DE2409650A1

DE2409650A1 - Waessrige haptoglobinloesungen, verfahren zu ihrer herstellung und arzneimittel

Info

Publication number: DE2409650A1
Application number: DE19742409650
Authority: DE
Inventors: Satoshi Funakoshi; Takeshi Ohshiro; Takao Omura
Original assignee: GREEN CROSS CORP; Green Cross Corp Japan
Current assignee: GREEN CROSS CORP; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1973-11-15
Filing date: 1974-02-28
Publication date: 1975-05-28
Also published as: CH608190A5; DE2409650C3; ES423697A1; FR2251314B1; GB1426039A; FR2251314A1; DE2409650B2

Description

^IPL.-CHEM. DR. VOLKER VOS3IUS

PATENTANWALT

8 MÖNCHEN 86, SiEBERTSTRASSE 4 PHONE: 47 40 75

CABLE ADDRESS: BENZOtPATENT MÖNCHEN TELEX 5-23453 VOPAT D

u.Z.: K 691 (Vo/Mü/kä)-POS-32820 GREEN CROSS

THE GREEN CROSS CORPORATION
Osaka, Japan

" Wäßrige Haptoglobinlösungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und Arzneimittel "

Priorität: 15. November 1973, Japan, Nr. 128 605/73 15. November 1973, Japan, Nr. 128 606/73

Die Erfindung betrifft wäßrige Haptoglobinlösungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und Arzneimittel.

Haptoglobin ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 85. 000 bis 400 000 und spielt im Stoffwechsel des im Blut freigesetzten Hämoglobins eine wichtige Rolle. Bei übermäßiger Hämolyse wird Hämoglobin mit einem Molekulargewicht von etwa 67 000, das im Blut freigesetzt wird, durch das Glomerulum in den Urin ausgeschieden, wobei nicht nur der Eisengehalt des Bluts gesenkt wird, sondern auch Störungen der Nierentubuli hervorgerufen werden.

Haptoglobin geht mit Hämoglobin eine selektive, feste Bindung ein, wobei ein Haptoglobin-Hämoglobinkomplex gebildet wird, der hauptsächlich von den Leberzellen aufgenommen wird. In den Le-

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·*- 240965Ü

berzellen wird dieser Komplex anschließend abgebaut, so daß das

wird
Eisen wiedergewonnen/und Nierenstörungen vermieden werden.

Die üblicherweise bei starker. Hämolyse, d.h. Hämoglobinfreisetzung, auftretenden Nierenstörungen haben oft tödlichen Ausgang. Zur Zeit stellen hämolytische Nierenstörungen, die durch Transfus ion fremder Blutarten, schwere Verbrennungen, Herzoperationen und hämolytische Krankheiten hervorgerufen werden, ein ernstes medizinisches Problem dar. Bisher wurden für solche Fälle nur symptomatische Behandlungen vorgeschlagen.

Aufgabe der Erfindung ist es, Mittel zur Verfügung zu stellen, mit denen die vorgenannten Störungen kausal behandelt werden können. Durch diese Behandlung soll sich eine Normalisierung des Stoffwechsels und der -Ausscheidung von Hämoglobin erreichen lassen. Diese Aufgabe wird durch wäßrige Lösungen von Menschlichem Serum—Haptoglobin, die praktisch keine hypotensiv wirkenden Substanzen enthalten, und die eine hohe Lagerstabilität aufweisen, gelöst. Vorzugsweise weisen diese wäßrigen Lösungen eine Haptoglobinkonzentration von 5 bis 15 Prozent auf. Die Reinheit des Haptoglobins beträgt vorzugsweise mindestens 65 Prozent. Insbesondere bevorzugt sind Lösungen von gereinigtem Haptoglobin, die einer Behandlung zur Inaktivierung des Hepatitis B-Antigens (im folgenden als HB-Ag abgekürzt) unterzogen worden sind.

Um Hämoglobin, das im Blutstrom auf Grund von Hämolyseerscheinungen mit verschiedenen Ursachen freigesetzt worden ist, in einen Haptoglobin-Häraoglobin-Komplex überzuführen und Nierenstörungen zu verhindern oder zu behandeln, ist die Verabreichung einer

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großen HaptogloMnmenge erforderlich. Es ist deshalb wünschenswert, daß hoch gereinigtes Haptoglobin verabreicht wird. Außerdem· enthalten Fraktionen von menschlichem Blutplasma nicht nur hypotensiv wirkende Substanzen, sondern sie können auch mit HB-Ag kontaminiert sein. Auch wenn die Untersuchung der Plasmafraktionen auf HB-Ag negativ ausgefallen ist, kann die Gefahr einer Infektion nicht immer mit Sicherheit ausgeschlossen werden. Dementsprechend ist die Entfernung der hypotensiv wirkenden Substanzen und die Inaktivierung von HB-Ag wichtig, wenn die genannten Fraktionen als Arzneimittel verv/endet werden sollen.

Deshalb betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von wäßrigen Lösungen von menschlichem Serum-Haptoglobin, das den vorgenannten Bedingungen entspricht. Diese Lösungen las sen sich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren in großen Mengen herstellen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Lösungen von menschlichem Serum-Haptoglobin ist dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige Lösung von α- und ß-Globulinfraktionen von menschlichem Blutplasma unter Verwendung von Ammoniumsulfat weiter fraktioniert, die bei 30 bis 40prozentiger Ammoniumsulfatsättigung ausgefällten Fraktionen sammelt, diese Fraktionen in Wasser löst, die erhaltene Lösung zur Adsorption des Haptoglobins mit einem Anionenaustauscher in Kontakt bringt, das Haptoglobin vom Anionenaustauscher selektiv eluiert und das erhaltene wäßrige Eluat einengt.

