DE3687097T2

DE3687097T2 - Therapeutisches mittel zur behandlung haematopoietischer krankheiten.

Info

Publication number: DE3687097T2
Application number: DE8686110996T
Authority: DE
Inventors: Tohru Masaoka
Original assignee: Green Cross Corp Japan; Morinaga Milk Industry Co Ltd
Current assignee: Morinaga Milk Industry Co Ltd; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1985-08-09
Filing date: 1986-08-08
Publication date: 1993-04-22
Anticipated expiration: 2006-08-09
Also published as: JPS6236326A; AU6100386A; EP0212501A3; CA1283048C; DE3687097D1; JPH0753667B2; US4845078A; EP0212501B1; AU590783B2; EP0212501A2

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung eines Glycoproteins für die Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung einer primären Immunmangelerkrankung, semi-aplastischer Anämie, erblicher, progressiver, hämocytischer funktioneller Abnormalität und/oder Tumoren in den blutbildenden Organen, wobei das Glycoprotein eine Wirkung aufweist, die Differenzierung und Proliferation von Granulocyten-Monocyten-Vorläuferzellen in dem menschlichen Knochenmark in Granulocyten zu stimulieren, oder eines Peptidfragmentes davon oder eines Derivates des Fragmentes, das nach der Transplantation des Knochenmarks für hämatopoetische Erkrankungen verabreicht werden soll.
Die Knochenmarktransplantation wird bei einem Patienten durchgeführt, der an einem Mangel oder einem Schaden der immunkompetenten Zellen oder hämatopoetischen Zellen leidet, mit dem Ziel, Funktionen des Knochenmarks durch Transplantieren ihrer normal funktionierenden Stammzellen (das Knochenmark) zu rekonstruieren.
Daher wird die Knochenmarktransplantation nicht nur bei der Behandlung von primären oder sekundären Erkrankungen oder Schäden von hämatopoetischen Geweben oder immunkompetenten Zellen, sondern in den letzten Jahren ebenfalls in großem Umfang bei der Chemotherapie von bösartigen Tumoren mit dem Zweck der Rekonstruktion solcher Gewebe oder Zellen, die zusammen mit den Tumorzellen als ein Ergebnis der immununterdrückenden Therapie geschädigt sind, in Erwartung von stärkeren Antitumorwirkungen angewandt.
Die Erkrankungen, bei denen die Knochenmarktransplantation durchgeführt wird, umfassen die primäre Immunmangelerkrankung, semi-aplastische Anämie, erbliche progressive hämocytische funktionelle Abnormalität und/oder Tumore in den blutbildenden Organen, wie akute Leukämie, chronische Leukämie, maligne Lymphoma, Plasmocytoma, progressive maligne feste Tumore.
Somit ist die Knochenmarktransplantation ein starkes zur Zeit verwendetes Mittel für die Behandlung von hämatopoetischen Erkrankungen. Jedoch kann das transplantierte Knochenmark nicht immer seine guten Funktionen entfalten.
Die Knochenmarktransplantation für eine hämatopoetische Erkrankung wird durchgeführt, wenn der Patient einen beachtlich geringen Leukocytengehalt aufweist, und ein derartig niedriger Leukocytengehalt wird für eine beachtlich lange Zeitspanne selbst nach der Transplantation aufrecht erhalten. Während dieser Zeitspanne besteht die Gefahr, daß der Patient Infekterkrankungen bekommt.
Um einen Leukocytengehalt nach der Transplantation schnell zu erhöhen, haben die Erfinder Versuche im Hinblick auf die Stimulierung der Produktion von Granulocyten durchgeführt. Als ein Ergebnis wurde nun festgestellt, daß die Verabreichung eines spezifischen Glycoproteins, eines Peptidfragmentes davon oder eines Derivates dieses Fragmentes an einen Patienten nach der Knochenmarktransplantation schnell den Leukocytengehalt in dem Blut auf ein normales Niveau wiederherstellt. Diese Erfindung wurde auf der Grundlage dieser Feststellung vollendet.
