｄ
。
ａｎｄ Ｈｅｒｂｅｒｍａｎ、 Ｒ，Ｂ、、 Ｊ、 Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ 、 １９８３．１３０ニア６８゜ ３） Ｄｏｍｚｉｇ、児、 ５ｔａｄｌｅｒ、 Ｂ、
Ｍ、 ａｎｄ Ｈｅｒｂｅｒ−ｍａｎ、Ｒ，Ｂ、、 Ｊ
、Ｔｍｍｕｒｒｏｌ、 １９８３．１３０： １９７０
゜４） Ｗｒｉｇｈｔ、Ｓ、 Ｃ，、Ｗｅｉｔｚｅｕ、
Ｍ、 Ｌ、、 Ｋａｈｌｅ、 Ｒ，。
ｍｍｕｎｏｌ 、 １９８３．１３０ニア６８゜ ３） Ｄｏｍｚｉｇ、児、 ５ｔａｄｌｅｒ、 Ｂ、
Ｍ、 ａｎｄ Ｈｅｒｂｅｒ−ｍａｎ、Ｒ，Ｂ、、 Ｊ
、Ｔｍｍｕｒｒｏｌ、 １９８３．１３０： １９７０
゜４） Ｗｒｉｇｈｔ、Ｓ、 Ｃ，、Ｗｅｉｔｚｅｕ、
Ｍ、 Ｌ、、 Ｋａｈｌｅ、 Ｒ，。
Ｇｒａｎｇｅｒ、 Ｇ、 Ａ、 ａｎｄ Ｂｏｎａｖｉ
ｄａ、 Ｂ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
ｄａ、 Ｂ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
１９８３、１３０： ２４７９．
５） Ｋｅｄａｒ、 Ｅ、、 Ｉｋｅｊｉｒｉ、 Ｂ、
Ｌ、、 ５ｒｅｄｎｉ、 Ｂ、。
Ｌ、、 ５ｒｅｄｎｉ、 Ｂ、。
Ｂｏｎａｖｉｄａ、 Ｂ、 ａｎｄ Ｈｅｒｂｅｒｍａ
ｎ、 Ｒ，Ｂ、 、 Ｇｅ１１．Ｉｍｍ−ｕｎｏｌ、１
９８２．６９： ３０５゜５） Ｗｅｉｔｚｅｎ、
Ｍ、 Ｌ、 、 Ｙａｍａｍｏｔｏ 、 Ｒ、Ｓ、 ａ
ｎｄＧｒａｎｇｅｒ、Ｇ、 Ａ、、 Ｃｅ１１． Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ 、 １９８３．７７： ３０゜７） Ｐ
ｅｔｅｒ、Ｈ，Ｈ，、Ｅｉｆｅ、 Ｒ，Ｆ、 ａｎｄ
Ｋａｌｄｅｕ、 Ｊ。
ｎ、 Ｒ，Ｂ、 、 Ｇｅ１１．Ｉｍｍ−ｕｎｏｌ、１
９８２．６９： ３０５゜５） Ｗｅｉｔｚｅｎ、
Ｍ、 Ｌ、 、 Ｙａｍａｍｏｔｏ 、 Ｒ、Ｓ、 ａ
ｎｄＧｒａｎｇｅｒ、Ｇ、 Ａ、、 Ｃｅ１１． Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ 、 １９８３．７７： ３０゜７） Ｐ
ｅｔｅｒ、Ｈ，Ｈ，、Ｅｉｆｅ、 Ｒ，Ｆ、 ａｎｄ
Ｋａｌｄｅｕ、 Ｊ。
Ｒ，、Ｊ、ｒｍｍｕｎｏｌ、１９７６．１１６： ３４
２゜８） Ｒａｎｓｏｍ、 Ｊ、 Ｈ，ａｎｄ Ｅｖ
ａｎｓ、 Ｃ，Ｈ＋、 Ｉｎｔ、 Ｊ。
２゜８） Ｒａｎｓｏｍ、 Ｊ、 Ｈ，ａｎｄ Ｅｖ
ａｎｓ、 Ｃ，Ｈ＋、 Ｉｎｔ、 Ｊ。
Ｃａｎｃｅｒ １９８２．２９： ４５１゜上記した
状況にかんがみ本発明者はナチュラルキラー細胞を活性
化するリンホカインの存在を想定して種々の検討をおこ
なった。すなわち９本発明者は下記文献９）〜１１）に
示されるとと（リンホカイン産生ヒトＴ細胞ハイブリド
ーマについて数種のセルラインを樹立し、ＭＩＦ（マク
ロファージ遊走阻止因子）、ＭＡＦ（マクロファージ活
性化因子）等のリンホカインの存在を明らか番こしてき
たが、これらに詔けるとは異なる特別の処理を施すこと
によってナチニラルキラー細胞活性化因子産生ｈ）７細
胞ハイブリドーマを特別に取得することを試みた。その
結果、ヒトＴ細胞をスカシ貝ヘモシアニンによって処理
し、これを出発細胞としてヒトＴ細胞ハイブリドーマを
取得すれば。
状況にかんがみ本発明者はナチュラルキラー細胞を活性
化するリンホカインの存在を想定して種々の検討をおこ
なった。すなわち９本発明者は下記文献９）〜１１）に
示されるとと（リンホカイン産生ヒトＴ細胞ハイブリド
ーマについて数種のセルラインを樹立し、ＭＩＦ（マク
ロファージ遊走阻止因子）、ＭＡＦ（マクロファージ活
性化因子）等のリンホカインの存在を明らか番こしてき
たが、これらに詔けるとは異なる特別の処理を施すこと
によってナチニラルキラー細胞活性化因子産生ｈ）７細
胞ハイブリドーマを特別に取得することを試みた。その
結果、ヒトＴ細胞をスカシ貝ヘモシアニンによって処理
し、これを出発細胞としてヒトＴ細胞ハイブリドーマを
取得すれば。
当該ハイブリドーマはナチュラルキラー細胞活性化因子
を産生ずるものであることを知り９本発明を完成するに
至った。
を産生ずるものであることを知り９本発明を完成するに
至った。
以上より明らかなごとく本発明の目的は新規なナチュラ
ルキラー細胞活性化因子の提供であり。
ルキラー細胞活性化因子の提供であり。
本発明は該目的の達成のためにスカシ貝ヘモシアニンで
処理したヒトＴ細胞を出発細胞とするヒトＴ細胞ハイプ
リビー１番ζよって産生され、下記の理化学的性質を有
するりンホカ゛インを開示する。
処理したヒトＴ細胞を出発細胞とするヒトＴ細胞ハイプ
リビー１番ζよって産生され、下記の理化学的性質を有
するりンホカ゛インを開示する。
（１）分子量 約１５．０００および３０，０００（１
１）酸性領域で化学的に不安定であるｒｕｎ）ナチュラ
ルキラー細胞活性化活性を有するＱＶ） インターロ
イキン−２活性を示さない（Ｖ） インターフェロン
活性を示さないｊ・ ホカイン産生ヒトＴ細胞
ハイブリドーマ６ζ関するものであり１本発明の参考の
ために列挙する。
１）酸性領域で化学的に不安定であるｒｕｎ）ナチュラ
ルキラー細胞活性化活性を有するＱＶ） インターロ
イキン−２活性を示さない（Ｖ） インターフェロン
活性を示さないｊ・ ホカイン産生ヒトＴ細胞
ハイブリドーマ６ζ関するものであり１本発明の参考の
ために列挙する。
９ ） Ｋｏｂａｙａｓｈｉ 、 Ｙ、 、 Ａａａｄ
ａ 、 Ｍ、、、Ｈｉｇｕｃｈｉ、 Ｍ、 ａｎｄＯｓ
ａｗａ、 Ｔ、、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １９８２．
１２８： ２７１４゜ＩＱ） Ａｓａｄａ、 Ｍ、 、
Ｈｉｇｕｃｈｉ、 Ｍ、 、 Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、
