DE3686113T2 - Lymphokin, dessen herstellung und verwendungen. - Google Patents
Lymphokin, dessen herstellung und verwendungen.Info
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neues Lymphokin sowie auf dessen Herstellung und Verwendungen.
- In der vorliegenden Beschreibung werden durchgehend folgende Abkürzungen verwendet:
- LT - bedeutet Lymphotoxin;
- TNF - bedeutet Tumor-Nekrose-Faktor;
- IL - bedeutet Interleukin;
- IFN - bedeutet Interferon;
- IFN-alpha - bedeutet Interferon-alpha;
- IFN-gamma - bedeutet Interferon-gamma; und
- HuIFN - bedeutet menschenspezifisches Interferon.
- LT und TNF sind bekannt als Lymphokine, die Tumorzellen zerstören. Beispielsweise ist LT beschrieben in Ryuichi Aoki et al, SHIN-MENEKIGAKU SOSHO, Band 6, "Lymphokine", S. 87-105 (1979), erschienen bei Igaku-Shoin, Tokyo, In Vitro Method in Cell-Medicated Immunity, herausgegeben von B.R. Bloom & P.R. Glade, erschienen bei Academic Press, Inc. (1971), und Cellular Immunology, Band 38, S. 388-402 (1978); und TNF ist beschrieben in E.A. Carswell et al, Proceedings of the National Academy of Sciences of the U.S.A., Band 72, Nr. 9, S. 3.666-3.670 (1975), sowie Lymphokines, Band 2, S. 235-272, "Tumor Necrosis Factor", herausgegeben von E. Pick, erschienen bei Academic Press, Inc. (1981).
- In jüngster Zeit haben H. Onishi et al ein antionkotisches Lymphokin-Glykoprotein in der japanischen Patent- Offenlegungsschrift Nr. 146,293/83 offenbart, während die Anmelderin ein antionkotisches Glykoprotein in der japanischen Patent-Offenlegungsschrift Nr. 126,228/85 offenbart hat.
- Lymphokine wurden über Jahre hinweg untersucht. Als ein Ergebnis haben wir ein neues Lymphokin mit physikalisch- chemischen Eigenschaften entdeckt, die gänzlich unterschiedlich von denen der bekannten Lymphokine sind, und das eine zytotoxische Aktivität bezüglich bösartiger Tumorzellen bei Vorhandensein von IFN aufweist. Die Produktion von Lymphokin und dessen Verwendung wurde aufgenommen.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Lymphokin, LK 3, zur Verfügung, das die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften besitzt:
- (1) Molekulargewicht:
- 15.000±2.000 Dalton
- (2) Isoelektrischer Punkt:
- pI = 4,5±0,5
- (3) Elektrophoretische Mobilität:
- auf Disc-PAGE, Rf = 0,73±0,05
- (4) UV-Absorptionsspektrum:
- ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm
- (5) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
- löslich in Wasser, Salzlösung und Phosphat-Puffer;
- kaum löslich oder unlöslich in Ethylenether, Ethylacetat oder Chloroform
- (6) Farbreaktion:
- protein-positiv nach dem Lowry-Verfahren oder dem Mikrobürette-Verfahren
- saccharid-positiv nach dem Phenol-Schwefelsäure- Verfahren oder dem Anthron-Schwefelsäure-Verfahren
- (7) Biologische Aktivität:
- cytostatisch bezüglich KB-Zellen mit oder ohne HuIFN-alpha
- cytotoxisch bezüglich L 929-Zellen im wesentlichen frei von IL- und IFN-Aktivitäten
- (8) Stabilität in wässriger Lösung:
- stabil bis zu 60ºC bei 30-minütiger
- Inkubation bei pH 7,2
- stabil im pH-Bereich von 2,0-11,0 bei 16-stündiger Inkubation bei 4ºC; und
- (9) Stabilität bei Kältekonservierung:
- stabil bei -10ºC über eine Zeitdauer von einem Monat oder länger.
- Zur Verkürzung wird das erfindungsgemäße neue Lymphokin nachfolgend einfach "LK 3" genannt.
- LK 3 wird hergestellt, indem LK 3 produzierende menschliche Zellen, beispielsweise menschliche Leukozyten, menschliche Lymphozyten und daraus gebildete Zell-Linien einem LK 3-Induktor ausgesetzt werden. Menschliche Leukozyten und Lymphozyten können aus frischem menschlichen Blut isoliert werden. Die gebildete menschliche Zell- Linie kann durch Verwendung eines herkömmlichen in vitro-Verfahrens proliferiert werden.
- Für eine effizientere Umsetzung der vorliegenden Erfindung ist es wünschenswert, ein in vivo-Zell-Proliferations-Verfahren zu verwenden, in dem die oben beschriebene menschliche Zell-Linie direkt in ein nicht-menschliches, warmblütiges Lebewesen transplantiert oder alternativ in eine konventionelle Diffusionskammer geimpft wird, mittels derer die Nähr-Körperflüssigkeit eines nicht-menschliches, warmblütigen Lebewesens der Zell- Linie zugeführt wird.
- Im Gegensatz zu der in vitro-Zell-Proliferation ist das in vivo-Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß es kein oder ein weitaus weniger kostspieliges Nährkultur-Medium enthaltendes Serum erfordert und weniger Probleme während der Zell-Proliferation bereitet, und darüber hinaus, daß die durch dieses Verfahren proliferierten menschlichen Zellen eine wesentlich höhere LK 3-Aktivität entwickeln.
- Bei dem in vivo-Verfahren kann die menschliche Zell-Linie einfach proliferiert werden, indem die Nähr-Körperflüssigkeit verwendet wird, die von einem nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesen durch Transplantation der menschlichen Zell-Linie in ein nicht-menschliches, warmblütiges Lebewesen geliefert wird, oder alternativ durch die Anordnung der Zell-Linie in einer zur Aufnahme der Körperflüssigkeit bestimmten konventionellen Diffusionskammer und Einbettung der Kammer in oder Anordnung der Kammer auf dem Lebewesen. In jedem Fall werden die Lebewesen in der üblichen Art und Weise gefüttert.
- Darüber hinaus weist das in vivo-Verfahren zusätzliche Vorteile dadurch auf, daß eine viel stabilere und schnellere Zell-Proliferation, eine höhere Zell-Produktion und eine sehr viel höhere Produktion von LK 3 pro Zelle erreicht wird als mit dem in vitro-Verfahren.
- Die menschlichen Zell-Linien, die bei der Erfindung verwendbar sind, können fähig zur Produktion von LK 3 sein, welches in ein nicht-menschliches, warmblütiges Lebewesen transplantiert werden kann, und sind einfach in dem Lebewesen proliferierbar. Beispielsweise können die in Protein, Nucleic Acid und Enzyme, Band 20, Nr. 6, S. 616-643 (1975) listenmäßig genannten menschlichen Zell-Linien bei der Erfindung verwendet werden. Besonders geeignet sind menschliche lymphoblastoide Linien, so wie Namalwa (ATCC CRL 1432), wie beschrieben im Journal of Cllnical Microbiology, Band 1, S. 116-117 (1975); BALL-1, TALL-1 und NALL-1, wie beschrieben von I. Miyoshi, Nature, Band 267, S. 843-844 (1977); M-7002 und B-7101, wie beschrieben in The Journal of Immunology, Band 113, S. 1.334-1.345 (1974); JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, MOLT-3 (ATCC CRL 1552) und EBV-HO, wie beschrieben in The Tissue Culture, Band 6, Nr. 13, S. 527-546 (1980), CCRF-SB (ATCC CCL 120); CCRF-CEM (ATCC CCL 119); BALM 2; DND-41 und andere aufgebaute Zell-Linien, die durch Transformieren von normalen menschlichen Monozyten oder Granulozyten mit einem karzinogenen Virus, einem Wirkstoff oder Bestrahlung erhalten worden sind.
