DE2910745C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Glykoproteid, nachstehend als HGI- Glykoproteid bezeichnet (HGI = human granulocyte inducing), isoliert aus dem Urin gesunder Menschen, das auf die granulopoetischen Stammzellen im menschlichen Knochenmark wirkt und dadurch die Proliferation und Differenzierung dieser Zellen zur Bildung von Granulozyten stimuliert. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung des Glykoproteids sowie die Verwendung dieses Glykoproteids bei der Bekämpfung von Leukozytopenie.

Während das periphere Blut gesunder Menschen etwa 5000 bis 9000 Leukozyten pro mm³ enthält, liegt die Zahl der Leukozyten bei Leukozytopenie unterhalb etwa 4000 pro mm³. Die Leukozytopenie hängt mit einer anormalen Abnahme der Proliferation von Knochenmarkzellen bei einigen infektiösen und parasitären Erkrankungen, Bestrahlung oder Verabfolgung von Zytostatika zusammen. Zur Therapie der Leukozytopenie wurden bisher Präparate verwendet, die Glycyrrhizin oder ein Gemisch von Gystein und Glykokoll, α-Mercaptopropionylglycin oder das Alkaloid Cepharatin enthalten. Die Chemoterapeutika sind jedoch unerwünscht aufgrund ihrer unbefriedigenden Wirkung und/oder Nebenwirkungen. Es war daher das Ziel zahlreicher Forschungsgruppen, Arzneistoffe zur Behandlung von Leukozytopenie zu entwickeln, die wirksamer sind und geringere Nebenwirkungen hervorrufen. Es war bekannt, daß ein "colony-stimulating- factor", nachstehend kurz mit CSF bezeichnet, die Proliferation und Differenzierung von Knochenmarkzellen stimuliert. CSF wirkt auf Knochenmarkzellen und stimuliert die Proliferation und Differenzierung zur Bildung von Granulozyten oder Makrophagen. Es ist ein essentieller Faktor für die Knochenmarkzellen, bei ihrer in vitro Züchtung durch gleichzeitige Proliferation und Differenzierung Granulozyten- oder Makrophagenzellaggregate zu bilden (nachstehend als Granulozyten- oder Makrophagen-Kolonien bezeichnet); vgl. Y. Ichikawa, Proceedings of the National Academy of Science, Bd. 56 (1966), S. 488, und D. Metcalf, Experimental Hematology, Bd. 1 (1973), S. 185. Da CSF die Bildung von Granulozyten- und Makrophagen-Kolonien von Knochenmarkzellen induziert, schlugen einige Forschungsgruppen vor, CSF als getrennte Faktoren anzusehen, nämlich als Granulozyten induzierenden Faktor und Makrophagen induzierenden Fakttor; vgl. E. R. Stanley et al., J. Exp. Med., Bd. 143 (1967), S. 631. Im allgemeinen werden diese Faktoren jedoch gemeinsam als CSF in vitro Tests an Mäuseknochenmarkzellen bestimmt. Es wurden zahlreiche Faktoren, die die Koloniebildung in vitro in Mäuseknochenmarkzellen stimulieren, aus verschiedenen Quellen isoliert, beispielsweise Serum, Urin, verschiedenen Organextrakten und Medien, die durch verschiedene Gewebe und Zelllinien konditioniert sind, Körperflüssigkeitselemente, wie Serum und Urin, konditionierte Medien von Zellen, wie Leukozyten und Gewebe; vgl. J. W. Sheridan, Journal of Cell Physiology, Bd. 78 (1971), S. 451. Auf menschliche Knochenmarkzellen wirkendes CSF wurde aus menschlichen Quellen isoliert, nämlich aus verschiedenen Organextrakten, Serum und Gewebemedien; vgl. D. Metcalf und M. A. S. Moore, "Ciba Foundation Symposium 13, Haemopoietic Stem Cells" , S. 157-175, Elsevier Excerpta Medica, Holland, 1973. Das aus verschiedenen Organen, verschiedenen Zellen und deren konditionierten Medien erhaltene CSF ist jedoch nicht identisch. Beispielsweise beträgt das Molekulargewicht von CSF aus Medien, die durch humane Placentazellen konditioniert sind, 30 000 Dalton (vgl. A. W. Burgess et al., Blood, Bd. 49 (1977), S. 573), während das Molekulargewicht von CSF aus humanen Serum 45 000 Dalton beträgt (vgl. S. H. Chan et al., British Journal of Haematology, Bd. 20 (1971), S. 329). Zwei Typen von CSF mit einem Molekulargewicht von 35 000 und weniger als 1300 wurden aus Medien isoliert, die durch humane Leukozyten konditioniert worden sind; vgl. G. B. Price et al., Blood, Bd. 42 (1973), S. 341. Die verschiedenen CSF-Präparate haben eine unterschiedliche Aktivität. Einige wirken entweder auf zu proliferierende und zu differenzierende Granulozytenzellen oder Makrophagenzellen. Andere wirken auf beide Arten von Zellen. Deshalb sind die aus verschiedenen Quellen isolierten CSF-Präparate voneinander verschieden; vgl. Metcalf und Moore, a. a. O., 1973.

Es ist ferner bekannt, daß im menschlichen Urin ein Typ von CSF vorkommt, der Mäuseknochenmarkzellen zur Bildung von Kolonien von Granulozyten und Makrophagen in vitro stimuliert; vgl. E. R. Stanley et al., Federation Proceedings, Bd. 34 (1975), S. 2272, und E. R. Stanley und D. Metcalf, Aust. J. exp. Biol. med. Sci., Bd. 47 (1969), S. 467-483. Dieses CSF-Präparat soll ein Molekulargewicht von 45 000 haben und die Proliferation und Differenzierung von Mäuseknochenmarkzellen zur Bildung von vorwiegend Makrophagen- Kolonien stimulieren. Im Gegensatz zu seiner stimulierenden Wirkung gegenüber Mäuseknochenmarkzellen stimuliert das Präparat kaum die Bildung von Granulozyten- oder Makrophagen- Kolonien in menschlichen Knochenmarkzellen, sondern es stimuliert die Bildung von sogenannten Gluster. Im Zusammenhang mit menschlichen Knochenmarkzellen bedeuten die Ausdrücke "Kolonie" und "Gluster" Zellaggregate mit 40 oder mehr Zellen bzw. 3 bis weniger als 40 Zellen nach der Definition von Metcalf; vgl. D. Metcalf, Experimental Hematology, Bd. 2 (1974), S. 157.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Glykoproteid bzw. ein CSF-Präparat sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung zu schaffen, das als Arzneistoff zur Bekämpfung von Leukozytopenie eingesetzt werden kann. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem Befund, daß aus menschlichem Urin ein HGI- Glykoproteid isoliert werden konnte, das sich von den bekannten CSF-Präparaten erheblich unterscheidet, ein Molekulargewicht von etwa 75 000 bis 90 000 Dalton (bestimmt durch Gelfiltration) besitzt und sowohl bei menschlichen Knochenmarkzellen als auch Mäuseknochenmarkzellen die Bildung reiner Granulozytenkolonien in vitro bewirkt. Das HGI-Glykoproteid hat eine starke Wirkung auf menschliche Knochenmarkzellen und stimuliert die Proliferation und Differenzierung reiner Granulozytenkolonien. Nachstehend wird diese Wirkung bisweilen auch als "biologische Aktivität" bezeichnet.

Die Erfindung betrifft somit die in den Patentansprüchen 1, 2 und 11 gekennzeichneten Gegenstände. Die Unteransprüche 3 bis 10 betreffen bevorzugte Ausgestaltungen des Verfahrens; der Unteranspruch 12 betrifft eine bevorzugte Ausführungsform des Verwendungsanspruchs 11.

Das HGI-Glykoproteid der Erfindung wird folgendermaßen hergestellt. Menschlicher Urin wird auf die in ihm enthaltenen Proteine konzentriert. Sodann werden die Proteine mit einem Kationenaustauscher zur Abtrennung von Verunreinigungen behandelt. Die Verunreinigungen werden am Austauscher adsorbiert. Die abfließende Lösung wird mit einem Anionenaustauscher behandelt, um den Wirkstoff zu adsorbieren. Sodann wird der Wirkstoff mit einer Salzlösung mit linearem Konzentrationsgradienten eluiert. Das Eluat wird der Gelfiltrationschromatographie an einem stark vernetzten Polymergel unterworfen, um den Wirkstoff zu entwickeln. Es werden die Fraktionen mit einem relativen Elutionsvolumen von 1,11 bis 1,60 aufgefangen, vorzugsweise noch der Affinitätschromatographie an einem Absorptionsmittel mit Affinität für Zucker unterworfen und das adsorbierte Glykoproteid mit einer 20- bis 100 m-molaren Saccharidlösung eluiert. Vorzugsweise wird das Eluat noch der präparativen Zonenelektrophorese unterworfen und das Glykoproteid mit einer Kochsalzlösung eluiert und in reiner Form isoliert. Nachstehend wird die Erfindung näher beschrieben.

Ein typisches Verfahren zur Herstellung des HGI-Glykoproteids der Erfindung wird folgendermaßen durchgeführt: Frischer Urin von gesunden Menschen wird auf einen pH-Wert von 6 bis 9, vorzugsweise 7 bis 8, mit verdünnter Säure oder Base eingestellt und sodann zur Abtrennung von unlöslichen Substanzen zentrifugiert. Der Überstand wird mit einem Silicium enthaltenden Adsorptionsmittel, wie Kieselgel, Kieselgel-Magnesiumsilikat, Diatomeenerde, Quarzglas oder Bentonit, zusammengebracht, und die adsorbierten Bestandteile werden mit einer alkalischen Lösung mit einem pH-Wert von vorzugsweise 9 oder höher eluiert. Die Art der zur Eluierung verwendeten alkalischen Lösung ist nicht besonders kritisch. Vorzugsweise wird eine wäßrige Ammoniaklösung oder Natronlauge in einer Konzentration von 0,3 bis 1,5 M verwendet. Das erhaltene Eluat wird mit einer Säure auf einen pH-Wert von 7 bis 8 eingestellt und mit einem Neutralsalz, beispielsweise Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt, um den Wirkstoff auszusalzen. Es wird eine rohe Proteinfraktion erhalten, die das HGI- Glykoproteid enthält.

