KR950008569B1

KR950008569B1 - 신규 림포카인(lymphokine) 및 그 제조방법과 사용방법

Info

Publication number: KR950008569B1
Application number: KR1019860007870A
Authority: KR
Inventors: 마사가즈 미쓰하시; 마사시 구리모도
Original assignee: 가부시기가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겡뀨우쇼; 하야시바라 겡
Priority date: 1985-09-18
Filing date: 1986-09-17
Publication date: 1995-08-03
Also published as: JPH0631318B2; EP0216605A3; JPS6267026A; DE216605T1; EP0216605A2; EP0216605B1; KR870003194A; CA1295241C; DE3686113D1; US4994556A; DE3686113T2

Abstract

내용 없음.

Description

신규 림포카인(LYMPHOKINE) 및 그 제조방법과 사용방법

본 발명은 신규 림포카인 및 그 제조방법과 사용방법에 관한 것이다.

본 명세서를 기재함에 있어 편의상 다음과 같은 약어를 사용한다. 림포톡신(Lymphotoxin)은 LT로, 종양괴사인자(tumor necrosis factor)는 TNF로, 인터루킨(interleukin)은 IL로, 인터페론(interferon)은 IFN으로, 인터페론-알파는 IFN-

로, 인터페론-감마는 IFN-

로, 그리고 인체-특히 인터페론은 HuIFN으로 표기한다.

LT 및 TNF는 종양세포를 해치는 림포카인으로 알려져 있다. 예를 들면, LT는 여러 문헌에 소개되어 있다[참조 : Pyuichi Aoki et al., SHIN-MENEKIGAKU SOSHO, Vol.6, "Lymphokine", pp.87-105(1979), Igaku-Shoin, Tokyo, In Vitro Method in Cell-Mediated Immunity, B.R. Bloom & P.R. Glade, Academic Press, Inc.(1971), 및 Cellular Immunology, Vol.38, pp.388-402(1978)]. TNF도 문헌에 소개되어 있다[참조 : E.A. Carswell et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., Vol.72, No.9, pp.3, 666-3,670(1975) 및 Lymphokines, Vol.2, PP.235-272, "Tumor Necrosis Factor", E. Pick, Academic Press, Inc (1981)].

최근 항종양(antioncotic) 림포카인 글리코프로테인에 대해서는 일본국 특허공개(일본국 공개특허공보 제146,293/83호)에 개시(開示)되어 있고, 본 발명자등이 그에 대하여 특허출원한 것이 공개된 바 있다(일본국 공개 특허공보 제126,228/85호).

본 발명자들은 수년에 걸쳐 림포카인에 대한 연구를 수행하였다. 그 결과 마침내 종래 앝려진 림포카인과는 전해 다른 불리화학적 특성을 가진 새로운 림포카인을 발견하기에 이르렀다. 이는 인터페론 존재하의 악성 종양세포에 대한 세포 독성 작용이 다른 것임을 또한 확인하였다.

한편, 림포카인이 생산방법과 사용방법을 개발하였다. 본 발명은 다음과 같은 물리화학적 특성을 가진 새로운 림포카인에 관한 것이다.

(1) 분자량 :

15,0000±2,000 달톤

(2) 등전점 :

pI = 4 .5±0.5

(3) 전기영동 이동치(Disc-PAGE에서) :

Rf = 0.73 ± 0.05

(4) 자외선 흡수 스펙트럼 :

파장 약 280mm에서 최대 흡수

(5) 용매에 대한 용해도 :

물, 생리 식염수 또는 인산염 완충액에 가용성, 에틸 에테르, 에틸 아세테이트 또는 클로로포름에는 거의 녹지 않거나 불용성

(6) 착색반응 :

로우리(Lowry)방법 또는 마이크로뷰레트 방법에 의해 단백질 양성, 페놀-황산 방법 또는 안트론-황산 방법에 의해 사카라이드 양성

(7) 생물학적 활성 :

HuIFN-

존재 또는 부재하에 KB 세포에 대하여 세포 정지성(cytostatic), L 929 세포에 대하여 세포 독성(cytotoxic), IL 및 IFN 활성 거의 없음

(8) 수용액중의 안정성 :

pH 7.2에서 30분간 보존할 때 60℃까지 안정, 4℃에서 16시간 보존할 때 pH 2.0 내지 11.0범위에서 안정

(9) 냉온보존 안정성 :

-10℃에서 1개월 이상 안정

본 발명은 또한 림포카인의 제조방법 및 사용방법에 관한 것이다.

본 발명의 새로운 림포카인을 편의상 "LK 3"으로 약기하기로 한다.

LK 3은 사람의 적혈구, 임파아구 및 이들의 세포계(cell lines)등과 같은 LK 3 생산성 인체세포를 LK 3유도물질(inducer)에 작용시켜 제조한다. 인체 적혈구 및 임파아구를 신선한 혈액으로부터 분리한다. 형성된 인체 세포계는 통상의 시험관내 방법으로 증식시킬 수 있다.

본 발명을 더욱 효과적으로 실시하기 위하여는 생체내 세포증식 방법을 적용하여 상술한 인체 세포계를 사람이외의 온혈동물에 직접 이식하거나 통상의 확산실(diffusion chamber)에서 접종하고 사람이외의 온혈동물의 영양체액을 세포계에 공급하는 것이 바람직하다.

시험관내 세포증식과는 달리 생체내 시행방법은고가의 혈청을 함유하는 영양배지를 전혀 또는 거의 필요로 하지 않을 뿐아니라 세포증식에 특별히 어려운 일어 없고, 이 방법에 따라 증식된 인체세포는 현저하게 높은 LK 3 활성을 나타낸다는데 그 특징이 있다.

생체내 방법에 있어서, 인체 세포계를 온혈동물에 이식하므로서 온혈동물로부터 공급되는 영양체액을 이용하거나, 체액을 수용하도록 고안된 통상의 확산실에 세포계를 도입하고, 상기 확산실을 동물의 체내에 매설하거나 또는 체외에 설치하여 인체 세포계를 쉽게 증식시킬 수 있다. 또, 생체내 방법은 시험관내 방법에 하여 훨씬 안정되고 신속한 세포증식, 높은 세포 생산성 및 세포당 현저하게 높은 LK 3 생산성을 얻을 수 있다는데 그 특징이 있다.