Ｙ。
ａ 、 Ｍ、、、Ｈｉｇｕｃｈｉ、 Ｍ、 ａｎｄＯｓ
ａｗａ、 Ｔ、、 Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、 １９８２．
１２８： ２７１４゜ＩＱ） Ａｓａｄａ、 Ｍ、 、
Ｈｉｇｕｃｈｉ、 Ｍ、 、 Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、
Ｙ。
ａｎｄ Ｏｓａｗａ、 Ｔ、、 Ｃｅ１１． Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、 １９８３．７７：１５０゜ １１） Ｈｉｇｕｃｈｉ、 Ｍ、、 Ａｓａｄａ、 Ｍ
、、 Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、 Ｙ。
ｎｏｌ、 １９８３．７７：１５０゜ １１） Ｈｉｇｕｃｈｉ、 Ｍ、、 Ａｓａｄａ、 Ｍ
、、 Ｋｏｂａｙａｓｈｉ、 Ｙ。
ａｎｄ Ｏｓａｗａ、 Ｔ、、 Ｃｅ１１．Ｉｍｍｕｎ
ｏｌ、 １９８３．７８：２５７゜ 発明の構成 以下に本発明の詳細な説明する。
ｏｌ、 １９８３．７８：２５７゜ 発明の構成 以下に本発明の詳細な説明する。
本発明のヒトＴ細胞はヒト末梢血リンパ球あるいは肺臓
または胸腺より分離したリンパ球であり。
または胸腺より分離したリンパ球であり。
通常は末梢血リンパ球が使用される。ただし単核細胞の
リンパ球のみが使用され、さらに使用にあたっては、ロ
ゼツトを形成するもの（ロゼツト形成細胞）およびプラ
スチックへの耐着性をもつたもの（耐着性細胞）が選択
され、用意される。
リンパ球のみが使用され、さらに使用にあたっては、ロ
ゼツトを形成するもの（ロゼツト形成細胞）およびプラ
スチックへの耐着性をもつたもの（耐着性細胞）が選択
され、用意される。
本発明の特徴はヒトＴ細胞がスカシ貝ヘモシアニンによ
って処理される点にある。スカシ貝ヘモシアニンはマイ
ト−ジエンの一種であり、 Ｋｅｙｈｏ−１ｅ ｌｉｍ
ｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨと略記）の名称
をもってＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｃｏ
、、ＣＡより入手することができる。スカシ貝ヘモシア
ニンでヒトＴ細胞を処理するとは９例えば適当な培地中
で前記ロゼツト形成細胞と耐着細胞の混合物をスカシ貝
ヘモシアニンに接触感作せしめることであり、感作後さ
らに増殖せしめるためにインターロイキンー２を加えて
継代培養すればよい。
って処理される点にある。スカシ貝ヘモシアニンはマイ
ト−ジエンの一種であり、 Ｋｅｙｈｏ−１ｅ ｌｉｍ
ｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨと略記）の名称
をもってＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ Ｃｏ
、、ＣＡより入手することができる。スカシ貝ヘモシア
ニンでヒトＴ細胞を処理するとは９例えば適当な培地中
で前記ロゼツト形成細胞と耐着細胞の混合物をスカシ貝
ヘモシアニンに接触感作せしめることであり、感作後さ
らに増殖せしめるためにインターロイキンー２を加えて
継代培養すればよい。
本発明に係るヒトＴ細胞ハイブリドーマはスカシ貝へそ
シアニンで処理したヒトＴ細胞を出発細胞として適当な
融合方法９例えばＨＡＴセレクション法あるいはエメチ
ンーアクチノマイシンＤ法により融合細胞とし、ナチュ
ラルキラー細胞活性化能をもってスクリーニングするこ
とにより得ることができる。本発明者等が開発したエメ
チンー７クチノマイシンＤ法に従っておこなう場合には
。
シアニンで処理したヒトＴ細胞を出発細胞として適当な
融合方法９例えばＨＡＴセレクション法あるいはエメチ
ンーアクチノマイシンＤ法により融合細胞とし、ナチュ
ラルキラー細胞活性化能をもってスクリーニングするこ
とにより得ることができる。本発明者等が開発したエメ
チンー７クチノマイシンＤ法に従っておこなう場合には
。
スカシ貝ヘモシアニンで処理したヒトＴ細胞およびエメ
チンーアクチノマイシンＤで処理したヒト急性白血病細
胞株２例えばＯＥＭを１＝１乃至１０：１の割合で混合
し、ポリエチレングリコール４０００を加えて融合し、
スクリーニングすればよい。また、クローニングはりミ
ティングダイリューション法を用いておこなえばよい。
チンーアクチノマイシンＤで処理したヒト急性白血病細
胞株２例えばＯＥＭを１＝１乃至１０：１の割合で混合
し、ポリエチレングリコール４０００を加えて融合し、
スクリーニングすればよい。また、クローニングはりミ
ティングダイリューション法を用いておこなえばよい。
後記実施例によって示されるごとく本発明者は本発明に
係るヒトＴ細胞ハイブリドーマとしてＫＣ８−１と命名
する株を得た。ＫＣ８−１をさらにナチュラルキラー細
胞活性化活性にもとづいてクローニングしてＫＣ８−１
−９およびＫＣ８−１−１０と命名する株を得た。ＫＣ
８−１，ＫＣ８−１−９およびＫＣ８−１−１０は微工
研にそれぞれ寄託申請された。
係るヒトＴ細胞ハイブリドーマとしてＫＣ８−１と命名
する株を得た。ＫＣ８−１をさらにナチュラルキラー細
胞活性化活性にもとづいてクローニングしてＫＣ８−１
−９およびＫＣ８−１−１０と命名する株を得た。ＫＣ
８−１，ＫＣ８−１−９およびＫＣ８−１−１０は微工
研にそれぞれ寄託申請された。
本発明リンホカインは本発明に係るヒトＴ細胞ハイブリ
ドーマの培養上清に存するが、培養上清を９０９６硫安
飽和とすることによって濃縮し、ブルーセファローズカ
ラム（ファルマシア）にかけてＰＢＳで溶出させナチュ
ラルキラー細胞活性化活性をもって所定のフラクション
を集めれば精製リンホカインとして得ることができる。
ドーマの培養上清に存するが、培養上清を９０９６硫安
飽和とすることによって濃縮し、ブルーセファローズカ
