DE2703620C2

DE2703620C2 - Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Antihämophiliefaktors

Info

Publication number: DE2703620C2
Application number: DE2703620A
Authority: DE
Inventors: Edward Santa Ana Calif. Shanbrom
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1976-01-30
Filing date: 1977-01-28
Publication date: 1984-11-22
Also published as: AT354632B; FR2339621B1; FR2339621A1; NO145563C; SE442953B; ATA53277A; DK146855B; DK146855C; JPS52102410A; CA1101332A; DE2703620A1; SE7700864L; MX5197E; JPS6242887B2; NL179290C; GB1557609A; NL179290B; NL7700927A; BE850852A; LU76652A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Faktors VIII bzw. des Antihämophlliefaktors.

Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Herstellung des Antihämophlllefaktors (AHF oder Faktor VIII) beschrieben worden, um die therapeutische Verwendung dieses Faktors zu ermöglichen. Diese Verfahren umfassen beispielsweise die selektive Ausfällung, die fraktionierte Absorption und Elution, die Extraktion in schwach-Ionischem Medium und die Chromatographie. Die am häufigsten für die Ausfällung verwendeten chemischen Produkte sind Alkohol, Gerbsäure, Ammoniumsulfat, Glycin und Polyäthylenglykol. Obwohl die Reinigung des Faktors VIII die Beseitigung einer Vielzahl von anderen Plasmaproteinen umfaßt, stellt Fibrinogen das wichtigste und am schwierigsten zu beseitigende dieser Proteine dar, insbesondere wenn es denaturiert ist, beispielsweise durch Ausfällen mit Alkohol oder durch Gefrieren und Auftauen. Dieses denaturierte Fibrinogen beeinträchtigt die Filtration des Faktors VIII, verursacht erhebliche Verluste des Faktors VIII während der Reinlgungsschrltte und vermindert die Löslichkeit des gefriergetrockneten Produkts in der für die Herstellung einer Lösung eingesetzten Flüssigkeit. Somit muß ein zufriedenstellendes Verfahren zur Reinigung des Faktors VIII in der Lage sein, erhebliche Mengen Fibrinogen zu entfernen. Die oben beschriebenen Verfahren zum selektiven Ausfällen sind für diesen Zweck entwickelt worden, besitzen jedoch den Nachteil, daß sie entweder das Fibrinogen und den Faktor VIII denaturieren oder unerwünschte Verluste des Faktors VIII verursachen.

Die Verfahren, bei denen lediglich eine Ausfällung In der Kälte ohne die Anwendung von chemischen Produkten durchgeführt wird (Kryopräzlpltation), sind auf die Bildung geringer Mengen des Faktors VIII beschränkt, werden üblicherweise in Blutbanken durchgeführt und führen bei der therapeutischen Anwendung der Produkte zu hohen Fibrinogensplegeln im Blut, einer Tatsache, die von gewissen Fachleuten als unerwünscht angesehen wird.

Die Verfahrensweisen, bei denen der Faktor VIII mit Hilfe von Puffern mit geringer Ionenstärke aus dem Kryopräzlpltat extrahiert wird, ergeben, obwohl sie zu einer gewissen Erniedrigung des Flbrlnogengehalts des Endprodukts führen, Produkte mit einem noch unerwünscht hohen Proteingehalt, erfordern die Anwendung spezieller Vorrichtungen und Verfahrenswelsen zum Zentrifugleren und sind In der Gesamtmenge, In der der Faktor VIII, ohne die Reinheit zu beeinträchtigen, aus dem Kryopräzipitat extrahiert werden kann, beschränkt.

Weitere Probleme, die Üblicherwelse bei der großtechnischen Herstellung des Faktors VIII auftreten, sind insbesondere die Verunreinigung des Endprodukts durch pyrogene Substanzen, Isohämagglutinine und Hepatitis verursachende Viren (mit Hepatitis verbundenes Antigen, HAA). Gewisse chemische Ausfällungsmittel begünstigen die Anwesenheit dieser unerwünschten Verunreinigungen. Derzeit wird Polyäthylenglykol ganz allgemein zur Herstellung von Konzentraten des Faktors VIII mit großer Reinheit verwendet. Diese Methoden wenden jedoch so hohe Polymerkonzentrationen an, daß zusätzliche Wasch- und Ausfällungsstufen erforderlich sind, um aus dem Endprodukt die überschüssigen Mengen des Polyäthylenglykols zu beseitigen. Diese Verfahren führen daher zu weiteren unerwünschten Verlusten des Faktors VIII. In diesem Zusammenhang sei auf die folgenden Literaturstellen hingewiesen: M. Wlckerhauser »Large-scale fractionation of Factor VIII - Concentrate from cryoethanol precipitate« (Literaturstelle 1); E. Shanbrom und L. Fekete »Production of stable high-potency human AHF using polyethylene glycol and glycine to fractionate a cryoprecipitate of AHF concentrate«, US-PS

36 31 018 (Literaturstelle 2); J. T. Sgourls und M. Wlckerhauser »Use of frozen cryoprecipitate for the prepara- B

tion of clinical Factor VIII concentrate«, Transfusion 13 (1973) 399 (Literaturstelle 3); Newman, A. J. Johnson, P