본 발명에서 이용할 수 있는 인체 세포계는 LK 3 생산성의 온혈동물에 이식 가능한 것으로서 동물체내에서 곧 증식할 수 있는 것들이면 된다. 예를 들면, 공지[참조 : Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Vol.20, No.6, pp.616-643(1975)]의 인체 세포계를 본 발명에 사용할 수 있고, 특히 나말와[Namalwa (ATCC CRL 1433)] 세포[참조 : Journal of Clinical Microbiology, Vol.1, pp.116-117(1975)], BALL-1, TALL-1 및 NALL-1 등의 세포[참조 : I. Miyoshi, Nature Vol.267, pp.843-844(1977)], M-7002 및 B-7101등의 세포[참조 : The Journal of Immunology , Vol.113, pp.1,334-l,345(1974)], JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, MOLT-3(ATCC CRL 1552) 및 EBV-HO등의 세포[참조 : The Tissue Culture, Vol.6, No.13, pp.527-546(1980)], CCRF-SB 세포(ATCC CCL 120), CCRF-CEM 세포(ATCC CCL119), BALM 2 세포, DND-41 세포 등의 주화된 인체 임파아구종 세포(lymphoblastoid line) 및 정상적인 사람의 단핵세포(monocyte)나 과립성 백혈구(granilocyte)를 각종 발암성 바이러스, 약제 또는 방사능으로 처리하여 형질 전환시켜 수득되는 세포계(cell line)가 가장 적합하다.

이들 세포계의 증식률 및/또는 세포당 LK 3 생산성은 폴리에틸렌 글리콜이나 센다이 바이러스(Sendai virus)를 사용하는 세포 융합법에 의하거나 또는 뉴클레아제 효소, 리가아제 효소, DNA 폴리머라아제 효소 등을 이용하는 유전자 재조합 법에 의해 개량할 수 있다. 본 명세서에 기재하는 본 발명에 적용 가능한 인체 세포계는 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 후술하는 바와 같이 LK 3을 유도 생성시키기까지의 과정에서 하나 이상의 이들 세포계를 조합하여 사용할 수 있다. 필요한 경우에는 신선한 사람 혈액으로부터 얻을 수 있는 백혈구 또는 임파아구를 이들 인체 세포계의 어느 것이나 조합하여 사용할 수도 있다.

본 발명에 이용할 수 있는 온혈동물은 인체세포가 증식할 수 있는 것이면 좋고, 예를 들면 닭, 비둘기와 같은 가금류, 개, 고양이, 원숭이, 토끼, 양, 돼지, 말, 소, 기니아피그, 쥐, 누드 래트, 햄스터나 보통 생쥐, 누드 생쥐 등과 같은 포유류 동물이다.

인체세포를 동물에 이식하면 바람직하지 않은 면역반응이 일어나므로 사용동물은 될 수 있는 한 유년기, 즉, 알, 태아, 신생동물 또는 어린동물을 사용하여 상기 면역 반응을 감소시킨다.

이식 전에 동물을 약 200 내지 600rem 정도의 X-선 또는

-선으로 조사(照射)하거나 항혈청 또는 면역 억제제를 구사하여 면역 반응을 최소한으로 감소시킨다.

사용되는 동물이 누드 마우스 또는 누드 래트 등과 같은 면역 결핍성 동물을 숙주동물로 사용하는 경우에는 성장한 것이라도 면역 반응이 약하므로 상술한 인채 세포계를 예비처리 없이 이들 동물에게 이식할 수 있고 불필요한 면역 반응을 염려할 것 없이 쉽사리 증식시킬 수 있다.

동종 또는 이종의 사람이외의 온혈동물을 사용하여 연속 이식을 실시함으로써 세포증식을 안정화 할 수 있고 LK 3 생산성을 증가시킬 수 있다. 예를 들면, 인체 세포계를 먼저 햄스터에 이식하여 증식시켜 다음 이 세포를 다시 누드 마우스에 이식하여 증식시킴으로써 목적을 달성할 수 있다. 이 연속 이식은 동일한 강 또는 목 그리고 동일한 속 또는 종에 속하는 온혈동물에 대하여 실시할 수 있다.

인체 세포계를 증식할 수 있는 부위이면 동물의 어느 부위이던지 이식할 수 있는데, 예를 들면 요액강(allantoic cavity), 정맥, 복강 또는 피하에 이식할 수 있다.

또한, 동물세포로 오염되는 것을 방지하고 반면에 인체세포에 동물의 영양체액을 공급하는 다공성 여과막, 예를 들면 구멍직경이 약 10^-7∼10^-5m인 멤브레인 필터, 한외 여과기 또는 중공섬유(hollow fiber)등이 구성된 공지의 각종 형상과 크기의 확산실내에 인체세포를 넣고 이 확산실을 동물 복강내에 매설하여 동물로부터 영양체액을 공급받으면서 확산실내에서 인체세포를 증식시킬 수도 있다.

더욱이, 확산실을 동물체외에 설치하여 확산실내의 영양액이 확산실내를 쉽게 순환할 수 있도록 고안하기도 한다. 실내의 배양상태를 확산실벽에 구성한 투명한 옆창문을 통해 관찰하고/하거나 일정한 시간 간격으로 확산실 자체를 새것으로 대체하여 동물을 희생시키지 않고 동물의 수명이 있는 동안까지 세포를 계속 증식시켜 동물당 세포 생성량을 증가시킬 수 있다. 인체세포와 동물세포의 직접 접촉이 없기 때문에 확산실은바람직하지 아니한 면역반응을 일으킬 염려가 없고, 면역반응을 감소시키기 위해 어떠한 사전처리를 할 필요없이 사람이외의 온혈동물을 쉽사리 이용할 수 있으며, 증식된 생존한 인체세포를 확산실로부터 쉽게 수확할 수 있다.