Die erhaltene rohe Proteinfraktion wird in einer geringen Menge einer alkalischen Lösung gelöst, von niedermolekularen Substanzen durch Ultrafiltration befreit, mit einer 0,01 bis 0,15 molaren Salz-Pufferlösung verdünnt und mit einem Kationenaustauscher, beispielsweise einem Carboxymethyldextran, Carboxymethylcellulose oder Phosphocellulose, behandelt, um Verunreinigungen abzutrennen. Die Behandlung mit dem Austauscher wird bei neutralem pH-Wert durchgeführt. Die rohe Fraktion des HGI-Glykoproteids und der Kationenaustauscher wurden vor dem Zusammenbringen auf einen pH-Wert von 6 bis 8 mit vorzugsweise 0,01 bis 0,15 m Salz-Pufferlösung eingestellt. Der größte Teil des HGI-Glykoproteids läuft durch den Kationenaustauscher ohne Adsorption hindurch. Die abfließende Lösung wird konzentriert und das Konzentrat mit einer verdünnten Pufferlösung vom pH-Wert 6 bis 8 äquilibriert und der Ionenaustauschchromatographie an einem Anionenaustauscher, wie DEAE-Cellulose, unterworfen, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert worden ist. Das HGI-Glykoproteid wird an dem Anionenaustauscher adsorbiert. Sodann wird das adsorbierte HGI-Glykoproteid mit einer 0,1 bis 0,3 m Salzlösung, vorzugsweise einer Natriumchlorlösung, mit linearem Konzentrationsgradient eluiert. Das HGI-Glykoproteid wird bei einer Salzkonzentration von 0,1 M oder höher eluiert. Eine vollständige Trennung ist schwierig. Die Fraktionen der abfließenden Lösung bei einer 0,1 bis 0,3 M Salzkonzentration werden aufgefangen und gegebenenfalls entsalzt und konzentriert.

Es ist auch möglich, die stufenweise Eluierung mit 0,1 bis 0,3 M Salzlösung zur Eluierung des HGI-Glykoproteids aus dem Ionenaustauscher anzuwenden.

Zur weiteren Reinigung werden die erhaltenen vereinigten Fraktionen der Gelfiltrationschromatographie an einem stark vernetzten Polymergel mit einem Wasseraufnahmewert von 10 bis 20 ml pro g unterworfen, beispielsweise Sephadex G-150 oder Biogel P-100. Die aktiven Substanzen werden mit einer 0,05 bis 0,1 M Salz-Pufferlösung entwickelt. Fraktionen mit einem relativen Elutionsvolumen von 1,11 bis 1,60, vorzugsweise 1,11 bis 1,45, werden aufgefangen, entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet.

Die auf diese Weise enthaltenen, halbreinen HGI-Glykoproteid- Präparate können bereits als Arzneistoffe verwendet werden.

Das relative Elutionsvolumen wird ausgedrückt durch den Quotient Ve/Vo, wobei Ve das zur Eluierung der in der Säule vorliegenden Substanz erforderliche Elutionsvolumen und Vo das äußere Volumen (Hohlraumvolumen) darstellt.

Zur weiteren Reinigung wird das halbgereinigte Präparat in einer verdünnten Kochsalz-Pufferlösung gelöst, die 1,0 bis 2,0 Mol/l NaCl enthält, beispielsweise einer Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0, die 1,0 bis 2,0 M an Natriumchlorid ist. Die Lösung wird der Affinitätschromatographie an einem Absorptionsmittel mit Affinität für Zucker unterworfen, beispielsweise Concanavalin A-Sepharose 4B, das mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Das an der Säule adsorbierte HGI-Glykoproteid wird mit einer 1,0 bis 2,0 M Kochsalzlösung in einer verdünnten Pufferlösung, die 20 bis 100 mMolar an Sacchariden und 1,0 bis 2,0 M an Kochsalz ist, beim pH 6,0 bis 8,0 eluiert. Beispielsweise ist das Saccharid ein α-Methyl-D-glucosid, das in Lösung einen pH-Wert von 6,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0 hat. Die das HGI-Glykoproteid enthaltenden Fraktionen werden aufgefangen und erforderlichenfalls entsalzt und konzentriert oder gefriergetrocknet.

Zur weiteren Reinigung des HGIO-Glykoproteids durch Elektrophorese werden die vereinigten Fraktionen aus der Affinitätschromatographie der präparativen Zonenelektrophorese unter Verwendung von Polyacrylamidgel oder Agarosegel als Träger beim pH-Wert 7,0 bis 9,0 unterworfen. Stark gereinigtes HGI-Glykoproteid wird vom Träger mit verdünnter Salzlösung unter Kühlung eluiert. Sodann wird die erhaltene Lösung entsalzt, konzentriert oder gefriergetrocknet.

Im Verlauf des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Gewinnung des HGI-Glykoproteids ist es möglich, gleichzeitig noch Urokinase, Kallikrein und Lysozym zu gewinnen.

Das erhaltene stark gereinigte HGI-Glykoproteid ist ein weiß bis hellbraun gefärbtes Pulver, es ist geschmack- und geruchlos und etwas hygroskopisch und hat die nachstehend beschriebenen physikalischen und chemischen Eigenschaften.

In Fig. 1 ist das IR-Absorptionsspektrum des HGI-Glykoproteids wiedergegeben. Fig. 2 zeigt die Beziehung zwischen der relativen Beweglichkeit bei der Elektrophorese und dem Molekulargewicht. In Fig. 3 ist das UV-Absorptionsspektrum des HGI- Glykoproteids wiedergegeben und Fig. 4 zeigt die Beziehung zwischen der zugesetzten Menge des HGI-Glykoproteids und der Zahl der Kolonien, die sich beim in vitro Test entwickelt haben.

Die physikalischen und chemischen Eigenschaften wurden an der Probe Nr. 6 von Beispiel 1 (vgl. unten) bestimmt.

(1) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des HGI-Glykoproteids der Erfindung beträgt etwa 85 000 Dalton, bestimmt durch Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamid-Gelelektrophorese, und 75 000 bis 90 000 Dalton, bestimmt durch Gelfiltration an Sephadex G-150. Dementsprechend scheint der zuverlässigste Wert für das Molekulargewicht zwischen 75 000 und 90 000 Dalton zu liegen.

(2) Löslichkeit

Die Löslichkeit des HGI-Glykoproteids in verschiedenen Lösungsmitteln ist in Tabelle I zusammengestellt. Tabelle I

LösungsmittelLöslichkeit

Wasserlöslich Äthanolunlöslich Acetonunlöslich Chloroformwenig löslich 1 M Natriumchloridlösunglöslich 10% Sucroselösunglöslich

Außerdem ist HGI-Glykoproteid in verdünnten Salzlösungen leicht löslich, beispielsweise einer verdünnten Phosphatlösung oder einer verdünnten Trisaminomethanlösung. Es ist ferner löslich in einer verdünnten Salzlösung im pH-Bereich von 1 bis 12.

(3) pH-Wert

Der pH-Wert einer 1prozentigen wäßrigen Lösung des HGI-Glykoproteids beträgt 5,0 bis 6,0. Somit reagiert es schwach sauer.

(4) Spezifischer Drehwert

Der spezifische Drehwert wird an einer 0,25prozentigen wäßrigen Lösung des HGI-Glykoproteids bei 20°C und der Wellenlänge der D-Linie bestimmt. [α] = 0 ± 40°.

(5) IR-Absorptionsspektrum

Das IR-Absorptionsspektrum des HGI-Glykoproteids als Kaliumbromid- Preßling ist in Fig. 1 wiedergegeben. Die charakteristischen Absorptionsbanden sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

(6) Isoelektrischer Punkt

Der isoelektrische Punkt des HGI-Glykoproteids liegt bei pH 4,7 ±0,2, bestimmt durch Polyacrylamidgel-Elektrofocussierung.

(7) Farbreaktionen

Farbreaktionen des HGI-Glykoproteids werden in wäßriger Lösung durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengefaßt.

Tabelle III

(8) Thermostabilität

Bei 30minütigem Erhitzen einer 1prozentigen wäßrigen Lösung des HGI- Glykoproteids auf 60 ± 0,5°C ist die CSF-Aktivität nicht mehr feststellbar.

(9) Aminosäurezusammensetzung des Proteinfragments

Das HGI-Glykoproteid wird mit 1 n Salzsäure bei 110°C hydrolysiert, und die Aminosäurezusammensetzung des Proteinfragments wird mittels eines Aminosäure-Auto-Analyzers bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

Aus Tabelle IV ist ersichtlich, daß das Proteinfragment des HGI-Glykoproteids aus 17 Aminosäuren-Grundbausteinen besteht, wobei die sauren und neutralen Aminosäuren überwiegen, während die basischen Aminosäuren in untergeordneten Mengen vorliegen. Ebenfalls charakteristisch ist, daß über 70% der gesamten Aminosäuren unverzweigte Aminosäuren sind, einschließlich Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glykokoll, Alanin, Valin und Leucin.

(10) Elektrophorese

Nach der Methode von Laemmli, Nature, Bd. 227 (1970), S. 680, und unter Verwendung von Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel, zeigt das HGI-Glykoproteid eine einzige Bande bei einer Stellung einer relativen Beweglichkeit von 0,25. Gleichzeitig wurden der Elektrophorese unterworfen der Trypsininhibitor (Molekulargewicht 21 500), Ovalbumin (Molekulargewichtr 43 000), monomeres humanes Serumalbumin (Molekulargewicht 65 000) und dimeres humanes Serumalbumin (Molekulargewicht 130 000). Aus den Beweglichkeiten der Substanzen bekannten Molekulargewichts und der Beweglichkeit des HGI-Glykoproteids berechnet sich das Molekulargewicht des Glykoproteids zu etwa 85 000 (Fig. 2). In Fig. 2 bedeuten die Buchstaben a, b, c und d den Trypsininhibitor, das Ovalbumin, das monomere humane Serumalbumin und das dimere humane Serumalbumin. Der Pfeil kennzeichnet das HGI- Glykoproteid.

(11) UV-Absorptionsspektrum

Das UV-Absorptionsspektrum des HGI-Glykoproteids, bestimmt an einer 0,1prozentigen wäßrigen Lösung in einer Quarzzelle einer Schichtdicke von 1 cm ist in Fig 3 wiedergegeben. Das Absorptionsspektrum zeigt ein Absorptionsmaximum bei 280 nm und Endabsorption im Wellenlängenbereich unterhalb 250 nm. Die optische Dichte E bei 280 nm beträgt 3,8.

(12) Zuckerzusammensetzung des Polysaccaridfragments

Neutralzucker wurden durch die Phenol-Schwefelsäure-Reaktion, Sialinsäuren nach der Thiobarbital-Methode von Warren (Journal of Biological Chemistry, Bd. 234 (1959), S. 1971) und Aminozucker nach der Methode von Elson-Morgan (Biochemical Journal, Bd. 27 (1933), S. 1824) bestimmt. Die Menge der Neutralzucker wird in Glucose ausgedrückt. Es wurden folgende Ergebnisse erhalten: Neutralzucker 10,0 bis 13,0%; Sialinsäuren 3,0 bis 7,0%; Aminozucker wenigert als 1,0%; Gesamtzucker 13,0 bis 20,0%.

(13) Protein- und Polysaccharid-Gehalt

Der Proteingehalt des HGI-Glykoproteids beträgt 75 bis 85%, bestimmt nach der semi-mikro-Kjeldahl-Methode. Der Gesamtzuckergehalt beträgt 13,0 bis 20,0%, wie vorstehend beschrieben.

(14) Elementaranalyse

Die Elementaranalyse des HGI-Glykoproteids ergibt folgende Werte: Kohlenstoff 42,3 bis 47,3%; Wasserstoff 5,7 bis 7,8%; Stickstoff 9,6 bis 14,3%; Sauerstoff 34,4 bis 39,4%; Schwefel weniger als 0,2%.