ラム（ファルマシア）にかけてＰＢＳで溶出させナチュ
ラルキラー細胞活性化活性をもって所定のフラクション
を集めれば精製リンホカインとして得ることができる。
この精製リンホカインをＴＳＫ Ｇ３０００−８Ｗカラ
ムにかけＰＢＳで溶出してゲル濾過をおこなうと。
ムにかけＰＢＳで溶出してゲル濾過をおこなうと。
おおよその分子量が１５．０００および３０，０００で
あることが判明する。また下記に示すナチュラルキラー
細胞活性化活性測定法によって、その活性を測定してみ
ると当該活性を有しており、従って本発明リンホカイン
はナチュラルキラー細胞活性化因子（ＮＫＡＦ）と本発
明者によって命名される。またこの活性は本発明リンホ
カインをｐＨ２において２４時間放置したときに大きく
失なわれ。
あることが判明する。また下記に示すナチュラルキラー
細胞活性化活性測定法によって、その活性を測定してみ
ると当該活性を有しており、従って本発明リンホカイン
はナチュラルキラー細胞活性化因子（ＮＫＡＦ）と本発
明者によって命名される。またこの活性は本発明リンホ
カインをｐＨ２において２４時間放置したときに大きく
失なわれ。
従って本発明リンホカインは酸性領域１ζおいて化学的
に不安定であることが知られる。
に不安定であることが知られる。
また下記に示すインターロイキン−２活性測定法および
インターフェロン活性測定法によって。
インターフェロン活性測定法によって。
それらの活性を求めてみると、いづれの活性も有しない
ことが判明する。
ことが判明する。
なお、また本発明リンホカインの標的細胞はナチュラル
キラー細胞であると考えられる。すなわち下記に示すナ
チュラルキラー細胞活性化活性の測定法におけるプラス
チック非耐着性ＰＢＳを抗Ｌｅｕ−１１モノクロナール
抗体およびウサギ補体によって処理し、あらか、じめＬ
ｅｕ−１１表面抗原を有するナチュラルキラー細胞を除
去してから本発明リンホカインを加えて本発明リンホカ
インのナチュラルキラー細胞活性化活性を求めても、当
該活性は発現しない。従って本発明リンホカインは標的
細胞としてのナチュラルキラー細胞の存在を必要とする
ことが判明する。なおナチュラルキラー細胞の表面抗原
Ｌｅｕ−１１については下記文献が参照される。
キラー細胞であると考えられる。すなわち下記に示すナ
チュラルキラー細胞活性化活性の測定法におけるプラス
チック非耐着性ＰＢＳを抗Ｌｅｕ−１１モノクロナール
抗体およびウサギ補体によって処理し、あらか、じめＬ
ｅｕ−１１表面抗原を有するナチュラルキラー細胞を除
去してから本発明リンホカインを加えて本発明リンホカ
インのナチュラルキラー細胞活性化活性を求めても、当
該活性は発現しない。従って本発明リンホカインは標的
細胞としてのナチュラルキラー細胞の存在を必要とする
ことが判明する。なおナチュラルキラー細胞の表面抗原
Ｌｅｕ−１１については下記文献が参照される。
１２） Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、 Ｊ、 Ｈ，ａｎｄ Ｂａ
ｂｃｏｃｋ、 Ｇ、 Ｆ、。
ｂｃｏｃｋ、 Ｇ、 Ｆ、。
Ｉｍｍｕｎｏｌ、 Ｌｅｔｔｅｒｓ １９８３．５：
１４３゜１３） Ｌａｎ１ｅｒ、 Ｌ、 Ｌ、、 Ｌｅ
、 Ａ、 Ｍ、、 Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、 Ｊ、 Ｈ，。
１４３゜１３） Ｌａｎ１ｅｒ、 Ｌ、 Ｌ、、 Ｌｅ
、 Ａ、 Ｍ、、 Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、 Ｊ、 Ｈ，。
Ｗａｒｎｅｒ、 Ｎ、 Ｌ、 ａｎｄ Ｂａｂｃｏｃｋ
、 Ｇ、 Ｆ、 、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
、 Ｇ、 Ｆ、 、 Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
１９８３．１３１： １７８９゜
１４） Ｐｈ１ｌｌｉｐｓ、 Ｊ 、 Ｈ，、Ｌｅ、
Ａ−Ｍ、 ａｎｄ Ｌａｎ１ｅｒ、 Ｌ。
Ａ−Ｍ、 ａｎｄ Ｌａｎ１ｅｒ、 Ｌ。
Ｌ、、 Ｊ、 Ｅｘｐ、 Ｍｅｄ、 １９８４．１５９
： ９９３゜ナチュラルキラー細胞活性化活性の測定法
牛胎児血清１０９６を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地
にプラスチック非耐着性のヒト末梢血リンパ球（プラス
チック非耐着性ＰＢＬと略称される）を入れ。
： ９９３゜ナチュラルキラー細胞活性化活性の測定法
牛胎児血清１０９６を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地
にプラスチック非耐着性のヒト末梢血リンパ球（プラス
チック非耐着性ＰＢＬと略称される）を入れ。
ヒトＴ細胞ハイブリドーマの培養上清を加え、さらに全
量を１００μｔとし試料とする。ただ゛しプラスチック
非耐着性ＰＢＬの細胞密度は５Ｘ１０５／−となるよう
にする。２０時間培養し、この培養液に５１Ｃｒでラベ
ルしたに５６２細胞液（１０５ｋ）１００μｔを加え、
さらに４時間培養する。次にここから１００μｔをとり
、遊離５１Ｃｒを測定する。別に対照として牛胎児血清
１０９６を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地１００μｔ
を用意し、２０時間培養し、この培養液に５１Ｃｒでラ
ベルしたに５６２細胞液（・１０５／ｒｔ’） １００
ｐｔを加え、さらに４時間培養する。次にここから１
００μｔをとり、遊離５１Ｃｒを測定する。
量を１００μｔとし試料とする。ただ゛しプラスチック
非耐着性ＰＢＬの細胞密度は５Ｘ１０５／−となるよう
にする。２０時間培養し、この培養液に５１Ｃｒでラベ
ルしたに５６２細胞液（１０５ｋ）１００μｔを加え、
さらに４時間培養する。次にここから１００μｔをとり
、遊離５１Ｃｒを測定する。別に対照として牛胎児血清