- Die Proliferationsrate und/oder die LK 3-Produktivität pro Zelle von diesen Zell-Linien kann verbessert werden durch Zellfusions-Techniken unter Verwendung von Polyethylenglykol oder einem Sendai-Virus, oder durch genrekombinierende Techniken unter Verwendung eines Nuklease-Enzyms, eines Ligase-Enzyms, eines DHA-Polymerase- Enzyms usw. Die Aufzählung der geeigneten menschlichen Zell-Linien gemäß dieser Beschreibung sollte nicht als die Erfindung einschränkend ausgelegt werden. Es können eine oder mehrere der Zell-Linien in Kombination miteinander bei den Verfahrensstufen bis zur LK 3-Induktion, die nachfolgend beschrieben wird, verwendet werden. Falls notwendig, können menschliche Leukozyten oder Lymphozyten, die aus frischem menschlichen Blut gewonnen worden sind, in Kombination mit jeder der menschlichen Zell- Linien verwendet werden.
- Das nicht-menschliche, warmblütige Lebewesen, das für die Verwendung bei der Erfindung geeignet ist, kann ein beliebiges Lebewesen sein, in dem solche menschlichen Zellen proliferieren. Beispiele für solche Lebewesen sind Vögel, sowie Hühner und Tauben, weiterhin Säugetiere, wie z.B. Hunde, Katzen, Affen, Kaninchen, Ziegen, Schweine, Pferde, Rinder, Meerschweinchen, Ratten, Nacktratten, Hamster, Mäuse und Nacktmäuse.
- Da die Transplantation der menschlichen Zellen in das Lebewesen unerwünschte Immunreaktionen verbietet, ist die Verwendung eines nicht-menschlichen, warmblütigen Lebewesens in seinem jüngstmöglichen Zustand, beispielsweise in der Form eines Eies, eines Embryos oder Fötus, oder eines neugeborenen Lebewesens oder Jungtieres erwünscht, um Immunreaktionen soweit wie möglich zu reduzieren.
- Vor der Transplantation kann das Lebewesen mit Röntgen- oder Gamma-Strahlen mit etwa 200-600 rem bestrahlt werden oder es kann mit einem Antiserum oder einem Immununterdrücker geimpft werden, um Immunreaktionen auf die niedrigst mögliche Stufe zu reduzieren.
- Wenn ein an Immunmangel leidendes Lebewesen, wie beispielsweise eine Nacktmaus oder eine Nacktratte, als Wirtstier verwendet wird, kann jede der vorstehend erwähnten menschlichen Zell-Linien ohne die genannte Vorbehandlung in dieses transplantiert und leicht proliferiert werden, und zwar mit weniger Besorgnis, daß Unerwünschte Immunreaktionen entstehen könnten, weil diese Tiere sogar als ausgewachsene Tiere geringere Immunreaktionen aufweisen.
- Man kann die Zell-Proliferation stabilisieren und/oder die LK 3-Produktion erhöhen durch sukzessives Transplantieren unter Verwendung desselben oder unterschiedlicher warmblütiger Lebewesen. Diese Ziele können dadurch erreicht werden, daß beispielsweise zunächst die Transplantation einer menschlichen Zell-Linie in einen Hamster und die Proliferation der menschlichen Zell-Linie in dem Hamster erfolgt und sukzessiv die Transplantation der proliferierten menschlichen Zelle in eine Nacktmaus erfolgt. Die sukzessive Transplantation kann mit einem warmblütigen Lebewesen der gleichen Art oder Kategorie sowie mit denen der gleichen Spezies oder Gattung erfolgen.
- Die menschliche Zelle kann an beliebiger Stelle des Lebewesens transplantiert werden, so lange die menschliche Zelle an dieser Stelle proliferiert: beispielsweise in die Allantoishöhle oder intravenös, intraperitoneal oder subkutan.
- Alternativ werden die menschlichen Zellen proliferiert durch deren Anordnung in einer konventionellen Diffusionskammer (die von unterschiedlicher Form und Größe sein kann), die mit einer geeigneten Einrichtung versehen ist, die eine Kontaminierung der Kammer mit tierischen Zellen verhindert, aber die menschlichen Zellen mit der Nähr-Körperflüssigkeit des Lebewesens versorgt, beispielsweise ein Membranfilter, Ultrafilter oder Hohlfasern mit einer Nenn-Porengröße von etwa 10&supmin;&sup7;-10&supmin;&sup5; m; durch Einbettung, beispielsweise intraperitoneal, der Kammer in das Lebewesen; und der Möglichkeit für die menschlichen Zellen in der Kammer zu proliferieren, indem diese die Nähr-Körperflüssigkeit des Lebewesens aufnehmen.
- Darüber hinaus kann die Diffusionskammer beispielsweise auf dem Lebewesen ausgebildet und angeordnet sein, so daß die Nährflüssigkeit in der Kammer frei durch die Kammer zirkulieren kann. Die Kultur in der Kammer kann während der Zell-Proliferation durch transparente Seitenfenstereinrichtungen beobachtet werden, die in der Kammerwand oder den Kammerwandungen vorgesehen sind, und/oder die Kammer als solche kann in Intervallen mit einer frischen Kammer ausgetauscht werden, beides, um die Zell-Proliferation während der Lebensdauer des Lebewesens fortzusetzen, ohne das Lebewesen zu opfern. Auf diese Art und Weise kann die Zellproduktion pro Lebewesen erhöht werden. Wegen des Fehlens von direktem Kontakt der menschlichen Zellen mit den tierischen Zellen werden durch eine solche Diffusionskammer weniger unerwünschte Immunreaktionen hervorgerufen, und ein beliebiges, warmblütiges Lebewesen kann einfach verwendet werden, ohne daß die Notwendigkeit für eine Vorbehandlung zur Reduzierung solcher Immunreaktion besteht. Außerdem können die proliferierten lebensfähigen menschlichen Zellen einfach aus einer solchen Diffusionskammer gewonnen werden.
- Die Fütterung des Lebewesens kann auf die übliche Art und Weise erfolgen, und sogar nach der Zelltransplantation ist keine besondere Sorgfalt erforderlich. Die zur Erzielung einer maximalen Zell-Proliferation erforderliche Zeitspanne liegt im allgemeinen zwischen einer und zehn Wochen. Die Anzahl der so erhaltenen menschlichen Zellen liegt bei 10&sup7;-10¹² Zellen pro Lebewesen und mehr. Insbesondere vermehren sich erfindungsgemäß die transplantierten menschlichen Zellen um das 10²-10&sup7;-fache, also mit einer Wachstumsrate, die um das 10-10&sup6;-fache höher liegt als die durch Impfung und Proliferation von menschlichen Zellen in einem in vitro-Nährkulturmedium erreichte Wachstumsrate. Dies ist bei der Produktion von LK 3 sehr vorteilhaft.
- Jedes beliebige Verfahren zur Induzierung von LK 3 kann bei der Erfindung verwendet werden, solang die LK 3-Produktion in den proliferierten menschlichen Zellen induziert werden kann. Die proliferierten menschlichen Zellen können direkt in dem Wirtstier einem LK 3-Induktor ausgesetzt werden. Beispielsweise werden menschliche Zellen, proliferiert in Bauchwasser in Suspension, oder Tumorzellen, die beispielsweise subkutan ausgebildet sind, direkt in vivo einem LK 3-Induktor ausgesetzt, um die LK 3-Produktion zu induzieren, und die Akkumulation von LK 3 wird aus dem Bauchwasser, Serum und/oder Tumor gesammelt mit nachfolgender Reinigung des LK 3. Alternativ werden die proliferierten menschlichen Zellen vom Tier gesammelt und dann in vitro einem LK 3-Induktor ausgesetzt. Beispielsweise werden die proliferierten menschlichen Zellen, die durch Gewinnung aus der Bauchwassersuspension oder Extrahierung und Auflösung der Tumormasse(n), die beispielsweise subkutan ausgebildet sind, erhalten werden, in einem Nährkulturmedium suspendiert, auf eine Temperatur von etwa 20ºC-40ºC vorgewärmt, um eine Zelldichte von etwa 10&sup5;-10&sup8; Zellen pro ml zu erreichen, und in vitro einen LK 3-Induktor ausgesetzt, gefolgt von der Wiedergewinnung des akkumulierten LK 3 aus der Kultur.