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Das erfindungsgemäße Verfahren ist aus folgenden Gründen besonders wirtschaftlich und vorteilhaft:

Erstens können als Nebenprodukte erhaltene α- und ß-Globulin-

werden.
fraktionen verwendet/ Diese Globulinfraktionen werden bei der Fraktionierung der hauptsächlichen Plasmaproteine, Fibrinogen, y-Globulin und Albumin, die im allgemeinen zur Herstellung von wichtigen biologischen Arzneimitteln verwendet werden, erhalten. Zweitens läßt sich das erfindungsgemäße Verfahren bei Raümtem-' peratur durchführen.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten α- und ß-Globulinfraktionen entsprechen beispielsweise den Fraktionen IV, IV-1 und IV-4 gemäß der Fraktionierung mit Alkohol bei niedrigen Temperaturen nach Cohn; vgl. E. J. Cohn, L. E. Strong, W. L. Hughes, D. J. Mulford, J.N. Ashworth, M. MeIin und H. L. Taylor, Journal of the American Chemical Society, Bd.68 (1946), S. 459. Nach einem anderen Verfahren lassen sich beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat bei 35 bis 50prozentiger Sättigung im wesentlichen die gleichen α- und ß-Globulinfraktionen erhalten. Die vorgenannten α- und ß-Globulinfraktionen werden im 3- bis 10-fachen Volumen einer Pufferlösung vom pH-Wert 6 bis 9, vorzugsweise etwa 8, gelöst, wobei eine wäßrige Lösung entsteht, die in den meisten Fällen trüb ist. Diese wäßrige Lösung wird entweder direkt oder nach Klärung durch Zentrifugieren von restlichem Äthanol befreit, indem sie gegen eine Pufferlösung vom pH-Wert 6 bis 9 dialysiert wird.

solchen Menge einer wäßrigen Anschließend wird diese Lösung mit einer/Rivanollösung (Äth-

versetzt,

acridin-lactat-monohydrat)/ daß die Rivanolkonzentratj on 0,2 I- -J

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■ ^·

*y ·

bis 0,6, vorzugsweise 0,4 Gewichtsprozent, bezogen auf das Volumen der Lösung, beträgt. Dabei entsteht ein Niederschlag. Der Niederschlag wird durch Filtrieren oder Zentrifugieren abgetrennt und das in der wäßrigen Lösung verbleibende Rivanol wird beispielsweise durch Dialysieren gegen eine Pufferlösung oder durch Adsorption an Bentonit, Kaolin oder Aktivkohle entfernt. Die Rivanolbehandlung ist zur Klärung der wäßrigen Lösung wichtig. Durch diese Behandlung wird erreichti daß die anschließenden Verfahrensschritte glatt ablaufen.

Die so geklärte wäßrige Lösung wird auf einen pH-Wert von 5,5 bis 8,0, vorzugsweise 7,0, eingestellt. Sodann wird eine wäßri-, ge, konzentrierte Ammoniumsulfatlösung zugegeben. Der Niederschlag, der sich bei 30prozentiger Ammoniumsulfatsättiguhg gebildet hat, wird entfernt. Anschließend wird der Überstand mit weiterer Ammoniumsulfatlösung versetzt. Der bei einer 40prozentigen Ammoniumsulfatsättigung gebildete Niederschlag wird gesammelt, d. h. man erhält den Niederschlag, der zwischen 30 bis 40prozentiger AmmoniumsulfatSättigung entsteht.

Durch die fraktionierte Ammoniumsulfatfällung werden Transferrin,

unerwünschte
Albumin und andere/in den α- und ß-Globulinfraktionen enthaltene ·

Proteine entfernt.

Die vorstehend beschriebene Klärung von wäßrigen Lösungen von α- und ß-Globulinfraktionen mit Rivanol ist auch auf wieder hergestellte Lösungen der genannten, mit Ammoniumsulfat ausgefällten Niederschläge anwendbar. Die durch Ämmoniumsulfat ausgefällten Fraktionen· werden im 3- bis 10-fachen Volumen Acetatpuffer _j

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vom pH-Wert 4,5 Ms 8,5, vorzugsweise 5,5, und einer Ionenstärke von 0,01 Ms 0,08, beispielsweise einem 0,05 m Acetatpuffer, gelöst. Die erhaltene Lösung wird in Kontakt mit einem starken Anionenaustauscher gebracht, der vorher mit der vorgenannten Pufferlösung äquilibriert worden ist. Als Anionenaustauscher wird vorzugsweise QAE-Sephadex (mit Epichlorhydrin vernetztes Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-aminoäthyldextran der Firma Pharmacia Co,) oder Aminoäthylcellulose verwendet. Der Anionenaustauscher, an dem das Haptoglobin adsorbiert ist, wird gegebenenfalls mit einer geringen Menge der vorgenannten Pufferlösung von einer geringen Ionenstärke gewaschen. Anschließend wird das Haptoglobin mit einer Pufferlösung, die eine lonenstärke von 0,25 bis 0,35 und einen pH-Wert von 4,5 bis 8,5, vorzugsweise

hat,
5,5 / eluiert. Beispielsweise wird ein 0,05 m Acetatpuffer, der durch Zusatz von Natriumchlorid auf die vorgenannte lonenstärke gebracht worden ist, verwendet. Auf diese Weise erhält man ein wäßriges Haptoglobineluat.