Das HGI-Glykoproteid der Erfindung mit den vorstehenden physikalischen und chemischen Eigenschaften stimuliert die Proliferation und Differenzierung von Granulozyten sowohl des Menschen als auch der Maus. Dies ist aus dem nachstehend beschriebenen Versuch 1 ersichtlich. Das Glykoproteid zeigte keine akute Toxizität, wie aus dem nachstehend beschriebenen Versuch 4 hervorgeht. Aus dem nachstehend beschriebenen Versuch 3 ist ersichtlich, daß das Glykoproteid zur Bekämpfung von Leukozytopenie eingesetzt werden kann.

Das aus menschlichem Urin nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellte HGI-Glykoproteid der Erfindung wird unter aseptischen Bedingungen in Gefäßen gefriergetrocknet und sodann hermetisch verschlossen. Vor der Gefriertrocknung ist es möglich, das HGI-Glykoproteid mit einer wäßrigen Lösung von humanem Serumalbumin als Stabilisator sowie einer Aminosäure oder einem Saccharid zur Verbesserung der Löslichkeit zu versetzen. Die erhaltene Lösung wird durch Membranfiltration sterilisiert und sodann aseptisch gefriergetrocknet. Vor dem Gebrauch wird das Gefäß geöffnet und das HGI-Glykoproteid durch Zusatz steriler physiologischer Kochsalzlösung, sterilen Wassers oder einer sterilen isotonischen Lösung gelöst. Die erhaltene Lösung kann intravenös, intramuskulär oder subcutan injiziert werden.

Aus den Ergebnissen der nachstehend beschriebenen Versuche 1 und 2 geht hervor, daß die wirksame Tagesdosis mindestens 0,75 mg, vorzugsweise 0,75 bis 2,24 mg pro kg Körpergewicht beträgt. Halbgereinigte, großtechnisch hergestellte Präparate mit einer spezifischen biologischen Aktivität von mindestens etwa 35 000 Einheiten pro mg, beispielsweise die HGI-Glykoproteidprobe Nr. 4 und Nr. 5 von Beispiel 1, können ebenfalls als Arzneistoffe verwendet werden.

Die Wirkung des HGI-Glykoproteids der Erfindung auf die Proliferation und Differenzierung von Granulozyten wird nachstehend im einzelnen beschrieben.

Versuch 1 Stimulierende Wirkung auf die Proliferation und Differenzierung von Granulozyten der Maus und des Menschen in vitro

Kunststoff-Petrischalen mit einem Durchmesser von 35 mm werden jeweils mit 1 ml McCoy's 5A Medium beschickt, das 0,05, 0,1, 0,15 bzw. 0,2 µg HGI-Glykoproteid (Probe Nr. 6 von Beispiel 1), 20% foetales Kälberserum, 0,3% Agar und 7,5 × 10⁴ Knochenmarkzellen der Maus oder 25 × 10⁴ Knochenmarkzellen von gesunden Menschen oder Patienten mit Eisenmangelanämie enthalten. Das Medium in den Petrischalen wird in feuchter, 5% CO₂ Atmosphäre 7 bis 9 Tage bei 37°C inkubiert. Der Unterschied in der Zahl der eingeimpften Mäusezellen und Menschenzellen beruht auf der größeren Zahl von Stammzellen im Falle der Maus. Nach dem Inkubieren werden Einzelkolonien, die mehr als 50 Zellen von der Maus oder mehr als 40 Zellen vom Menschen enthalten, mit einem umgekehrten Mikrokop (Strahlengang umgekehrt) gezählt. Zur morphologischen Analyse der Kolonien werden einige von ihnen in Mikrohämatokritröhrchen überimpft und mit 0,6prozentiger Orcein in 40prozentiger Essigsäure gefärbt. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 wiedergegeben. In dieser Figur ist die Beziehung zwischen der HGI-Glykoproteid-Dosis und der Zahl der in vitro gebildeten Kolonien wiedergegeben. In Fig. 4 bedeuten die Kreise die Mäuseknochenmarkzellen und die Produkte die menschlichen Knochenmarkzellen.

Aus Fig. 4 ist ersichtlich, daß das HGI-Glykoproteid der Erfindung die Proliferation und Differenzierung von Knochenmarkzellen der Maus und des Menschen stimuliert. Es besteht eine Dosis-Reaktions-Beziehung zwischen dem HGI-Glykoproteid und der Zahl der gebildeten Kolonien.

Die morphologische Analyse der Zellen in den Kolonien ergibt, daß alle Zellen reife Granulozyten sind.

Wie vorstehend beschrieben wirkt das HGI-Glykoproteid auf Knochenmarkzellen des Menschen und der Maus unter Bildung von Granulozytenkolonien, wobei die Zahl der Kolonien proportional der Dosis des HGI-Glykoproteids ist. Es besteht eine bestimmte Beziehung zwischen der Bildung der Kolonien der Knochemarkzellen zwischen Maus und Mensch. Deshalb wurden in allen nachfolgenden Versuchen nur Knochenmarkzellen der Maus verwendet.

Versuch 2 Stimulierende Wirkung auf die Proliferation und Differenzierung von Granulozyten in vivo

60 männliche Mäuse des C₅₇-BL-Stammes mit einem durchschnittlichen Körpergewicht von 20 g werden statitisch in 6 Gruppen zu jeweils 10 Tieren unterteilt. Eine Gruppe diente zum Vergleich. Dieser Gruppe wird subcutan 0,04 mg pro Maus humanes Serumalbumin in 0,2 ml steriler normaler Kochsalzlösung einmal täglich an drei aufeinanderfolgenden Tagen gegeben. Den restlichen 5 Gruppen wird subcutan 0,005, 0,01, 0,02, 0,03 bzw. 0,04 mg pro Maus HGI-Glykoproteid der Probe Nr. 6 von Beispiel 1, gelöst in 0,2 ml steriler normaler Kochsalzlösung, einmal täglich während drei aufeinanderfolgender Tage gegeben.

Blutproben werden aus der Vena coccygea jeder Maus vor der Injektion und 2, 4, 6, 8 und 10 Tage nach der Injektion entnommen. Die Leukozyten jeder Blutprobe werden mit 1prozentiger Gentiana Violettlösung gefärbt und die Leukozytenzahl wird in einer Bürker-Türk-Zählkammer gezählt.

Weiterhin wird jede Blutprobe auf einen Objektträger aufgestrichen, mit Wright-Giemsa Lösung gefärbt, und der Anteil der Granulozyten bei den Leukozyten wird mikroskopisch bestimmt.

Die Zahl der Granulozyten wird nach folgender Gleichung berechnet:

Leukozytenzahl in 1 mm³ × Anzahl der Granulozyten in den Leukozyten = Zahl der Granulozyten in 1 mm³

Die Ergebnisse sind in Tabelle V zusammengestellt.

Tabelle V

Aus Tabelle V ist ersichtlich, daß die periphere Granulozytenzahl der Versuchsgruppen, denen 0,01 bis 0,04 mg pro Maus HGI- Glykoproteid gegeben wurde, zwei Tage nach der Verabfolgung zunahm und nach 6 Tagen den 3- bis 6fachen Wert der Vergleichsgruppe erreichte.

Die Granulozytenzahl nimmt danach wieder ab und nach 10 Tagen ist wieder der Normalwert erreicht. Bei Steigerung der Tagesdosis auf mehr als 0,04 mg zeigt sich keine signifikante Zunahme der Granulozyten entsprechend der Dosis des HGI-Glykoproteids.

Diese Ergebnisse zeigen, daß durch tägliche Injektion von mindestens 0,01 mg, vorzugsweise 0,01 bis 0,03 mg HGI-Glykoproteid einer Maus mit einem mittleren Körpergewicht von etwa 20 g Granulozytose erzeugt werden kann. Da die stimulierenden Wirkungen des HGI-Glykoproteids auf Mäuseknochenmarkzellen in vitro durchschnittlich etwa 1,5mal höher sind als die Wirkung auf menschliche Knochenmarkzellen (Versuch 1), ist die wirksame Dosis für den Menschen 1,5mal so hoch wie für die Maus, bestimmt in vivo nach Versuch 2. Dementsprechend liegt die wirksame Tagesdosis beim Menschen pro kg Körpergewicht bei mindestens etwa 0,75 mg, vorzugsweise 0,75 bis 2,24 mg.

Versuch 3 Schutzwirkung des HGI-Glykoproteids durch Zytostatika hervorgerufener Leukozytopenie

30 männliche, 4 bis 5 Wochen alte Mäuse des C₅₇ BL-Stammes werden statitisch in drei Gruppen zu je 10 Tieren unterteilt. Der Vergleichsgruppe wird intraperetoneal 30 mg pro kg Körpergewicht (entspricht 1/10 LD₅₀) Cytosin-D-arabinosid, gelöst in 0,2 ml steriler normaler Kochsalzlösung einmal täglich während 14 aufeinanderfolgender Tage gegeben. Zusätzlich werden 0,2 ml pro Maus sterile normale Kochsalzlösung subcutan einmal täglich während 14 aufeinanderfolgender Tage gegeben. Der ersten Versuchsgruppe wird Cytosin-D-arabinosid wie der Vergleichsgruppe gegeben. Zusätzlich werden 0,03 mg pro Maus HGI-Glykoproteid der Probe Nr. 6 von Beispiel 1 subcutan einmal täglich während 14 aufeinanderfolgenden Tage gegeben. Der restlichen Versuchsgruppe wird ebenfalls Cytosin-D-arabinosid wie der Vergleichsgruppe gegeben sowie subcutan 0,3 mg pro Maus Cepharatin, gelöst in 0,2 ml steriler normaler Kochsalzlösung, einmal täglich während 14 aufeinanderfolgender Tage.

Blutproben werden aus der Vena coccygea jeder Maus vor der Verabfolgung und am 2., 4., 6., 8., 10., 12. und 14. Tag nach der Verabfolgung entnommen. Die Leukozytenzahl wird wie in Versuch 2 bestimmt und die prozentuale Abnahme (Dekrement) der Leukozytenzahl nach der Verabfolgung wird erhalten. Die Leukozytenzahl vor der Verabfolgung wird zu 100 angenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI zusammengestellt.

Tabelle VI

Im Vergleich zur Vergleichsgruppe zeigt die HGI-Glykoproteid- Gruppe eine ausgeprägte Schutzwirkung gegenüber der Verminderung der Leukozytenzahl 10 Tage nach Beginn der HGI-Glykoproteid- Verabfolgung. Der Effekt ist mindestens ebenso gut wie der von Cepharantin. Am 14. Tag nach Beginn der Behandlung ist die Leukozytenzahl der Vergleichsgruppe auf 46,6% vermindert, während die der HGI-Glykoproteid-Gruppe 73,3% beträgt. Die Verminderung ist geringer als die bei der Cepharantin-Gruppe. Aus diesen Werten ist ersichtlich, daß das HGI-Glykoproteid sich wirksam eignet zur Therapie der menschlichen Leukozytopenie.