Das Glycoprotein, das entsprechend dieser Erfindung verwendet wird, wird aus menschlichem Urin gewonnen, wirkt auf die menschlichen Knochenmarkzellen, um die Differenzierung und Proliferation von Granulocyten-Monocyten-Abstammungen davon zu stimulieren, und es weist die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften auf, wenn das Glycoprotein gereinigt ist, so daß es eine spezifische Aktivität von 100.000 bis 1 Mio Einheiten/mg aufweist:
(a) Molmasse: 75.000 bis 90.000 (Gelfiltrationschromatografie);
(b) pH: 5,0 bis 6,0 (1 Gew.-%ige wäßrige Lösung);
(c) Elektrophorese: es wurde durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese festgestellt, daß die Molmasse 85.000 ist;
(d) Farbreaktion: positiv für Zucker in einer alpha-Naphtholschwefelsäure-Reaktion, Indol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion und Phenol-Schwefelsäure-Reaktion; positiv für Peptidbindungen und Aminosäure bei der Folin-Lowry's-Reaktion und Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure;
(e) Bestandteil von Aminosäuren in dem Proteinanteil: Prolin, Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Lysin, Histidin, Tryptophan und Arginin;
(f) Farbe und Form: im wesentlichen weiß, amorph;
(g) biologische Wirksamkeit: wirkt auf die menschlichen Knochenmarkzellen, zur Stimulierung der Differenzierung und Proliferation von Monocytenabstammungen davon;
(h) Löslichkeit: löslich in Wasser, leicht löslich in Chloroform; unlöslich in Ethylalkohol oder Aceton;
(i) spezifische optische Drehung: [alpha]D²&sup0;
0 ± 40 (0,25%ige wäßrige Lösung);
(j) isoelektrischer Punkt: pH 4,7 ± 0,2
(k) thermische Stabilität: bei der Erhitzung bei 60 ± 0,5ºC in 1%iger (G/V) wäßriger Lösung ist die Stimulierungsaktivität bei der Proliferation und Differenzierung vollständig verlorengegangen;
(l) Infrarotabsorption: charakteristische Absorptionen bei 3600-3200 (stark), 1700-1600 (stark), 1550 (mittel), 1430-1380 (mittel) und 1150-1000 (breit) (cm¹);
(m) Bestandteil an Zucker in dem Polysaccharidanteil: Neutralzucker (bei Glukoseumwandlung) = 10,0 bis 13,0 G/G%; Sialsäuren = 3,0 bis 7,0 G/G%; Aminozucker = nicht mehr als 1 G/G%;
(n) Bestandteil an Protein- und Polysaccharidverhältnis: Protein = 75 bis 85 G/G%, Saccharin = 13,0 bis 20,0 G/G%;
(o) Elementaranalyse:
C: 42,3 bis 47,3%
H: 5,7 bis 7,8%
N: 9,6 bis 14,3%
S: nicht mehr als 0,2%
Das Glycoprotein wird zur Herstellung eines Medikamentes für die Verabreichung nach einer Knochenmarktransplantation bei Patienten verwendet, die an einer primären Immunmangelkrankheit, semi-aplastischer Anämie, erblicher, progressiver, hämocytischer, funktioneller Abnormalität und/oder Tumoren in den blutbildenden Organen leiden.
Verfahren zur Herstellung des Glycoproteins dieser Erfindung sind in JP-A-140704/79, 26503/80, 26504/80 und 45618/80 offenbart.
Das typische Verfahren zum Erhalt des erfindungsgemäßen Glycoproteins ist wie folgt.
Frischer Urin von gesunden Menschen wird auf einen pH von 6 bis 9 und vorzugsweise von 7 bis 8 mit einer verdünnten Säure oder einer Alkalilösung eingestellt, mit anschließender Zentrifugation, zur Entfernung von irgendwelchen unlöslichen Stoffen in dem Urin. Der resultierende Überstand wird mit einem Silikon, das ein Adsorbens enthält, beispielsweise Silicagel, Silicagel-Magnesiumsilikat, Diatomeenerde, Silicaglas oder Bentonit, in Kontakt gebracht, und die adsorbierten Komponenten werden vorzugsweise mit einer wäßrigen Alkalilösung mit einem pH von 9 oder mehr eluiert. Die wäßrige Alkalilösung, die als ein Eluent verwendet werden soll, ist nicht besonders beschränkt, umfaßt aber vorzugsweise eine 0,3 bis 1,5 M wäßrige Lösung von Ammoniumhydroxid oder Natriumhydroxid. Das Eluat wird auf einen pH von 7 bis 8 eingestellt, und ein neutrales Salz, wie Ammoniumsulfat, wird dazu bis zu einer 70%igen Sättigung gegeben, um ein Aussalzen zu bewirken, um dadurch eine rohe Fraktion zu erhalten, die ein Glycoprotein enthält.