- Bei Verwendung einer konventionellen Diffusionskammer wird die Exposition der proliferierten menschlichen Zellen zu einem LK 3-Induktor in der Kammer oder nach dem Einsammeln aus der Kammer ausgeführt.
- Die auf diese Art und Weise erhaltenen menschlichen Zellen können für zusätzliche 1-4 Tage in vitro kultiviert werden, um ihre Entwicklungszeit vor der Induzierung der LK 3-Produktion einzustellen.
- Die LK 3-Produktion pro Tier kann weiter dadurch gesteigert werden, daß eine oder mehrere der folgenden Verfahren angewendet werden:
- (1) Ein Verfahren, in dem proliferierte menschliche Zellen einem LK 3-Induktor in dem Tier ausgesetzt werden, das als Wirt für die Zell-Proliferation verwendet worden ist, und dann von einer bestimmten Stelle (bestimmten Stellen) des Tiers oder seines gesamten Körpers eingesammelt werden, gefolgt von einer in vitro- Exposition der menschlichen Zellen zu einem LK 3-Induktor,
- (2) ein Verfahren, in dem die menschlichen Zellen wiederholt einem LK 3-Induktor ausgesetzt werden, und
- (3) ein Verfahren, in dem eine Diffusionskammer, eingebettet in oder verbunden mit dem Tier, in Intervallen mit einer frischen Diffusionskammer ausgewechselt wird.
- Die für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeigneten LK 3-Induktoren sind konventionelle IFN-alpha- Induktoren sowie Viren, nukleinsaure Säuren und Nukleotide; und konventionelle IFN-gamma-Induktoren, wie pflanzliches Haemagglutinin, Concanavallin A, Pokeweed- Mitogen, Lipopolysaccharide, Endotoxine, Polysaccharide und Bakterien. Antigene wirken auf die sensibilisierten Zellen als LK 3-Induktoren.
- Die LK 3-Produktion wird erhöht durch Verwendung einer Kombination von IFN-alpha- und IFN-gamma-Induktoren als LK 3-Induktoren. Es wurde herausgefunden, daß eine solche Kombination gleichzeitig die Produktion von HuIFN bewirkt. Dies ist von besonderem Vorteil bei einer gleichzeitigen und kostengünstigen Massenproduktion von zwei oder mehr biologisch-aktiven Substanzen, nämlich dem unbezahlbaren LK 3 und dem HuIFN, sowie bei einer viel effektiveren Nutzung von menschlichen Zellen.
- Das so erhaltene LK 3 kann wiedergewonnen werden durch ein oder mehrere Reinigungs- und/oder Trennverfahren, beispielsweise durch Entsalzen, Dialyse, Filtration, Zentrifugieren, Konzentration und/oder Lyophilisierung. Falls ein in noch höherem Maße gereinigtes LK 3-Präparat gewünscht wird, kann ein Präparat von höchster Reinheit erhalten werden durch das (die) oben beschriebene(n) Verfahren in Kombination mit (einem) anderen konventionellen Verfahren, beispielsweise Adsorption und Desorption mit einem Ionenaustausch, Gel-Filtration, isoelektrischer Punkt-Fraktionierung, Elektrophorese, Ionenaustausch- Chromatographie, Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie, Säulen-Chromatographie und/oder Affinitäts-Chromatographie.
- Immobilisierte monoklonale Antikörper, erhalten durch Anbindung monoklonaler Anti-LK 3-Antikörper an einen geeigneten wasserunlöslichen Träger, beispielsweise BrCN-aktivierte Sepharose, einem Produkt der Pharmacia Fine Chemical AB, Uppsala, Schweden, können vorteilhaft angewendet werden, um die Reinigung von LK 3 zu beschleunigen und zu vereinfachen. Die monoklonalen Anti-LK 3- Antikörper können durch Immunisierung eines warmblütiges Lebewesens mit LK 3, Wiedergewinnung der Antikörper produzierenden Zellen vom Tierkörper, Vereinigung der Antikörper produzierenden Zellen mit einer Myelom-Zelle, Selektion eines Klons, der in der Lage ist, Anti-LK 3-Antikörper zu produzieren, Proliferierung der Klone und Wiedergewinnung der gebildeten Antikörper bereitgestellt werden.
- Das derart erhaltene LK 3 hat die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
- (1) Molekulargewicht:
- 15.000±2.000 Dalton
- (2) Isoelektrischer Punkt:
- pI = 4,5±0,5
- (3) Elektrophoretische Mobilität:
- auf Disc-PAGE, Rf = 0,73±0,05
- (4) UV-Absorptionsspektrum:
- ein Absorptionsmaximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm
- (5) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
- löslich in Wasser, Salzlösung und Phosphat-Puffer;
- kaum löslich oder unlöslich in Ethylenether, Ethylacetat oder Chloroform
- (6) Farbreaktion:
- protein-positiv nach dem Lowry-Verfahren oder dem Mikrobürette-Verfahren
- saccharid-positiv nach dem Phenol-Schwefelsäure- Verfahren oder dem Anthron-Schwefelsäure-Verfahren
- (7) Biologische Aktivität:
- cytostatisch bezüglich KB-Zellen mit oder ohne HuIFN-alpha,
- extrem cytostatisch bezüglich bösartigen Tumorzellen mit menschlichem Interferon-alpha, aber nicht cytostatisch bezüglich bösartigen Tumorzellen ohne menschliches Interferon-alpha,
- nicht cytostatisch bezüglich normaler Zellen mit oder ohne menschliches Interferon-alpha,
- cytotoxisch bezüglich L 929-Zellen im wesentlichen frei von IL- und IFN-Aktivitäten
- (8) Stabilität in wässriger Lösung:
- stabil bis zu 60ºC bei 30-minütiger
- Inkubation bei pH 7,2
- stabil im pH-Bereich von 2,0-11,0 bei 16-stündiger Inkubation bei 4ºC; und
- (9) Stabilität bei Kältekonservierung:
- stabil bei -10ºC über eine Zeitdauer von einem Monat oder länger.
- Darüber hinaus wird versichert, daß LK 3 keine wesentliche Zytolyse bei normalen menschlichen Zellen bewirkt, sondern eine bemerkenswerte Zytolyse bei einer Vielzahl von menschlichen Tumorzellen bei Vorliegen von HuIFN bewirkt, wodurch die Zellen getötet werden. Daher ist LK 3 beispielsweise in der Form der Zusammensetzung zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Anwendung gegen LK 3-sensitive Krankheiten, beispielsweise bösartige Tumore, insbesondere solche menschlichen Ursprungs, deren Behandlung als sehr schwierig angesehen worden ist, geeignet.
- Die Aktivität von LK 3 wurde entweder bei KB-Zellen oder L 929-Zellen als Ziel-Zellen erprobt. Bei der Verwendung von KB-Zellen wurde die cytostatische Aktivität bezüglich KB-Zellen bei Vorliegen oder Abwesenheit von 20.000 Einheiten HuIFN-alpha (spezifische Aktivität von 2 x 10&sup8; Einheiten/mg Protein) gemäß dem in Cancer Chemotherapy Reports Part 3, Band 3, Nr. 2, September (1972) beschriebenen Verfahren bestimmt. Bei Verwendung von L 929-Zellen wurde die cytotoxische Aktivität bezüglich L 929-Zellen bei Vorliegen von Actinomycin D bestimmt durch das Verfahren, das in Lymphokines, Band 2, S. 245-249, "Tumor Necrosis Factor", herausgegeben von E. Pick, veröffentlicht von Academic Press, Inc. (1981) beschrieben ist. Bei der vorliegenden Beschreibung wurde das vorhergehend genannte Verfahren unter Verwendung von KB-Zellen und HuIFN-alpha verwendet, wenn nichts anderes ausgesagt ist.