Bei dieser Stufe werden größere Mengen von hypotensiv wirkenden Substanzen, die in der wäßrigen Lösung enthalten sind, und unstabile Substanzen, die eine Trübung oder Ausfällung während der Lagerung des Endproduktes hervorrufen, abgetrennt.

Das erhaltene, Haptoglobin enthaltende Eluat wird anschließend eingeengt, beispielsweise durch Ausfällung aller Bestandteile in der Lösung mit Ammoniumsulfat und Auflösen des Niederschlags in der entsprechenden Menge eines Lösungsmittels, vorzugsweise einer physiologisch verträglichen wäßrigen Lösung, wie einer isotonischen Kochsalzlösung. Eine andere Möglichkeit besteht darin,

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^Γ - 7 - 240965G ^π

die wäßrige Lösung durch Dialyse unter vermindertem Druck einzuengen. Wird unter vermindertem Druck gegen eine physiologisch verträgliche, wäßrige Lösung dialysiert, so wird in einer Stufe aus dem das Haptoglobin enthaltenden Eluat eine physiologisch verträgliche Lösung gebildet.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene wäßrige Haptoglobinlösung läßt sich in beliebiger Konzentration erhalten. Wird die wäßrige Lösung zur intravenösen Injektion zur Verhinderung oder Behandlung von durch übermäßige Hämolyse hervorgerufenen Nierenstörungen verwendet, so wird eine Haptoglobin-konzentration von 5 bis 15 Prozent im allgemeinen bevorzugt. Die Reinheit des Haptoglobins -in der wäßrigen Lösung beträgt mindestens 65 Prozent und die Ausbeute mindestens 30 Prozent der Theorie. Die Mengen an hypotensiv wirkenden Substanzen und unstabilen Substanzen, die in der wäßrigen Lösung enthalten sind, ist bei weitem geringer als in der wäßrigen Lösung vor der Behandlung mit dem Anionenaustauscher. Selbstverständlich wird die wäßrige Lösung vor der klinischen Anwendung steril filtriert oder einer ähnlichen Behandlung unterworfen, um ein keimfreies ■ Arzneimittel zu erhalten.

Wäßrige Haptoglobinlösungen sind nicht in ausreichendem Maße wärmestabil und verlieren im wesentlichen ihre Aktivität, wenn sie zur Inaktivierung von HB-Ag erwärmt werden, was bei der Albuminherstellung durchgeführt v/ird. Es wurde festgestellt, daß die Haptoglobinaktivität in wäßriger Lösung bei einer 10-stündigen Erwärmung auf 60⁰C, wie sie im allgemeinen zur Inaktivierung

von HB-Ag vorgenommen wird, verschwindet. ι _l

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240965C ι

Es wurde nun erfindungsgemäß festgestellt, daß "bei Zusatz von bestimmten Stabilisatoren zu den wäßrigen Haptoglobinlösungen das Haptoglobin gegen Erwärmen stabil wird. Beispiele für solche Stabilisatoren sind neutrale Aminosäuren, Monosaccharide, Disaccharide oder Zuckeralkohole. Nach Zusatz dieser Stabilisatoren behalten die wäßrigen Haptoglobinlösungen ihre Aktivität auch nach einer 10-stündigen Erwärmung auf 60⁰C. Die vorgenannten Stabilisatoren können entweder einzeln oder in Kombination von zwei oder mehr dieser Verbindungen verwendet werden.

Die vorgenannte Erwärmungs- und Stabilisierungsbehandlung kann in einem beliebigen Stadium der Herstellung der erfindungsgemäßen Haptoglobinlösungen vorgenommen werden. Folgende Lösungen können mit dem vorgenannten Stabilisator versetzt und anschließend der Wärmebehandlung zur Inaktivierung" von HB-Agunterzogen werden: die wäßrige Ausgangslösung der α- und ß-Globulinfraktionen, die mit Rivanol geklärte wäßrige ,Lösung, die von Rivanol freie wäßrige Lösung, die nach Auflösen der Ainmoniumsulfatfällungen wieder hergestellte wäßrige Lösung, das nach Elution des Anionenaustauschers erhaltene wäßrige Eluat und die eingeengte wäßrige Lösung.

Spezielle Beispiele für Stabilisatoren sind neutrale Aminosäuren (Monoamino-monocarbonsäuren) wie Glycin, Alanin, Valin, Leucin und Isoleucin, Monosaccharide, wie Glucose, Mannose, Galactose und Fructose, Disaccharide, wie Saccharose, Maltose und Lactose, sowie Zuckeralkohole, wie Mannit, Sorbit und Xylit. Die Menge des zugesetzten Stabilisators beträgt mindestens 5 Gewichtsprozent, vorzugsweise 15 bis 20 Gewichtsprozent, bezogen auf das

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_₉_ 240965C

Volumen der Lösung.

Die Wärmebehandlung zur Inaktivierung von HB-Ag wird nach.einem üblichen Verfahren durchgeführt. Bei einer üblichen 1O-stündigen Behandlung bei 60⁰C behält die wäßrige Lösung 95 Prozent ihrer Haptoglobinaktivität.

Der in der wäßrigen Lösung verbleibende Stabilisator -wird anschließend durch Dialyse, durch Dialyse unter vermindertem Druck oder durch die zur Einengung der wäßrigen Lösung angewendete Ammoniumsulfatfällung entfernt.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Stabilisierung von wäßrigen Haptoglobinlösungen kann auch auf wäßrige Haptoglobinlösungen angewendet werden, die nach anderen Verfahren erhalten worden sind. Beispielsweise sei das Verfahren von Betrach und McMillan genannt; Anal. Biochem., Bd. 49 (1972), Seiten 103 bis 108.