Die resultierende rohe Fraktion wird in einer kleinen Menge einer wäßrigen Alkalilösung aufgelöst und die Lösung wird durch eine Ultrafiltration geleitet, zur Entfernung von niedermolekulargewichtigen Komponenten mit einem Molekulargewicht von nicht mehr als 10.000. Die Lösung wird dann mit einem Kationenaustauscher (beispielsweise Dextran, das eine Carboxymethyl-Austauschgruppe enthält, Carboxymethylzellulose oder Phosphozellulose) in Kontakt gebracht, zur Adsorption und Entfernung von Verunreinigungen, die in der Lösung vorhanden sind. Der Kontakt wird bei im wesentlichen neutralen Bedingungen durchgeführt, und die rohe Glycoproteinfraktion und der Ionenaustauscher werden auf einen pH von 6 bis 8, vorzugsweise mit einer 0,01 bis 0,15 M anorganischen Salzpufferlösung, eingestellt. Der Hauptteil des Glycoproteins, das durch den Ionenaustauscher durchgeleitet ist, wird konzentriert und dann mit einem Anionenaustauscher (beispielseise DEAE-Zellulose) in Kontakt gebracht, der mit einer geringen Salzkonzentrations-Pufferlösung mit einem pH von 6 bis 8 äquilibriert ist, wodurch Glycoprotein auf dem Anionenaustauscher adsorbiert wird. Das adsorbierte Glycoprotein wird mit einer 0,1 bis 0,3 M Lösung eines anorganischen Salzes, beispielsweise Natriumchlorid, eluiert, wobei dessen Konzentration variiert wird (Gradientenelution). Das Glycoprotein fängt bei Salzkonzentrationen von 0,1 M oder mehr an zu eluieren, aber eine vollständige Trennung ist schwierig. Die aktiven Fraktionen, die mit Salzkonzentrationen von 0,1 bis 0,3 M eluiert sind, werden gesammelt und einer Entsalzung und Konzentrierung, falls gewünscht, unterworfen. Vor der Gradientenelution kann das Glycoprotein vorher durch Adsorption an einem Anionenaustauscher gereinigt werden, mit anschließender schrittweiser Elution mit einer wäßrigen Lösung, die eine Salzkonzentration von 0,3 M aufweist.
Für die Molekularsieb-Chromatografie werden die oben genannten Fraktionen durch eine Säule geleitet, die mit einem hochvernetzten Polymergel gepackt ist, das einen Wasserabsorptionswert von 10 bis 20 ml/g aufweist, beispielsweise Sephadex G-150 und Biogel P-100, und der adsorbierte aktive Bestandteil wird mit einer 0,05 bis 0,1 M Salzpufferlösung entwickelt. Fraktionen mit einer relativen Menge des Eluates von 1,11 bis 1,60, und vorzugsweise von 1,11 bis 1,45, werden gesammelt, mit anschließender Entsalzung und Konzentrierung oder Lyophilisierung.
Der Ausdruck "relative Menge des Eluates" bedeutet einen Ve/Vo-Wert, worin Ve eine Menge eines Lösungsmittels darstellt, die für die Elution von Substanzen innerhalb einer Säule notwendig ist; und worin Vo eine Menge des Lösungsmittels außerhalb der Gelpartikel innerhalb der Kolonne darstellt.
Für die weitere Reinigung wird das somit erhaltene Rohprodukt in einer verdünnten Pufferlösung, die 1,0 bis 2,0 M eines Salzes enthält, beispielsweise einer Phosphatpufferlösung, bei einem pH von 6,0 bis 8,0 und vorzugsweise 6,0 bis 7,0, aufgelöst, und die Lösung wird durch eine Säule geleitet, die mit einem Zuckeraffinitätsadsorbens, beispielsweise Concanavalin A-Sepharose 4B (verkauft von Pharmacia Fine Chemicals) gepackt ist. Die Säule wird mit einer 1,0 bis 2,0 M salzhaltigen Pufferlösung, die 20 bis 100 mM Zucker, beispielsweise alpha-Methyl-D-glycosid, enthält und die einen pH von 6,0 bis 8,0 und vorzugsweise 6,0 bis 7,0 aufweist, entwickelt. Die Glycoproteinfraktionen werden gesammelt und, falls erforderlich, einer Entsalzung unterworfen, mit anschließender Konzentrierung oder Lyophilisierung.