Weitere Versuche ergaben, daß das HGI-Glykoproteid der Erfindung auch gegenüber anderer Zytostatika wirksam ist, beispielsweise 5-Fluoruracil und Daunomycin, die eine Verminderung der Leukozytenzahl ähnlich dem Cytosin-D-arabinosid hervorrufen. Humanes Serumalbumin hat keine vorbeugende Wirkung bei der Verminderung der Leukozytenzahl unter den gleichen Versuchsbedingungen.

Versuch 4 Akute Toxizität des HGI-Glykoproteids

Die akute Toxizität des HGI-Glykoproteids, hergestellt gemäß Beispiel 1, Probe Nr. 4 und Nr. 6, wird an männlichen Mäusen des C₅₇ BL-Stammes nach der Methode von Litchfield und Wilcoxon (Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Bd. 90 (1949), S. 99) berechnet. Das Glykoproteid wird in einer Dosis von 4000 mg pro kg Körpergewicht intraperitoneal bzw. 2000 mg pro kg Körpergewicht intravenös gegeben. Infolgedessen war eine Abschätzung der LD₅₀ praktisch unmöglich. Die LD₅₀ liegt bei subcutaner Injektion oberhalb 4000 mg pro kg und oberhalb 2000 mg pro kg bei intravenöser Injektion.

400 Liter frischer Urin von gesunden Menschen wird mit 10prozentiger Natronlauge auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und in einer Durchlaufzentrifuge bei 15 000 g und 0°C zur Abtrennung unlöslicher Substanzen zentrifugiert. Der Überstand wird mit 10prozentiger Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule mit den Abmessungen 10 × 80 cm aufgesetzt. Die am Kieselgel adsorbierten Substanzen werden mit 40 Liter 5prozentiger Ammoniaklösung eluiert. Das erhaltene Eluat wird mit 1 n Schwefelsäure auf eine pH-Wert von 7,5 eingestellt und mit Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt. Sodann wird die Lösung 15 bis 18 Stunden bei 0°C stehengelassen. Die entstandene Fällung wird abfiltriert, in 2 Liter 5prozentiger wäßriger Ammoniaklösung gelöst, in Cellophanschläuche abgefüllt und gegen 0,05 M Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 dialysiert. Das Retentat wird mit der gleichen Pufferlösung auf 10 Liter aufgefüllt und auf eine mit CM Sephadex C-50 gefüllte Säule mit den Abmessungen 40 × 40 cm aufgesetzt. Diese Säule war mit 0,05 M Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 äqulibriert worden. An dem Ionenaustauscher werden Verunreinigungen adsorbiert. 10 Liter der Elutionslösung werden mittels einer DIAFLO-Hohlfaden- Ultrafiltrationsvorrichtung (Amicon DC-30; Molekulargewichtstrenngrenze etwa 10 000) konzentriert. Die konzentrierte Lösung wird gegen 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 bei 5°C während 15 bis 18 Stunden dialysiert. Das Retentat wird mit der gleichen Pufferlösung auf 1 Liter aufgefüllt. Die erhaltene Lösung wird als Probe Nr. 1 bezeichnet.

Die erhaltene Lösung wird durch eine DEAE-Cellulosesäule mit den Abmessungen 4,0 × 40 cm geleitet, die vorher mit 0,1 M tris- HCl-Puffer vom pH 7,0 äquilibriert worden war. Sodann wird die Säule mit einem ausreichenden Volumen 0,1 m tris-HCl-Pufferlösung vom pH 7,0 gewaschen. Hierauf wird stufenweise mit 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0, der 0,3 M an Natriumchlorid ist, eluiert. Die Fraktionen, die eine Proliferation und Differenzierung von Granulozyten bewirken, wie dies in Versuch 1 beschrieben ist, werden aufgefangen und gegen 0,1 M tris- HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert. Diese Lösung wird als Probe Nr. 2 bezeichnet.

Die dialysierte Lösung (das Retentat) wird erneut auf eine mit DEAE Cellulose gefüllte Säule mit den Abmessungen 4,0 × 40 cm aufgesetzt, die mit 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden war. Sodann wird die Säule mit einem linearen Konzentrationsgradient von 0 bis 0,3 M Kochsalzlösung eluiert. Die das Glykoproteid enthaltenden aktiven Fraktionen werden aufgefangen und mit Ammoniumsulfat bis 70prozentiger Sättigung versetzt. Die entstandenen Fällungen werden abzentrifugiert und in einem kleinen Volumen 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst und gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert. Diese dialysierte Lösung (Retentat) wird als Probe Nr. 3 bezeichnet.

20 ml der dialysieren Lösung werden auf eine mit Sephadex G-150 gefüllte Säule mit den Abmessungen 4,0 × 40 cm aufgesetzt, die mit 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden war. Die Elutionsfraktionen bei einem Ve/Vo-Verhältnis von 1,11 bis 1,45 werden aufgefangen. Die vereinigten Fraktionen werden gegen destilliertes Wasser bei 5°C gründlich dialysiert. Sodann wird die dialysierte Lösung (Retentat) gefriergetrocknet. Es werden etwa 500 mg eines Pulvers erhalten. Dieses halbgereinigte HGI-Glykoproteid wird als Probe Nr. 4 bezeichnet.

200 mg des halbgereinigten HGI-Glykoproteids werden in 0,02 M Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst, die 1,0 M an Natriumchlorid ist, und auf eine mit 100 ml Concanavalin A-Sepharose 4B gefüllte Säule aufgesetzt, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden war. Nach gründlichem Waschen der Säule mit dem gleichen Puffer wird das HGI-Glykoproteid mit 0,02 M Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 50 mM α-Methyl-D-glucosid und 1,0 M an Natriumchlorid ist. Diejenigen Fraktionen, die in vitro eine Proliferation und Differenzierung von Granulozyten hervorrufen, werden aufgefangen und gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung (Retentat) wird gefriergetrocknet. Dieses Präparat wird als Probe Nr. 5 bezeichnet.

Etwa 50 mg erhaltenen gefriergetrockneten Pulvers werden in 1 ml einer 0,125 M tris-Glykokoll-Pufferlösung vom pH-Wert 6,8 gelöst, die 10% Glycerin enthält. Die erhaltene Lösung wird bei 10 mA unter Kühlung mittels einer präparativen Elektrophoresevorrichtung (Typ Fuji Kabara II) unter Verwendung von 8% Acrylamidgel (pH 8,9; 20 mm × 25 mm) der Elektrophorese unterworfen. Die Fraktion mit einer relativen Beweglichkeit von 0,46 wird mit 0,025 M tris-Glykokoll-Puffer vom pH-Wert 8,3 isoliert und gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung (Retentat) wird gefriergetrocknet. Es werden etwa 10 mg des HGI-Glykoproteids erhalten, das als Probe Nr. 6 bezeichnet wird.

Die in den verschiedenen Herstellungstufen erhaltenen Proben Nr. 1 bis 6 werden auf Proliferation und Differenzierung der Knochenmarkzellen sowohl des Menschen als auch der Maus gemäß Versuch 1 untersucht. Das HGI-Glykoproteid oder das dieses Glykoproteid enthaltende Präparat wird dem Medium in solcher Menge zugesetzt, daß sich pro Petrischale 200 Kolonien bilden. Die spezifische Aktivität wird nach folgender Gleichung berechnet, wobei eine Einheit einer gebildeten Kolonie entspricht.

Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt.

Tabelle VII

Beispiel 2

100 mg des HGI-Glykoproteidpulver (Probe Nr. 6 von Beispiel 1) werden mit 100 ml einer wäßrigen Lösung versetzt, die 5% humanes Serumalbumin und 1% Glykokoll enthält. Die erhaltene Lösung wird durch Filtration mittels Membranfiltern einer Porengröße von 0,45 µ sterilisiert. Sodann wird die sterilisierte Lösung aseptisch in 1 ml Anteilen in Gefäße abgefüllt, die vorher durch zweistündiges Erhitzen auf 180°C sterilisiert worden sind. Nach dem Gefriertrocknen werden die Gefäße hermetisch verschlossen. Auf diese Weise werden 95 Ampullen eines Arzneistoffs zur Behandlung von Leukozytopenie erhalten. Jede Ampulle enthält 1 mg HGI-Glykoproteid.

Beispiel 3

Auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise wird 1 Liter einer konzentrierten, HGI-Glykoproteid enthaltenden Lösung hergestellt (analog Probe Nr. 1), und zwar aus 1000 Litern frischem Urin von gesunden Menschen. Diese konzentrierte Lösung wird mit 10 Litern einer 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 verdünnt. Nach gründlichem Rühren wird die verdünnte Lösung auf etwa 1/10 ihres ursprünglichen Volumens mittels einer DIAFLO Hohlfaden-Ultrafiltrationsvorrichtung eingeengt. Die erhaltene konzentrierte Lösung wird mit 5 Liter einer 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 und 5 Litern einer DEAE- Cellulosesuspension versetzt, die 300 g DEAE Cellulose (auf Trockenbasis berechnet) enthält, und die mit 0,1 M tris-HCl- Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden waren. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt, sodann 10 Minuten stehengelassen und schließlich auf einen Büchnertrichter unter verminderten Druck filtriert. Es wird die DEAE-Cellulose erhalten. Sodann wird die abfiltrierte DEAE-Cellulose mit 10 Liter einer 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gewaschen und erneut auf dem Büchnertrichter abfiltriert. Hierauf wird die DEAE-Cellulose mit 10 Liter einer 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gewaschen, die 0,05 M an Natriumchlorid ist, und in gleicher Weise auf dem Büchnertrichter abfiltriert. Die auf diese Weise behandelte DEAE-Cellulose wird mit 10 Litern einer 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 versetzt, die 0,3 M an Natriumchlorid ist, und gerührt, um das HGI-Glykoproteid von der DEAE-Cellulose abzutrennen. Das Gemisch wird auf einem Büchnertrichter abfiltriert und das Filtrat durch DIAFLO-Hohlfaden-Ultrafiltration entsalzt. Die erhaltene entsalzte Lösung wird gefriergetrocknet. Es werden etwa 15 g eines Pulvers erhalten. Das Pulver wird in 150 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine mit Sephadex G-150 gefüllte Säule der Abmessungen 6,0 × 80 cm aufgesetzt, die mit 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden war. Es werden die Fraktionen entsprechend dem Ve/Vo Verhältnis von 1,11 bis 1,60 aufgefangen. Die vereinigten Fraktionen werden gegen destilliertes Wasser gründlich dialysiert. Sodann wird die dialysierte Lösung (Retentat) mittels einer DIAFLO- Hohlfaden-Ultrafiltrationsvorrichtung (Typ DC-2) auf etwa 100 ml Konzentrat eingeengt, das etwa 3 g rohes HGI-Glykoproteid enthält. Die konzentrierte Lösung wird mit 1 g Glykokoll und 5 g Serumalbumin gewaschen. Die erhaltene Lösung wird gemäß Beispiel 1 durch Filtration sterilisiert und sodann aseptisch in 2,5 ml Anteilen in Ampullen abgefüllt. Nach aseptischer Gefriertrocknung werden die Ampullen hermetisch verschlossen. Es werden 40 Ampullen eines Arzneistoffs zur Bekämpfung von Leukozytopenie erhalten. Jede Ampulle enthält etwa 3,8 mg HGI-Glykoproteid.