- Die Aktivität von IL wurde bestimmt durch Messung entweder der IL 1-Aktivität in Übereinstimmung mit dem Verfahren, über das in Diana Boraschi et al, The Journal of Immunology, Band 133, Nr. 2, August (1984), berichtet wurde, oder der IL 2-Aktivität in Übereinstimmung mit dem Verfahren, über das in Steven Gillis et al, The Journal of Immunology, Band 120, Nr. 6, S. 2027-2032 (1978), berichtet wurde.
- Die Aktivität von HuIFH wurde überprüft durch die Plaque-Reduktions-Methode unter Verwendung von FL-Zellen menschlichen Amnion-Ursprungs, wie beschrieben in Protein, Nucleic Acid and Enzyme, Band 20, Nr. 6, S. 616-643 (1975).
- Die Haemagglutinations-Aktivität wurde überprüft gemäß dem Verfahren, über das von S.E. Salk, The Journal of Immunology, Band 49, S. 87-98 (1944), berichtet wurde.
- Die folgenden Experimente erläutern die vorliegende Erfindung weitergehend.
- Neugeborene Hamster wurden mit einem konventionellen Antiserum geimpft, das aus Kaninchen gewonnen wurde, um die Immunreaktionen der Hamster zu schwächen. Den Hamstern wurde dann subkutan eine menschliche lymphoblastoide Linie, BALL-1, transplantiert, und sie wurden auf die übliche Art und Weise drei Wochen lang gefüttert. Tumor- Massen, die subkutan ausgebildet wurden, wurden extrahiert, zerkleinert und in Salzlösung aufgelöst. Die so erhaltene Zell-Suspension wurde mit einem RPMI 1640- Medium (pH 7,2), ergänzt durch Serum, gewaschen und wiederholt in einer frischen Präparation desselben Kulturmediums suspendiert, um eine Zelldichte von ungefähr 2x10&sup6; Zellen/ml zu erreichen. Der Zell-Suspension wurde ein Sendai-Virus (ungefähr 400 Haemagglutinations-Titer/ml) hinzugefügt, und die Zell-Suspension wurde bei 37ºC über 24 Stunden inkubiert, um eine LK 3-Produktion zu induzieren.
- Die Kultur wurde mit etwa 1.000xg und bei 4ºC zentrifugiert, und der resultierende Niederschlag wurde entnommen. Der so erhaltene Überstand wurde in einer Kochsalzlösung mit 0,01 M-Phosphat-Puffer (pH 7,2) für 20 Stunden dialysiert und dann einer Filterung in einem Membranfilter unterzogen. Das Filtrat wurde anschließend durch eine Säule eines immobilisierten Anti-HuIFN-Antikörpers geleitet, und der nicht adsorbierte Teil wurde gesammelt. Ein aktiver Teil wurde aus diesem Teil mittels Chromatofocussierung wiedergewonnen, konzentriert und lyophilisiert, um ein pulvriges Puderprodukt mit LK 3-Aktivität zu erhalten.
- Die spezifische Aktivität des Produkts betrug etwa 10&sup5; Einheiten/mg Protein. Die LK 3-Ausbeute betrug etwa 1,0x10&sup6; Einheiten pro Hamster.
- Ein LK 3-Präparat, das durch das Verfahren gemäß Experiment A-1 erhalten worden ist, wurde in Kochsalzlösung aufgelöst, um eine Konzentration von etwa 0,05 Gewicht/Gewicht % als Protein zu erreichen, und der Lösung wurde die gleiche Menge des vollständigen Freund'schen Hilfsmittels hinzugegeben. Mäuse wurden durch subkutanes Injizieren von 0,2 ml aliquoter Teile der so erhaltenen Mischung immunisiert und diese Impfung wurde sieben Tage nach der ersten Impfung wiederholt. Nach der Induzierung einer Anti-LK 3-Antikörper-Produktion in Antikörper produzierende Zellen der Lebewesen wurde die Milz der Tiere extrahiert, zerkleinert, aufgelöst und zusammen mit einer Myelom-Zell-Linie einer Maus, P&sub3;-X63-Ag8, suspendiert, die von der Flow Laboratories Inc., Rockville, Maryland, USA, erworben wurde, in serumfreiem Eagle's minimal- essentiellen Medium (pH 7,2) mit 50 Gewicht/Volumen-% Polyethylenglykol 1000 auf 37ºC erwärmt, um eine Zelldichte von 10&sup4; Zellen/ml zu erreichen, gefolgt von 5-minütigem Stehenlassen der resultierenden Mischung. Danach wurde die Mischung 20-fach in einer frischen Aufbereitung desselben Kulturmediums verdünnt und die Hybriden-Zellen, die zum Wachstum auf dem Hypoxanthin, Aminopterin, Thymidin enthaltenden Medium fähig sind, wurden entsprechend dem Verfahren, über das von R.L. Davidson und P.S. Gerald in Somatic Cell Genetics, Band 2, Nr. 2, S. 175-176 (1976) berichtet wurde, gesammelt, um ein hybrides Klon, das zur Produktion von Anti-LK 3-Antikörpern fähig ist, zu selektieren. Den Mäusen wurde das Klon intraperitoneal transplantiert in einer Dosis von etwa 10&sup6; Zellen pro Maus, die Mäuse wurden zwei Wochen gefüttert und dann getötet. Die Körperflüssigkeit der Tiere, wie das Bauchwasser und das Blut, wurden wiedergewonnen, zentrifugiert und mit Ammoniumsulfat entsalzen, gefolgt von dem Einsammeln der bei 30-50% Sättigung sedimentierten Teile. Diese Fraktionen wurden dialysiert und einer Affinitäts-Chromatographie unterworfen unter Verwendung von immobilisiertem Anti-LK 3- Antikörper-Gel, das durch die Reaktion einer LK 3-Probe, die nach dem in Experiment A-1 beschriebenen Verfahren mit BrCN-aktivierter Sepharose bei Umgebungstemperatur hergestellt wurde, um eine Anti-LK 3-Antikörper-Fraktion zu erhalten, die anschließend dialysiert, konzentriert und lyophilisiert wurde.
- Das resultierende Puder-Produkt wies eine immunulogisch- spezifische Neutralisation gegenüber der LK 3-Aktivität auf.
- Eine partiell-reine LK 3-Probe, die durch das Verfahren nach Experiment A-1 erhalten wurde, wurde einer Affinitäts-Chromatographie ausgesetzt unter Verwendung eines immobilisierten monoklonalen Antikörper-Gels, das nach dem in Experiment A-2 beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, um LK 3-Fraktionen zu sammeln, die anschließend dialysiert, konzentriert und lyophilisiert wurden.
- Das resultierende Produkt war eine hochreines LK 3-Präparation mit einer spezifischen Aktivität von etwa 10&sup7; Einheiten/mg Protein. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften von LK 3 wurden bei dieser Präparation untersucht.
- (1) Molekulargewicht:
- Das Molekulargewicht von LK 3 wurde durch elektrophoretische Verfahren unter Verwendung von SDS-Polyacrylamid-Gel, wie in K. Weber und M. Osborn in Journal of Biological Chemistry, Band 244, S. 4.406 (1969), beschrieben, bestimmt. Säulen von 10 % Acrylamid-Gel wurden mit etwa 10 Mikrogramm aliquoten Teilen der LK 3-Präparation bei Vorliegen von 0,1 % SDS belastet und mit 8 mA pro Säule für vier Stunden beaufschlagt, um eine Elektrophorese zu bewirken. Nach der Extraktion und der nachfolgenden LK 3-Analyse der aktiven Fraktionen wurde das Molekulargewicht von LK 3 mit 15.000 ± 2.000 Dalton bestimmt.