Weiter, für die elektrophoretische Reinigung werden die oben erhaltenen Fraktionen einer präparativen Zonenelektrophorese unter Verwendung eines Trägers, wie Acrylamid oder Agarosegel, bei einem pH von 7,0 bis 9,0 unterworfen und das Glycoprotein wird aus dem Träger gewonnen und einer Entsalzung unterworfen, mit anschließender Konzentrierung oder Lyophilisierung.
Es ist bevorzugt, daß eine wäßrige Lösung, die das resultierende Glycoprotein in einer Menge von wenigstens 70 mg/ml enthält, bei einem pH von 5 bis 9 bei einer Temperatur von 50 bis 70ºC für eine Zeitspanne von 8 bis 30 Stunden erhitzt wird. Es ist mehr bevorzugt, Albumin zu der wärmebehandelten wäßrigen Glycoproteinlösung als ein Stabilisator zuzugeben. Das somit gereinigte Glycoprotein weist eine spezifische Aktivität von 100.000 bis 1 Mio Einheiten/mg auf.
Das Glycoprotein, das von menschlichem Urin durch das oben beschriebene Verfahren gewonnen ist, wird in einer Ampulle unter sterilen Bedingungen lyophilisiert und in einer Pulverform abgedichtet. Vor der Lyophilisierung kann menschliches Serumalbumin als ein Stabilisator für das Glycoprotein und eine Aminosäure oder ein Saccharid als eine Hilfe für die Wiederherstellung zu dem Glycoprotein zugegeben werden, mit anschließender steriler Filtration.
Die Bestimmung der biologischen Aktivität des Glycoproteins kann durchgeführt werden, indem die Kolonienbildung von Maus-Knochenmarkzellen in vitro als ein Parameter verwendet wird. Spezifisch werden 0,1 ml einer Probe mit 1 ml McCoy's 5A-Medium vermischt, das 20% fötales Rinderserum, 0,3% Agar und 7,5·10&sup4; Maus-Knochenmarkzellen enthält, in einer Kunststoffschale mit einem Durchmesser von 35 mm vermischt. Die Kulturschalen werden 7 Tage lang bei 37ºC in befeuchteter Luft, die 5% CO&sub2; enthält, inkubiert. Nach der Inkubation werden Kolonien, die aus 50 oder mehr Zellen bestehen, unter einem Umkehrmikroskop gezählt, und eine gebildete Kolonie wird als eine Einheit dargestellt.
Die Ansätze, die das Glycoprotein, wie oben angegeben, enthalten, werden beispielsweise in physiologischer Kochsalzlösung und/oder destilliertem Wasser für die Injektion bei einer Konzentration von 10 bis 100 mg/ml aufgelöst und durch Tropfeninfusion oder durch direkte, intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Injektion verabreicht.
Die Dosierung bewegt sich üblicherweise von 1000 bis 150.000 Einheiten/kg Körpergewicht/Dosis, aber sie kann entsprechend den Symptomen variiert werden.
Der Zeitpunkt der Verabreichung ist unmittelbar nach der Knochenmarktransplantation oder 3 bis 10 Tage nach der Knochenmarktransplantation, zu dem der Leukocytengehalt den normalen Wert nicht erreicht oder eine GVH (Transplantation gegen Wirt) -Reaktion bei dem Implantat aufzutreten scheint. Die Verabreichung kann mehrere Male durchgeführt werden oder für mehrere Tage (2 bis 14 Tage) aufrecht erhalten werden, entsprechend der Veränderung des Leukocytengehaltes, bis dieser konstant wird.
Es gibt keine Beschränkung im Hinblick auf die Patienten, die mit derartigen Ansätzen behandelt werden sollen, solange sie an hämatopoetischen Erkrankungen leiden und eine Knochenmarktransplantation durchgeführt worden ist.
Wenn die Ansätze, die das Glycoprotein enthalten, den oben erwähnten Patienten verabreicht werden, wird eine beachtliche Verbesserung bei dem Leukocytengehalt im Blut beobachtet, ohne daß dies von irgendwelchen schädlichen Nebenwirkungen begleitet wird, was die Nützlichkeit der Ansätze als Behandlungsmittel für hämatopoetische Erkrankungen vermuten läßt.
Diese Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Beispiele und Testbeispiele detaillierter beschrieben.