１０９６を含有するＲＰＭＩ−１６４０培地１００μｔ
を用意し、２０時間培養し、この培養液に５１Ｃｒでラ
ベルしたに５６２細胞液（・１０５／ｒｔ’） １００
ｐｔを加え、さらに４時間培養する。次にここから１
００μｔをとり、遊離５１Ｃｒを測定する。
各測定値より２次式に基づきナチュラルキラー細胞活性
（ＮＫ活性と略記される）を求める。
（ＮＫ活性と略記される）を求める。
−ａ
ＮＫ活性＝ −Ｘ １００５％
−ａ
ただし９式中−は試料に係る遊離”Ｃｒ（ｃｐｍ ）を
示し、ａは対照に係る遊離”Ｃｒ（ｃｐｍ ）を示し。
示し、ａは対照に係る遊離”Ｃｒ（ｃｐｍ ）を示し。
また今は６１（ｒでラベルしたに５６２細胞液（１０５
／ｄ）１００μｔにおける総５℃ｒ（ｃｐｍ）を示す。
／ｄ）１００μｔにおける総５℃ｒ（ｃｐｍ）を示す。
なお。
三回の測定の平均値を求める。
他方、上記記載においてヒトＴ細胞ハイブリドーマを加
えない点を除いて上記記載とまったく同一に測定操作を
おこない、ナチュラルキラー細胞活性を求める。三回の
測定の平均値を求める。ヒトＴ細胞ハイブリドーマの培
養上清を加えた場合におけるナチュラルキラー細胞活性
をＳとし、またヒトＴ細胞ハイブリドーマの培養上清を
加えない場合におけるナチュラルキラー細胞活性をＲと
すると９本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化活性
（ＮＫＡＦ活性と略記される）は次式によって求められ
る。
えない点を除いて上記記載とまったく同一に測定操作を
おこない、ナチュラルキラー細胞活性を求める。三回の
測定の平均値を求める。ヒトＴ細胞ハイブリドーマの培
養上清を加えた場合におけるナチュラルキラー細胞活性
をＳとし、またヒトＴ細胞ハイブリドーマの培養上清を
加えない場合におけるナチュラルキラー細胞活性をＲと
すると９本発明に係るナチュラルキラー細胞活性化活性
（ＮＫＡＦ活性と略記される）は次式によって求められ
る。
ただし９本発明において特にことわらない限り。
ＮＫＡＦ活性は上式によって算出される値としてではな
く、単にＲおよびＳのＮＫ活性値を対比のために提示す
ることによって表現されるものとする。
く、単にＲおよびＳのＮＫ活性値を対比のために提示す
ることによって表現されるものとする。
インターロイキン−２活性の測定法
この活性は、ヒトＴ細胞ハイブリドーマの培養上清がマ
ウスのインターロイキン−２依存性細胞（例えばＬｅ７
）の成長を維持する能力として測定される。すなわち
５Ｘ１０個のＬｃ７細胞を牛胎児血清１０９６を含有す
るＲＰＭＩ−１６４０培地５０μＬにとり。
ウスのインターロイキン−２依存性細胞（例えばＬｅ７
）の成長を維持する能力として測定される。すなわち
５Ｘ１０個のＬｃ７細胞を牛胎児血清１０９６を含有す
るＲＰＭＩ−１６４０培地５０μＬにとり。
これにヒトＴ細胞ハイブリドーマの培養上清を系列希釈
したもの５Ｑｐｔを加え、混合する。２０時間； 培養後 ３Ｈ−チミジン（比活性５．ＯＣ＋／ｍＭ。
したもの５Ｑｐｔを加え、混合する。２０時間； 培養後 ３Ｈ−チミジン（比活性５．ＯＣ＋／ｍＭ。
Ａｍｅｒｓｈａｍ、 Ｅｎｇｌａｎｄ ） Ｑ、５ ｐ
（：ｉで４時間パスルし。
（：ｉで４時間パスルし。
とりこまれた放射活性を液体シンチレーションカウンタ
ーで測定する。
ーで測定する。
他方上記記載においてヒトＴ細胞ハイブリドーマの培養
上清を加えない点を除いて上記とまったく同一に測定操
作をおこない放射活性を測定する。
上清を加えない点を除いて上記とまったく同一に測定操
作をおこない放射活性を測定する。
本発明においてインターロイキン−２活性（ＩＬ−２活
性）は上記の二側定値が対比のために提示されることに
よって表現されるものとする。
性）は上記の二側定値が対比のために提示されることに
よって表現されるものとする。
インターフェロン活性の測定法
この活性は具体的には口内炎ウィルスに対する抗ウィル
ス活性として測定され、当該ウィルスにｊ・
よってヒト羊膜細胞上に形成されるプラークの減少に
よって測定される。測定方法の詳細については下記文献
１５）および１６）が参照される。
ス活性として測定され、当該ウィルスにｊ・
よってヒト羊膜細胞上に形成されるプラークの減少に
よって測定される。測定方法の詳細については下記文献
１５）および１６）が参照される。
１５） Ｈｏｏｋｓ 、 Ｊ、 Ｊ、 、 Ｈａｙｅ
ｓ、 Ｂ、 Ｆ、、 Ｐｅｔｒｉｃｈ −Ｈｏ−ｏｋｓ
、 Ｂ、、 Ｄｉｅｈ、 Ｌ、 Ｆ、、 Ｇｅｒｒａｒ
ｄ、 Ｔ、 Ｌ、 ａｎｄ Ｆｃｕｕ−ｃｉ、 Ａ、
Ｓ、、 Ｂｌｏｏｄ １９８２．５９： １９８゜
１６） Ｈｏｏｋｓ Ｊ、Ｊ、 Ｍｏｕｔｓｏｐｏｕ
ｌｏｓ Ｍ、 Ｇｅ１ｓ Ｓ、５ｔａ−ｈｌ ＮＩ 、
Ｄｅｃｋｅｒ ＪＬ、 Ｎｏｔｋｉｎｓ ＡＬ ：
Ｉｍｍｕｎｅ １ｎｔｅｒｆｅ−ｒｏｎ ｉｎ ｔｈｅ
ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ
ｗｉｔｈ ａｕｔｏｉｍ−ｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ、
Ｎ Ｅｎｇｌ、Ｊ、 Ｍｅｄ、 ３Ｑｌ ：５（１９
７９）以下に記載する実施例をもつて本発明をさらに具
体的に説明する。
ｓ、 Ｂ、 Ｆ、、 Ｐｅｔｒｉｃｈ −Ｈｏ−ｏｋｓ
、 Ｂ、、 Ｄｉｅｈ、 Ｌ、 Ｆ、、 Ｇｅｒｒａｒ
ｄ、 Ｔ、 Ｌ、 ａｎｄ Ｆｃｕｕ−ｃｉ、 Ａ、
Ｓ、、 Ｂｌｏｏｄ １９８２．５９： １９８゜
１６） Ｈｏｏｋｓ Ｊ、Ｊ、 Ｍｏｕｔｓｏｐｏｕ
ｌｏｓ Ｍ、 Ｇｅ１ｓ Ｓ、５ｔａ−ｈｌ ＮＩ 、
Ｄｅｃｋｅｒ ＪＬ、 Ｎｏｔｋｉｎｓ ＡＬ ：
Ｉｍｍｕｎｅ １ｎｔｅｒｆｅ−ｒｏｎ ｉｎ ｔｈｅ
ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ
ｗｉｔｈ ａｕｔｏｉｍ−ｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅ、