동물의 사육은 보통방법으로 실시하며, 이식후에도 특별한 조치가 필요없다. 세포의 최대증식에 필요한 기간은 보통 1주 내지 10주이다. 수득되는 인체세포의 수는 동물개체당 약 10⁷∼10¹²개 또는 그 이상이다. 특히, 본 발명에 따르면 이식된 인체세포는 약 10¹∼10⁷배 또는 그 이상 증가하는데, 이것은 생체외의 영양 배지에서 인체세포를 접종하여 증식시켜 얻을 수 있는 양의 10∼10⁶배 또는 그 이상의 양에 해당된다. 이 방법은 LK 3 생산에 참으로 이로운 것이다.

증식된 인체세포내에서 LK 3을 유도할 수 있는 한 어떤 방법이던 본 발명에 적용할 수 있다. 증식된 인체세포를 세포증식 숙주로 사용되는 동물체내에서 LK 3 유도물질을 작용시킬 수 있다. 예를 들면, 복강내의 복수에 부유상으로 증식된 인체세포나 피하에서 형성된 종양세포를 체내에서 LK 3 유도물질에 직접 작용시켜 LK 3의 생성을 유도하고, 복수, 혈청 및/또는 종양으로부터 LK 3을 채취한 다음 이를 정제한다. 또한, 증식된 인체세포를 동물로부터 수확하여 체외에서 LK 3 유도물질에 작용시킬 수도 있다. 예를 들면,복수 현탁액으로부터 수확하거나 피하에서 형성된 종양물질을 적출분리하여 수득한 증식된 인체세포를 약20∼40℃로 예열된 영양배지에 세포농도가 약 10⁵∼10⁸세포/ml되게 부유시켜 생체외에서 유도물지를 작용시킨 다음 배지로부터 축적된 LK 3을 회수한다.

종래 형식의 확산실을 사용하는 경우, 증식된 인체세포를 확산실내에서 또는 확산실로부터 수거한 후에 LK 3에 유도물질에 작용시킨다.

이같이 수득한 인체세포를 시험관내에서 1 내지 4일간 더 배양하여 세포의 증식세대를 동조시킨 다음 LK 3 생산을 유도할 수도 있다.

동물당 LK 3의 생산은 다음 방법 중 한가지 이상을 적용하여 더 증가시킬 수 있다.

(1) 증식된 인체세포를 세포증식용 숙주동물 체내에서 LK 3 유도물질에 작용시킨 다음 동물의 특정부위 또는 전부위로부터 채취한 후, 시험관외에서 인체세포를 LK 3 유도물질에 작용시키는 방법.

(2) 인체세포를 거듭하여 LK 3 유도물질에 작용시키는 방법 및,

(3) 동물체내에 매설되거나 체외에 연결된 확산실을 일정한 시간 간격을 두고 새로 대체하는 방법.

본 발명에 사용할 수 있는 LK 3 유도물질은 바아러스, 헥산 및 뉴클레오타이드 등과 같은 통상의 IFN-

유도물질과, 피토헤마그글루티닌, 콘가나발린 A, 포우크워드 미토겐, 리포폴리사카라이드, 엔도톡신, 폴리사카라이드 및 박테리아 등과 같은 통상의 IFN-

유도물질이다.

항원은 감작세포(sensitilzed cell)에 대하여 LK 3 유도불질로 작용한다. LK 3 생산은 IFN-

- 및 IFN-

- 유도물질을 조합하여 사용하므로써 증가시킬 수 있다. 이 조합은 HuIFN의 동시 생산을 유도함을 확인하였다. 둘 이상의 생물학적 활성물질, 즉, 고가의 LK 3 및 HuIFN등을 적은 비용으로 동시에 대량 생산할 수 있고, 인체세포를 더욱 효과적으로 사용할 수 있다는 점에서 매우 유익하다.

이렇게 수득한 LK 3은 한가지 이상의 정제 및/또는 분리방법, 예를 들면 염석(salting-out), 투석(dialysis), 여과, 원심분리, 농축 및/또는 동결 건조 처리로 회수할 수 있다. 고순도의 정제된 LK 3이 필요한 경우에는 상기 처리방법파 함께 통상의 다른 처리방법, 즉, 이온교환에 의한 흡착 및 탈착, 겔 여과(gel filtration), 등전점 분별, 전기영동, 이온교환 크로마토그라피, 고속 액체 크로마토그라피, 칼럼 크로마토그라피 및/또는 친화성(affinity) 크로마토그라피 등의 방법을 조합하여 최고순도의 LK 3을 얻을 수 있다. 모노클로날(monoclonal) 안티-LK 3 항체를 적당한 수불용성 담체, 예를 들면 BrCN-활성화 세파로스(스웨덴국의 웁살라의 Pharmacia Fine Chemical AB제품)에다 결합시켜 수득한 고정화 모노클로날 항체를 사용하여 효율적으로 LK 3의 정제처리를 신속하고도 용이하게 할 수 있다. 모노클로날 안티-LK 3항체는, 인간을 제외한 온혈동물에 LK 3을 면역시키고 동물체내로부터 항체 생산 세포를 회수하여 이를 미엘로마 세포(myeloma cell)와 융합시킨 후 안티-LK 3 항체 생산성 클론(clone)을 분리하여 이를 증식시키고 형성된 항체를 회수함으로서 제조할 수 있다.

이렇게 수득한 LK 3은 다음과 같은 물리화학적 특성을 가지고 있음이 확인되었다.

(1)분자량 :

15,0000±2,000달톤

(2) 등전점 :

pI = 4.5±0.5

(3) 전기영동 이동치(Disc-PAGE에서) :

Rf = 0 .73±0 .05

(4) 자외선 흡수 스펙트럼 :

약 280mm에서 최대 흡수

(5) 용매에 대한 용해도 :

(6) 착색반응 :

로우리 방법 또는 마이크로뷰레트 방법에 의해 단백질 양성, 페놀-황산 방법 또는 안트론-황산 방법에 의해 사카라이드 양성

(7) 생물학적 활성 :

HuIFN-

(8) 수용액중의 안정성 :

(9) 냉온보존 안정성:

-10℃에서 1개월 이상 안정

LK 3은 정상 인체세포에 대하여 세포 붕해작용을 거의 미치지 아니하나, HuIFN 존재하에 각종 인체 종양세포에는 현저한 붕해현상을 일으켜 세포를 사멸시킨다는 것도 확인되었다. 따라서 조성물 형태의 LK 3은 LK 3-감수성 질환, 예를 들면 악성종양, 특히 종래 치료가 극히 어려웠던 인체 질환의 예방 또는 치료제로 적당하다.