Die Toxizität der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten wäßrigen Haptoglobinlösungen ist äußerst gering. Bei Injektionen von großen Mengen an Mäuse oder Ratten, sowie auch an Menschen, werden keine ungünstigen Nebenwirkungen hervorgerufen. So ergeben sich beispielsweise bei intravenöser Infusion einer 5proζentigen Haptoglobinlösung in isotonischer Kochsalzlösung an Erwachsene keine ungünstigen Nebenwirkungen.

Wie bereits erwähnt, sind die erfindungsgemäßen wäßrigen Haptoglobinlösungen wertvoll zur Behandlung von Nierenstörungen auf

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S09822/096&

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. - ίο -

Grund von übermäßiger Hämolyse.

Die Erfindung betrifft daher auch Arzneimittel, bestehend aus den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten wäßrigen Haptoglobinlösungen und üblichen Trägerstoffen und/oder Hilfsmitteln und/oder Verdünnungsmitteln.

Die Figur zeigt den klinischen Fortschritt eines Patienten mit Beckenbruch, Harnröhrenriß und Blutungsschock, dem ein erfindungsgemäßes Kaptoglobinpräparat verabreicht wurde.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Die in den Beispielen genannte Hämoglobin-Bindekapazität ist folgendermaßen definiert: '

Höchstmenge an Hämoglobin, die einer definierten Menge Haptoglobin zugesetzt werden kann, ohne daß freies Hämoglobin auftritt. Das erhaltene Gemisch wird durch Dünnschichtelektrophorese an Pplyacrylamidgel entwickelt. Anschließend wird mit einem Benzidinreagens angefärbt; vgl. The Society of the Electrophoresis: Experimental Methods by Electrophoresis, Herausgeber Bunkodo, S. 247.

Die Gesamtmenge an Haptoglobin wird nach dem™lmraiuno%j.?rusionsverfahren von G. Mancini, A. 0. Carbonara und J. F. Heremans, Immunochem., Bd. 2 (1965) S. 235, unter Vervrendung von Kaninchen-Antihaptoglobinseren (Behringwerke) gemessen. Die Reinheit des Haptoglob"ns wird als der Haptoglobinanteil im Gesamtprotein des

_tPräparats \nger ^e-·, Die Proteinmenge wurde dabei als Stickstoff-

509822/0965 original inspected

. .. „ _ 24Q96bü ι

nach Kjeldahl bestimmt, wobei mit dem Faktor 6,25 multipliziert wurde.

Die akute Toxizität (LD₅₀) wurde durch intravenöse Injektion von wäßrigen Haptoglobinlösungen an Mäuse und Ratten bestimmt. Zur Bestimmung der hypotensiven Aktivität wurden die Haptoglobinlösungen an erwachsene Hunde verabfolgt; Die hypotensive Aktivität wird als Verhältnis des arteriellen Blutdrucks vor der Verabreichung zum Blutdruck nach der Verabreichung angegeben. Eine hypotensive Aktivität von weniger als 10 Prozent wird als negativ gewertet. Die Messung von HB-Ag wurde nach einem radioimmunologischen Verfahren gemäß der japanischen Patentveröffentlichung 49 919/73 unter Verwendung der Ausria-125-Ausrüstung der Firma Abbott Co. bestimmt.

Beispieli

30 kg der Fraktion IV, die durch Fraktionierung von menschlichem Blutplasma nach der Cohn'sehen Äthanolfraktionierung bei niedriger Temperatur erhalten wurden, werden in 145 Liter 0,05 m Ammoniumacetatpuffer vom pH-Wert 8,2 suspendiert. Die erhaltene

ι - ■

Suspension wird mit 120 Liter einer Iprozentigen wäßrigen Rivanollösung vermischt, 3 Stunden gerührt und anschließend 2 Stunden zum Absetzen des Niederschlags stehengelassen. Der Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt und der Überstand mit 8 kg Bentonit vermischt, 2 Stunden gerührt und anschließend filtriert. Man erhält eine klare Lösung. Nach dem Einstellen des pH-tfertes des Filtrats auf 7,0 durch Zugabe von 1 η Essigsäure wird Ammoniumsulfat bis zum Erreichen einer 30prozentigen Sättigung zugesetzt.- Der gebildete Niederschlag

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wird durch Abzentrifugieren entfernt. Anschließend wird weiteres Ammoniumsulfat bis zu 40prozentiger Sättigung zugesetzt und der gebildete Niederschlag abzentrifugiert. Dieser Niederschlag

gelöst wird sodann in 10 Litemeiner 0,05 m Natriumacetatlösung/und gegen die gleiche Pufferlösung dialysiert. Die erhaltene Lösung wird bis zu einer Konzentration von 20 Prozent (Gewicht/Volumen)