BEISPIEL 1

Frischer Urin (400 l), der von gesunden Personen gesammelt war, wurde auf einen pH von 8 mit 10%igem Natriumhydroxid eingestellt und dann einer Zentrifugation bei 15.000 Upm unterworfen, während er auf 0ºC gekühlt wurde, um dadurch irgendwelche unlöslichen Stoffe zu entfernen. Der resultierende Überstand wurde mit 10%iger Salzsäure auf einen pH von 7 eingestellt und durch eine Säule (10·80 cm), die mit Silicagel gepackt war, geleitet. Die Komponente, die auf Silicagel adsorbiert war, wurde mit 40 5%igem wäßrigen Ammoniak eluiert. Das Eluat wurde auf einen pH von 7,5 mit 1 N Schwefelsäure eingestellt und Ammoniumsulfat wurde bis zur 70%igen Sättigung dazugegeben. Die Lösung konnte über Nacht bei 0ºC stehen und das gebildete Präzipitat wurde durch Zentrifugation gesammelt. Das Präzipitat wurde in 2 l 5%igem wäßrigen Ammoniak aufgelöst und die Lösung wurde in einer Zelluloseröhre (hergestellt von Visking Co.) ausreichend gegen eine 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 6,5) dialysiert. Zu der nicht-dialysierten Flüssigkeit wurde die gleiche Pufferlösung zugegeben, zur Auffüllung auf 10 l. Die Lösung wurde durch eine Säule (4,0·40 cm), die mit einem CM Sephadex® C-50 Ionenaustauscher gepackt war, der zuvor mit einer 0,05 M Phosphatpufferlösung (pH 6,5) äquilibriert war, geleitet, zur Adsorption von Verunreinigungen auf dem Ionenaustauscher.
Der Abfluß (10 l) wurde durch ein Diaflow-Hohlfaser-Konzentrationsgerät (DC-30 Modell, hergestellt von Amicon Co., Ltd.) konzentriert und das Konzentrat wurde gegen eine 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0) bei 5ºC über Nacht auf gleiche Weise, wie oben beschrieben, dialysiert. Die gleiche Pufferlösung wurde zu der nicht-dialysierten Flüssigkeit zur Herstellung von 3 l zugegeben.
Die resultierende Lösung wurde durch eine Säule (4,0·40 cm) DEAE-Zellulose geleitet, die mit der gleichen Pufferlösung aktiviert und äquilibriert worden war. Nach dem sorgfältigen Waschen der Säule mit einer 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0) wurde die Säule mit einer 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,3 M Natriumchlorid enthielt, eluiert. Fraktionen mit einer Stimulierungsaktivität bei der Differenzierung und Proliferation von Granulocyten wurden gesammelt und gegen eine 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0) dialysiert.
Die nicht-dialysierte Flüssigkeit wurde erneut durch eine Säule (4,0·40 cm) DEAE-Zellulose geleitet, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war, und mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,1 bis 0,3 M NaCl eluiert. Fraktionen mit einer Stimulierungsaktivität bei der Differenzierung und Proliferation von Granulocyten wurden gesammelt und Ammoniumsulfat wurde dazu bis zu einer 70%igen Sättigung gegeben. Das somit gebildete Präzipitat wurde gesammelt, in einer kleinen Menge einer 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0) aufgelöst und gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert.