LK 3의 활성을 KB 세포나 L 929 세포를 표적세포로 하여 분석하였다. KB 세포를 사용하는 경우, KB세포에 대한 세포정지 활성을 공지 방법[참조 : Cancer Chemotherapy Reports Part 3, Vol.3 No.2, September(1972)]에 따라 HuIFN-

(비활성 : 2×10⁸단위/mg 단백질) 20,000단위 존재 또는 부재하에 측정하였다. L 929 세포를 사용하는 경우, 악티노마이신 D 존재하의 L 929 세포에 대한 세포독성은 공지 방법[참조 : Lymphokines, Vol.2, pp.246-249, "Tumor Necrosis Factor", edited by E. Pick, Acadmic press, Inc. (1981)]에 따라 측정하였다. 본명세서에서는 특별한 기재가 없는 한 KB 세포 및 HuIFN-

를 사용하는 첫번째 방법을 사용하였다.

IL 1의 활성을 측정[참조 : Diana Boraschi et al., The Journal of Immunology, Vol.133, No.2 August(1984)]하거나, IL 2의 활성을 측정[참조 : Steven Gillis et a1., The Journal of Immunology, Vol.120, No.6, pp.2027-2032(1978)]함으로써 IL의 활성을 측정하였다.

HuIFN 활성은 사람 양막(amnion) 발원 FL 세포를 사용하는 플라크 환원 방법(plaque-reduction method) [참조 : Protein Nucleic Acid and Enzyme, Vol.20, No.6 pp.616-643(1975)]에 따라 분석하였다.

혈구응집역가를 공지 방법[참조 : S.E. Salk, The Journal of Immunology, Vol.49, pp.87-98(1944)]에 따라 측정하였다.

다음 실험을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

실험 A-1

부분정제 LK 3의 제조

신생 햄스터에 토끼로부터 공지 방법으로 만든 항혈청을 주사하여 그 면역 반응을 약화시키고, 피하에 인체 임파아구종 세포인 BALL-1을 이식한 후 통상의 방법으로 3주간 사육하였다. 피하에 형성된 종양 덩어리를 추출하여 세절하고 생리 식염수(Saline)중에서 분산시켰다. 수득한 세포 현탁액을 혈청을 보충을 RPMI 1640매체(pH 7.2)로 씻고 새로 조제한 동일한 배지에 현탁시켜 약 2×10⁶세포/ml의 세포농도로 되게 하였다. 이 세포 현탁액에 센다이 바이러스(약 400혈구응집역가/ml)를 가하고 37℃에서 24시간 방치하여 LK 3 생산을 유도하였다.

배양균을 4℃ 및 약 1,000×g에서 원심분리하고 생성된 침전물을 제거하였다. 수득한 상청액을 0.01M 인산염 완충액(pH 7.2) 함유 생리 식염수에 대하여 20시간 투석하고 멤브레인 필터로 처리하였다. 여액을 고정된 안티-HuIFN 항체의 칼럼을 통과시키고 비흡착 부분을 채취하였다. 이 분획물로부터 크로마토포커싱(chromatofocuging)법으로 활성부분을 회수하고 농축한 후 동결건조하여 LK 3 활성을 가진 분말을 얻었다.

이 분말 제품의 비활성은 약 10⁵단위/mg 단백질이었다. 또한 LK 3 수율은 햄스터 1마리당 약 1.0×10⁶단위이었다.

실험 A-2

안티-LK 3 항체의 제조

상기 실험 A-1 방법으로 수득한 LK 3을 생리 식염수에 용해시켜 약 0.05w/w%(단백질로서)의 농도로 만들고, 여기에 동량의 "프로인드 완전 보조제(Freund's complete adjuvant)"를 가하였다. 수득한 혼합액 0.2ml씩을 마우스의 피하에 주사한 다음 7일 후 마찬가지로 주사하여 마우스를 면역 증강시켰다. 동물의 항체 생산 세포에서 안티-LK 3 항체 생산을 유도한 후 동물의 비장을 취출하여 세절, 분산하고, 마우수의 미엘로마 세포계, P₃-X63-Ag8(Flow Laboratories Inc., Rockville, Maryland, USA의 제품)와 함께 50w/v% 폴리에틸렌 글리콜 1000함유의 37℃로 예열된 무혈청 "이글(Eagle)"최소 필수배지(pH 7.2)중에 현탁시켜 각 세포 농도가 10⁴세포/ml되게 한 후 수득한 혼합물을 5분간 방치하였다.

이어서 혼합물을 새로 조제한 동일 배지를 사용하여 20배로 희석하고 히포크산틴, 아미노프테린, 티미딘 함유 배지 중에서 성장 가능한 하이브리도마 세포를 공지 방법[참조 : R.L. Davidson and P.S. Gerald, Somatic Cell Genetics, Vol.2, No.2, pp.(1976)]으로 수집하고, 안티-LK 3 항체 생산성 하이브리도마클론을 선택하였다. 마우스 복강내에 클론을 마우스 1마리당 약 10⁶세포의 양으로 이식하고 2주간 사육한후 도살하여 복수나 혈액같은 동물의 체액을 회수하여 원심분리하고, 황산암모늄을 염석한 후 30-50% 포화도에서 침전하는 분획을 모아 이들 분획을 투석하고, 실험 A-1에서 얻은 LK 3 시료와 BrCN-활성화 세파로스를 실온에서 반응시켜 수득한 고정화 안티-LK 3 항체 겔을 사용하여 친화성 크로마토그라피 처리하여 안티-LK 3 항체를 수득한 다음 투석, 농축 및 동결건조시켰다.

수득한 분말 제제는 LK 3 활성에 대하여 면역학적으로 특이한 중화활성을 나타내었다.