M. H. Karpatkln und S. Puszkln »Methods for the production of clinically effective Intermediate and high- n,

purity Factor VIII concentrates«, BrIt. J. Haemat (1971) 211 (Literaturstelle 4); und L. F. Fekete und S. L. Holst

»Stabilization of AHF using Heparin«, US-PS 38 03 115 (Literaturstelle 5). (]

Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, diese Probleme zu überwinden und ein Verfahren bereltzustel- '^

len, das nicht an den Nachtellen leidet, die durch die Verwendung von chemischen Ausfüllungsmitteln auftre- fi

ten, und das In einfacher Welse eine selektive Ausfällung des Flbrlnogens und der davon abgeleiteten denatu- >>

denen und abgebauten Produkte in der Kälte ermöglicht.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Faktors VIII (Antihämophlllefaktor) aus einer Lösung des Plasmas, des Kryopräzipitats oder des zu reinigenden pyrogenen Faktors VIII in einem Citratpuffer, durch Ausfällung mit einem Polyol, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

a) den pH-Wert auf 6,8 bis 7,2,

b) eine Polyolkonzentration von 6 Prozent,

c) die Temperatur auf 0 bis 5° C einstellt,

und be! dieser Temperatur hält, bis die Ausfällung erfolgt, und anschließend den ausgefällten Faktor VIII abtrennt.

Die selektive Ausfällung des Fibrinogens ohne einen damit verbundenen Verlust des Faktors VIII ist bislang in einem in der Praxis durchführbaren Verfahren für die großtechnische Herstellung eines gereinigten Konzentrats des Faktors VIII nicht erreicht worden. In der Tat unterstreicht Wickerhauser die Bedeutung der Begrenzung der Zeitdauer und der Temperatur bei der Extraktion des Faktors VIII, indem er ausführt: »Etwas höhere Ausbeuten an dem Faktor VIII wurden durch längere Extraktion mit Tris-Puffer bei 30° C während mehr als 60 Minuten erzielt, wobei jedoch der Extrakt zunehmend mit Fibrlnogenaggregaten verunreinigt ist, was das Endkohzenirat schlecht filtrierbar macht«.

Ein Verfahren, das zur Herstellung eines hochreinen Konzentrats des Faktors VIII mit hoher Ausbeute die selektive Ausfällung von Fibrinogen bei niedriger Temperatur umfaßt, ist Gegenstand der deutschen Patentanmeldung P 26 36 757.7 vom 14. 8. 1976 von Edward Shanbrom, Inc. mit dem Titel »Verfahren zum Aufkonzentrieren und Reinigen des Antihämophiliefaktors« (Literaturstelle 7). Es ist dort angegeben, daß das Produkt noch weiter gereinigt und aufkonzentriert werden kann, indem man eine Ausfällung mit Polyäthylenglykol in der Kälte durchführt.

Bislang erfordern sämtliche Verfahren zur Herstellung von Konzentraten des Faktors VIII, bei denen Polyäthylenglykol angewandt wird, eine zusätzliche Stufe des Waschens und/oder Ausfällens mit Glycin oder Alkohol, da das Polymere in hohen Konzentrationen (von 10 bis \2%) angewandt wird (wozu auf die genannten Literaturstellen verwiesen sei). In jüngster Zelt wurde vorgeschlagen, die Ausfällung in der Kälte mit Polyäthylenglykol durchzuführen (C. Vermeer, B. A. M. Soute und H. G. J. Brummelhuls »Improvement of the preparation of Factor VIII Concentrates«, Proc. of Int. Soc. Haemostasis and Thrombosis, Paris [JuIi 1975] [Literaturstelle 8]). Jedoch beträgt die für die Ausfällung des Fibrinogens angewandte Polyäthylenglykolkonzentration lediglich 2,5%, was zu einem weniger reinen Produkt führt. Weiterhin haben diese Autoren die Proteinkonzentration nicht für bedeutsam erachtat und haben ein Mandelat zugesetzt, um eine irreversible Ausfällung des Fibrinogens zu vermelden, was dazu geführt hat, daß sie ein erheblich weniger reines Produkt in geringeren Ausbeuten erhalten haben. In ähnlicher Weise wendet das Verfahren von Shanbrom und Fekete (siehe die oben erwähnte Literaturstelle 2) während der Ausfällung mit Polyäthylenglykol eine relativ geringe Proteinkonzentration an, das heißt ein Volumen des Niederschlags in 10 Volumen des zur Bildung der Lösung verwendeten Puffers; hierdurch wird wiederum sine sehr geringe Ausbeute und eine schlechte Reinheit verursacht. Diese Autoren haben ebenso wie Johnson et al (Literaturstelle 4) und Johnson et al »Antlhemophilic factor prepared from blood plasma using polyethylene glycol«, US-PS 36 52 530 (Literaturstelle 6) für das letztendliche Aufkonzentrleren des Faktors VIII 10- bis 12%iges Polyäthylenglykol verwendet, was eine zusätzliche Stufe der Wiederauflösung und des Wiederausfällens mit Glycin oder Äthanol in der Kälte erforderlich macht, um den Polyäthylenglykolgehalt des Endprodukts zu vermindern.