Für die klinische Anwendung ist es wichtig, pathogene Viren, die im Urin enthalten sind und die Hepatitis und andere Krankheiten verursachen, aus dem HGI-Glykoproteid abzutrennen. Dies erfolgt durch Hitzeinaktivierung analog der Hitzeinaktivierung der Viren in Serumalbumin durch 10stündiges Erhitzen auf 60°C. Zur Durchführung einer 10stündigen Hitzeinaktivierung bei 60°C müssen die zu behandelten Substanzen unter diesen Bedingungen stabil sein. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Stabilisatoren entwickelt. Zur Stabilisierung humaner Serumproteine gegen Wärme werden verschiedene Aminosäuren oder Saccharide bei physiologisch isotonischer Konzentration oder darunter verwendet. Bei der thermischen Inaktivierung von Viren in HGI-Glykoproteid geht die biologische Aktivität des Glykoproteids durch 10stündiges Erhitzen auf 60°C verloren.

Erfindungsgemäß wurde festgestellt, daß unter folgenden Bedingungen die Hitzestabilität des HGI-Glykoproteids in wäßriger Lösung verbessert werden kann und seine charakteristischen Eigenschaften nicht verlorengehen. Das HFI-Glykoproteid ist stabil gegen Hitzebehandlung bei pH 5 bis 9, wenn Albumin in der Lösung in einer Konzentration von mindestens 2% vorliegt oder die Konzentration des HGI-Glykoproteids in der Lösung mindestens 70 mg pro ml beträgt, oder wenn menschliche Proteine aus dem Urin in einer Konzentration von mindestens 70 mg pro ml vorliegen.

Die Erfindung stellt somit ein HGI-Glykoproteid zur Verfügung, das zur Inaktivierung von Viren einer thermischen Inaktivierung unterworfen worden ist. Diese thermische Inaktivierung besteht im Erhitzen einer wäßrigen Lösung des HGI-Glykoproteids, das gegen Erhitzung auf 50 bis 70°C, vorzugsweise 55 bis 65°C während 8 bis 30 Stunden, vorzugsweise 8 bis 12 Stunden und bei einem pH-Wert von 5 bis 9 stabilisiert worden ist.

Bei Verwendung von Albumin als Stabilisator ist der Reinigungsgrad des in der wäßrigen Lösung enthaltenen HGI-Glykoproteids nicht kritisch, doch werden HGI-Glykoproteid-Fraktionen einer Reinheit entsprechend denen der Proben Nr. 4 bis Nr. 6 von Beispiel 1 bevorzugt.

Die Konzentration des HGI-Glykoproteids in der der Wärmebehandlung zu unterwerfenden wäßrigen Lösung beträgt mindestens 0,1% (Gewicht pro Volumen, d. h. Zahl der Gewichtseinheiten in 100 Volumeneinheiten; das gleiche trifft nachstehend für die wäßrige Lösung zu), vorzugsweise 0,5 bis 15%. Die wäßrige Lösung wird auf einen pH-Wert von 5 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8, mit einer Säure oder Base, vorzugsweise einer Pufferlösung, eingestellt. Das verwendete Albuminpräparat kann von menschlichem Serum oder menschlicher Placenta stammen. Beide Präparate wurden vorzugsweise für medizinische Zwecke gereinigt, und sie haben eine Reinheit von mindestens 80%, bestimmt durch Elektrophorese. Die zur wäßrigen HGI-Glykoproteid-Lösung zugesetzte Menge an Albumin beträgt mindestens 2,0, vorzugsweise 10 bis 20%. Die obere Grenze der zugesetzten Menge des Albumins ist nicht besonders kritisch, und die geeignete Menge hängt vom gestatteten Anteil des Albumins im Endprodukt ab.

Bei Verwendung von humanem Albumin zum Stabilisieren des HGI- Glykoproteids gegen Wärme ist die Gefahr der Verunreinigungen des Endprodukts mit antigenen Substanzen ausgeschlossen, und es wird eine wirksame Stabilisierung des Glykoproteids gegen Hitzeinaktivieren erreicht. Da Albumin außerdem die Stabilität der Glykoproteidpräparat sicherstellt, ist die Abtrennung des Albumins nach der Wärmebehandlung nicht erforderlich, sofern eine geeignete Menge bei der Wärmebehandlung verwendet wird. Deshalb stellt die Wärmebehandlung nach dem Verfahren der Erfindung eine bevorzugte Ausführungsform zur Herstellung eines nichtinfektiösen HGI-Glykoproteids dar.

Versuch 5

Die Wirkung der Wärmebehandlung in Gegenwart von Albumin auf die Infektiosität durch Viren wird unter Verwendung verschiedener Viren untersucht, die möglicherweise HGI-Glykoproteid- Präparate verunreinigen können.

Die HGI-Glykoproteid-Probe Nr. 4 von Beispiel 1 wird in Wasser in einer Menge von 100 mg pro ml gelöst. Diese Lösung wird mit 0,2 ml einer Virensuspension mit einer virusinfektiösen Dosis von 1 × 10⁵ bis 1 × 10⁶ pro 0,2 ml (gemessen nach der nachstehend beschriebenen Methode) Pockenvirus, Mumpsvirus, Masernvirus, Herpesvirus, Chikungunyavirus, Japanisches Encephalitisvirus, Rubellavirus, Poliovirus, Coxsackievirus oder ECHO-Virus sowie anschließend 0, 20, 100 oder 200 mg pro ml humanes Serumalbumin versetzt. Die erhaltene Lösung wird mit 0,1 M tris-HCl- Pufferlösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt und sodann 10 Stunden auf 60°C erhitzt, hierauf sofort in eiskaltem Wasser abgekühlt, entsalzt und durch Membranfiltration sterilisiert und schließlich gefriergetrocknet. Die biologische Aktivität und die Virusinfektion werden nach den nachstehend beschriebenen Methoden bestimmt und mit den Werten verglichen, die vor der Wärmebehandlung erhalten wurden.

Die biologische Aktivität wird anhand der Koloniebildung von Mäuseknochenmarkzellen in vitro bestimmt. Petri-Kunststoffschalen mit einem Durchmesser von 35 mm werden mit 1,0 ml supplementiertem McCoy 5A Medium versetzt, das 20% foetales Kälberserum, 10% (ß,1 ml) Probe, 0,3% Agar, 7,5 × 10⁴ Mäuseknochenmarkzellen und 10% (0,1 ml) der Probe enthält. Die Konzentration jeder Probe wird auf den gleichen Wert eingestellt. Nach 7tägiger Inkubation in feuchter 5prozentiger Kohlendioxidatmosphäre werden Einzelkolonien mit mehr als 50 Zellen mit dem umgekehrten Mikroskop gezählt. Das prozentuale Verhältnis der Zahl der nach der Wärmebehandlung gebildeten Kolonien zu der Zahl der Kolonien vor der Wärmebehandlung wird als Wiedergewinnung der biologischen Aktivität bezeichnet.

Die virusinfektiöse Dosis wird folgendermaßen bestimmt: Pockenvirus wird auf HeLa-Zellen überimpft und die Plaquesbildenden Einheiten (Virology, Bd. 36 (1968), S. 174 bis 179) werden mit den gleichen Zellen bestimmt. Nachfolgende Transplantate von Mumpsvirus, Masernvirus und Japanischen Encephalitisvirus werden mit Vera-Zellen durchgeführt. Diejenigen mit Poliovirus, Coxsackievirus und ECHO-Virus werden mit HeLa-Zellen durchgeführt. Die Infektiosität jedes Virus wird durch Bestimmung der 50prozentigen infektiösen Dosis für die Gewebekultur bestimmt (National Institute of Health, Japan, "Experimental Virology", Maruzen Co., Tokyo, 1967). Als Indikator wird der zytopathische Effekt benutzt. Die Beobachtungszeit beträgt 10 Tage.

Herpesvirus und Chikungunyavirus werden nacheinander in FL-Zellen und Vero-Zellen überimpft. Sodann werden die Plaques-bildenden Einheiten bestimmt.

Rubellavirus wird nacheinander in BHK-21-Zellen überimpft. Die Plaques-bildenden Einheiten werden an Vero-Zellen bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefaßt.

Tabelle VIII

Aus Tabelle VIII ist ersichtlich, daß nach 10stündigem Erhitzen auf 60°C die virale Infektiosität bei jeder Probe vollständig verlorengegangen war, unabhängig davon, ob Albumin zugesetzt worden war oder nicht. Dies zeigt, daß andere Viren ebenfalls durch Wärmebehandlung nach dem Verfahren der Erfindung inaktiviert werden können. Es wurde festgestellt, daß die biologische Aktivität des HGI-Glykoproteids in den Proben aufrechterhalten bleibt, die Albumin enthalten. Dies zeigt, daß das Albumin ein wirksamer Stabilisator ist.

Die Ergebnisse der Wärmebehandlung unter unterschiedlichen Bedingungen sind ähnlich den vorstehend erwähnten.

Im nächsten Versuch wird der pH-Wert der wäßrigen Albuminlösung, die HGI-Glykoproteid enthält, variiert, um die Änderung der biologischen Aktivität nach der Wärmebehandlung zu bestimmen.

Versuch 6

Das in Versuch 5 verwendete HGI-Glykoproteid wird in Wasser zu einer Lösung mit einer Konzentration von 20 mg pro ml gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 100 mg pro ml humanen Serumalbumin versetzt. Es werden Lösungen mit einem pH-Wert von 2 bis 10 mit Abständen von 1 Einheit folgendermaßen hergestellt: pH-Wert 2 bis 6, 0,1 M Citronensäure-Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7 bis 10, 0,1 M tris-HCl-Puffer. Jede Probe wird 10 Stunden auf 60°C erhitzt. Sodann wird die restliche biologische Aktivität gemäß Versuch 5 bestimmt. Das prozentuale Verhältnis der Zahl der Kolonien, die nach der Wärmebehandlung entstanden sind, zu der zu der Zahl der Kolonien vor der Wärmebehandlung, wird als Wiedergewinnung der biologischen Aktivität bezeichnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengefaßt. Die biologische Aktivität des HGI-Glykoproteids bleibt im pH-Bereich von 5 bis 9 gut erhalten. Dies zeigt, daß ein Einstellen des pH-Wertes der HGI-Glykoproteidlösung auf diesen Bereich vor der Wärmebehandlung erforderlich ist.

Tabelle IX

Bei einem später beschriebenen Versuch wird eine wäßrige Lösung, die mindestens 70 mg pro ml HGI-Glykoproteid enthält, mit einer Säure oder Base auf einen pH-Wert von 2 bis 10 eingestellt, und es wird die Wiedergewinnung der biologischen Aktivität nach der Wärmebehandlung bestimmt. Es wurde festgestellt, daß die Wiedergewinnung der biologischen Aktivität etwa 40 bis 50% bei einem pH-Wert im Bereich von 5 bis 9 beträgt, während die biologische Aktivität einer wäßrigen Lösung des HGI-Glykoproteids bei einem pH-Wert unterhalb 5 oder oberhalb 9 nach der Wärmebehandlung vollständig verschwunden ist.