/Glycin versetzt. Der pH-Wert wird auf 8 eingestellt. Sodann wird 10.Stunden im Wasserbad auf 60⁰C erwärmt. Die so wärmebe-" handelte Lösung wird gegen eine 0,05 m Acetatpufferlösung vom pH-Wert 5,0 dialysiert und anschließend· mit 200 g QAE-Sephadex-A-50, das mit der vorgenannten Pufferlösung äquilibriert worden ist, vermischt, um das Haptoglobin zu adsorbieren. Anschließend wird das QAE-Sephadex-A-50 mit einer Pufferlösung der linenstärke 0,05 (Zusammensetzung: 0,05 m CH-zCOOH + 0,05 m CH^COONa.3^0) gewaschen. Anschließend wird das Haptoglobin mit einer Pufferlösung der Ionenstärke 0,3 (Zusammensetzung: 0,05 m CH₃COOH, 0,05 m CH₃COONa.3H₂O + NaCl) eluiert. Sodann wird Ammoniumsulfat bis zu einem Sättigungsgrad von 50 Prozent zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und in 1,5 Liter einer isotonischen Kochsalzlösung gelöst. Die erhaltene Lösung wird dialysiert und anschließend

(Spezialfilter für sterile Filtration) durch eine 0,2 u Milliporefilter-Membran/filtriert. Man erhält eine sterile wäßrige Lösung von Haptoglobin.- Die Haptoglobinkonzentration dieser wäßrigen Lösung beträgt· 4,8 Prozent und die Haptoglobinausbeute 42 Prozent. Die Eigenschaften des erhaltenen Haptoglobins sind in Tabelle I zusammengestellt:

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Tabelle I

Reinheit des Haptoglobins	Mäuse	75 % :
Hämoglobinbindekapazität	Ratten	0,62 mg Hämoglobin/mg Haptoglobin
^LD50 .	hypotensive Aktivität	mindestens 11,7 g/kg
HB-Ag	mindestens-10,5 g/kg
9,5 %
negativ

Um die Wirkung, der Ionenaustaüscherbehandlung zu zeigen, werden die hypotensive Aktivität und die Lagerstabilität der Haptoglobinlösungen vor und nach dieser Behandlung miteinander verglichen. - ·

■ Tabelle II

	hypotensive	Lagerstabilität	unverändert klar
	Aktivität (%)	dreimonatige Lage- dreimonatige La- rung bei 4⁰C gerung bei Raum temperatur
Vor der Behand lung mit Ionen austauscher	18	Auftreten von Auftreten von feinen suspendier- feinen suspen- ten Partikeln dierten Parti keln
Nach der Behänd lung mit Ionen austauscher	9,5	unverändert klar

Beispiel- 2

3 kg der Fraktion IV, die gemäß der Cohn¹sehen'Äthanolfraktionierung aus menschlichem Blutplasma" erhalten wurden, werden in 15 LiternAcetatpuffer vom pH-Wert 7 suspendiert. Die erhaltene

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Suspension wird gegen Acetatpuffer dialysiert und anschließend zentrifugiert, um das Äthanol bzw. die unlöslichen Bestandteile zu entfernen. Der Überstand wird bis zu 33prozentiger Sättigung mit Ammoniumsulfat 'versetzt, und der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren· entfernt. Anschließend wird weiteres Ammoniumsulfat bis zu 40prozentiger Sättigung zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und in 10 LiternV7asser gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 8 LitemO,5prozentiger Rivanollösung versetzt. Der pH-tfert der Lösung wird auf 7,5 eingestellt. Anschließend wird die Lösung zur Entfernung der Niederschläge zentrifugiert. Der Überstand wird zur Entfernung des Rivanols gegen Acetatpuffer dialj^siert. Die dialysierte Lösung wird bis zu einer Konzentration von 20 Prozent (Gewicht/ Volumen) mit Mannit versetzt und anschließend 10 Stunden auf 60⁰C erwärmt. Die wärmebehandelte Lösung wird zur Entfernung des Mannits gegen 0,05 m Acetatpuffer vom pH-Wert 6,5 dialysiert. Man erhält 1,2 Liter einer 3prozentigen wäßrigen Haptoglobinlösung. Diese Haptoglobinlösung wird mit 30 g Aminoäthylcellulose (Serva Co), die mit dem vorgenannten Puffer ä'quilitriert worden ist, vermischt. Anschließend wird die Aminoäthylcellulose mit einer wäßrigen Lösung der Ionenstärke 0,08 (Zusammensetzung: 0,08 m'CH^COOH + 0,08 m CH^COONa . 3H₂O) gewaschen. Anschließend wird das Haptoglobin mit einer wäßrigen Lösung der lonenstärke 0,25 (Zusammensetzung: 0,08 m CH^COOH + 0,08 m CH₃COONa.3H₂O + NaCl) eluiert. Das Eluat" wird unter vermindertem Druck gegen eine isotonische Kochsalzlösung dialysiert, eingeengt und sodann durch eine 0,2 u-Millipore-Filtermembran filtriert.'Man erhält eine sterile wäßrige Haptoglobin-

lösung. Die Proteinkonzentration dieser Lösung beträgt 10 Pro-L ^J

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zent und die Haptoglobinausbeute 40 Prozent. Die Eigenschaften des erhaltenen Haptoglobins sind in Tabelle III zusammengestellt.

Um die Wirkung der Behandlung mit dem Ionenaustauscher zu zeigen, werden in Tabelle IV die hypotensive Aktivität und die Lagerstabilität der Haptoglobinlosungen vor und nach dieser Behandlung miteinander verglichen.