Ein weiterer Beweis, daß die Konzentration der Proteine und die Ausfällung mit Polyäthylenglykol in der Kälte von Bedeutung sind und zu einem geeigneten Produkt führen, 1st in der Tatsache zu sehen, daß die »unvollständigen« Isohämagglutinlne (Antikörper) praktisch vollständig beseitigt werden, wodurch das Risiko von hämolytlschen Reaktionen vermieden werden kann, das dann auftritt, wenn massive Injektionen von derzeit im Handel erhältlichen Konzentraten notwendig sind (siehe R. A. Seeler, M. Telischi, P. L. Langehennlg und J. B. Ashenhurst »Anti-A und Antl-B tiers in coagulation concentrates«, Abst. of Int. Soc. of Blood Transf. Helsinki [1875] Literaturstelle 9). so

Ein weiteres Kennzeichen des erfindungsgemäßen Produkts 1st sein hoher Reinheitsgrad (das heißt sein geringer Proteingehalt), insbesondere was die Menge des meßbaren Fibrinogens anbelangt. Dieser hohe Reinheitsgrad führt zu einem sehr gut löslichen Produkt, das in der Tat so gut löslich Ist, daß nach der Auflösung in dem Fläschchen kein ungelöstes Material verbleibt. Hierdurch wird die Notwendigkeit der Verwendung eines Spezlalfilters oder einer Filtriernadel vermieden, die dazu dienen, das nichtgelöste Protein vor dem Injizieren des Materials In den Patienten zu beseitigen. In dieser Welse wird die Verunreinigung des Konzentrats des Faktors VIII durch metallische Teilchen vermieden (I. A. Couper, J. H. McAdam, M. S. MacKenzle und J. F. Davidson »Contamination of Factor VIII Concentrates with metal particles«. Lancet [21. Dezember 1974], Seite 1515 [Literaturstelle 10]).

Das erfindungsgemäße Verfahren oder ein Teil davon kann auch zur »erneuten Behandlung« von pyrogenen Chargen von Konzentraten des Faktors VIII dienen, die mit Hilfe irgendeines anderen Verfahrens bereitet sind, wodurch der pyrogene und kostspielige, jedoch nicht verwendbare Faktor VIII in ein wertvolles, therapeutisch anwendbares Mittel umgewandelt wird. Das erneut behandelte Produkt wird entweder in einer einzigen Stufe der Ausfällung in der Kälte mit 6%lgem Polyäthylenglykol oder mit Hilfe eines Im folgenden genauer erläuterten zweistufigen Verfahrens von den pyrogenen Materlallen befreit.

Die erfindungsgemäß erreichten unerwarteten und stark verbesserten Ergebnisse stehen Im Gegensatz zu den Lehren und Vorschlägen des Standes der Technik und wurden eher zufällig als durch systematische Forschuneen Befunden.

Die Erfindung betrifft - wie bereits ausgeführt wurde - ein spezifisches Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Faktors VIII mit sehr hoher Reinheit, welches Verfahren in großem Maßstab durchgeführt werden kann. Die wesentlichsten Maßnahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Entfernung unerwünschter Proteine, wie der Isohämag*lutlnine, und das Aufkonzentrieren des Faktors VIII in einer einzigen Stufe durch eine Ausfällung in der Kälte mit einem Poiyol, ohne daß dabei eine unerwünschte Verminderung der Aktivität des Faktors VIII verursacht wird, sowie gegebenenfalls die selektive Ausfällung der überschüssigen Flbrinogenmengen und der davon abgeleiteten Denaturierungs- und Abbau-Produkte. Ein weiteres bemerkenswertes Merkmal ist die erstaunlich hohe Ausbeute von etwa 20 bis 40%, bezogen auf die eingesetzte, im Plasma theoretisch vorhandene Menge, in der der Faktor VEI erhalten wird. Weiterhin und trotz der erhöhten Ausbeute des Faktors VIII ist der Prcteingehalt im Vergleich zu anderen Produkten in unerwarteter Weise vermindert, insbesondere was den Flbrmogengehalt anbelangt. Diese Tatsache wird durch die folgende Tabelle I verdeutlicht. Das Bedürfnis für eine erhöhte Ausbeute an einem gefriergetrockneten Konzentrat des Faktors VIII mit großer Reinheit ist allgemein anerkannt und von weltweiter Bedeutung. Hierzu sei auf »Recent Advances in Hemophilia«, Ann. N. Y. Acad. Sei. (1975) 240 (Literaturstelle 11); J. G. Pool »Recent chapters in the Factor VIII saga: perils of a protein«, West. J. of Med. 122 (1975) 406 (Literaturstelle 12) verwiesen. Es ist allgemein anerkannt, daß die handelsäblichen Konzentrate im allgemeinen weniger als 2096 des theoretisch in dem Plasma vorhandenen Faktors VIII ergeben, wobei die Ausbeuten im Fall von hochgereinigten Produkten noch geringer sind (Literaturstelle 11, Seiten 156 und 208 und Literaturstellen 5 und 8).