Die nicht-dialysierte Flüssigkeit (20 ml) wurde auf eine Säule (4,0·60 cm), die mit Sephadex® G-150 gepackt war, die zuvor mit einer 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0) äquilibriert war, aufgebracht. Fraktionen mit einer relativen Menge des Eluates von 1,11 bis 1,45 wurden gesammelt und sorgfältig gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die nicht-dialysierte Flüssigkeit wurde lyophilisiert unter Erhalt von etwa 500 mg eines Pulvers.
Das resultierende Pulver (200 mg) wurde in einer 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0), die 1,0 M Natriumchlorid enthielt, aufgelöst und die Lösung wurde durch eine Säule geleitet, die 100 ml Concanavalin A-Sepharose 4B (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals) geleitet, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war. Die Säule wurde sorgfältig mit einer 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) gewaschen, die 1,0 M Natriumchlorid enthielt, und dann mit einer 0,02 M Phosphatpufferlösung (pH 7,0) eluiert, die 50 mM alpha-Methyl-D-glucosid und 1,0 M Natriumchlorid enthielt. Fraktionen mit einer Stimulierungsaktivität bei der Differenzierung und Proliferation von Granulocyten, die durch das oben beschriebene Verfahren untersucht wurden, wurden gesammelt und einer Dialyse gegen destilliertes Wasser unterworfen. Die nicht-dialysierte Fraktion wurde gefriergetrocknet.
Etwa 50 mg des resultierenden gefriergetrockneten Pulvers wurden in 1 ml einer 0,125 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 6,8), die 10 0- Glyzerin enthielt, aufgelöst und mit der Lösung wurde eine Zonenelektrophorese bei 10 mA dadurch unter Wasserkühlung mit Hilfe eines Gerätes für die präparierte Elektrophorese (Unifor 7900 Modell, hergestellt von LKB) unter Verwendung von 8%igem Acrylamidgel (pH 8,9; 25 mm·100 mm) durchgeführt. Eine Fraktion mit einer relativen Mobilität von 0,46 wurde gewonnen und gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die Lyophilisierung der nicht-dialysierten Flüssigkeit ergab etwa 10 mg eines Glcoproteins entsprechend dieser Erfindung.
Das oben genannte Verfahren wurde wiederholt, um etwa 1 g des gereinigten Glycoproteins zu erhalten. Zu 1 g des somit gereinigten Glycoproteins wurden 10 ml Wasser zugegeben, um das Glycoprotein vollständig aufzulösen und eine wäßrige 10%ige Natriumhydroxidlösung wurde dazugegeben, um einen pH von 6,8 einzustellen.
Die resultierende Lösung wurde bei 60ºC 10 Stunden lang erhitzt, mit anschließendem Abschrecken mit Eiswasser. Die Lösung wurde 10-fach mit sterilisiertem Wasser verdünnt, durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 um (hergestellt von Millipore) zur Entfernung von Bakterien filtriert, steril in Ampullen, die zuvor bei 180ºC 2 Stunden lang trockensterilisiert worden waren, in 1 ml-Portionen gegossen, aseptisch lyophilisiert und abgedichtet, unter Erhalt von etwa 27 Ampullen, die jeweils 1 mg des wärmebehandelten Glycoproteins enthalten.