Versuch 7

Es wird die Abhängigkeit der Wirkung der Wärmebehandlung auf die Konzentration des HGI-Glykoproteids in der wäßrigen Lösung untersucht.

Das gereinigte HGI-Glykoproteid von Probe Nr. 6 von Beispiel 1 wird in Wasser gelöst und mit 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Sodann wird die Lösung auf Endkonzentrationen von 10, 50, 60, 70, 80, 100, 150 bzw. 200 mg pro ml eingestellt. Jede Lösung wird 10 Stunden auf 60°C erhitzt, sodann rasch in Eiswasser abgekühlt, durch Filtration sterilisiert und gefriergetrocknet. Die biologische Aktivität jeder Probe wird gemäß Versuch 5 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle X zusammengefaßt.

Tabelle X

Aus Tabelle X ist ersichtlich, daß bei einer Konzentration des HGI-Glykoproteids von 50 mg pro ml die Wiedergwinnung der biologischen Aktivität nach der Wärmebehandlung 25,4% beträgt. Zur Wiedergewinnung einer biologischen Aktivität von mindestens 35% nach der Wärmebehandlung muß die Konzentration des HGI-Glykoproteids mindestens 70 mg pro ml, vorzugsweise 100 bis 200 mg pro ml betragen.

Versuch 8

Das in Versuch 5 verwendete HGI-Glykoproteid wird in Wasser gelöst und verschiedene pH-Werte im Bereich von 2 bis 10 eingestellt. Für den pH-Bereich von 2 bis 6 wird 0,01 M Citronensäure- Natriumphosphat-Pufferlösung und für den pH-Bereich von 7 bis 10 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung verwendet. Jede Lösung wird mit destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration von 100 mg pro ml eingestellt und 10 Stunden auf 60°C erhitzt, sodann rasch in Eiswasser abgekühlt und gemäß Versuch 5 auf die biologische Aktivität untersucht. Ein Teil der Lösung (pH 4,5) vor der Einstellung des pH-Werts wird als Vergleichsprobe verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle XI zusammengefaßt.

Tabelle XI

Aus Tabelle XI ist ersichtlich, daß bei einem pH-Wert der HGI- Glykoproteidlösung im Bereich von 5 bis 9 die Wiedergewinnung der biologischen Aktivität 36,0 bis 46,3% beträgt. Bei einem pH-Wert unterhalb 5 oder oberhalb 9 geht die biologische Aktivität vollständig verloren. Aus den Ergebnissen der Versuche 7 und 8 ergibt sich, daß bei der Wärmebehandlung der HGI-Glykoproteidlösung die Konzentration des Glykoproteids mindestens 70 mg pro ml betragen und der pH-Wert im Bereich von 5 bis 9 liegen soll.

Versuch 9

Versuch 5 wird wiederholt, jedoch wird das HGI-Glykoproteid in Wasser in einer Konzentration von 200 mg pro ml gelöst. Es wird kein Serumalbumin zugesetzt, und die Lösung wird auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Nach der Wärmebehandlung wird wie in Versuch 5 nur die virusinfektiöse Dosis bestimmt. In diesem Beispiel ist die Virusaktivität vollständig verloren gegangen. Das Ergebnis zeigt, daß andere als die verwendeten Viren ebenfalls durch die Wärmebehandlung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren inaktiviert werden können.

Das vorstehend beschriebene Verfahren der Virusinaktivierung durch Erhitzen in Gegenwart eine Stabilisators wird auf HGI- Glykoproteid-Präparate mit bestimmtem Reinheitsgrad angewendet. Deshalb wurde nach einem praktischen Verfahren gesucht, das unmittelbar zur Herstellung eines gereinigten HGI-Glykoproteids verwendet werden kann. Im Laufe dieser Untersuchungen wurde festgestellt, daß die HGI-Glykoproteidlösung, die mindestens 70 mg pro ml eines Proteins aus dem als Ausgangsmaterial eingesetzten Urin enthält, eine wärmebeständige Lösung für diesen Zweck darstellt. Dieses neue Verfahren zum Stabilisieren der HGI-Glykoproteidlösung gegen Erwärmung wird nachstehend näher beschrieben.

1 Liter frischer Urin von gesunden Menschen enthält normalerweise 30 bis 50 mg Proteine. Diese Proteine des Urins werden durch Ultrafiltration, Ionenaustauschchromatographie, Adsorption an Kieselgel, Aussalzen oder eine Kombination dieser Methoden, konzentriert. Die Proteine aus Urin einschließlich des HGI- Glykoproteids, werden unter vermindertem Druck weiter eingedampft, um den Proteingehalt auf einen Wert von mindestens 70, vorzugsweise 100 bis 150 mg pro ml zu bringen. Wenn der Proteingehalt der HGI-Glykoproteid enthaltenden Fraktion unter 70 mg pro ml liegt, fällt die biologische Aktivität des HGI-Glykoproteids beim Erhitzen sehr stark ab. Obwohl jede rohe Fraktion mit 70 mg pro ml oder mehr Proteinen aus Harn dem Zweck dient, wird eine Rohfraktion, die im vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung des HGI-Glykoproteids der Erfindung erhalten wird, vorzugsweise für das neue Stabilisierverfahren verwendet. Die Rohfraktion wird auf einen Urin-Proteingehalt von mindestens 70 mg pro ml und einen pH-Wert von 5 bis 9, vorzugsweise 6 bis 8, eingestellt.

Die erhaltene hitzestabilisierte HGI-Glykoproteidlösung wird gegebenenfalls nach Reinigung nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren zur Wärmebehandlung unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen unterworfen, und es wird eine Fraktion erhalten, die unmittelbar als Arzneistoff eingesetzt werden kann.

Versuch 10

Beispiel 1 wird wiederholt. Es wird eine HGI-Glykoproteid enthaltene Fraktion analog Probe Nr. 1 erhalten, mit Ausnahme folgender Modifikation:

Das durch Aussalzen mit Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung erhaltene Präzipitat wird in 8 Anteile unterteilt. Jeder Teil wird in Wasser gelöst und mit 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die erhaltenen 8 Lösungen werden auf einen Proteingehalt von 10, 50, 60, 70, 80, 100, 150 bzw. 200 mg pro ml eingestellt. Jede Lösung wird weiter in zwei Gruppen unterteilt. Die eine Gruppe wird 10 Stunden auf 60°C erhitzt, die andere bleibt unbehandelt.

Sämtliche Lösungsproben werden gemäß Beispiel 1 weitergereinigt bis auf den Reinigungsgrad der Probe Nr. 4 von Beispiel 1. Es werden auf diese Weise zwei Reihen von Proben mit unterschiedlichem Proteingehalt erhalten. Die eine Reihe (Testproben) ist hitzebehandelt, die andere Reihe (Vergleichsproben) unbehandelt. Jede Probe wird auf ihre biologische Aktivität gemäß Versuch 5 untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle XII zusammengefaßt.

Tabelle XII

Beispiel 4

Das Verfahren gemäß Beispiel 1 wird mehrmals wiederholt zur Herstellung von 100 mg HGI-Glykoproteid entsprechend dem Reinheitsgrad der Probe Nr. 6. 100 mg des erhaltenen gereinigten Glykoproteids werden mit 100 ml 10prozentigem humanem Serumprotein als Stabilisator versetzt. Die erhaltene Lösung wird mit 10prozentiger Natronlauge auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt, 10 Stunden auf 60°C erhitzt und unmittelbar darauf rasch in Eiswasser abgekühlt und durch Filtration durch ein Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 µ sterilisiert. Jeweils 1 ml der erhaltenen sterilisierten Lösung werden aseptisch in Glasampullen abgefüllt, die vorher 2 Stunden bei 180°C sterilisiert worden sind. Nach dem Gefriertrocknen unter aseptischen Bedingungen werden die Ampullen abgeschmolzen. Es werden 97 Ampullen mit jeweils 1 mg eines Präparats mit hitzebehandeltem HGI-Glykoproteid erhalten.

Die erhaltenen Präparate werden auf ihre biologische Aktivität und virale Infektiosität gemäß Versuch 5 untersucht. Die biologische Aktivität ist vergleichbar mit der einer unbehandelten Probe, und es kann keine virale Infektiosität festgestellt werden.

Beispiel 5

1000 Liter frischer Urin von gesunden Menschen wird gemäß Beispiel behandelt. Die Elutionsflüssigkeit aus der CM Sephadex C-50 Säule wird auf 1 Liter rohe HGI-Glykoproteidlösung konzentriert. Das Rohkonzentrat wird mit 10 Liter einer 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 versetzt, gründlich gerührt und erneut auf etwa 1 Liter mittels einer DIAFLO-Hohlfaden- Ultrafiltrationsvorrichtung eingeengt. Das Konzentrat wird mit 5 Liter 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 sowie 5 Liter einer DEAE-Cellulosesuspension (300 g DEAE-Cellulose auf Trockenbasis) versetzt, das vorher mit 0,1 M tris- HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt und nach dem Stehen unter vermindertem Druck filtriert. Die abfiltrierte DEAE-Cellulose wird mit 10 Litern einer 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gewaschen. Sodann wird die DEAE-Cellulose unter vermindertem Druck abfiltriert und nochmals mit 10 Litern einer 0,1 M tris- HCl-Pufferlösung gewaschen, die 0,05 M an Natriumchlorid ist. Hierauf wird die DEAE-Cellulose unter vermindertem Druck abfiltriert. Die abfiltrierte DEAE-Cellulose wird mit 10 Liter einer 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 versetzt, die 0,3 M an Natriumchlorid ist, und zur Eluierung der HGI-Glykoproteid- Fraktion gerührt. Das Eluat wird mittels einer DIAFLO- Hohlfaden-Ultrafiltrationsvorrichtung (Typ DC-30) entsalzt. Die entsalzte Fraktion wird gefriergetrocknet. Es werden etwa 15 g eines Pulvers erhalten. Dieses Pulver wird in 150 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine mit Sephadex G-150 gefüllte Säule mit den Abmessungen 6,0 × 80 cm aufgesetzt, die mit 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Die Fraktionen entsprechen einem Ve/Vo Verhältnis von 1,11 bis 1,60 und werden aufgefangen. Die Fraktionen werden vereinigt und gründlich gegen destilliertes Wasser dialysiert. Sodann wird die dialysierte Lösung (Retentat) mittels einer DIAFLO-Hohlfaden-Ultrafiltrationsvorrichtung (Typ DC-2) konzentriert. Es werden 100 ml Konzentrats erhalten, das etwa 3 g rohes HGI-Glykoproteid enthält.

10 g pulverisiertes humanes Placenta-Albumin (hergestellt nach dem Beispiel der JA-AS 40 132/76) einer Reinheit von 98% (bestimmt durch Elektrophorese), werden in dem erhaltenen Konzentrat gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 10prozentiger Natronlauge auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt, gemäß Beispiel 4 durch Filtration sterilisiert, aseptisch in 2,5 ml Portionen in Ampullen abgefüllt und aseptisch gefriergetrocknet. Sodann werden die Ampullen abgeschmolzen. Es werden 40 Ampullen mit jeweils 3,8 mg wärmebehandeltem HGI-Glykoproteid erhalten. Die erhaltenen Präparate werde auf biologische Aktivität und virale Infektiosität gemäß Versuch 5 untersucht. Die biologische Aktivität ist vergleichbar mit den nichtwärmebehandelten Präparaten, und es kann keine virale Infektiosität festgestellt werden.