Die Angaben der folgenden Tabelle I sind abgesehen von den erfindungsgemäßen Ergebnissen, dem Artikel von Robert Breckenridge »Recent advances in hemophilia«, Ann. N. Y. Acad. of Science (1975) 240, entnommen.

Tabelle I

Eigenschaften der Konzentrate des Faktors VIII^a)

	Produkt	Einheiten	verab	Gesamt	Gesamt-	Gesamt -	Gesaml-	Gesamt-	Gesamt	Quellen
		des Fak	reichtes	einheiten	Fibrlno-	Protein	Natrlum-	Chlorld-	kosten
		tors	Gesamt	des Fak	gengehalt	gehalt	gehalt	gehalt	($)
3(1		Vlll/ml	volumen	tors VIII	(g)	(g)	(mÄq)	(mÄq)
			(ml)
	Frisches,	0,5	8000	4000	8,0	240	1200	800	480	Blutbank
	gefrorenes
.15	Plasma
	Kryoprä-	10 ^b»	400	4000	4,0	20	40	40	400	Blutbank
	zipität
	Faktor VIII	10	400	4000	0,8	14	96	80	480	Armor
										Pharma
40										ceutical
	AHF	10	400	4000	C)	20	80	48	480	Abbot
										Laboratory
	Hämophille-	25	160	4000	1,0	5,6	25	20	528	Hyland
•45	faktor
	AHF	10	400	4000		6,0				d)
	AHF	10	400	4000		2,0				e)

^a) Diese Zahlen basleren auf den Erfahrungen des Hemophilia Center of Rochester and Monroe County und sind als Gesamtmenge ausgedrückt, die erforderlich Ist, einen Patienten mit einem Gewicht von 70 kg mit einer Einheit pro Milliliter zu behandeln. Es wird dabei von einer In vlvo-Ausnutzung von 80% ausgegangen.

^b) Variabel, jedoch üblicherweise zwischen 7 bis 12 u/ml.

^c) Wegen einer Ausfällung bei 37° C Ist die Bes.lmmung des Flbrlnogens nicht möglich.

^d) Produkt der deutschen Patentanmeldung P 26 36 757.7.

^e) Produkt erhalten durch Ausfällung In der Kälte mit einem Poiyol gemäß der vorliegenden Erfindung.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren, das dadurch gekennzeichnet 1st, daß man In einer Lösung des Faktors VIII den Proteingehalt auf 1 bis 3 Prozent einstellt, zuerst etwa 4 Prozent des Polyols zusetzt, den Niederschlag von der Lösung abtrennt, dann die Polyolkonzentration auf 6 Prozent steigert und diese Lösung bei einer Temperatur von 0 bis 5° C hält, bis die Ausfällung des Faktors VIII erfolgt.

Gemäß weiteren bevorzugten Ausführungsformen wendet man die folgenden Maßnahmen getrennt oder In Kombination an:

Man verwendet als Quelle für den Faktor VIII ein Kryopräzipltat, das In etwa der zweifachen bis der vierfachen Volumenmenge eines Puffers gelöst Ist;

man arbeitet bei einem Volumenverhältnis von Kryopräzipltat zu Puffer von etwa 1 : 3;
man wendet das Verfahren an, das weitere Schritte umfaßt, die darin bestehen, daß man den ausgefällten

Faktor VIII erneut In einem Puffer löst, die erhaltene Lösung während etwa 12 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 0,5 bis 5° C hält und anschließend das aus der Lösung abgeschiedene tellchenförmlge Material abtrennt, so daß man einen Faktor VIII erhält, der praktisch frei Ist von Fibrinogen, Fibrlnogenfragmenten und Komplexen davon;

als geeignete Polyole kann man Polyäthylenglykole, Insbesondere Polyäthylenglykol 4000 und a-Hydroxygrup- s pen und ω-Hydroxygruppen aufweisende Copolymere der Sequenz Poly(oxyäthylen)-poly(oxypropylen)-poly(oxyäthylen) verwenden. Als Sequenzcopolymere kann man Insbesondere die unter der Bezeichnung Pluronic® von der Firma Wyandotte Chemicals und Uglne-Kuhlmann erhältlichen Produkte nennen, Insbesondere das Produkt Pluronic® F 68, bei dem es sich um ein Copolymeres mit den folgenden Eigenschaften handelt: Molekulargewicht der Poly(oxypropylen)-Gruppe: Etwa 1750; Poly(oxyäthylen)-Gehalt etwa 80 Gew-%; die zuvor durchgeführte Flbrinogenausfällung In Gegenwart von 4% des Polyols erfolgt vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,0 bis 6,5 und bei einer Temperatur von etwa 20 bis 30° C.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens gelingt es insbesondere, die pyrogenen Anteile einer Lösung des Faktors VIII in einem Puffer zu beseitigen. Dieses Verfahren 1st insbesondere durch die Tatsache gekennzeichnet, daß man der Lösung etwa 6% eines Polyols zusetzt und die erhaltene Lösung auf eine Temperatur von etwa 0 bis 5° C kühlt, um den Faktor VIII auszufällen, wobei das pyrogene Material in der Lösung verbleibt. Dieses Verfahren kann vorzugsweise wie folgt durchgeführt werden:

Man versetzt die Lösung des Faktors VIII in der Pufferlösung mit etwa 4% des Polyols, trennt den Niederschlag von der Lösung ab, gibt 2% des Polyols zu und hält die Lösung bei einer Temperatur von 0 bis 5° C, bis die Ausfällung des Faktors VIII erfolgt; vorzugsweise enthält die zu reinigende Lösung etwa 1 bis 3%, insbesondere 2 bis 3% Protein;
das Verfahren umfaßt vorzugsweise die folgenden Schritte, die darin bestehen, den ausgefällten Faktor VIII In einem Citratpuffer zu lösen, die erhaltene Lösung während einer Zeltdauer von etwa 12 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von etwa 0,5 bis 5° C zu halten und anschließend das In der Lösung gebildete tellchenförmlge Material abzutrennen, um den Faktor VIII zu gewinnen, der praktisch frei ist von Fibrinogen, Flbrinogenfragmenten und Komplexen davon.

Gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine Lösung von etwa 1 Teil einer Blutfraktion, die den Faktor VIII enthält und durch Kryopräzipitatlon von Plasma erhalten worden ist, in etwa 3 Teilen Citratpuffer, der etwa 6% Polyol enthält, bei einer Temperatur von etwa 0 bis 5° C gehalten, um die Ausfällung des Faktors VIII aus der Lösung zu verursachen, und den Faktor VIII erneut In dem Puffer gelöst, um eine Lösung des Faktors VIII mit sehr großer Reinheit zu erhalten.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Man taut gefrorenes Plasma in einer Menge von beispielsweise 100 bis 3000 1 von etwa -5° C auf etwa +2° C auf und bringt das Material in einen geeigneten Behälter ein. Größere Volumina können ebenfalls verarbeitet werden, erschweren jedoch die Verfahrensmaßnahmen. Die in der Kälte unlösliche Fraktion (Kryopräzipitat) wird bei einer Temperatur von weniger als 3° C abgetrennt, vorzugsweise unter Anwendung von kontinuierlich betriebenen Zentrifugen (Sharpless oder ähnliche Zentrifugen). Man kann das Material auch mit anderen Methoden gewinnen, die jedoch weniger wirksam sind. Das Kryopräzipitat wird gewogen, in kleine Teilchen zerschnitten oder in einer Mischeinrichtung (des Typs Waring) während einiger Sekunden vermischt, um einen Brei oder eine Emulsion zu bilden. Die Kryopräzipltatteilchen oder dieser Brei werden dann bei einer Temperatur von 20 bis 30° C in 2 bis 4 Volumen eines Puffers gelöst, der 0,02 Mol/l Trlnatriumcitrat und 0,1 Mol/l Glycin enthält und mit Zitronensäure auf einen pH-Wert von 6,9 eingestellt ist. Nach der vollständigen Auflösung fällt man das Fibrinogen selektiv bei einem pH-Wert von 6,0 bis 6,5 und bei einer Temperatur von etwa 25° C durch Zugabe von 4% Polyäthylenglykol 4000 oder Pluronic® F-68 aus. Man zentrifugiert den Niederschlag In einer kontinuierlich betriebenen Zentrifuge (Sharpless) ab und stellt die überstehende Flüssigkeit auf einen pH-Wert von 6,8 bis 7,2 ein. Dann gibt man eine zusätzliche Menge von 296 Polyäthylenglykol oder Pluronic® F-68 zu und kshli die Suspension auf 0 bis 5° C, bis eine sichtbare Ausfällung erreicht 1st.

Für sämtliche Stufen der Auflösung und der Ausfällung wendet man ein Reaktionsgefäß mit doppelter Wandung an und rührt ständig, wobei man die Schaumbildung vermeidet.

An die zweite Stufe der Ausfällung schließt sich das kontinuierlich durchgeführte Zentrifugleren bei 1 bis T C an, wobei die überstehende Flüssigkeit abgetrennt wird. Anschließend lößt man den Niederschlag In einem Glycin-citrat-Puffer oder einem Citrat-Puffer, wobei das Volumen des Puffers von der Qualität des Kryopräzipitats und der Anzahl der Faktor VIII-Elnheiten abhängt, die in der Ausgangslösung vorhanden sind. Die beiden Verfahren zur Errechnung dieses Volumens sind die folgenden:

1. Man löst den Endniederschlag in einem Puffervolumen, das gleich 1st einem Hundertstel des Volumens des ursprünglichen Plasmas.

2. Man löst den Endniederschlag in einem Puffervolumen, das gleich ist dem 15- bis 25fachen des Gewichts des Niederschlags.

Die Lösung wird dann mit Zitronensäure auf einen pH-Wert von 6,7 bis 6,9 eingestellt, geklärt und anschlleßend sterilisiert, indem man die Lösung über Membranfilter mit Mlkroporen führt (Höhe der Filter = 293 mm oder entsprechende Patronenfilter), die beispielsweise Poren mit einem Durchmesser von 1,2, 0,65, 0,45 oder 0.3 um aufweisen. Die erhaltene sterile Lösung, die etwa 20 bis 40% des in dem als Ausgangsmaterial eingesetz-'

ten Plasma enthaltenen Faktors VIII enthält, wird in üblicher Welse zur Lagerung gefriergetrocknet.