- (2) Isoelektrischer Punkt:
- Eine 2-stündige, mit 25 W durchgeführte Elektrofocussierung der LK 3-Präparation unter Verwendung von "AMPHOLINE PAGPLATE (pH 3,5-9,5)", einem Gel-Produkt zur Elektrofocussierung, vertrieben von LKB-Produkter AB, Stockholm, Schweden, ergab einen isoelektrischen Punkt pI von 4,5 ± 0,5.
- (3) Elektrophoretische Mobilität:
- Gemäß dem Verfahren, das in B.J. Davis, Annals of New York Academy of Sciences, Band 121, S. 404 (1964), beschrieben ist, wurden etwa 10 Mikrogramm aliquote Teile der LK 3-Präparation auf Säulen von 7,5 % Acrylamid-Gel geladen, einer Elektrophorese mit pH 8,3 und 3 mA pro Säule für zwei Stunden ausgesetzt, extrahiert und hinsichtlich der LK 3-Aktivität analysiert, um eine elektrophoretische Mobilität Rf von 0,73 ± 0,05 zu erhalten.
- (4) UV-Absorptions-Spektrum:
- Nach Analyse des UV-Spektrums der LK 3-Präparation mit einem UV-250-Spektrometer, einem Produkt der Shimadzu Seisakusho K.K., Kyoto, Japan, wurde ein Absorptions-Maximum bei einer Wellenlänge von etwa 280 nm festgestellt.
- (5) Löslichkeit in Lösungsmittel:
- Löslich in Wasser, Kochsalzlösung und Phosphat- Puffer-Lösung; kaum löslich oder unlöslich in Ethylether, Ethylazetat und Chloroform.
- (6) Farbreaktion:
- Protein-positiv nach dem Lowry-Verfahren und dem Mikrobürette-Verfahren; Saccharid-positiv nach dem Phenol-Schwefelsäure-Verfahren und dem Anthron-Schwefelsäure-Verfahren.
- (7) Biologische Aktivität:
- Eine cytostatische Aktivität bezüglich KB-Zellen mit oder ohne HuIFN-alpha und eine cytotoxische Aktivität bezüglich L 929-Zellen wurde festgestellt. Keine wesentliche IL- oder IFN-Aktivität wurde festgestellt.
- (8) Stabilität in wässriger Lösung:
- (i) Wärmestabilität:
- Etwa 1x10³ Einheiten/ml aliquote Teile der LK 3-Präparation wurden bei pH 7,2 und verschiedenen Temperaturen 30 Minuten lang inkubiert und die verbleibenden Aktivitäten wurden untersucht. Dabei wurde eine Stabilität von LK 3 bis zu einer Temperatur von 60ºC festgestellt.
- (ii) pH-Stabilität:
- 0,1 ml aliquoter Teile der Präparation (1x10&sup4; Einheiten/ml) wurden 1 ml Puffer-Lösung mit verschieden pH-Werten hinzugefügt, d.h. Mc11vaine-Puffer mit pH 2-7; Phosphat-Puffer, pH 7-8; Glyzin-NaOH-Puffer, pH 8-11, und bei 4ºC 16 Stunden lang inkubiert. Danach wurden 0,1 ml der inkubierten Mischung mit 0,05 M-Phosphat-Puffer (pH 7,2) auf pH 7,2 eingestellt und die verbleibende Aktivität wurde untersucht. Dabei erwies sich LK 3 in einem pH-Bereich von 2,0-11,0 als stabil.
- (9) Stabilität bei Kältekonservierung:
- Die LK 3-Präparation wurde in wässriger Lösung bei -10ºC und pH 7,2 einen Monat lang aufbewahrt, aufgetaut und untersucht. Es konnte keine Abnahme der Aktivität festgestellt werden.
- Diese Resultate zeigen, daß LK 3 physikalisch-chemische Eigenschaften aufweist, die von denen bekannter Lymphokine, wie LT, TNF, IL oder IFN, unterscheidbar sind.
- Die cytostatische Aktivität von LK 3 bezüglich verschiedener menschlicher Zellen wurde anhand von LK 3-Präparationen untersucht, die durch das in Experiment A-3 beschriebene Verfahren erhalten wurden.
- Eine Probe der menschlichen Zellen (10&sup6;-Zellen), die in Tabelle I aufgeführt ist, wurde in 1 ml konventionellen Nährkulturmediums suspendiert unter Hinzufügung von fötalem Kälber-Serum, einen Tag kultiviert, es wurden 0,1 ml einer Kochsalzlösung, die entweder 20 Einheiten einer LK 3-Präparation (zubereitet gemäß dem in Experiment A-3 beschriebenen Verfahren) oder 20 Einheiten der LK 3-Präparation und 2.000 Einheiten HuIFN-alpha mit einer spezifischen Aktivität von 2x10&sup8; Einheiten/mg Protein hinzugefügt und zwei Tage lang bei 37ºC inkubiert. Nach Fertigstellung der Kultur wurden die lebensfähigen Zellen mit Neutralrot, einem Färbemittel, gemäß dem in Applied Microbiology, Band 22, Nr. 4, S. 671-677 (1971) beschriebenen Verfahren gefärbt, und das Färbemittel wurde mit einer angesäuerten Ethanollösung ausgewaschen. Die Anzahl der lebensfähigen Zellen wurde durch Messung der Absorption des Eluats bei einer Wellenlänge von 540 nm bestimmt.
- Zur Gegenprobe wurden 0,1 ml einer LK 3-freien Kochsalzlösung verwendet.
- Der cytostatische Anteil (%) wurde mittels der folgenden Gleichung berechnet:
- Cytostatischer Anteil (%)
- = [1 - Absorption bei Verwendung von LK/Absorption der Gegenprobe] x 100 Tabelle I LK 3-Dosierung (HuIFN-alpha-Dosierung) Zell-Linie Herkunft der Zell-Linie 20 Einheiten (0 Einheiten) 0 Einheit (2.000 Einheiten) 20 Einheiten (2.000 Einheiten) Chang-Leber** Giradi-Herz** epidermoides Larynx-Karzinom Lungen-Karzinom Magenkrebs Leberkrebs epithelähnliches Cervix-Karzinom embryonale Lunge Leber Herz Anmerkung: *) sind menschliche Zell-Linien bösarigen Tumor-Ursprungs; **) solche normalen Ursprungs
- Die Ergebnisse waren wie in Tabelle I dargestellt.
- Diese Ergebnisse bekräftigen, daß LK 3 zusammen mit HuIFN das Wachstum verschiedener bösartiger Tumorzellen extrem hemmt. Die Ergebnisse bekräftigen darüber hinaus, daß LK 3 und ein hochreines HuIFN-alpha weder normale noch bösartige Tumorzellen beeinflußt.
- Einer Gruppe von BALB/c-Nacktmäusen wurden subkutan in ihren Rückenbereich kleine Fragmente von menschlichem Brustkrebsgewebe transplantiert.
- Nachdem die Tumormassen in den Körpern der Tiere auf etwa 200 mm³ angewachsen waren, wurde eine Kochsalzlösung mit einer LK 3-Präparation, die durch das in Experiment A-1 oder A-3 beschriebene Verfahren erhalten wurde, intravenös einmal täglich in einer Dosierung von entweder 50 Einheiten/kg oder 500 Einheiten/kg zusammen mit 5.000 Einheiten HuIFN-alpha, spezifische Aktivität von 2x10&sup8; Einheiten/mg Protein, 20 Tage lang injiziert. Daran anschließend wurden die Tiere getötet und die resultierenden Tumormassen gewogen.