실험 A-3

고순도 정제 LK 3의 제조 및 물리화학적 특성

실험 A-1 방법으로 수득한 부분정제 LK 3을 시험 A-2 방법으로 제조한 고정화 모노클로날 항체 겔을 사용하여 친화성 크로마토그라피 처리하여 LK 3 분획을 모아 투석, 농축 및 동결건조시킴으로써 비활성(specific activity)이 약 10⁷단위/mg 단위×단백질인 고순도 LK 3 제제를 수득하였다.

이 제제로 LK 3의 물리화학적 특성을 검토하였다.

(1) 분자량 :

LK 3의 분자량은 SDS-폴리아크릴아이드 겔을 사용하는 전기영동 방법[참조 : K. Weber and M.Osborn, Journal of Biological Chemistry, Vol.244, p.4,406(1969)]으로 측정하였다. 0.1% SDS 존게하에 10% 아크릴아미드 겔의 칼럼에 시료 약 10마이크로그람을 부하하여 각 칼럼당 8mA로 4시간 전하를 걸어서 전기영동을 실시한 다음 추출하여 활성분획의 LK 3을 분석한 결과, LK 3의 분자량은 15,000±2,000달톤이었다.

(2) 등전점 :

일렉트로포커스 처리용 겔 제제인 "앰플림 패그플레드(AMPHOLINE PAGPLATE(pH 3.5∼9.5"; (LKB-Produkter AB, Stockholm, Sweden의 상품)를 사용하여 2시간 25W의 등전점 전기영등 처리 결과, 등전점 pI는 4.5±0.5이었다.

(3) 전기영동 이동치 :

공지방법[참조 : B.J.Davis, Annals of New York Academy of Sciences, Vo.121, p.404(1964)]에 따라 제제 약 10마이크로그람씩을 7.5% 아크릴아미드 겔 칼럼상에 걸고 pH 8.3에서 3mA로 각 칼럼을 2시간 전기영동 처리한 후 추출하여 LK 3 활성을 분석한 결과 전기영동 이동치 Rf는 0.73±0.05이었다.

(4) 자외선 흡수 스펙트럼 :

제제를 UV-흡수 스펙트럼 분석(사용 기기는 UV-250 스펙트로메터, 일본 시마쓰 회사 제품) 결과, 파장 약 280nm에서 최대 흡수를 보였다.

(5) 용매에 대한 용해도 :

물, 생리 식염수 및 인산염 완출액에는 가용성이며, 에틸 에테르, 에틸 아세테이트 및 클로로포름에는 거의 녹지 않거나 전혀 녹지 아니하였다.

(6) 착색반응 :

로우리 방법 및 마이크로뷰레트 방법에 의해 단백질 양성, 페놀-황산 방법 및 안트론-황산 방법에 의해 사카라이드 양성이었다.

(7) 생물학적 활성 :

HulFN-

존재 또는 부재하에 KB 세포에 대해 세포정지성 활성, L 929 세포에 대하여는 세포독성을 나타내었다.

IL 또는 IFN 활성은 거의 없었다.

(8) 용액중의 안정성 :

i) 열안정성 : 약 1×10³단위/ml씩의 제제를 각기 pH 7.2에서 30분간 상이한 온도에서 방치한 후, 잔존활성을 분석한 결과, LK 3은 60℃까지 안정함을 확인하였다.

ii) pH 안정성 : 0.1ml의 제제(1×1⁴단위/ml) 각각에 pH가 다른 완충액, 즉 pH 2∼7의 매킬배인 완충액(Mcllvaine buffer), pH 7∼8의 인산염 완충액, pH 8∼11의 글리신-NaOH 완충액 각각 1ml씩을 가하고, 4℃에서 16시간 방치한 후 방치 혼합액 각 0.1ml를 0.05M 인산염 완충액(pH 7.2)으로 pH 7.2로 조절하여 잔존활성을 분석한 결과, LK 3은 pH 2.0-11.0의 범위에서 안정함을 확인하였다

(9) 냉온보존 안정성 :

LK 3 제제 용액 중에서 -10℃, pH 7.2로 1개월 보존한 후 분석 결과, 활성감소는 전무하였다.

상기 실험 결과로부터 LK 3은 LT, IL 또는 IFN 등과 같은 공지의 림포카인과는 물리화학적 특성이 현저히 다른 것임을 보이고 있다.

실험 B-1

악성종양세포에 대한 세포정지 활성

실험 A-3의 방법에 따라 수득한 LK 3 제제로 몇가지 인체세포에 대한 LK 3의 세포정지 활성을 조사하였다.

표 1에 나타낸 인체세포 한가지(10⁶세포)를 태아 송아지 형청을 보충한 통상의 영양배지 1ml중에 현탁시키고 1일간 배양하여 20단위의 LK 3 제제(실험 A-3의 방법으로 제조한 것) 또는 20단위의 LK 3 제제와 2,000단위의 HuIFN-

(비활성 : 2×10⁸)를 함유하는 0.1ml씩의 생리 식염수를 가하고 37℃에서 2일간 배양하였다. 배양이 완료된 후 활성세포를 공지방법[참조 : Applied Microbiobiology, Vol.22, No.4, pp.671-677(1971)]에 따라 염색제인 뉴트럴 레드(neutral red)로 염색하고, 영색제를 산성 에탄올 용액으로 용출시켜 파장 540nm에서 용리액의 흡광도를 측정하여 활성세포의 수를 측정하였다.

대조 실험용으로 LK 3 무함유 생리 식염수 0.1ml를 사용하였다.

세포정지율(%)을 다음 식으로 계산하였다.

[표 1]

주 : *)는 악성종양 발원의 인체 세포계를 나타냄.

**)는 정상 발원의 것을 나타냄.

표 1에 결과를 나타냈다.

위의 결과에서 보는 바와 같이 LK 3은 HuIFN과 함께 여러가지 악성종양 세포의 성장을 억제하고 있다. 또 LK 3 및 고순도 정제된 HuIFN-

는 정상 또는 악성종양세포에 영향을 미치지 아니한다.

실험 B-2

한무리의 BALB/C 누드 마우스 등 부위 피하조직에 사람의 유암조직 단면을 이식하고, 동물체내에서 종양 덩어리가 약 200mm³로 성장한 후 실험 A-1, 또는 A-3 방법에 따라 수득한 LK 3 제제를 함유하는 생리 식염수를 매일 1회 HuIFN-

(비활성 : 2×10⁸단위/mg 단백질) 5,000단위와 함께 50단위/kg 또는 500단위/kg을 20일간 정맥주사 하였다. 그런 다음, 누드 마우스를 도살하여 종양 덩어리의 무게를 측정하였다.