Man kann das Verfahren auch abwandeln, Insbesondere durch die Anwendung von erneut gefrorenem Kryopräzlpltät oder Varianten der Cohn-Fraktlon I, obwohl In diesem Fall die Ausbeute an dem Faktor VIII geringer Ist und von seiner Konzentration In dem Ausgangsmaterial abhängt. Die Lösung oder Anfangsextraktion des Faktors VIII kann In destilliertem Wasser oder In Puffern mit geringer Ionenstärke, wie Trls-Puffer erfolgen. Die Abkühizelt kann ebenfalls, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen, variiert werden und entweder erhöht werden oder stufenweise angewandt werden. In ähnlicher Weise kann man die Extraktionszelt bei dem beschriebenen Verfahren auf bis zu 24 Stunden verlängern. Schließlich kann das Verfahren an Irgendeiner beliebigen Stufe unterbrochen und am nächsten Tag weitergeführt werden. Alle diese Abänderungen können eine

ίο gewisse Verminderung der Gesamtausbeute des Faktors VIII, bezogen auf das Ausgangsplasma, mit sich bringen.

Beispiel 2

Bei dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren kann man auch pyrogene Chargen des Konzentrats des Faktors VIII mit niiiiierer Reinheit verwenden, die man mit Hilfe irgendwelcher anderer Verfahren erhalten hat, beispielsweise durch Extraktion mit einem Puffer mit geringer Ionenstärke, durch Ausfällen mit Glycin, durch Ausfällen mit Polyäthylenglykol etc. Das gefriergetrocknete Material wird mit pyrogenfreiem Wasser gelöst, das in einer solchen Menge eingesetzt wird, daß sich ein Proteingehalt von 1 bis 3 G ergibt. Dann vereinigt man die gelösten Materialien In einem Behälter und unterzieht sie erneut den Behandlungsschritten, die in Beispiel 1 angegeben sind.

Wenn der Gehalt der Ausgangsmaterialien an pyrogenen Materialien nur gering 1st und das Produkt bereits eine hohe Reinheit besitzt, kann eine einzige Ausfällungsstufe genügen. Dazu wird das Material in der oben beschriebenen Welse gelöst, mit 6% Polyäthylenglyko! bei einem pH-Wert von 6,8 bis 7,2 versetzt und bei einer Temperatur von 0 bis 5° C gehalten. Anschließend wird der gebildete Niederschlag in der oben beschriebenen Weise behandelt, wobei die die pyrogenen Materialien enthaltende überstehende Flüssigkeit verworfen wird.

Beispiel 3

Man führt die Verfahrensweise des Beispiels 1 durch. Vor der Durchführung der endgültigen Filtration bringt man das Produkt jedoch In eine Kühlkammer (0,5 bis 5° C) ein und läßt es dort während 12 bis 24 Stunden stehen. Das nach dieser Zeitdauer ausgeflockte weiße Material wird durch Dekantieren, Zentrifugieren oder Vorfiltration entfernt. Das Endprodukt wird in der oben beschriebenen Weise durch Filtration sterilisiert und den gleichen Gefriergetrocknungsmaßnahmen unterworfen. Dieses Produkt ist noch reiner als die oben beschriebenen Produkte und kann daher noch leichter filtriert werden. Durch diese zusätzliche Stufe erfolgt kein Verlust des Faktors VIII.

Die erhaltenen Produkte können während einer längeren Zeit von 1 bis 2 Jahren bei einer Temperatur von +5° C gelagert werden und können dann in destilliertem Wasser oder physiologischem Serum aufgelöst werden. Aufgrund seiner sehr hohen Reinheit und seinem sehr geringen Fibrinogengehalt läßt sich das gefriergetrocknete Produkt sehr schnell auflösen (1 bis 2 Minuten). Da die Gesamtbehandlungsdauer im Vergleich zu anderen Herstellungsverfahren von dem Augenblick an, wo die Plasmabehälter geöffnet werden, sehr kurz ist, ist die Verunreinigung mit Bakterien stark eingeschränkt. Da die anfängliche Auflösung nur In geringen Mengen des Puffers erfolgt, wird die Menge, in der y-Globuline in die Lösung eindringen können, auf einem Minimum gehalten. Weiterhin wird die optimale Ausfällung des überschüssigen Fibrinogens dadurch erreicht, daß man eine Polyolkonzentration von 496 anwendet. Weiterhin schließt der flockige, schwere Fibrlnogenniederschlag offenbar das vorhandene pyrogene Material ein und vermindert die Mengen des mit Hepatitis verbundenen Antigens (HAA oder Hepatitisvirus). Da man in der Stufe der Ausfällung in der Kälte nur 6% des Polyols verwendet, werden die unerwünschten Proteine, insbesondere die Isohämagglutinine, die sich selbst In den sehr geringen Puffervolumina gelöst haben können, nicht zusammen mit dem Faktor Vm ausgefällt und werden als überstehende Flüssigkeit beseitigt. In dieser Welse erhält man ein in bezug auf das Plasma um den Faktor 200 bis 400 gereinigtes Produkt, das sehr wenig Fibrinogen und Isohämagglutinine enthält. Die Konzentrate des Faktors VIII, die mit größeren Volumina des für die Extraktion verwendeten Puffers hergestellt sind, beispielsweise 10 Volumina (Literaturstelle 2), besitzen nicht den gleichen Reinheitsgrad oder ergeben nicht die gleiche Ausbeute an dem Faktor VIII (Literaturstellen 1, 2, 3, 4 und 8), was offenbar eine Folge der Tatsache ist, daß das tür die Copräzipitation optimale Verhältnis von Protein zu Polymerem nicht erreicht wird. Gewflnschtenfalls kann dieses Produkt unter Anwendung üblicher Verfahren oder mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens weiter gereinigt und aufkonzentriert werden. Ein erheblicher Vorteil der Erfindung beruht auf der Tatsache, daß man den Faktor VTII mit sehr großer Reinheit in großem Maßstab In der Hälfte oder zwei Dritteln der Zelt herstellen kann, die für andere Verfahren erforderlich ist.