- Die Ergebnisse sind in Tabelle II wiedergegeben. Tabelle II Behandlung Dosis pro Tag (Einheiten/kg) Tumormasse (g) Gegenprobe LK 3 bei Experiment A-1 LK 3 bei Experiment A-3 Anmerkung: *) bedeutet, daß die Werte statistisch signifikant sind im Verhältnis zur Gegenprobe bei einem Signifikanz-Niveau von 5 %.
- Ein akuter Toxizitäts-Test, bei dem einer Gruppe von 20 Tage alten Mäusen eine LK 3-Präparation verabreicht wurde, die nach dem Verfahren von Experiment A-3 erhalten wurde, bestätigte, daß die Toxizität der Präparation extrem gering war, d.h. LD&sub5;&sub0;, 10&sup8; Einheiten oder mehr, bei intraperitonealer Injektion.
- Wie aus den vorstehenden Experimenten ersichtlich ist, wirkt sich eine Kombination von LK 3 und HuIFN extrem hemmend auf das Wachstum bösartiger Tumore sowohl in vitro sowie in vivo aus. Die Verabreichung von LK 3 erweist sich als sehr sicher bezüglich seiner effektiven Dosis.
- Die effektive Dosis von LK 3 beträgt im allgemeinen 1-100.000.000 Einheiten/Tag für einen Erwachsenen: genauer gesagt, bei lokaler Verabreichung, beispielsweise in Form einer lokalen Injektion oder eines Collyriums, 1-1.000.000 Einheiten/Tag; bei perkutaner oder permukosaler Verabreichung, z.B. in Form einer Salbe oder eines Suppositoriums, 10-50.000.000 Einheiten/Tag; bei systemischer Verabreichung, beispielsweise intravenöser oder intramuskulärer Injizierung, 10-10.000.000 Einheiten/Tag; und bei oraler Verabreichung 50-100.000.000 Einheiten/Tag, wobei jedoch die Dosierung in Abhängigkeit von der Verabreichungsmethode und den Symptomen des Patienten variiert werden kann. Obwohl LK3 in konventioneller Art in einer Medizin präpariert sein kann nach Zumischung zu einem geeigneten konventionellen Trägerstoff, Grundstoff und/oder Vehiculum, sollte der LK 3-Bestandteil darin mindestens 1 Einheit/g hinsichtlich seiner Toxizität, effektiven Dosierung und Sicherheit betragen.
- Die Gestalt und Art von prophylaktischen und/oder therapeutischen Mitteln für LX 3-sensitive Krankheiten kann nach Wunsch variiert werden; bei oraler Verabreichung beispielsweise können die Präparationen den enterischen Anwendungen entsprechend geformt sein, z.B. als Kapseln, Tabletten oder Pulver; bei rektaler Verabreichung als Zäpfchen; für Injektionen können sie beispielsweise lyophilisierter Art sein, die vor Gebrauch in einer Injektionslösung mit destilliertem Wasser aufgelöst wird, sowie als Collunarium, Collyrium oder Salbe.
- Bei der Behandlung eines Patienten mit einem bösartigen Tumor kann beispielsweise ein aus dem Patienten extrahiertes Tumorgewebefragment in vitro mit LK 3 behandelt werden, um die Immunogenizität des Gewebefragments zu verbessern, und, verabreicht an den Patienten, eine wesentlich effektivere Behandlung des bösartigen Tumors zu erzielen. Kombinierte Anwendungen von LK 3 und antionkotischen Substanzen, beispielsweise Lymphokinen, wie TNF, LT und IL; antionkotischen Polysacchariden, wie Beta-1,3-Glukan, Arabinomannan, Lipopolysacchariden, Pikibanil (OK-432), Krestin (PSK) und Lentinan; metabolischen Antagonisten, wie Methotrexat (MTX) und Fluorouracil (5-FU); und antionkotischen Antibiotika, wie Doxorubicin (ADM) und Mitomycin C (MMC) sind sehr vorteilhaft.
- Die folgenden Beispiele A und B dienen der Erläuterung der Produktion von LK 3 und pharmazeutischen Zusammensetzungen, die LK 3 enthalten.
- Eine menschliche lymphoblastoide Linie, BALL-1, wurde in das Eagle'sche minimal erforderliche Medium (pH 7,4) geimpft unter Ergänzung von 20 % fötalem Kälberserum und in vitro in Suspension bei 37ºC in der üblichen Art und Weise kultiviert. Die proliferierten menschlichen Zellen wurden dann mit serumfreiem Eagle'schen minimal erforderlichem Medium (pH 7,4) gewaschen und in einer frischen Präparation desselben Kulturmediums resuspendiert, um eine Zelldichte von etwa 1x10&sup7; Zellen/ml zu ergeben. Der Zell-Suspension wurde der Sendai-Virus in einer Dosierung von etwa 1.000 Haemagglutionations-Titern/ml hinzugefügt und bei 38ºC einen Tag lang inkubiert, um die LK 3- Produktion zu induzieren. Nach Zentrifugierung der resultierenden Kultur mit etwa 1.000xg und bei etwa 4ºC wurde der Überstand in einer Kochsalzlösung mit 0,01 M-Phosphat-Puffer (pH 7,2) für 15 Stunden dialysiert und durch einen Membranfilter gefiltert. Das Filtrat wurde dann durch eine Säule von Anti-LK 3-Antikörpern in ähnlicher Art und Weise hindurchgeleitet, wie in Experiment A-1 beschrieben, und der nicht absorbierte Teil wurde ähnlich wie in Experiment A-3 beschrieben durch Affinitäts-Chromatographie gereinigt unter Verwendung einer Säule von einem Anti-LK 3-Antikörper-gebundenen Gel, und konzentriert, um ein Konzentrat mit einer spezifischen LK 3-Aktivität von etwa 10&sup7; Einheiten/mg Protein zu erhalten.
- Die Ausbeute betrug etwa 2,0x10&sup4; Einheiten/Liter der induzierten Zell-Suspension.
- Neugeborenen Hamstern wurde ein konventionelles Antiserum, gewonnen aus Kaninchen, injiziert, um deren Immunreaktionen zu schwächen, eine menschliche lymphoblastoide Linie, BALL-1, wurde subkutan transplantiert, und die Hamster wurden drei Wochen lang auf übliche Art und Weise ernährt. Die Tumormassen von jeweils etwa 15 g, die subkutan in den Tieren ausgebildet wurden, wurden extrahiert, zerkleinert und in Kochsalzlösung aufgelöst. Nach dem Waschen mit serumfreiem RPMI 1640-Medium (pH 7,2) wurden die proliferierten Zellen in einer frischen Präparation desselben Kulturmediums resuspendiert, um eine Zelldichte von etwa 5x10&sup6; Zellen/ml zu ergeben. Der Zell-Suspension wurde der Sendai-Virus und E. coli-Endotoxin in Dosierungen von etwa 1.000 Haemagglutinations- Titern/ml bzw. etwa 10 Mikrogramm/ml hinzugefügt, und die Zell-Suspension wurde bei 37ºC einen Tag lang inkubiert, um die LK 3-Produktion zu induzieren. Nach dem Zentrifugieren der Kultur mit etwa 1.000xg und bei 4ºC, um das Sediment auszuscheiden, wurde der Überstand in einer Kochsalzlösung mit 0,01 M-Phosphat-Puffer (pH 7,2) 21 Stunden lang dialysiert und durch einen Membranfilter gefiltert. Das Filtrat wurde mit einer Säule von Antikörpern, ähnlich wie in Beispiel A-1 beschrieben, gereinigt, und die Eluat-Lösung wurde konzentriert und lyophilisiert, um ein Pulverprodukt mit einer spezifischen LK 3-Aktivität von etwa 10&sup7; Einheiten/mg Protein zu erhalten.