그 결과는 표 2와 같다.

[표 2]

주: *)는 5% 유의 수준에서의 대조 실험에 대한 통계적 의의가 있는 값을 나타냄.

실험 B-3

급성독성 실험을 우해 20일 성장쥐 한 무리에 시험 A-3 방법에 따라 수득한 LK 3 제제를 투여한 결과, 제제의 독성은 매우 낮은 것으로서 본강내에 주사하였을 때의 LD₅₀은 10⁸단위 또는 그 이상이었음음 확인하였다.

위의 실험에서 명백한 바와 같이, LK 3 및 HuIFN의 조합은 생체외나 생체내에서 모두 악성종양 성장을 현저하게 억제하고 있다. LK 3의 투여는 유효 투여량을 감안할 때 안정성은 극히 높다.

일반적으로 LK 3의 유효 투여량은 성인에 있어서 1∼100,000,000단위/일인데, 이를 상세히 설명하면, 예컨데 국부투여인 경우는 국부주사나 점안제 형태로 1∼1,000,000단위/일이고, 경피 또는 경점막 투여인 경우는 연고나 좌제 형태로 10∼50,000,000단위/일이고, 전신 투여인 경우는 정맥 또는 근육주사로 10∼10,000,000단위/일인데, 그 투여량은 투여방법과 환자의 증후에 따라 임의로 바꿀 수 있다. LK 3은 통상의 담체, 염기 및/또는 부형제와 함께 적당히 혼합하여 의약을 조제할 수 있는데, 이 경우 LK 3의 함량은 독성, 유효량 및 안전성 등을 감안하여 1단위/g 이상이 되어야 한다.

LK 3-감수성 질환의 예방 및/또는 치료제의 형태 및 종류는 임의로 선택할 수 있는데, 예를 들면 경구 투여에 있어서는 캡슐, 정제, 산제 등의 장용제제, 직장투여용으로는 좌제로 하여, 주사제일 경우는 사용직전 증류수로 희석하여 주사액으로 사용할 수 있도록 동결건조 주사제로 할 수 있고, 국부처리용으로는 점비제, 점안제 또는 연고 등으로 조제할 수도 있다.

악성종양 환자를 치료함에 있어서는 환자로부터 종양조직 단편을 채취하여 시험관내에서 LK 3으로 처리하여 조직 단편의 면역발현성을 강화시켜 환자에게 투여함으로써 악성종양의 치료를 더욱 효과있게 한다. LK 3과 기타 항종양제, 예컨데 TNF, LT 및 LIS등과 같은 림포카인, 베타-1,3-글루칸, 아라비노만난, 리포폴리사카라이드, 피시바닐(OK-432), 크레스틴(PSK) 및 렌티난 등과 같은 항종양성 다당류, 매토트렉세이트(MIX) 및 풀루오로우라실(5-FU)등과 같은 대사 독소루비산(ADM) 및 미토마이신 C(MMC)등과 같은 항종양성 항생제 등을 조합하여 사용하는 것도 매우 효과적이다.

다음 실시예 A에서 LK 3의 제조예를, 그리고 실시예 B에서 LK 3 함유 약제학적 조성물의 제조예를 설명한다.

실시예 A-1

20% 태아 송아지 혈청을 보충한 Eagle의 최소 필수배지(pH 7.4)에 인체 임파아구종 세포, BALL-1을 접종하고 통상의 방법으로 37℃에서 시험관내 현탁액중에서 배양하였다. 증식한 인체세포를 혈청 무함유 Eagel의 필수배지(pH 7.4)로 세척하고 새로 조제한 같은 배양 배지중에 재현탁시켜 세포밀도를 약 1×10⁷세포/ml로 한다. 세포 현탁액에 약 1,000현구응집역가/ml의 양으로 센다이 바이러스를 가한 후 38℃에서 1일간 방치하여 LK 3 생산을 유도하였다. 수득한 배양물을 1,000×g, 약 4℃에서 원심분리하고 상청액을0.01M 인산염 완충액(pH 7.2) 함유 생리 식염수로 15시간 투석한 후 멤브레인 필터로 여과하였다. 여액을 실험 A-1에서와 마찬가지로 안티-LK 3 항체의 칼럼을 통과시키고 비흡착 분획을 실험 A-3의 경우와 마찬가지로 안티-LK 3 항체-결합 겔을 사용하는 친화성 크로마토그라피로 정제한 후, 이를 농축하여 비활성이 약 10⁷단위/mg 단백질인 LK 3 농축액을 수득하였다.

수율은 유도된 세포 현탁액 1ℓ당 약 2.0×10⁴단위이었다.

실시예 A-2

신생 햄스터에 토기로부터 공지 방법으로 만든 항혈청을 주사하여 면역 반응을 약화시킨 후, 피하에 인체 임파아구종 세포, BALL-1을 이식하고 통상의 방법으로 3주간 사육하였다. 동물의 피하에 형성된 약 15g의 종양 덩어리를 채취하고 세절하여 생리 식염수 중에서 분산시켰다. 혈청 무함유 RPMI 1640배지(pH 7.2)로 세척하고 증식세포를 새로 조제한 같은 배지중에 재현탁시켜 세포밀도를 약 5×10⁶세포/ml로 하였다.이 세포 현탁액에 1,000 혈구응집역가/ml 및 10마이크로그람/ml의 양으로 센다이 바이러스 및 E. coli 엔도톡신을 각각 가하고 37℃에서 1일간 방치하여 LK 3 생산을 유도하였다. 배양액을 약 1,000×g, 4℃에서 원심분리하여 침전을 제거하고 상청액을 0.10M 인산염 완충액(PH 7.2) 함유 생리 식염수에 대하여 21시간 투석하고 멤브레인 필터로 여과 처리하였다. 여액을 실시예 A-1의 경우와 마찬가지로 항체 칼럼으로 정제하고 용출액을 농축, 동결건조 처리하여 비활성이 약 10⁷단위/mg 단백질인 LK 3 분말 제제를 수득하였다.