Ｎ Ｅｎｇｌ、Ｊ、 Ｍｅｄ、 ３Ｑｌ ：５（１９
７９）以下に記載する実施例をもつて本発明をさらに具
体的に説明する。
実施例１
（ａ） ヒトＴ細胞の調製
ヒト末梢血（供与者ＹＫ）をＦｉｃｏｌｌ −Ｕｒｏｇ
ｒａｆｉｎ溶液に重層し、濃度勾配遠心法により単核細
胞を採取した。なお、下記文献が参照される。
ｒａｆｉｎ溶液に重層し、濃度勾配遠心法により単核細
胞を採取した。なお、下記文献が参照される。
１７） Ｋａｗａｇｕｃｈｉ 、Ｔ、 、 Ｍａｔｓｓ
ｂｍｏｔｏ、Ｉ 、 ａｎｄ Ｏｓａｗａ。
ｂｍｏｔｏ、Ｉ 、 ａｎｄ Ｏｓａｗａ。
Ｔ、、 Ｊ、 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、 １９７４．２４
９： ２７８６゜次に単核細胞に２−アミノエチルイソ
チオウロニウムブロマイド臭化水素塩（ＡＥＴと略記さ
れる）で処理したヒツジ赤血球を加えてロゼツトを形成
せしめ、ロゼツトを形成する細胞のみを分離した。なお
、下記文献が参照される。
９： ２７８６゜次に単核細胞に２−アミノエチルイソ
チオウロニウムブロマイド臭化水素塩（ＡＥＴと略記さ
れる）で処理したヒツジ赤血球を加えてロゼツトを形成
せしめ、ロゼツトを形成する細胞のみを分離した。なお
、下記文献が参照される。
１８） Ｐｅｌｌｅｇｒｉｎｏ 、 Ｍ、 Ａ、 、
Ｆｅｒｒｏｎｅ、 Ｓ、、 Ｄｉｅｒｉｃｈ。
Ｆｅｒｒｏｎｅ、 Ｓ、、 Ｄｉｅｒｉｃｈ。
Ｍ、 Ｐ、 ａｎｄ Ｒｅ１ｓｆｅｌｄ、 Ｒ，Ａ、
、 Ｃｌ１ｎ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
、 Ｃｌ１ｎ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。
Ｉｍｍｕｎｏｐｂａｔｏ！、 １９７５．３： ３２４
゜また、前記単核細胞をプラスチック製ペトリ皿（３Ｑ
Ｑ３ 、 Ｆａｌｃｏｎ Ｐｌａｓｔｉｃｓ、 Ｂｅｃ
ｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＩε ＆ Ｃｏ、 、 Ｃｏｃｋｎｅｙｓｖｉｌｂ、 Ｍ Ｄ
）に入れて１時間培養し、プラスチック面に耐着した
細胞を採取し、マイトマイシンＣ（５０μｙ／ｒｎｔ）
を加えて３０分間処理し、プラスチック耐着細胞を用意
した。
゜また、前記単核細胞をプラスチック製ペトリ皿（３Ｑ
Ｑ３ 、 Ｆａｌｃｏｎ Ｐｌａｓｔｉｃｓ、 Ｂｅｃ
ｔｏｎ ＤｉｃｋｉｎｓｏｎＩε ＆ Ｃｏ、 、 Ｃｏｃｋｎｅｙｓｖｉｌｂ、 Ｍ Ｄ
）に入れて１時間培養し、プラスチック面に耐着した
細胞を採取し、マイトマイシンＣ（５０μｙ／ｒｎｔ）
を加えて３０分間処理し、プラスチック耐着細胞を用意
した。
（ｂｌ スカシ貝ヘモシアニン処理
牛脂児血清１０％、グルタミン２ｍＭおよび２−メルカ
プトエタノール５刈０−５Ｍを含有するＲＰＭＩ−１６
４０培地に、前記Ｔａ）におけるロゼツト形成細胞（１
０’／ｄ ）およびプラスチック耐着細胞（１０７ｄ）
を入れ、スカシ貝ヘモシアニン１００μｆ／ｄノ存在下
で１０日間培養した。再びＦｉｃｏｌｌ−Ｕｒｏｇｒａ
ｆｉｎ溶液による濃度勾配遠心により生細胞を集め、プ
ラスチック耐着細胞とともに牛胎児血清１０９６を含有
するＲＰＭＩ−１６４０培地に入れ、１００μｔ／ｖａ
ｔのスカシ貝ヘモシアニンおよび５９６のインターロイ
キン−２の存在下で培養し、５日毎に牛胎児血清を１０
９６およびインターロイキン−２を５９６それぞれ含有
する新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地にとりかえて継代培
養した。
プトエタノール５刈０−５Ｍを含有するＲＰＭＩ−１６
４０培地に、前記Ｔａ）におけるロゼツト形成細胞（１
０’／ｄ ）およびプラスチック耐着細胞（１０７ｄ）
を入れ、スカシ貝ヘモシアニン１００μｆ／ｄノ存在下
で１０日間培養した。再びＦｉｃｏｌｌ−Ｕｒｏｇｒａ
ｆｉｎ溶液による濃度勾配遠心により生細胞を集め、プ
ラスチック耐着細胞とともに牛胎児血清１０９６を含有
するＲＰＭＩ−１６４０培地に入れ、１００μｔ／ｖａ
ｔのスカシ貝ヘモシアニンおよび５９６のインターロイ
キン−２の存在下で培養し、５日毎に牛胎児血清を１０
９６およびインターロイキン−２を５９６それぞれ含有
する新鮮なＲＰＭＩ−１６４０培地にとりかえて継代培
養した。
（Ｃ） エメチンーアクチノマイシンＤ処理ＯＥＭの
調製 ＯＥＭをＲＰＭＩ−１６４０培地に細胞密度２ ＸＩＯ
’／ｗｔとなるように懸濁し、 ５Ｘ１０−Ｍ塩酸エ
メチンおよび０．２５μｆ／−アクチイマイシンＤを加
えて３７℃、５９６ＣＯ２中で２時間処理した。処理後
、細胞をＰＢＳで４回洗浄し、ＭＥＭ培地を加えた。
調製 ＯＥＭをＲＰＭＩ−１６４０培地に細胞密度２ ＸＩＯ
’／ｗｔとなるように懸濁し、 ５Ｘ１０−Ｍ塩酸エ
メチンおよび０．２５μｆ／−アクチイマイシンＤを加
えて３７℃、５９６ＣＯ２中で２時間処理した。処理後
、細胞をＰＢＳで４回洗浄し、ＭＥＭ培地を加えた。
（ｄ）融合
前記（ｂ）の継代培養を３０日おこなった後、エメチン
ーアクチノマイシンＤ処理ＯＥＭと融合した。
ーアクチノマイシンＤ処理ＯＥＭと融合した。
すなわち、まず前記（ｂ）の継代培養後の細胞をよ（洗
浄してスカシ貝ヘモシアニン除去し、遠心後。
浄してスカシ貝ヘモシアニン除去し、遠心後。
２５ｍＭ−ＨＥＰＥＳを含有するＭＥＭ培地（ｐＨ７，
２）に懸濁し、（Ｃ）で調製したエメチンーアクチノマ
イシンＤ処理ＣＥＭを１０：１の比で混合した。混合液
を遠心してペレットを形成せしめ、このペレットに、ポ
リエチレングリコール４０００を４６％、ジメチルスル
ホキサイドを１５％、ポリＬ−アルギニン（分子量６０
，０００）を５ ｐｆ／−含有し、あらかじめ３７℃に
温めたＭＥＭ培地０．５−を加えた。３７℃で４５秒間
ゆっ（り撹拌し９次に２５ｍＭＨＥＰＥＳを含有するＭ