- Die Ausbeute betrug etwa 1,5x10&sup6; Einheiten.
- Erwachsenen Nacktmäusen wurde eine menschliche lymphoblastoide Linie, TALL-1, intraperitoneal transplantiert, die Mäuse wurden auf übliche Art und Weise fünf Wochen lang ernährt, den Mäusen wurde intraperitoneal der Newcastle Krankheitsvirus (etwa 3.000 Haemagglutinations- Titer pro Nacktmaus), das zuvor durch UV-Bestrahlung im wesentlichen inaktiviert worden war, injiziert, und 24 Stunden nach der Injektion wurden die Mäuse getötet, gefolgt von einem Sammeln ihres Bauchwassers. Das Bauchwasser wurde gereinigt, konzentriert und lyophilisiert, ähnlich wie in Beispiel A-2 beschrieben, um ein Pulverprodukt mit LK 3-Aktivität zu erhalten.
- Die Ausbeute betrug etwa 3,0x10&sup5; Einheiten pro Nacktmaus.
- Erwachsene Mäuse wurden mit etwa 400 rem Röntgenstrahlung bestrahlt, um ihre Immunreaktionen zu schwächen, den Mäusen wurde subkutan eine menschliche lymphoblastoide Linie, Mono-1, transplantiert, und die Mäuse wurden in der üblichen Art und Weise drei Wochen gefüttert. Die Tumormassen von jeweils etwa 10 g, die in den Tieren subkutan ausgebildet waren, wurden, wie in Beispiel A-2 beschrieben, extrahiert und aufgelöst. Die so erhaltenen menschlichen Zellen wurden, wie in Beispiel A-2 beschrieben, suspendiert, und danach wurde der resultierenden Zell-Suspension der Sendai-Virus und Concanavallin A in einer entsprechenden Dosierung von etwa 500 Haemagglutinations-Titern/ml bzw. etwa 0,8 Mikrogramm/ml hinzugefügt und die Zell-Suspension wurde bei 37ºC einen Tag lang inkubiert, um die LK 3-Produktion zu induzieren. Danach wurde die Kultur gereinigt, konzentriert und, ähnlich wie in Beispiel A-2 beschrieben, lyophilisiert, um ein Pulverprodukt mit LK 3-Aktivität zu erhalten.
- Die Ausbeute betrug etwa 1,0x10&sup6; Einheiten pro Maus.
- Neugeborenen Hamstern wurde eine menschliche lymphoblastoide Linie, Namalwa (ATCC CRL 1432), wie in Beispiel A-2 beschrieben, transplantiert, und die Hamster wurden auf die übliche Art und Weise vier Wochen lang ernährt. Die Tumormassen von jeweils etwa 20 g, die in dem Tieren subkutan ausgebildet waren, wurden extrahiert und aufgelöst, um eine Zell-Suspension zu erhalten mit einer Zelldichte von etwa 3x10&sup6; Zellen/ml. Der Zell-Suspension wurde der Sendai-Virus in einer Dosierung von etwa 1.000 Haemagglutinations-Titern/ml hinzugefügt, und die Zell- Suspension wurde bei 36ºC zwei Tage lang inkubiert, um die LK 3-Produktion zu induzieren. Die Kultur wurde gereinigt und konzentriert in einer Art und Weise, ähnlich wie in Beispiel A-1 beschrieben, um ein Konzentrat mit LK 3-Aktivität zu erhalten.
- Die Ausbeute betrug etwa 1,3x10&sup6; Einheiten pro Hamster.
- Eine menschliche lymphoblastoide Linie, NALL-1, wurde in Kochsalzlösung suspendiert und in einer etwa 10 ml fassenden zylindrischen Kunststoff-Diffusionskammer plaziert, die mit einem Membranfilter ausgestattet war mit einer nominellen Porengröße von etwa 0,5 um. Die Kammer wurde intraperitoneal eingebettet in eine erwachsene Ratte, und die Ratte wurde in der üblichen Art und Weise vier Wochen lang ernährt. Nach der Entfernung der Kammer wurde festgestellt, daß die Zelldichte in der Kammer etwa 5x10&sup8; Zellen/ml betrug, also um etwa das 10²-fache höher im Vergleich zu der in vitro-Proliferation in einem CO&sub2;- Inkubator unter Verwendung eines Nährkulturmediums. Die menschlichen Zellen wurden in einem Kulturmedium, wie in Beispiel A-2 beschrieben, suspendiert, es wurde ihnen der Newcastle Krankheitsvirus (etwa 500 Haemagglutinations- Titer/ml) hinzugefügt, der zuvor durch UV-Bestrahlung inaktiviert worden war, sowie Phytohaemagglutinin (etwa 50 Mikrogramm/ml), und die Zell-Suspension wurde bei 37ºC einen Tag lang inkubiert, um die LK 3-Produktion zu induzieren. Danach wurde die Kultur gereinigt, konzentriert und lyophilisiert, wie in Beispiel A-2 beschrieben, um ein Pulverprodukt mit LK 3-Aktivität zu erhalten.
- Die Ausbeute betrug etwa 4x10&sup5; Einheiten pro Ratte.
- Eine menschliche lymphoblastoide Linie, CCRF-CEM (ATCC CCL 119), wurde in die Allantoishöhlen von in Eiern enthaltenen Embryos geimpft, die fünf Tage lang bei 37ºC inkubiert worden waren, und die Eier wurden bei dieser Temperatur für eine weitere Woche inkubiert. Die proliferierten menschlichen Zellen wurden aus den Eiern geerntet und, ähnlich wie in Beispiel A-1 beschrieben, suspendiert, um eine Zelldichte von 5x10&sup6; Zellen/ml zu ergeben.
- Der Zell-Suspension wurde dann der Sendai-Virus (etwa 500 Haemagglutionations-Titer/ml) hinzugefügt, und die Zell- Suspension wurde bei 37ºC einen Tag lang inkubiert, um die LK 3-Produktion zu induzieren. Die resultierende Kultur wurde gereinigt und konzentriert, ähnlich wie in Beispiel A-2 beschrieben, um ein Pulverprodukt mit LK 3-Aktivität zu erhalten.
- Die Ausbeute betrug etwa 5,0x10&sup5; Einheiten pro zehn befruchtete Eier.
- Fünfhunderttausend Einheiten einer LK 3-Probe, die gemäß dem Verfahren von Beispiel A-2 hergestellt wurde, wurden in 200 ml Kochsalzlösung aufgelöst und unter sterilen Bedingungen durch einen Membranfilter gefiltert. Zwei ml aliquote Teile des Filtrats wurden in sterilisierte Glasphiolen aufgeteilt, lyophilisiert und verschlossen, um ein Injektionspulver zu erhalten.
- Das Pulver ist geeignet für die Verwendung in Kombination mit HuIFN-alpha und/oder HuIFN-beta zur Behandlung von Brustkrebs, Lungenkarzinom, Leberkarzinom und Leukämie.
- Ein Injektionspulver wurde wie in Beispiel B-1 beschrieben hergestellt mit der Ausnahme, daß 3x10&sup8; Einheiten HuIFN-alpha, die von einer menschlichen lymphoblastoiden Zelle abgeleitet wurden, in 200 ml einer Kochsalzlösung zusammen mit 2x10&sup5; Einheiten LK 3 aufgelöst wurden.
- Das Pulver ist geeignet zur Behandlung von Brustkrebs, Lungenkarzimon, Leberkarzinom und Leukämie.
- Eine LK 3-Probe, die gemäß dem Verfahren von Beispiel A-3 hergestellt wurde, und HuIFN-alpha wurden homogen verknetet mit einen minimalen Menge von flüssigem Paraffin. Der Mischung wurde dann weißes Petrolatum in der üblichen Art und Weise hinzugefügt, um eine Salbe mit einem LK 3-Gehalt von 1.000 Einheiten/g und einem HuIFN-alpha-Gehalt von 1x10&sup6; Einheiten/g zu erhalten.