수율은 약 1.5×10⁶단위이었다.

실시예 A-3

성장한 누드 마우스(nude mouse)의 복강내에 인체 임파아구종 세포, TALL-1을 이식하고 통상의 방법으로 5주간 사육한 후, 자외선 조사로 미리 거의 불활성 처리한 뉴카슬병(Newcastle diseace) 바이러스(누드 마우스 1마리당약 3,000혈구응집역가)를 주사하고 24시간 후 도살하여 그 복수를 채취하였다. 복수를 실시예 A-2 경우와 마찬가지로 정제, 농축 및 동결건조 처리하여 LK 3 활성을 가진 분말 제제를 수득하였다.

수율은 약 3.0×10⁵단위/누드 마우스이었다.

실시예 A-4

성장한 마우스에 약 400rpm의 X-선을 조사하여 면역반응을 약화시키고, 피하에 인체 임파아구종 세포, Mono-1을 이식한 후, 통상의 방법으로 3주간 사육하였다. 동물 피하에 형성된 약 10g의 종양 덩어리를 채취하여 실시예 A-2 경우와 마찬가지로 분산시켰다. 이같이 수득한 인체세포를 실시예 A-2와 마찬가지로 현탁시킨 후, 센다이 바이러스 및 콘카나발린 A를 각각 약 500혈구응집역가/ml 및 0.8마이크로그람/ml의 양으로 가하고 37℃에서 1일간 방치하여 LK 3 생산을 유도하였다. 이어서 배양액을 실시예 A-2와 마찬가지로 정제, 농축 및 동결건조 처리하여 LK 3 활성을 가진 분말상 제제를 수득하였다.

수율은 약 1.0×10⁶단위/마우스이었다.

실시예 A-5

신생 햄스터에 실시예 A-2 경우와 마찬가지로 인체 임파아구종 세포, 나말와(ATCC CRL 1432)를 이식하고 통상의 방법으로 4주간 사육하였다. 피하에 형성된 약 20g의 종양 덩어리를 채취하고 분산시켜 세포농도 약 3×10⁶세포/ml인 세포 현탁액을 수득하였다. 이 세포 현탁액에 약 1,000혈구응집역가/ml의 양으로 센다이 바이러스를 가하고 36℃에서 2일간 방치하여 LK 3 생산을 유도하였다. 배양액을 실시예 A-1과 마찬가지로 정제, 농축하여 LK 3 활성을 가진 농축물을 수득하였다.

수율은 약 1.3×10⁶단위/햄스터이었다.

실시예 A-6

인체 임파아구종 세포, NALL-1을 생리 식염수에 현탁시킨 것을 기공지름이 약 0.5 미크론인 멤브레인 필터가 장치된 약 10ml의 원통형 플라스틱 확산실안에 넣고, 이 확산실을 성장쥐의 복강내에 매설하고 통상의 방법으로 4주간 사육한 다음 확산실을 제거하여 확산실내의 세포밀도가 약 5×10⁸세포/ml이었음을 확인하였다. 이는 영양배지를 사용하여 CO₂항온기중에서 시험관내에서 증식시키는 경우와 대비할 때 10²-배 이상의 양에 해당하는 것이었다. 인체세포를 실시예 A-2의 경우와 마찬가지로 배지에 현탁시키고, 자외선 조사로 미리 불활성 처리한 뉴카슬병 바이러스(약 500혈구응집역가/ml) 및 피토헤마글루티닌(약 50마이크로그람/ml)을 가하고 37℃에서 1일간 방치하여 LK 3 생산을 유도하였다. 그후 배양액을 실시에 A-2경우와 마찬가지로 정제, 농축 및 동결건조 처리하여 LK 3 활성을 가진 분말 제제를 수득하였다.

수율은 약 4×10⁵단위/쥐이었다.

실시예 A-7

인체 임파아구종 세포, CCRF-CEM(ATCC CCL 119)를 37℃에서 5일간 부화시킨 수정란의 요막강(allantoic cavity)에 접종하고, 이 계란을 계속하여 1주일간 같은 온도에서 부화시켰다. 증식된 인체세포를 계란으로부터 수확학 실시예 A-1 경우와 마찬가지로 현탁시켜 세포농도가 5×10⁶세포/ml로 되게 하였다. 이 세포 현탁액에 센다이 바이러스(약 500혈구응집역가/ml)를 가하고 37℃에서 1일간 방치하여 LK 3생산을 유도하였다. 이 배양액을 실시예 A-2의 경우와 마찬가지로 정제, 농축하여 LK 3 활성을 가진 분말 제제를 수득하였다.

수율은 약 5.0×10⁵단위/부화 계량 10개 이었다.

실시예 B-1

주사제

실시예 A-2의 방법에 따라 제조한 500,000단위의 LK 3을 200ml의 생리 식염수에 희석하고 멜브레인 필터로 멸균 여과 처리하였다. 여액 2ml를 멸균된 주사 앰플에 넣고 동결건조 처리 후 밀봉하여 분말 주사제를 얻었다.

이 분말 제제는 HuIFN-

및/또는 HuIFN-β와 함께 조합 사용하여 유암, 폐암, 간암 및 백혈병을 치료하는데 좋은 효과를 얻을 수 있다.

실시예 B-2

주사제

인체 임파아구중 세포로부터 유도한 HuIFN-

3×10⁸단위를 2×10⁵단위의 LK 3과 함께 200ml의 생리식염수에 용해시키는 것이외는 실시예 B-1 경우와 유사하게 분말 주사제를 만들었다.

이 분말 제제는 유암, 폐암, 간암 및 백혈병을 치료하는데 효과적으로 사용할 수 있다.

실시예 B-3

연고제

실시예 A-3의 방법에 따라 제조한 1과 HuIFN-

를 최소량의 액상 파라핀과 함께 균일한 반죽한 다음 이 혼합물에 통상의 방법으로 백색 바셀린을 가하여 LK 3 함량 1,000단위/g 및 HiIFN-

함량 1×10⁶단위/g인 연고를 수득하였다.

이 연고제는 피부종양, 유암 및 임파종을 효과적으로 치료할 수 있다.