BEISPIEL 2

Aus 1000 l einer frischen Urinsammlung von gesunden Personen wurden 2,5 l einer wäßrigen Lösung, die ein rohes Glycoprotein enthielt, auf gleiche Weise erhalten, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Zu der wäßrigen Lösung wurden 25 l einer 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0) zugegeben, und die Lösung wurde sorgfältig gerührt, mit anschließender Konzentrierung auf etwa 1/25 des Volumens durch die Verwendung eines Diaflow-Hohlfaser-Konzentrationsgerätes. Zu dem Konzentrat wurden 5 l einer 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0) und 5 l einer DEAE-Zelluloselösung (trockener DEAE-Zellulosegehalt: 200 g) gegeben, die mit einer 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0) äquilibriert war. Nach dem Rühren für 30 Minuten konnte die Mischung stehen und wurde dann durch Absaugen filtriert, zur Abtrennung der Zellulose. Die Zellulose wurde mit 10 l einer 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0) gewaschen und erneut durch Absaugen filtriert, zur Trennung der Zellulose. Die abgetrennte Zellulose wurde mit 10 l einer 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,05 M Natriumchlorid enthielt, gewaschen, mit anschließender Filtration durch Absaugen zur Abtrennung der Zellulose. Zu der abgetrennten Zellulose wurden 10 l einer 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0), die 0,3 M Natriumchlorid enthielt, gegeben, mit anschließendem Rühren, zur Elution des Glycoproteins aus der DEAE-Zellulose. Das resultierende Eluat wurde wiederholt mit destilliertem Wasser verdünnt, mit anschließender Konzentration durch die Verwendung eines Diaflow-Hohlfaser-Konzentrationsgerätes (DC-30 Modell). Das Konzentrat wurde entsalzt und lyophilisiert, unter Erhalt von etwa 15 g eines Pulvers. Das resultierende lyophilisierte Pulver wurde in 150 ml destilliertem Wasser aufgelöst und die Lösung wurde auf eine Gelfiltrationssäule (6,0·80 cm) aufgetragen, die mit Sephadex® G-150 gepackt war und mit einer 0,1 M Tris-HCl-Pufferlösung (pH 7,0) äquilibriert war. Glycoproteinhaltige Fraktionen mit relativen Mengen des Eluates von 1,11 bis 1,60 wurden gesammelt und sorgfältig gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die nicht-dialysierte Flüssigkeit wurde mit Hilfe eines Diaflow-Hohlfaser-Konzentrationsgerätes (DC-2 Modell) konzentriert, unter Erhalt von 100 ml eines Konzentrates, das etwa 9 g eines rohen Glycoproteins enthielt. Das Konzentrat wurde auf einen pH von 6,1 mit einer 0,1 M Natriumphosphatpufferlösung eingestellt und dann auf gleiche Weise wie bei Beispiel 1 erhitzt. Nach der Filtration zur Entfernung von Bakterien wurde die Lösung in Ampullen in 2,5 ml-Portionen gegossen, gefriergetrocknet und unter sterilen Bedingungen abgedichtet, unter Erhalt von 40 Ampullen, die jeweils etwa 3,8 ml des wärmebehandelten Glycoproteins enthielten.