Beispiel 6

400 Liter frischer Urin von gesunden Menschen werden in 10prozentiger Natronlauge auf einen pH-Wert von 8 eingestellt und sodann unter Kühlung bei 10°C in einer Durchlaufzentrifuge bei 15 000 × g zur Abtrennung unlöslicher Substanzen zentrifugiert. Der erhaltene Überstand wird mit 10prozentiger Salzsäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und auf eine mit Kieselgel gefüllte Säule mit den Abmessungen 10 × 80 cm aufgesetzt. Die am Kieselgel adsorbierten Substanzen werden mit 40 Litern 5prozentiger Ammoniaklösung eluiert. Das erhaltene Eluat wird mit 1 n Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 7,5 eingestellt und mit Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt. Nach 15- bis 18stündigem Stehen bei 0°C wird die entstandene Fällung abfiltriert. Die erhaltene Fällung wird in 2 Liter 5prozentiger Ammoniaklösung gelöst, in Cellophanschläuche abgefüllt und gegen 0,05 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,5 gründlich dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung (das Retentat) wird mit dem gleichen Puffer auf 10 Liter aufgefüllt und auf eine mit Sephadex C-50 gefüllte Säule mit den Abmessungen 40 × 40 cm aufgesetzt, die mit 0,05 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,5 äquilibriert worden ist. Verunreinigungen werden durch Adsorption abgetrennt. 10 Liter des erhaltenen Eluats werden mittels einer DIAFLO-Hohlfaden-Ultrafiltrationsvorrichtung (Amicon, Typ DC-30) konzentriert. Das erhaltene Konzentrat wird gegen 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 bei 5°C während 15 bis 18 Stunden auf die vorstehend beschriebene Weise dialysiert.

Die erhaltene dialysierte Lösung (das Retentat) wird mit der gleichen Pufferlösung auf 1 Liter aufgefüllt und auf eine DEAE-Cellulosesäule mit den Abmessungen 4,0 × 40 cm aufgesetzt, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gründlich gewaschen und sodann mit einer 0,1 M tris-HCl- Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,3 M an Natriumchlorid ist. Diejenigen Fraktionen, die die Proliferation und Differenzierung von Mäuseknochenmarkzellen in vitro stimulieren (bestimmt gemäß Versuch 5) werden aufgefangen. Die Fraktionen werden vereinigt und gegen 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 dialysiert. Die dialysierte Lösung (das Retentat) wird erneut auf eine DEAE-Cellulosesäule mit den Abmessungen 4,0 × 40 cm aufgesetzt, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit einem linearen Konzentrationsgradienten einer Kochsalzlösung (0 bis 0,3 M) eluiert. Die Fraktionen mit stimulierender Wirkung auf die Proliferation und Differenzierung von Granulozyten werden aufgefangen und mit Ammoniumsulfat bis zu 70prozentiger Sättigung versetzt. Die entstandene Fällung wird abfiltriert, in wenig 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst und gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert.

20 ml der erhaltenen dialysierten Lösung (Retentat) werden auf eine Sephadex G-150 Säule mit den Abmessungen 4,0 × 60 cm aufgesetzt, die mit einer 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Die Eluatfraktionen bei einem Ve/Vo Verhältnis von 1,11 bis 1,45 werden aufgefangen. Die Fraktionen werden vereinigt und gegen destilliertes Wasser gründlich dialysiert. Sodann wird die dialysierte Lösung (das Retentat) gefriergetrocknet. Es werden etwa 500 mg eines Pulvers erhalten.

200 mg des erhaltenen Pulvers werden in 0,02 M Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0 gelöst, der 1,0 M an Natriumchlorid ist, und auf eine Säule aufgesetzt, die 100 ml Concanavalin A- Sepharose 4B enthält, die mit der gleichen Pufferlösung äquilibriert worden ist. Die Säule wird mit 0,02 M Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0, die 1,0 M an Natriumchlorid ist, gründlich gewaschen und danach mit einer 0,02 M Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 7,0, die 50 mM an α-Methyl-D-glucosid und 1,0 nM an Natriumchlorid ist, eluiert. Die Fraktionen mit stimulierender Wirkung auf die Proliferation und Differenzierung der Granulozyten (bestimmt gemäß Versuch 5) werden aufgefangen und gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet.

Etwa 50 mg des erhaltenen gefriergetrockneten Pulvers werden in 1 ml einer 0,125 M tris-Glykokoll-Pufferlösung vom pH-Wert 6,8 gelöst, die 10% Glycerin enthält. Die erhaltene Lösung wird bei 10 mA unter Kühlung mittels einer präparativen Elektrophoresevorrichtung (Typ Fuji Kabara II) unter Verwendung von 8% Acrylamidgel (pH 8,9; 20 mm × 25 mm) der Elektrophorese unterworfen. Die Fraktion mit einer relativen Beweglichkeit von 0,46 wird mit 0,025 M tris-Glykokoll-Pufferlösung vom pH-Wert 8,3 eluiert und sodann gegen destilliertes Wasser dialysiert. Die dialysierte Lösung wird gefriergetrocknet. Es werden etwa 10 mg HGI-Glykoproteid erhalten.

Das vorstehend beschriebene Verfahren wird mehrmal wiederholt, und es werden etwa 1 g HGI-Glykoproteid erhalten. 1 g des erhaltenen HGI-Glykoproteids werden in 10 ml Wasser vollständig gelöst und mit 10prozentiger Natronlauge auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt. Sodann wird die erhaltene Lösung 10 Stunden auf 60°C erhitzt, hierauf rasch in Eiswasser abgekühlt und mit sterilem Wasser auf das 10fache Volumen verdünnt. Sodann wird die Lösung durch Filtration durch Membranfilter mit einer Porengröße von 0,45 µ sterilisiert. Jeweils 1 ml der erhaltenen sterilisierten Lösung werden aseptisch in Glasampullen abgefüllt, die 2 Stunden auf 180°C erhitzt worden sind. Nach aseptischer Gefriertrocknung werden die Glasampullen abgeschmolzen. Es werden etwa 97 Ampullen mit jeweils 10 mg hitzebehandeltem HGI-Glykoproteid erhalten.

Die erhaltenen Präparate werden auf biologische Aktivität und virale Infektiosität gemäß Versuch 5 und 7 untersucht. Die biologische Aktivität beträgt etwa 40% der einens Präparats vor der Wärmebehandlung, und es kann keine virale Aktivität festgestellt werden.

Beispiel 7

1000 Liter frischer Urin von gesunden Menschen wird gemäß Beispiel 6 behandelt. Aus dem Eluat der CM Sephadex C-50 Säule werden 2,5 Liter einer wäßrigen Lösung erhalten, die rohes HGI- Glykoproteid enthält. Die Lösung wird mit 25 Liter einer 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 versetzt. Nach gründlichem Rühren wird die Lösung mittels einer DIAFLO-Hohlfaden- Ultrafiltrationsvorrichtung etwa 1/25 ihres Anfangsvolumens eingeengt. Das Konzentrat wird mit 5 Liter einer 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung und 5 Liter einer DEAE-Cellulosesuspension (300 g DEAE-Cellulose auf Trockenbasis) versetzt, die mit 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Das Gemisch wird 30 Minuten gerührt, sodann stehengelassen und hierauf unter vermindertem Druck abfiltriert. Die abfiltrierte DEAE-Cellulose wird mit 10 Liter einer 0,1 M tris- HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gewaschen und unter vermindertem Druck abfiltriert. Sodann wird die DEAE-Cellulose mit 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gewaschen, die 0,05 M an Natriumchlorid ist, und hierauf erneut unter vermindertem Druck abfiltriert. Die auf diese Weise behandelte DEAE-Cellulose wird in 10 Liter einer 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 verrührt, die 0,3 M an Natriumchlorid ist, um die HGI-Glykoproteid-Fraktion zu eluieren. Das Eluat wird mittels einer DIAFLO-Hohlfaden-Ultrafiltrationsvorrichtung (Typ DC-30) entsalzt. Nach der Gefriertrocknung werden etwa 15 g eines Pulvers erhalten.

Das gefriergetrocknete Pulver wird in 150 ml destilliertem Wasser gelöst und auf eine Sephadex G-150 Säule mit den Abmessungen 6,0 × 80 cm aufgesetzt, die mit 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 äquilibriert worden ist. Die HGI- Glykoproteid-Fraktionen mit einem Ve/Vo Verhältnis von 1,11 bis 1,60 werden aufgefangen und gegen destilliertes Wasser gründlich dialysiert.

Die erhaltene dialysierte Lösung (das Retentat) wird mit einer DIAFLO-Hohlfaden-Ultrafiltrationsvorrichtung (Typ DC-2) konzentriert. Es werden 30 ml eines Konzentrats erhalten, das etwa 3 g rohes HGI-Glykoproteid enthält. Das Konzentrat wird mit Natronlauge auf einen pH-Wert von 6,8 eingestellt und gemäß Beispiel 6 wärmebehandelt. Das erhaltene wärmebehandelte Konzentrat wird durch Filtration sterilisiert und in 1,0 ml Anteilen in Ampullen aseptisch abgefüllt. Nach aseptischer Gefriertrocknung werden die Ampullen hermetisch verschlossen. Es werden 30 Ampullen mit jeweils 5,2 mg wärmebehandeltem HGI- Glykoproteid erhalten.

Die erhaltenen Präparate werden auf biologische Aktivität und virale Infektiosität gemäß Versuch 5 und 7 untersucht. Die biologische Aktivität beträgt etwa 40% der vor der Wärmebehandlung, und es kann keine virale Aktivität festgestellt werden.

Beispiel 8

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt. Es werden etwa 500 mg (etwa 26 mg Wirkstoff) HGI-Glykoproteid-Pulver entsprechend Probe Nr. 4 erhalten, jedoch wird folgende Stufe vor der Stufe der Dialyse der 5prozentigen wäßrigen Ammoniaklösung der Ammoniumsulfatfällung eingeschaltet: Etwa 20 g der erhaltenen Ammoniumsulfatfällung werden in 200 ml Wasser gelöst (Proteinkonzentration 100 mg pro ml). Die erhaltene Lösung wird 10 Stunden auf 60°C erhitzt und sodann in Eiswasser rasch abgekühlt. Es wird eine Fraktion erhalten, die das wärmebehandelte HGI-Glykoproteid enthält. Die Fraktion wird gemäß Beispiel 1 dialysiert. Die biologische Aktivität des erhaltenen HGI-Glykoproteid-Pulver ist vergleichbar mit der der Fraktion vor der Wärmebehandlung, und es kann keine virale Aktivität festgestellt werden.