Tabelle III

Reinheit des Haptoglobin

Hämoglobinbindekapazität	Mäuse "	0,68 mg Hämoglobin/mg Haptoglobin
^LD50	Ratten	mindestens 12 g/kg
hypotensive Aktivität	mindestens 10 g/kg
Hb-Ag	6,0 %
negativ

Tabelle IV

	hypoten sive Ak tivität (90	Lagerstabilität	dreimonatige La gerung bei Raum temperatur
Vor der Behandlung mit dem Ionenaus tauscher	12,0	dreimonatige La-' gerung bei 4⁰C	leicht trüb
Nach der Behand lung mit dem Ionen austauscher	6,0	feiner Nieder- . schlag	unverändert klar
unverändert klar

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Beispiel

werden
10 Liter frisches Blutplasma / zur Ausfällung der α- und ß-Globulinfraktionen mit Ammoniumsulfat versetzt. Diese Fraktionen werden in 10 Litern Ammoniumacetatpuffer vom pH-Wert 8 suspendiert. Die Suspension wird mit 7 Litemeiner Iprozentigen wäßrigen Rivanollösung vermischt und anschließend 2 Stunden stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und und der'Überstand mit 0,6 kg Kaolin versetzt, 2 Stunden gerührt und anschließend filtriert. Man erhält eine klare Lösung. Nach dem'Einstellen des pH-Wertes des Filtrats auf 7,0 durch Zusatz von 1 η Essigsäure wird Ammoniumsulfat bis zu 30prozentiger Sättigung zugegeben. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt. Der Überstand wird mit weiterem Ammoniumsulfat bis zu 40prozentiger Sättigung versetzt. Der gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert und in Wasser gelöst. Die erhaltene Lösung wird gegen 0,05 m Acetatpuffer vom pH-Wert 5,5 dialysiert. Die dialysierte Lösung wird der Säulenchromatographie an einer mit QAE-Sephadex-A-50 beschickten Säule der Abmessungen 4 χ 30 cm unterworfen. Die Säule wird mit Acetatpuffer der Ione.nstärke 0,12 gewaschen. Anschließend wird das Haptoglobin mit Acetatpuffer der Ionenstärke 0,3 eluiert. Das eluierte -Haptoglobin wird mit Hilfe von Polyäthylenglykol als wasserabsorbierendes Mittel eingeengt. Die eingeengte Flüssigkeit wird mit 15 Prozent (Gewicht/Volumen) Glycin versetzt und anschließend 10 Stunden auf 60⁰C erwärmt. Die wärmebehandelte Lösung wird zur Entfernung des Glycins gegen eine isotonische Natriumchloridlösung dialysiert und anschließend durch eine 0,2 u Millipore-Filtermembran filtriert. Man erhält eine sterile Lösung von Haptoglobin in isotonischer Kochsalzlösung. Die

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Proteinkonzentration dieser Lösung beträgt 8,2 Prozent und die Haptoglobinausbeute 38 Prozent. Die Eigenschaften des erhaltenen Haptoglobins sind in Tabelle V zusammengestellt. ' " .

Um die Wirkung der Behandlung mit dem Ionenaustauscher zu zeigen,' werden in Tabelle VI die hypotensive Aktivität und die Lagerstabilität von Haptoglobinlösungen vor und nach dieser Behandlung verglichen.

Tabelle V

Reinheit des Haptoglobins	Mäuse	I 91 % :
Hämoglobinbindekapazität	Ratten	0,88 mg Hämoglobin/mg Haptoglobin '■
^LD50	Hypotensive Aktivität	mindestens 12 g/kg
HB-Ag	mindestens 10 g/kg
.7,0 %
negativ

Tabelle VI

Ϊ	Vor der Behand lung mit dem Ionenaustauseher	hypοten sive Ak- "tivität (#)	Lagerstabilität	dreimonatige La gerung bei Raum temperatur !
Nach der Behand lung mit dem Ionenaustauscher	24,0	dreimonatige La gerung bei 4 C	"leicht trüb
	7,0	feiner Nieder-, schlag	unverändert klar
	unverändert klar

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Beispiel 4

Wenn die Wärmebehandlung zur Inaktivierung von gegebenenfalls in der Haptoglobinlösung vorhandenem HB-Ag in Abwesenheit eines Stabilisators durchgeführt wird, so verliert das Haptoglobin seine Hämoglobin-bindende Wirkung.

In diesem Beispiel werden der Einfluß der Katalysatormenge und die stabilisierende Wirkung verschiedener Stabilisatoren durch Messung der verbleibenden Hämoglobinbindekapazität des Haptoglobins nach der Wärmebehandlung untersucht.

Dabei wird die gemäß-Beispiel'1 erhaltene, noch nicht wärmebehandelte Lösung von Haptoglobin in isotonischer Kochsalzlösung verwendet. Als Stabilisatoren werden die neutralen Aminosäuren Glycin und Alanin und die 'Saccharide Mannit und Glucose verwendet. Die Stabilisatoren werden jeweils in den in Tabelle VII angegebenen Mengen in der Haptoglobinlösung gelöst, welche dann. 10 Stunden auf 60⁰C erwärmt wird. Anschließend werden die Hämoglobinbindekapazität der Haptoglobinlösung und das Verhältnis der entsprechenden Werte vor und nach der Wärmebehandlung bestimmt.

Zum Vergleich wird eine nicht mit Stabilisator versetzte Haptoglobinlösung der gleichen Wärmebehandlung unterzogen, wonach ebenfalls die Hämoglobinbindekapazität gemessen wird. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengestellt.

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240965G ι

- 19 Tabelle VII

i Stabilisator restliche Hämoglobinbindekapa-	-Art	_Μ : zität des Haptoglobins nach der (%) ^: Wärmebehandlung
Glycin ■	20 j 95 15 j 95 - 10 ■· 70 5 ; - 35 2,25 \ 20
Alanin -	20 75 " . 15 s -50
Mannit ι	20 85 15 : 80 10 55 7 ■ 'j · 40 5 ί 15

Glucose	20 15.	ohne Stabilisator	60 45
= 0

Beispiel 5

Beispiel 4 wird mit der Abänderung wiederholt, ■ daß als Haptoglobinlösung die noch nicht wärmebehandelte dialysierte Lösung von Beispiel 3 verwendet wird und als zusätzliche Stabilisatoren Sorbit und Saccharose eingesetzt werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengestellt.