- Die Salbe ist geeignet zur Behandlung eines Hautkarzinoms, von Brustkrebs und eines Lymphoms.
- Eine Mischung von 800 ml destilliertem Wasser, 5 ml Beta-Phenylethyl-Alkohol, 100.000 Einheiten einer LK 3-Probe, die gemäß dem Verfahren von Beispiel A-4 hergestellt wurde, und 1x10&sup7; Einheiten HuIFN-alpha wurde Natriumchlorid in einer zusätzlichen Menge destillierten Wassers zugemischt, um 1.000 ml einer isotonischen Lösung zu erhalten.
- Die Lösung ist geeignet zur Behandlung eines Retinoblastoms.
- Darmlösliche Tabletten wurden gemäß einer konventionellen Methode durch Tablettierung einer Mischung aus Stärke, Maltose und einer nach dem Verfahren von Beispiel A-7 präparierten LK 3-Probe hergestellt, mit einem LK 3- Gehalt von 200.000 Einheiten pro Tablette (100 mg), gefolgt von einem Überzug der Tabletten mit einem Phthalatester einer Methylzellulose.
- Die Tabletten können in Kombination mit Pharmazeutika, die HuIFN-alpha enthalten, verwendet werden zur Behandlung von Colon- und Leberkarzinom.
Claims (19)
1. Ein Lymphokin LX 3 mit den folgenden physiko-
chemischen Eigenschaften:
(1) Molekulargewicht:
15.000±2 .000 Dalton
(2) Isoelektrischer Punkt:
pI = 4,5±0,5
(3) Elektrophoretische Mobilität:
auf Disc-PAGE, Rf = 0,73±0,05
(4) UV-Absorptionsspektrum:
ein Absorptionsmaximum bei einer
Wellenlänge von etwa 280 nm
(5) Löslichkeit in Lösungsmitteln:
löslich in Wasser, Salzlösung und
Phosphat-Puffer;
kaum löslich oder unlöslich in
Ethylether, Ethylacetat oder Chloroform
(6) Farbreaktion:
protein-positiv nach dem Lowry-Verfahren
oder dem Microbiuret-Verfahren
saccharid-positiv nach dem
Phenol-Schwefelsäure-Verfahren oder dem Anthron-
Schwefelsäure-Verfahren
(7) Biologische Aktivität:
cytostatisch bezüglich KB-Zellen mit oder
ohne HuIFN-α,
extrem cytostatisch bezüglich bösartigen
Tumorzellen mit menschlichem
Interferonα, aber nicht cytostatisch bezüglich
bösartigen Tumorzellen ohne menschliches
Interferon-α,
nicht-cytostatisch bezüglich normaler
Zellen mit oder ohne menschliches
Interferon-α
cytotoxisch bezüglich L 929-Zellen
im wesentlichen frei von IL- und IFN-
Aktivitäten
(8) Stabilität in wässriger Lösung:
stabil bis zu 60ºC bei 30-minütiger
Inkubation bei pH 7,2
stabil im pH-Bereich von 2,0-11,0 bei 16-
stündiger Znkubation bei 4ºC; und
(9) Stabilität bei Kältekonservierung:
stabil bei -10ºC über eine Zeitdauer von
einem Monat oder länger.
2. Ein Verfahren zur Herstellung eines Lymphokins
LK 3 nach Anspruch 1, bei dem zur Herstellung
von LK 3 befähigte menschliche Zellen einem LK
3 Induktor ausgesetzt werden und angesammeltes
LK 3 wiedergewonnen wird.
3. Ein Verfahren nach Anspruch 2, bei dem zur
Produktion von LK 3 in vitro oder in vivo
befähigte menschliche Zellen proliferiert
werden;
die proliferierten menschlichen Zellen einem
LK 3 Induktor ausgesetzt werden; und
das angesammelte LK 3 wiedergewonnen wird.
4. Ein Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei dem
die zur Produktion von LK 3 befähigten
menschlichen Zellen erhalten werden durch:
- Transplantieren von zur Produktion von LK
3 befähigten menschlichen Zellen auf ein
nicht-menschliches, warmblütiges Tier;
- Füttern des Tieres, um es den
menschlichen Zellen zu erlauben, die
Nähr-Körperflüssigkeit
des Tieres für ihre
Proliferation zu verwenden; und
- Extrahieren und Auflösen des
entstandenen, im Tier gebildeten Tumors.
5. Ein Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, bei dem
die zur Produktion von LK 3 befähigten
menschlichen Zellen erhalten werden durch:
- Suspendieren von zur Produktion von LK 3
befähigten menschlichen Zellen in einem
Diffusionsraum, in dem die
Nähr-Körperflüssigkeit eines nicht-menschlichen,
warmblütigen Tieres den menschlichen
Zellen zugeführt wird;
- Einbetten oder Anbringen des Raumes in
oder auf einem nicht-menschlichen,
warmblütigen Tier dergestalt, daß die Nähr-
Körperflüssigkeit des Tieres den
menschlichen Zellen in dem Raum zugeführt wird;
- Füttern des Tieres, um den menschlichen
Zellen zu erlauben, die
Nähr-Körperflüssigkeit für ihre Proliferation zu
verwenden; und
- Sammeln der proliferierten menschlichen
Zellen aus dem Raum.
6. Ein Verfahren nach Anspruch 4, bei dem das
nicht-menschliche, warmblütige Tier einen
Immunmangel hat oder immununterdrückt ist.
7. Ein Verfahren nach Anspruch 5, bei dem der
Diffusionsraum mit einem oder mehreren
Membranfiltern, hohlen Fasern oder Ultrafiltern
mit einer nominellen Porengröße von 10&supmin;&sup7;-10&supmin;&sup5;
m ausgestattet ist.
8. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis
7, bei dem die zur Produktion von LK 3
befähigten menschlichen Zellen menschliche
Leukozyten oder menschliche Lymphozyten sind.
9. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis
7, bei dem die zur Produktion von LK 3
befähigten menschlichen Zellen lymphoblastoide
Zellen sind.
10. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis
7, bei dem die zur Produktion von LK 3
befähigten menschlichen Zellen ausgewählt sind aus
Namalwa (ATCC CRL 1432), BALL-1, TALL-1, NALL-
1, M-7002, B-7101, JBL, EBV-Sa, EBV-Wa, EBV-
HO, MOLT-3 (ATCC CRL 1552), CCRF-SB (ATCC CCL
120), CCRF-CEM (ATCC CCL 119), BALM 2, DND-41
und Mono-1-Zellen.
11. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis
10, bei dem der Schritt des Aussetzens in
vitro ausgeführt wird.
12. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis
10, bei dem der Schritt des Aussetzens in vivo
ausgeführt wird.
13. Ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis
12, bei dem der LK 3 Induktor ausgewählt ist
aus einem α-Interferon-Induktor, einem
Γ-Interferon-Induktor und Mischungen daraus.
14. Eine pharmazeutische Zusammensetzung,
aufweisend einen pharmazeutisch annehmbaren Träger
und eine wirksame Menge an LK 3 nach Anspruch
1.
15. Eine Zusammensetzung nach Anspruch 14, die ein
Antionkotikum ist.
16. Eine Zusammensetzung nach Anspruch 14, die
mindestens eine Einheit an LK 3 pro Gramm
enthält.
17. Eine Zusammensetzung nach Anspruch 14, die in
der Form einer Injektion, eines Collyriums,
einer Salbe, eines Suppositoriums oder eines
Collunariums ist.
18. Eine Zusammensetzung nach Anspruch 14, die ein
zusätzliches Lymphokin enthält.
19. Eine Zusammensetzung nach Anspruch 18, bei der
das zusätzliche Lymphokin ein menschliches
Interferon ist.
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