ＥＭ培地で徐々に１０ｗ１ｔに希釈した。
２）に懸濁し、（Ｃ）で調製したエメチンーアクチノマ
イシンＤ処理ＣＥＭを１０：１の比で混合した。混合液
を遠心してペレットを形成せしめ、このペレットに、ポ
リエチレングリコール４０００を４６％、ジメチルスル
ホキサイドを１５％、ポリＬ−アルギニン（分子量６０
，０００）を５ ｐｆ／−含有し、あらかじめ３７℃に
温めたＭＥＭ培地０．５−を加えた。３７℃で４５秒間
ゆっ（り撹拌し９次に２５ｍＭＨＥＰＥＳを含有するＭ
ＥＭ培地で徐々に１０ｗ１ｔに希釈した。
遠心してペレットとし９通常培地にゆっくり懸濁して細
胞密度５ ＸＩＯ’／−とした。当該細胞６．０×１０
６個にフィーダー細胞としてマイトマイシンＣ２５μｔ
／ｗｔで３７℃、３０分間処理したＣＥＭ細胞１．２Ｘ
１０’個を加え、９６穴プレ一ト番ζ０．２ｄづつ分注
した。
胞密度５ ＸＩＯ’／−とした。当該細胞６．０×１０
６個にフィーダー細胞としてマイトマイシンＣ２５μｔ
／ｗｔで３７℃、３０分間処理したＣＥＭ細胞１．２Ｘ
１０’個を加え、９６穴プレ一ト番ζ０．２ｄづつ分注
した。
融合後−週間は毎日各穴の培地の１００μｔを新鮮な培
地で交換した。数日後にはエメチンーアクチノマイシン
Ｄ処理ＯＥＭおよびマイトマイシンＣ処理ＯＥＭは死滅
したのに反し、融合細胞は２０穴中３穴において融合後
２週に良好に増殖した。
地で交換した。数日後にはエメチンーアクチノマイシン
Ｄ処理ＯＥＭおよびマイトマイシンＣ処理ＯＥＭは死滅
したのに反し、融合細胞は２０穴中３穴において融合後
２週に良好に増殖した。
（ｅ） クローニング
ラミティングダイリューション法によりクローニングし
た。すなわち選択したＫＯ８株を０．５細胞個／穴とな
るように９６穴プレートにまき、同時にフィーダー細胞
としてマイトマイシン０５０μｔ／−で３０分間処理し
たＯＥＭ細胞を２ ＸＩＯ’／−となるよう番ζ加えた
。１０〜１４日後番こクローンの増殖が認められ、ＫＣ
８−１株として微工研に寄託申請された。
た。すなわち選択したＫＯ８株を０．５細胞個／穴とな
るように９６穴プレートにまき、同時にフィーダー細胞
としてマイトマイシン０５０μｔ／−で３０分間処理し
たＯＥＭ細胞を２ ＸＩＯ’／−となるよう番ζ加えた
。１０〜１４日後番こクローンの増殖が認められ、ＫＣ
８−１株として微工研に寄託申請された。
げ）ハイブリドーマの表面形質の決定
ＯＫＴ ３ ＋ ４ 、８ ｅ １１ （０ｒｔｈｏ
ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ、 、 Ｒａｒｉｔ
ａｎ、 ＮＪ ）を使用するｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｂｉｎ
ｄｉｎｇａｓｓａｙ ＩこよりＫＣ８−１の表面形質を
求めたところ０ＫＴ８および１１がＣＥＭＩＩよりも多
く表現されていることが判明した（スチューデントの１
−検定においてｐ＜０．０１）。なお、 ｔｗｏ−ｓｔ
ｅｐ ｂｉｎｄｉ−ｎｇ ａｍｙについては前記文献９
）が参照される。
ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＣｏ、 、 Ｒａｒｉｔ
ａｎ、 ＮＪ ）を使用するｔｗｏ−ｓｔｅｐ ｂｉｎ
ｄｉｎｇａｓｓａｙ ＩこよりＫＣ８−１の表面形質を
求めたところ０ＫＴ８および１１がＣＥＭＩＩよりも多
く表現されていることが判明した（スチューデントの１
−検定においてｐ＜０．０１）。なお、 ｔｗｏ−ｓｔ
ｅｐ ｂｉｎｄｉ−ｎｇ ａｍｙについては前記文献９
）が参照される。
（ｇ） 精製リンホカインの取得
ＫＣ８−１を細胞密度１０６／−で２０時間培養した。
培養上清をとり、硫安を加えて９０９６飽和とし、沈澱
をとった。これをブルーセファローズカラム（５，Ｏｓ
ｄ、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ、 Ｓｗｅｄｅｎ ）にかけ
、ＰＢＳで溶出し、ＰＢＳに対して透析し、精製リンホ
カインを得た。
をとった。これをブルーセファローズカラム（５，Ｏｓ
ｄ、 Ｐｈａｒｍａｃｉａ、 Ｓｗｅｄｅｎ ）にかけ
、ＰＢＳで溶出し、ＰＢＳに対して透析し、精製リンホ
カインを得た。
（ｈ） 理化学的測定
前記（ｇｌの精製リンホカインをＴＳＫＧ３０００−Ｓ
ＷカラムにかけＰＢＳを用い０．２５ ｄ／ｍｉｎ （
７）流出速度で流出せしめた。各フラクションにつきナ
チュラルキラー細胞活性を測定した。
ＷカラムにかけＰＢＳを用い０．２５ ｄ／ｍｉｎ （
７）流出速度で流出せしめた。各フラクションにつきナ
チュラルキラー細胞活性を測定した。
結果を図１に示す。本図に限りタテ軸は前記ナチュラル
キラー細胞活性化活性の測定法において示される弐薯ζ
よって算出されたＮＫＡＦ活性を表わす。図中、矢印は
分子量既知の標準蛋白質の溶ＩＶグ 重位置を示しており、左から右へオポアーミン（４４Ｋ
）およびリボヌクレアーゼ（１４Ｋ）の流出位置を示す
。図１より本発明リンホカインの分子量は１５におよび
３０にであることが判明する。
キラー細胞活性化活性の測定法において示される弐薯ζ
よって算出されたＮＫＡＦ活性を表わす。図中、矢印は
分子量既知の標準蛋白質の溶ＩＶグ 重位置を示しており、左から右へオポアーミン（４４Ｋ
）およびリボヌクレアーゼ（１４Ｋ）の流出位置を示す
。図１より本発明リンホカインの分子量は１５におよび
３０にであることが判明する。
前記（ｇ）の精製リンホカインについて精製直後および
ｐＨ２でＵ時間放置後におけるナチュラルキラー細胞活
性を測定した。その結果精製リンホカインを加えないと
きのＮＫ活性が１３．１±４．２％であるのに対し、そ
れぞれ３３．２±７．２％招よび６．１±５．７ ％で
あり９本発明リンホカインは酸性領域において不安定で
あることが判明する。
ｐＨ２でＵ時間放置後におけるナチュラルキラー細胞活
性を測定した。その結果精製リンホカインを加えないと
きのＮＫ活性が１３．１±４．２％であるのに対し、そ