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Tabelle VIII

Stabilisator	Art	Menge (%)	ohne Stabilisator	restliche Hämoglobinbinde- i
Glycin	20	kapazität des Haptoglobins ; • nach der Wärmebehandlung
Alanin	20	92
Mannit.	20	83
Glucose	20	85'
' Sorbit	20	72
Saccharose	20	76
68
0

Beispiel 6

Die gemäß Beispiel 1 hergestellte Haptoglobinlösung wird zu in vivo-Experimenten an Kaninchen eingesetzt, um die Wirkung der Haptoglobinbehandlung nach einer Verabreichung von Hämoglobin festzustellen. ·

30 erwachsene Kaninchen mit einem Körpergewicht von 2,3 bis 2,9 kg werden in drei Gruppen von jeweils 10 Tieren eingeteilt. Diesen Tieren wird kontinuierlich Haptoglobin und/oder Hämoglobin verabfolgt, wobei die Überlebensrate der Kaninchen festgestellt wird. Nach beendeter Versuchsdauer werden die überleben- den Tiere seziert und die einzelnen Organe einer histopathologischen Untersuchung unterworfen.

Der ersten Gruppe wird Haptoglobin verabfolgt:

Sine 5prozentige Lösung von Haptoglobin in isotonischer Xoch-

'l_salzlösung wird nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt

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und einmal täglich durch intravenöse Dauerfusion in einer Dosis von 0,8 g/kg Körpergewicht verabfolgt.

•Der zweiten Gruppe wird Hämoglobin verabfolgt: Eine lOprozentige Lösung von Hämoglobin (aus roten Blutkörperchen, von Kaninchen isoliert) in isotonischer Kochsalzlösung wird hergestellt und einmal täglich in einer Dosis von 0,4 g/kg Körpergewicht durch intravenöse Dauerfusioh verabfolgt.

Der dritten Gruppe werden Haptoglobin und Hämoglobin verabfolgt: Hämoglobin und anschließend Haptoglobin v/erden auf die gleiche Weise und in den gleichen Dosen wie in Gruppe 1 und Gruppe 2 verabfolgt. · ' ■

Am 4. Tag nach der Verabfolgung wird die Anzahl der überlebenden Kaninchen pro Gruppe festgestellt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengestellt:.

Tabelle IX

	Anzahl der Testtiere	Anzahl der überleben den Tiere	Anzahl der ' toten Tiere
j Gruppe 1: Verabfolgung von Haptoglobin	10	' 10	0
Gruppe 2: Verabfolgung von Hämoglobin	10	• 3	7
Gruppe 3: Verabfolgung von Haptoglobin und Hämoglobin	10	9	1

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Die histopathologische Untersuchung ergibt folgendes:

Gruppe 1:

Bei Kaninchen, denen Ms zu 14 Tagen kontinuierlich HaptogloMn verabfolgt wurde, zeigen sich an Nieren, Milz und Lunge keine Veränderungen. Lediglich eine geringe Verengung des Sinusoids und eine Eisenablagerung in der Leber werden beobachtet.

Gruppe 2:

Bei Kaninchen, denen kontinuierlich 6 Tage Hämoglobin verabfolgt wurde,- lassen sich eine deutliche Eisenablagerung vcm proximalen Tubulus zum Sammelrohr der Miere, eine Verdünnung der renalen Epithelzellen, eine Vermehrung der retikulären Zellen in der MilZj eine deutliche Verengung-des Sinusoids und eine Eisenablagerung in der Leber feststellen.

Gruppe 3:

Bei Kaninchen, denen kontinuierlich Hämoglobin und Haptoglobin verabfolgt wurde, läßt sich eine Eisenablagerung nur im proximalen Tubulus der Niere feststellen. Eas Sammelrohr ist im wesentlichen normal. Es tritt keine Verdünnung der Epithelzellen auf. Ferner läßt sich eine leichte Infiltration von Zellen in der Milz feststellen. Ferner werden eine geringere Eisenablagerung und viel Gallenpigment in der Leber beobachtet.

Aus den vorstehenden Versuchen ergibt sich, daß die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellte Haptoglobinlösung im wesentlichen keine schädlichen Nebenwirkungen aufweist und wert-

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volle Arzneistoffe zur Verhinderung von durch Hämoglobin verursachten Nierenstörungen darstellen.