TESTBEISPIEL 1

Die akute Toxizität des Glycoproteins, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, wurde in männlichen C&sub5;&sub7;BL-Mäusen durch das Verfahren von Richard et al, Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 90, 99 (1949) untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind unten in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1 Verabreichungsroute LD&sub5;&sub0; i.p. i.v. s.c. Einheiten/kg

TESTBEISPIEL 2

Bei einem Patienten, der an einer akuten lymphatischen Leukämie litt, wurde eine Knochenmarktransplantation am 12. September durchgeführt. Eine intravenöse Tropfeninfusion mit 4 Mio Einheiten/Tag eines Glycoproteins wurde dann für 7 aufeinanderfolgende Tage ab dem 20. September gegeben. Vor der Knochenmarktransplantation erhielt der Patient eine Strahlentherapie mit insgesamt 200 rad für 4 Tage vom 5. bis 8. September, und eine Endoxan-Verabreichung mit einer gesamten Dosis von 2500 mg für 2 Tage vom 7. bis 8. September. Die Änderung der Leukocyten- und Granulocytengehalte im Blut im Verlaufe der Zeit während dieser Zeitspannen ist in Tabelle 2 angegeben. TABELLE 2 Monat/Tag Anzahl der Leukocyten Anzahl der Granulocyten

Claims

Verwendung eines Glycoproteins, erhältlich von menschlichem Urin, das die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften aufweist, wenn das Glycoprotein gereinigt ist, so daß es eine spezifische Aktivität von 100.000 bis 1 Mio Einheiten/mg aufweist:

(a) Molmasse: 75.000 bis 90.000 (Gelfiltrationschromatografie);

(b) pH: 5,0 bis 6,0 (1 Gew.%ige wäßrige Lösung);

(c) Elektrophorese: durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-Elektrophorese wurde festgestellt, daß die Molmasse 85.000 ist;

(d) Farbreaktion: positiv für Zucker in einer alpha-Naphtholschwefelsäure-Reaktion, Indol-Schwefelsäure-Reaktion, Anthron-Schwefelsäure-Reaktion und Phenol-Schwefelsäure-Reaktion; positiv für Peptidbindungen und Aminosäure in der Folin-Lowry's-Reaktion, und Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure;

(e) Bestandteil von Aminosäuren in dem Proteinanteil: Prolin, Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glycin, Alanin, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Lysin, Histidin, Tryptophan und Arginin;

(f) Farbe und Form: im wesentlichen weiß, amorph;

(g) biologische Aktivität: wirkt auf die menschliche Knochenmarkzelle, zur Stimulierung der Differenzierung und Proliferation von Monocytenabstammungen davon;

(h) Löslichkeit: löslich in Wasser, leicht löslich in Chloroform; unlöslich in Ethylalkohol oder Aceton;

(i) spezifische optische Drehung: [alpha]D²&sup0;

0 ± 40 (0,25%ige wäßrige Lösung);

(j) isoelektrischer Punkt: pH 4,7 ± 0,2

(k) thermische Stabilität: bei der Erwärmung bei 60 ± 0,5ºC in 1%iger (G/V) wäßriger Lösung ist die Stimulierungsaktivität bei der Proliferation und Differenzierung vollständig verlorengegangen;

(l) Infrarotabsorption: charakteristische Absorptionen bei 3600-3200 (stark), 1700-1600 (stark), 1550 (mittel), 1430-1380 (mittel) und 1150-1000 (breit) (cm&supmin;¹);

(m) Bestandteil an Zucker in dem Polysaccharidanteil: Neutralzucker (bei der Glukoseumwandlung) = 10,0 bis 13,0 G/G%; Sialsäuren = 3,0 bis 7,0 G/G%; Aminozucker = nicht mehr als 1 G/G%;

(n) Bestandteil an Protein- und Polysaccharidverhältnis: Protein = 75 bis 85 G/G%, Saccharid = 13,0 bis 20,0 G/G%;

(o) Elementaranalyse:

C: 42,3 bis 47,3%

H: 5,7 bis 7,8%

N: 9,6 bis 14,3%

S: nicht mehr als 0,2%

zur Herstellung eines Medikamentes für die Verabreichung nach einer Knochenmarktransplantation an Patienten, die an primärer Immunmangelerkrankung, semi-aplastischer Anämie, erblicher, progressiver, hämocytischer, funktioneller Abnormalität und/oder Tumoren in den blutbildenden Organen leiden.