れぞれ３３．２±７．２％招よび６．１±５．７ ％で
あり９本発明リンホカインは酸性領域において不安定で
あることが判明する。
前記（ｇ）記載と同様にＫＣ８−１の培養上清に硫安を
加えて９０９６飽和とし、沈澱をとり、ブルーセファロ
ーズカラム暑とかけ７．５−のＰＢＳ（溶出液Ａ）、１
０−のＰＢＳ （溶出液Ｂ）、塩化ナトリウム１．０Ｍ
を含有するｐＨ７，０のｌＱｍＭリン酸緩衝液１０−（
溶出液Ｃ）、エチレングリコール５０％を含有するｐＨ
７，０の１０ｍＭ９ン酸緩衝液（溶出液Ｄ）によって段
階的に溶出せしめ、各溶出液で溶出したフラクションを
とった。前記ナチュラルキラー細胞活性化活性の測定法
およびインターロイキン−２活性の測定法の各記載にお
いてヒトＴ細胞ハイブリドーマの培養上清とあるのを各
溶出液で溶出したフラクションに読みかえて各フラクシ
ョンにおけるナチュラルキラー細胞活性および放射活性
を測定した。結果を図２６と示す。図のタテ軸のうち上
段は放射活性を示し、下段はナチュラルキラー細胞活性
を示す。また横軸のＡ、 Ｂ、 Ｃ，Ｄは相当する各溶
出液で溶出したフラクションを示し、Ｅはフラクション
を加えないコントロールを示す。図２より本発明リンホ
カインはナチュラルキラー細胞活性化活性を有し、イン
ターロイキン−２活性を示さないことが判明する。
加えて９０９６飽和とし、沈澱をとり、ブルーセファロ
ーズカラム暑とかけ７．５−のＰＢＳ（溶出液Ａ）、１
０−のＰＢＳ （溶出液Ｂ）、塩化ナトリウム１．０Ｍ
を含有するｐＨ７，０のｌＱｍＭリン酸緩衝液１０−（
溶出液Ｃ）、エチレングリコール５０％を含有するｐＨ
７，０の１０ｍＭ９ン酸緩衝液（溶出液Ｄ）によって段
階的に溶出せしめ、各溶出液で溶出したフラクションを
とった。前記ナチュラルキラー細胞活性化活性の測定法
およびインターロイキン−２活性の測定法の各記載にお
いてヒトＴ細胞ハイブリドーマの培養上清とあるのを各
溶出液で溶出したフラクションに読みかえて各フラクシ
ョンにおけるナチュラルキラー細胞活性および放射活性
を測定した。結果を図２６と示す。図のタテ軸のうち上
段は放射活性を示し、下段はナチュラルキラー細胞活性
を示す。また横軸のＡ、 Ｂ、 Ｃ，Ｄは相当する各溶
出液で溶出したフラクションを示し、Ｅはフラクション
を加えないコントロールを示す。図２より本発明リンホ
カインはナチュラルキラー細胞活性化活性を有し、イン
ターロイキン−２活性を示さないことが判明する。
前記（ｇ）の精製リンホカインにつきインターフェロン
活性測定したところ、ＩＩＵ／ｓｇ以下であり。
活性測定したところ、ＩＩＵ／ｓｇ以下であり。
無視できる活性であるので１本発明リンホカインはイン
ターフェロン活性を示さないことが判明する。
ターフェロン活性を示さないことが判明する。
実施例２
実施例１で得られたヒトＴ細胞ハイブリドーマＫＣ８−
１を実施例１ （ｅ）り四−ニングの項番ζ記載と同じ
グミティングダイリューション法によりクローン化し、
７株を得た。これらのうちＫＣ８−１−９およびＫＣ８
−１−１０は微工研に寄託申請した。この両者の培養上
清のＮＫＡＦ活性を調べたところ、上清を加えないとき
のＮＫ活性が６．８±０．３９６であるのに対し前者に
おけるＮＫ活性は！９．５±１．７９６であり、また後
者におけるＮＫ活性は９．０±１．３ ％であって、共
番ＣＮＫＡＦ活性を示した。
１を実施例１ （ｅ）り四−ニングの項番ζ記載と同じ
グミティングダイリューション法によりクローン化し、
７株を得た。これらのうちＫＣ８−１−９およびＫＣ８
−１−１０は微工研に寄託申請した。この両者の培養上
清のＮＫＡＦ活性を調べたところ、上清を加えないとき
のＮＫ活性が６．８±０．３９６であるのに対し前者に
おけるＮＫ活性は！９．５±１．７９６であり、また後
者におけるＮＫ活性は９．０±１．３ ％であって、共
番ＣＮＫＡＦ活性を示した。
本発明りンホカインの標的細胞がナチュラルキラー細胞
であることを確認する目的で以下の実験をおこなった。
であることを確認する目的で以下の実験をおこなった。
実験例
試料
下記三種類のプラスチック非耐着性ＰＢＬを試料（イ）
、（ロ）、（ハ）として用意した。
、（ロ）、（ハ）として用意した。
（イ）プラスチック非耐着性ＰＢＬ
（ロ）抗Ｌｅｕ−１１ｂモ）クロナール抗体（１ａｔ／
１０６細胞個）詔細胞中サギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ
、 ０ｎｔａｒｉｏ。
１０６細胞個）詔細胞中サギ補体（Ｃｅｄａｒｌａｎｅ
、 ０ｎｔａｒｉｏ。
Ｃａｎａｄａ ）で処理し、（イ）と同じ細胞密度に調
整したプラスチック非耐着性ＰＢＬ （ハ）ウサギ補体（同上）で処理し、（イ）と同じ細胞
密度に調整したプラスチック非耐着性ＰＢＬ方法 前記ナチュラルキラー細胞活性化活性の測定法の記載に
おいてプラスチック非耐着性ＰＢＬとあるのを試料（イ
）、（ロ）、（ハ）に読みかえ、またと）Ｔ細胞ハイブ
リドーマの培養上清とあるのを実施例１（ｈ）理化学的
測定の項に記載されている溶出液Ａで溶出したフラクシ
ョンに読みかえて、ナチュラルキラー細胞活性化活性の
測定法の要領薔こ従ってナチュラルキラー細胞活性Ｓお
よびＲを求めた。ただし本発明りンホカインの最終濃度
を２０％となるようにした。
整したプラスチック非耐着性ＰＢＬ （ハ）ウサギ補体（同上）で処理し、（イ）と同じ細胞
密度に調整したプラスチック非耐着性ＰＢＬ方法 前記ナチュラルキラー細胞活性化活性の測定法の記載に
おいてプラスチック非耐着性ＰＢＬとあるのを試料（イ
）、（ロ）、（ハ）に読みかえ、またと）Ｔ細胞ハイブ
リドーマの培養上清とあるのを実施例１（ｈ）理化学的
測定の項に記載されている溶出液Ａで溶出したフラクシ
ョンに読みかえて、ナチュラルキラー細胞活性化活性の
測定法の要領薔こ従ってナチュラルキラー細胞活性Ｓお
よびＲを求めた。ただし本発明りンホカインの最終濃度
を２０％となるようにした。
結果
結果を表１に示す。