실시예 B-4

점안제

800ml의 증류수, 5ml의 페닐에틸 알콜, 100,000단위의 LK 3 사료(실시예 A-4의 방법으로 제조) 및 1×10⁷단위의 HuIFN-

의 혼합물을 염화 나트륨과 함께 증류수를 추가하여 혼합해서 1,000ml의 등장용액 (isotonic solution) 을 조제하였다.

이 액제는 망막아세포종을 효과적으로 치료할 수 있다.

설시예 B-5

장용성 제피정(enteric coated tablet)

전분, 말토스 및 LK 3(실시예 A-7의 방법으로 제조)의 혼합물을 통상의 방법으로 장용제피정으로 만들어 정제 1개(100mg)당 LK 3 함량이 200,000단위/정(100mg)되게 한 다음 메틸 셀루로스의 프탈레이트 에스테르로 피복시켰다.

이 정제를 HuIFN-

함유 약제와 조합하여 적당한 경로를 통해 투여함으로서 결장암 및 간암 등을 효과적으로 치료할 수 있다.

위에서 바람직한 실시예를 들고 본 발명의 내용을 상세히 설명하였으나, 본 분야에서 통상의 기술을 가진 사람은 본 발명의 요지와 범위를 이탈함이 없이 이들을 응용하고 변화시킬 수 있을 것이다.

Claims

(가) 림포카인(LK 3)을 생성할 수 있는, Namalwa 세포(ATCC CRL 1432), BALL-1 세포, TALL-1 세포, NALL-l 세포, M-7002 세포, B-7101 세포, JBL 세포, EBV-Sa 세포, EBV-Wa 세포, EBV-HO 세포, MOLT-3 세포(ATCC CRL 1552), CCRF-SB 세포(ATCC CCL 120), CCRF-CEM 세포(ATCC CCL 119), BALM 2 세포, DND-41 세포 및 Mono-1 세포로 된 군으로부터 선택되는 인체세포를 LK 3 유도물질에 작용시켜 상기 LK 3를 생성시키고, (b) 아래와 같은 물리화학적 특성을 가진 생성된 림포카인(LK 3)을 회수함을 특징으로 하는 림포카인(LK)의 제조방법.

(1)분자량 :

15,0000±2,000달톤

(2) 등전점 :

pI=4.5±0.5

(3) 전기영동 이동치(Disc-PAGE에서) :

Rf=0.73±0.05

(4) 자외선 흡수 스펙트럼 :

포장 약 280mm에서 최대 흡수를 보임

(5) 용매에 대한 용해도 :

물, 생리 식염수 또는 인산염 완충액에 가용성, 에틸 에테르, 에틸 아세테이트 또는 클로로포름에는 거의 녹지 않거나 불용성

(6) 착색반응 :

로우리(Lowry) 방법 또는 마이크로뷰레트 방법에 의해 단백질 양성, 페놀-황산 방법 또는 안트론-황산 방법에 의해 사카라이드 양성

(7) 생물학적 활성 :

HuIFN-
존재 또는 부재하에 KB 세포에 대하여 세포 정지성, L 929 세포에 대하여 세포 독성, IL 및 IFN 활성 거의 없음

(8) 수용액중의 안정성 :

pH 7.2에서 30분간 보존할 때 60℃까지 안정, 4℃에서 16시간 보존할 때 pH 2.0 내지 11.0범위에서 안정

(9) 냉온보존 안정성:

-10℃에서 1개월 이상 안정
제1항에 있어서, 인체세포를 생체내 또는 시험관내에서 증식시키는 제조 방법.
제1항에 있어서, LK 3을 생성할 수 있는 인체세포롤 인간을 제외한 온혈동물에 이식하고, 상기 동물을 사육하여 상기 이식된 인체세포가 동물의 영양체액을 이용하여 증식할 수 있게 하고, 상기 동물의 체내에서 형성된 종양을 적출하여 분산시킴으로써 생체내에서 증식된 인체세포를 수득하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 인간을 제외한 온혈동물의 영양체액을 인체세포에 공급할 수 있는 확산실내에 인체세포를 현탁시키고, 이 확산실을 인간을 제외한 온혈동물의 체내에 매설하거나 체표면에 설치하여 확산실내의 인체세포에 온혈동물의 영양체액을 공급하고, 동물을 사육하여 인체세포가 영양체액을 이용하여 증식토록 하고, 확산실로부터 증식된 인체세포를 채취함으로써 생채내에서 증식된 인체세포를 수득하는 제조 방법.
제3항에 있어서, 인간을 제외한 온혈동물이 가금류 또는 포유동물인 제조 방법.
제4항에 있어서, 인간을 제외한 온혈동물이 가금류 또는 포유동물인 제조 방법.
제3항에 있어서, 인간을 제외한 온혈동물이 면역결핍 또는 면역 억제된 것인 제조 방법.
제4항에 있어서, 확산실은 하나 또는 그 이상의 멤브레인 필터, 중공섬유(hollow fiber) 또는 10^-7∼10^-5m의 기공크기를 가진 한외여과기가 장치된 것인 제조 방법.
제1항에 있어서, 작용단계를 시험관내에서 실시하는 제조 방법.
제1항에 있어서, 작용단계를 체내에서 실시하는 제조 방법.
제1항에 있어서, LK 3 유도물질이
-인터페론 유도물질,
-인터페론 유도물질 및 이들의 혼합물로 된 군으로부터 선택되는 것인 제조 방법.
약제학적으로 허용되는 담체에 제1항의 LK 3을 유효량 함유시키는 단계를 포함하는 의약 조성물의 제조 방법.
제12항에 있어서, 의약 조성물이 항종양제인 제조 방법.
제12항에 있어서, 의약 조성물이 주사제, 점안제, 점비제, 좌제 또는 연고제 형태인 제조 방법.
제12항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체에 림포카인을 추가로 함유시키는 단계를 포함하는 제조 방법.
제13항에 있어서, 림포카인이 사람의 인터페론인 제조 방법.
제12항에 있어서, LK 3을 조성물 1g당 1단위 이상의 양으로 하여 약제학적으로 허용되는 담체에 함유시키는 제조 방법.