Die obigen Beispiele verdeutlichen optimale Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens. Es versteht sich jedoch, daß das erfindungsgemäße Verfahren unter Anwendung üblicher Behandlungstechniken und üblicher Materlallen durchgeführt werden kann. Beispielsweise kann man, wenn es Im allgemeinen auch nicht wirtschaftlich Ist, von weniger als etwa 1001 Plasma oder der dieser Plasmamenge entsprechenden Menge des Kryopräzipltats auszugehen, auch größere oder geringere Volumina als.die In den Beispielen angegebenen verwenden, beispielsweise 50» oder dergleichen, ohne daß dadurch die Vorteile der Erfindung nicht erreicht würden. Die in den Beispielen erläuterten optimalen Verfahrenswelsen werden unter Verwendung bekannter und leicht verfügbarer Vorrichtungen durchgeführt, beispielsweise einer Zentrifuge (Sharpless), einer Mischeinrichtung (Waring) etc; es Ist jedoch ersichtlich, daß neben der erfindungsgemäßen Verfahrenswelse die dazu

einzusetzenden Vorrichtungen nicht wesentlich sind und der Fachmann ohne weiteres dazu In der Lage ist, geeignete Vorrichtungen zur Durchführung des beanspruchten Verfahrens auszuwählen.

Nachdem man die den Faktor VIII enthaltende Lösung mit guter Ausbeute erhalten hat, bereitet man sie in üblicher Welse für die Lagerung und die Wiederherstellung vor. Beispielsweise wird sie geklärt, durch Filtration über übliche Filter mit Mlkroporen sterilisiert, zum Aufkonzentrieren des Faktors VIII auf ein geringes, leicht lagerfähiges Volumen gefriergetrocknet und wieder In die Form einer Lösung gebracht, indem man geeignete Flüssigkeiten verwendet, beispielsweise pyrogenfreles destilliertes Wasser oder physiologisches Serum.

Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Produkt zeichnet sich gegenüber den herkömmlichen Konzentraten des Faktors VIII durch folgende Eigenschaften aus:

1. Es besitzt eine größere Reinheit und damit eine höhere »spezifische Aktivität«;

2. es Ist besser löslich, was die Geschwindigkeit der Auflösung und die Endlösllchkeit anbelangt, so daß das Material für die Behandlung in Notfällen besonders gut geeignet ist;

3. es besitzt einen geringeren Proteingehalt, wodurch die unerwünschten Nebenreaktionen vermindert werden;

4. es besitzt einen gegingeren Gehalt an Immunoglobullnen, wodurch allergische Reaktionen vermindert werden;

5. es weist einen vernachlässigbaren Gehalt an Isohämagglutininen auf, wodurch hämolytische Reaktionen vermieden werden;

6. es besitzt einen geringeren Fibrlnogengehalt. wodurch die Gefahr von Komplikationen durch eine Hyperflbrlnogenämle verringert wird;

7. es sind keinerlei Filtrationsnadeln erforderlich, so daß das Risiko des Vorhandenseins von Fremdkörpern beseitigt wird; und

8. durch die Entfernung der pyrogenen Materialien während des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Faktor VIII therapeutisch anwendbar gemacht.

Beispiel A

696 g teilweise gereinigter Faktor VIII mit einem Gehalt an Pyrogenen wird in 16 Liter destilliertem Wasser gelöst. Der als Ausgangsprodukt verwendete Faktor VIII enthält 350 g Gesamtproteine und 529 426 μ (inteinationale Einheiten) an Faktor VIII, d. h. 1512 μ/g (1512 Einheiten pro 1 g des Gesamtproteins). Die Lösung wird durch Zugabe von 13 ml einer Natrlumcarbonatlösung auf den pH-Wert 6,9 eingestellt. Sodann wird Polyäthylenglykol 4000 bis zu einer Konzentration von 6 Prozent zugesetzt. Die Lösung wird auf +2° abgekühlt und 30 Minuten bei dieser Temperatur belassen. Sodann wird abzentrifuglert. Man erhält 436 g Niederschlag, der wieder in Citratpuffer gelöst wird. Nach Sterilfiltration durch eine Membrane erhält man 16 Liter einer Lösung mit einem Gehalt an 20,6 μ/ml, d. h. insgesamt 329 600 Einheiten des Faktors VIII. Diese Lösung wird den üblichen Untersuchungen zum Nachweis, daß keine Pyrogene enthalten sind, unterzogen.