Beispiel 9

Etwa 450 mg eines Pulvers entsprechend der Probe Nr. 4 von Beispiel 1, die 23,5 mg HGI-Glykoproteid enthalten, werden gemäß Beispiel 1 hergestellt, jedoch mit folgender Abänderung:
10 Liter des Eluats aus der CM Sephadex C-50 Säule werden mittels einer DIAFLO-Hohlfaden-Ultrafiltrationsvorrichtung konzentriert bis zu einer Proteinkonzentration von 70 mg pro ml. Die konzentrierte wäßrige Lösung wird 10 Stunden auf 60°C erhitzt und sodann rasch in Eiswasser abgekühlt. Unlösliche Substanzen werden abfiltriert, und die wäßrige Lösung wird in Cellophanschläuche abgefüllt und gegen 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 bei 5°C dialysiert. Die dialysierte Lösung (das Retentat) wird mit der gleichen Pufferlösung auf 1 Liter aufgefüllt. Es wird eine Lösung entsprechend der Probe Nr. 1 von Beispiel 1 erhalten.

Die biologische Aktivität des erhaltenen HGI-Glykoproteid- Pulvers ist vergleichbar mit der des Pulvers, das ohne Wärmebehandlung erhalten wurde. Es kann keine virale Aktivität festgestellt werden.

Beispiel 10

Etwa 500 mg eines Pulvers entsprechend Probe Nr. 4 von Beispiel 1, die etwa 26 mg HGI-Glykoproteid enthalten, werden gemäß Beispiel 1 hergestellt, jedoch mit folgender Abänderung:
Das Eluat aus der DEAE-Cellulosesäule wird mit Ammoniumsulfat ausgefällt. Die erhaltene Fällung wird in einer 0,1 M tris- HCl-Pufferlösung bis zu einem Proteingehalt von 150 mg pro ml gelöst. Die erhaltene Lösung wird 10 Stunden auf 60°C erhitzt und sodann rasch in Eiswasser abgekühlt. Die entstandene Fällung wird abfiltriert und das Filtrat gegen 0,1 M tris-HCl- Pufferlösung dialysiert. Die erhaltene dialysierte Lösung wird anstelle von Probe Nr. 3 in Beispiel 1 verwendet.

Die biologische Aktivität des schließlich erhaltenen HGI-Glykoproteid- Pulvers ist vergleichbar mit der des Präparats, das ohne Wärmebehandlung erhalten worden ist. Es kann keine virale Aktivität festgestellt werden.

Beispiel 11

50 Liter frischer Urin von gesunden Menschen wird mit 10prozentiger Natronlauge neutralisiert und mittels einer kühlbaren Durchlaufzentrifuge bei 10 000 × g zentrifugiert. Der Überstand wird mittels einer DIAFLO-Hohlfaden-Ultrafiltrationsvorrichtung (Aminon Co., Typ DC-30, ausgerüstet mit einer Membran die ein Molekulargewicht von 10 000 abschneidet) auf 1/10 ihres Volumens konzentriert. Nach Zusatz von 50 Liter Wasser wird die Lösung erneut konzentriert. Es werden 3 Liter Konzentrat erhalten. Der konzentriert Urin wird mittels eines Drehverdampfers auf etwa 50 ml Konzentrat mit einem Proteingehalt von 70 mg pro ml eingedampft. Das Konzentrat wird 10 Stunden auf 60°C ± 0,5°C erhitzt und sodann rasch abgekühlt. Es wird eine wärmebehandelte HGI-Glykoproteid-enthaltende Fraktion erhalten. Nach Abtrennung unlöslicher Substanzen wird das Konzentrat mit 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 auf 5 Liter aufgefüllt und auf eine DEAE-Cellulosesäule mit den Abmessungen 4,0 × 40 cm aufgesetzt, die vorher mit 0,1 M tris- HCl-Pufferlösung äquilibriert worden ist. Das HGI-Glykoproteid wird an der DEAE-Cellulose adsorbiert. Die Säule wird mit 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 gründlich gewaschen und mit 0,1 M tris-HCl-Pufferlösung vom pH-Wert 7,0 eluiert, die 0,3 M an Natriumchlorid ist. Danach wird das Verfahren gemäß Beispiel 1 wiederholt, jedoch wird das erhaltene Eluat anstelle der 5prozentigen wäßrigen Ammoniaklösung des Präzipitats der 70prozentigen Ammoniumsulfatfällung verwendet. Es werden etwa 200 mg HGI-Glykoproteid-Pulver entsprechend Probe Nr. 4 nach Wiederholung des Verfahrens von Beispiel 1 erhalten.

Die biologische Aktivität des erhaltenen HGI-Glykoproteid- Pulvers ist vergleichbar mit der des Präparats, das ohne der Wärmebehandlung erhalten worden ist. Es kann keine virale Aktivität festgestellt werden.

Beispiel 12

Das Verfahren von Beispiel 1 wird wiederholt, es wird eine Fraktion entsprechend Probe Nr. 3 von Beispiel 1 isoliert. Diese Fraktion wird auf einen Proteingehalt von 70 mg pro ml konzentriert und 10 Stunden auf 60°C erhitzt. Danach wird die Fraktion rasch in Eiswasser abgekühlt, von der entstandenen Fällung befreit und in gleicher Weise wie in Beispiel 1 weiterbehandelt. Es werden etwa 10mg eines HGI-Glykoproteid-Pulvers entsprechend Probe Nr. 6 von Beispiel 1 erhalten.

Die biologische Aktivität des erhaltenen HGI-Glykoproteid- Pulvers ist vergleichbar mit der des Präparats ohne Wärmebehandlung.

Claims (12)

1. Glykoproteid aus menschlichem Urin, welches die Proliferation und Differenzierung von Granulozyten stimuliert, gekennzeichnet durch folgende physikalische und chemische Parameter:

• (a) Löslichkeit:
  Löslich in Wasser, etwas löslich in Chloroform und unlöslich in Äthanol und Aceton;
• (b) spezifischer Drehwert:
  [α] = 0± 40°(c = 0,25% in Wasser);
• (c) pH-Wert:
  5,0 bis 6,0 (1gewichtsprozentige wäßrige Lösung);
• (d) Isoelektrischer Punkt:
  pH 4,7 ± 0,2;
• (e) Thermostabilität:
  Vollständiger Verlust der stimulierenden Wirkung auf die Proliferation und Differenzierung menschlicher Granulozyten nach 30minütigem Erhitzen einer 1prozentigen wäßrigen Lösung auf 60 + 0,5°C;
• (f) Elektrophorese:
  Relative Beweglichkeit 0,25 bei der Elektrophorese an Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgel;
• (g) IR-Absorptionsspektrum:
  Charakteristische Absorption bei 3600 bis 3200 (starke Absorption), 1700 bis 1600 (starke Absorption), 1550 (mittlere Absorption), 1430 bis 1380 (mittlere Absorption) und 1150 bis 1000 (breite Bande) cm^-1;
• (h) Farbreaktion:
  Charakteristische Farbreaktion für Saccharide mit a-Naphthol-Schwefelsäure, Indol-Schwefelsäure, Anthron- Schwefelsäure und Phenol-Schwefelsäure; charakteristische Farbreaktion für Polypeptidbindungen und Aminosäuren bei der Lowry-Folin-Reaktion und der Ninhydrin-Reaktion nach Hydrolyse mit Salzsäure;
• (i) Aminosäure-Grundbausteine des Proteinrests:
  Prolin, Asparaginsäure, Threonin, Serin, Glutaminsäure, Glykokoll, Alanin, Valin, Methionin, Isoleucin, Leucin, Tyrosin, Phenylalanin, Lysin, Histidin, Tryptophan und Arginin;
• (j) Farbe und Kristallform:
  Weiß und amorph;
• (k) Zuckerzusammensetzung des Polysaccharidrests:
  10,0 bis 13,0 Gewichtsprozent neutrale Zucker (ausgedrückt in Glucose), 3,0 bis 7,0 Gewichtsprozent Sialinsäuren und 1 Gewichtsprozent anderer Aminozucker;
• (l) Gewichtsverhältnis von Protein zu Polysaccarid:
  75 bis 85 : 13,0 bis 20,0;
• (m) Elemtaranalyse:
  42,3 bis 47,3% Kohlenstoff, 5,7 bis 7,8% Wasserstoff, 9,6 bis 14,3% Stickstoff, 34,4 bis 39,4% Sauerstoff und höchstens 0,2% Schwefel.
• (n) Molekulargewicht:
  75 000 bis 90 000 (bestimmt durch Gelfiltration).

2. Verfahren zur Herstellung des Glykoproteids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die in menschlichem Urin enthaltenen Proteine konzentriert, die erhaltenen Proteine zur Abtrennung von Verunreinigungen mit einem Kationenaustauscher behandelt, das Eluat zur Adsorption des Glykoproteids mit einem Anionenaustauscher behandelt, das Glykoproteid aus dem Anionenaustauscher mit einer Salzlösung mit linearem Konzentrationsgradient eluiert, das Eluat der Gelfiltrationschromatographie an einem stark vernetzten Polymergel unterwirft, um das Glykoproteid zu entwickeln, und die Fraktionen mit relativen Elutionsvolumen Ve/Vo von 1,11 bis 1,60 auffängt.

3.Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man die aufgefangenen Fraktionen zusätzlich einer Affinitätschromatographie an einem Absorptionsmittel mit Affinität für Zucker unterwirft, und das adsorbierte Glykoproteid mit einer 20 bis 100 molaren Saccharidlösung eluiert.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Eluat der präparativen Zonenelektrophorese unterwirft und das Glykoproteid mit einer Salzlösung eluiert.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das relative Elutionsvolumen 1,11 bis 1,45 beträgt.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fraktionen mit einem relativen Elutionsvolumen von 1,11 bis 1,60 auf einen pH-Wert von 5 bis 9 einstellt und die erhaltene wäßrige Lösung zur Inaktivierung von Viren in Gegenwart von humanen Albumin 8 bis 30 Stunden auf 50 bis 70°C erhitzt.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Albuminkonzentration in der wäßrigen Lösung mindestens 2,0% (Gewicht pro Volumen) beträgt.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Albumin aus humanen Serum oder humaner Placenta stammt.

9. Verfahren nach Anspruch 2-4, dadurch gekennzeichnet, daß man die das Glykoproteid enthaltenden Fraktionen, einschließlich des Proteine enthaltenden konzentrierten menschlichen Urins, zur Inaktivierung von Viren in einer beliebigen Stufe in Form einer wäßrigen Lösung 8 bis 30 Stunden auf 50 bis 70°C unter solchen Bedingungen erhitzt, daß der Proteingehalt der wäßrigen Lösung auf mindestens 70 mg pro ml und der pH-Wert auf 5 bis 9 eingestellt worden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Proteingehalt der wäßrigen Lösung für die Vireninaktivierung 100 bis 150 mg pro ml beträgt.

11. Verwendung des Glykoproteids nach Anspruch 1 bzw. des nach einer der Ansprüche 2-10 hergestellten Glykoproteids, bei der Bekämpfung von Leukozytopenie.

12. Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Glykoproteid eine spezifische biologische Aktivität von mindestens 35 000 Einheiten pro mg Protein aufweist.