Bei'spiel 7

In diesem Beispiel wird die klinische Wirkung der nach Beispiel 2 hergestellten Haptoglobinlösung erläutert. Bei einem männlichen Patienten von 53 Jahren, der bei einem Arbeitsunfall durch .einen Holzbalken verletzt wurde und sofort ins Krankenhaus kam, wird ein Beckenbruch, ein Harnröhrenriß und ein Blutungsschock diagnostiziert. Unmittelbar nach der Einlieferung wird der Patient zur Wiederherstellung des Harntraktes operiert. Während ■ der Operation beträgt der gesamte Blutverlust 7500 ml. Die Menge des übertragenen Blutes beträgt insgesamt 4200 ml und die Menge des Blutersatzes ebenfalls 4200 ml. Während dieser Zeit werden zwei Ampullen Lasix (Warenzeichen für eine Injektionslösung der Japan Hoechst Co., , wobei jede Ampulle 2 ml

(4-ChIOr-N-furfuryl-5-sulfamov±anthranilsäure) einer Losung mit ZO mg Fursemide/enthält) una 200 ml einer 20prozentigen Mannitlösung (Daiichi Xagaku) verabfolgt, wobei die gewünschte Wirkung im Urin nicht eintritt. Der klinische Fortschritt des Patienten nach der Operation ist aus der Figur ersichtlich. Das Symbol " Ί" im oberen Teil der Figur gibt den Zeitpunkt der Zugabe der einzelnen Stoffe und das Symbol " T" im unteren Teil der Figur gibt den Zeitpunkt der Operation und der klinischen Befunde an. Auf der Abszisse sind die Tage nach dem Unfall angegeben. Nach 20 Stunden beträgt die Urinmenge lediglich 120 ml. Im Urin ist eine deutliche Menge an Blutpigmenten festzustellen. In diesem Stadium v/erden dem Patienten durch intravenöse Infus ion 250 ml einer -5prozentigen Lösung von Haptoglobin in isotonischer Kochsalzlösung, die nach dem erfin-

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dungsgemäßen Verfahren hergestellt wurde, verabfolgt. Die roten Blutpigmente verschwinden innerhalb einiger Stunden nach der Haptoglobingabe aus dem Urin. Außerdem steigt die Urinmenge;, und die allgemeinen Symptome des Patienten bessern sich allmählich. Auch 6 Monate später ergeben sich durch die Verabfolgung von Haptoglobin keine nachteiligen Nebenwirkungen.

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Claims

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Patentansprüche

1. Wäßrige Lösung von menschlichem Serum-Haptoglobin, die im wesentlichen keine hypotensiv wirkenden Substanzen enthält

• und eine große Lagerstabilität auf v/eist.

2. Wäßrige Haptoglobinlösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Haptoglobinkonzentration 5 bis 15 Prozent beträgt .

3. Wäßrige Haptoglobinlösung nach Anspruch 1, dadurch gekenn-'zeichnet, daß die Reinheit des Haptoglobins mindestens 65 Prozent beträgt. ' .

4. Wäßrige Haptoglobinlösung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das gegebenenfalls vorhandene HB-Ag inaktiviert worden ist. '

5. Verfahren zur Herstellung von Lösungen von menschlichem Serum-Haptoglobin, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wäßrige

. Lösung von α- und ß-Globulinfraktionen von menschlichem Blutplasma unter Verwendung von Ammoniumsulfat weiter fraktioniert, die bei 30' bis 40prozentiger Ammoniumsulfatsättigung ausgefällten Fraktionen sammelt, diese Fraktionen in -Wasser löst, die •erhaltene Lösung zur Adsorption des Haptoglobins mit einem Anionenaustauscher in Kontakt bringt, das Haptoglobin vom Anionenaustauscher selektiv eluiert, das Eluat -einengt und gegebenenfalls die eingeengte Lösung in eine wäßrige, physiologisch verträgliche Lösung überführt.

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6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man wäßrige Lösungen von α- und ß-Globulinfraktionen oder von mit Ammoniumsulfat ausgefällten Niederschlägen verwendet, die nach Klärung durch Zusatz von' Rivanol, Abtrennen des gebildeten Niederschlags und Entfernen des restlichen Rivanols aus der Lösung erhalten worden sind.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die wäßrige Haptoglobinlösung anschließend an einen beliebigen Verfahrensschritt mit mindestens einem Stabilisator aus der Gruppe neutrale Aminosäuren, Monosaccharide, Disaccharide und lösliche Zuckeralkohole versetzt, bis zur Inaktivierung von HB-Ag erwärmt und anschließend den Stabilisator entfernt.

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als/Ionenaustauscher mit Epichlorhydrin vernetztes Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-aminoäthyldextran oder Aminoäthylcellulose verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, daß man das wäßrige Eluat durch Fällung mit Ammoniumsulfat einengt.

'10. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man das wäßrige'Eluat durch Dialyse unter vermindertem Druck einengt.

11. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine physiologisch verträgliche Lösung' 'von Haptoglobin in isotonischer Kochsalzlösung herstellt.

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12. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das restliche Rivanol durch Dialyse gegen 'eine Pufferlösung entfernt.

13. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man das restliche Rivanol durch Adsorption an Bentonit,

Kaolin' oder Aktivkohle" entfernt.

•14. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als neutrale Aminosäure Glycin, Alanin, Valin, Leucin oder Isoleucin verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als Monosaccharide Glucose, Mannose, Galactose oder Fructose verwendet.

16. Verfahren nach Anspruch ,7, dadurch gekennzeichnet, daß man · als Disaccharide Saccharose, Maltose oder Lactose verwendet.

17. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man als lösliche Zuckeralkohole Mannit, Sorbit oder Xylit verwendet.

18. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man. die wäßrige Haptoglobinlösung 10 Stunden auf 6O⁰C erwärmt.

19. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stabilisator durch Dialyse entfernt.

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20. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stabilisator in einer Menge von mindestens 5 Gewichtsprozent, bezogen auf das Volumen der Lösung, zusetzt.

21. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stabilisator in einer Menge von 15 bis 20 Gewichtsprozent, bezogen auf das Volumen der Lösung, zusetzt.

22. Arzneimittel, bestehend aus einer nach Anspruch 5 hergestellten Haptoglobinlösung und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffen.

ORKSiNAL

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