表１
表１より試料（ロ）にみられるとと（Ｌｅｕ−１１表面
抗原を有するナチュラルキラー細胞を除去するとナチュ
ラルキラー細胞活性が失なわれるのが知られる。従って
本発明リンホカインは標的細胞としてナチュラルキラー
細胞の存在を必要とすることが判明する。
抗原を有するナチュラルキラー細胞を除去するとナチュ
ラルキラー細胞活性が失なわれるのが知られる。従って
本発明リンホカインは標的細胞としてナチュラルキラー
細胞の存在を必要とすることが判明する。
図１は実施例１（ｈ）理化学的測定の項に記載の図１に
相当し、ゲル濾過におけるフラクション魔とナチュラル
キラー細胞活性化活性（ｙ）ｉｎｃｒｅａｓｅ ）との
関係を示すグラフである。 図２は実施例１（ｈ）理化学的測定の項に記載の図２に
相当し、各種溶出液で溶出したフラクションの放射活性
およびナチュラルキラー細胞活性を示すグラフである。
相当し、ゲル濾過におけるフラクション魔とナチュラル
キラー細胞活性化活性（ｙ）ｉｎｃｒｅａｓｅ ）との
関係を示すグラフである。 図２は実施例１（ｈ）理化学的測定の項に記載の図２に
相当し、各種溶出液で溶出したフラクションの放射活性
およびナチュラルキラー細胞活性を示すグラフである。
Claims (4)
- （１）スカシ貝ヘモシアニンで処理したヒトＴ細胞を出
発細胞とするヒトＴ細胞ハイブリドーマによって産生さ
れ、下記の理化学性質を有する新規リンホカイン （ｉ）分子量約１５，０００および３０，０００ （ｉｉ）酸性領域で化学的に不安定である （ｉｉｉ）ナチュラルキラー細胞活性化活性を有する （ｉｖ）インターロイキン−２活性を示さない （Ｖ）インターフェロン活性を示さない - （２）ヒトＴ細胞がヒト末梢血由来である特許請求の範
囲第１項記載の新規リンホカイン - （３）ヒトＴ細胞ハイブリドーマがＫＣ８−１である特
許請求の範囲第２項記載の新規リンホカイン - （４）ヒトＴ細胞ハイブリドーマがＫＣ８−１−９およ
びＫＣ８−１−１０である特許請求の範囲第２項記載の
新規リンホカイン
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59218643A JPS6197224A (ja) | 1984-10-19 | 1984-10-19 | 新規なリンホカイン |
| NO854122A NO854122L (no) | 1984-10-19 | 1985-10-17 | Fremgangsm¨te for fremstilling av et nytt lymfokin. |
| EP85113254A EP0181524A3 (en) | 1984-10-19 | 1985-10-18 | Novel lymphokine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59218643A JPS6197224A (ja) | 1984-10-19 | 1984-10-19 | 新規なリンホカイン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6197224A true JPS6197224A (ja) | 1986-05-15 |
Family
ID=16723161
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59218643A Pending JPS6197224A (ja) | 1984-10-19 | 1984-10-19 | 新規なリンホカイン |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0181524A3 (ja) |
| JP (1) | JPS6197224A (ja) |
| NO (1) | NO854122L (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5185431A (en) * | 1988-08-31 | 1993-02-09 | Eisai Co., Ltd. | Recombinant natural killer cell activator |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0631318B2 (ja) * | 1985-09-18 | 1994-04-27 | 株式会社林原生物化学研究所 | 新リンホカインｉｉｉとその製法 |
-
1984
- 1984-10-19 JP JP59218643A patent/JPS6197224A/ja active Pending
-
1985
- 1985-10-17 NO NO854122A patent/NO854122L/no unknown
- 1985-10-18 EP EP85113254A patent/EP0181524A3/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5185431A (en) * | 1988-08-31 | 1993-02-09 | Eisai Co., Ltd. | Recombinant natural killer cell activator |
| US5316933A (en) * | 1988-08-31 | 1994-05-31 | Eisai Co., Ltd. | Recombinant natural killer cell activator |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0181524A3 (en) | 1988-12-14 |
| NO854122L (no) | 1986-04-21 |
| EP0181524A2 (en) | 1986-05-21 |
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