Die erhaltene Lösung enthält 170,6 g Gesamtprotein. Die Ausbeute an Faktor VIII beträgt somit 62 Prozent, während die Ausbeute an Gesamtprotein 49 Prozent beträgt, was bedeutet, daß eine wesentliche Anreicherung ' in bezug auf Faktor Viii stattgefunden hat. Dieses Beispiel zeigt, daß sich durch eine einzige Behandlung mit Polyäthylenglykol eine Verringerung des Gesamtproteingehalts verbunden mit einer Beseitigung von Pyrogenen erzielen läßt.

Beispiele B bis D

In diesen Beispielen wird als Ausgangsprodukt ein Kryopräzipität verwendet.

Die Ausgangslösung wird einer Vorbehandlung durch Zusatz von 2 Prozent Polyäthylenglykol unterzogen. Der gebildete Niederschlag wird durch Zentrifugieren entfernt. Sodann wird der Überstand auf eine Polyäthylenkonzentration von 6 Prozent eingestellt. Der gebildete Niederschlag wird abzentrifugiert und im Hinblick auf eine spätere Lyophilisation in Citratpuffer gelöst.

In der nachstehenden Tabelle finden sich nähere Angaben bezüglich der Ausgangs-, Zwischen- und Endpro-

Betspiele B

1. Herstellung der Ausgangslösung Gewicht des Kryopräzipitats Volumen der Cltratpufferlösung Gesamtvolumen

Angaben über die Ausgangslösung: Faktor vm Proteine

Fibrinogen (Mittelwert) Spezifische Aktivität pro g Gesamtprotein

224 g 672 ml 889 ml

10,6 u/ml 29,37 g/l 19,5 g/l 362 u

164 g 492 ml 671 ml

10 u/ml 29 g/l 24,5 g/l 34Ou

487 g 1461 ml 1907 ml

12.4 u/ml 31 g/l

21.5 g/l 394 u

Fortsetzung

Beispiele BCD

6,9	C	6,9	6,9
+2°	ml	+2⁰C	+2° C
740		570 ml	1730 ml
5g	6,5 g	14 g

2. Erste Fällung mit Polyäthylenglycol (Beseitigung von Verunreinigungen)

Einstellung des pH-Werts auf 6,3 6,3 6,3

Zusatz von Polyäthylenglykol 296 2% 2%

,ο Einstellung der Temperatur auf +2° C +2° C +2° C

Volumen nach der Zentrlfugation 800 ml 570 ml 1670 ml

Angaben über den Überstand:

Faktor VIII 6,1 u/ml 6,1 u/ml 8 u/ml

Gesamtprotein 7,1 g/l 5,7 g/l 7,4 g/I

Fibrinogen (Mittelwert) 0,9 g/l 0,75 g/l 0,95 g/l

Spezifische Aktivität pro g Gesamtprotein 839 u 1070 u 1081 u

3. Polyäthylenglykolfällung (6%) (Anreicherung von Faktor VIII) Zusatz von Polyäthylenglykol auf 6% Einstellung des pH-Werts auf Temperatur Volumen des Überstands Gewicht des Überstands

4. Herstellung der Lösung für die Lyophilisation

Volumen der Lösung im Puffer 94 ml 93 ml 280 ml

Angaben über die Lösung:

Aktivität an Faktor VIII Gesamtprotein Fibrinogen Spezifische Aktivität pro g Gssamtprotein Gewicht des Fibrinogens (mg) pro 1000 u Faktor VIII

40,5 u/ml	28 u/ml	24,7 u/ml
9,25 g/l	7,25 g/l	5,95 g/l
3,8 g/l	2,5 g/l	2,7 g/l
4324 u	386Ou	4151 u
93,8	89,2	109

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung eines Konzentrats des Faktors VIII (Antlhämophillefaktor) aus einer Lösung des Plasmas, des Kryopräzlpitats oder des zu reinigenden pyrogenen Faktors VIII in einem Citratpuffer, durch Ausfällung mit einem Polyol, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) den pH-Wert auf 6,8 bis 7,2,

b) eine Polyolkonzentration von 6 Prozent,

c) die Temperatur auf 0 bis 5° C einstellt,

und bei dieser Temperatur hält, bis die Ausfällung erfolgt, und anschließend den ausgefällten Faktor VIII abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in einer Lösung des Faktors VIII den Proteingehalt auf 1 bis 3 Prozent einstellt, zuerst etwa 4 Prozent des Polyols zusetzt, den Niederschlag von der Lösung abtrennt, dann die Polyolkonzentration auf 6 Prozent steigert und diese Lösung bei einer Temperatur von 0 bis 5° C hält, bis die Ausfällung des Faktors VIII erfolgt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den ausgefällten Faktor VIII im Puffer löst, die erhaltene Lösung während 12 bis 24 Stunden bei einer Temperatur von 0,5 bis 5° C hält und anschließend das in der Lösung gebildete teilchenförmige Material abtrennt.