DE2428982A1 - Verfahren zur herstellung einer blutfraktion - Google Patents
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Description
PATENTANWÄLTE Dlpl.-lng. P. WIRTH · Dr. V. SCH MI ED-K OWARZ! K
Dipl.-Ing. G. DANNENBERG · Dr. P. WELNHOLD · Dr. D. GUDEL
281134 6 FRANKFUBT AM MAIN
TELEFON (0611)
287014 GH. ESCHENHEJMER STnASSESS
-·-'■■ . . SK/SK -;■- ." . .■ H-390; SJM:gk
Baxter Laboratories, Inc. Morton Grove, 111." 60053 / USA
Verfahren zur Herstellung einer Blutfraktion
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Fraktionierung von Blut. Sie bezieht sich insbesondere auf ein
Verfahren zur Fraktionierung von Cohn Präzipitat IV-4 zur Entfernung
von restlichen Gerinnungsfaktoren.und Lipiden-und zur
Herstellung eines an Albumin, Transferrin und anderen s<- und
ß-Glo.bulinen reichen Konzentrates, das zur intravenösen Verabreichung
geeignet ist.
Cohn Präzipitat IV-4 ist eine Fraktion des Blutes, die man in
der Hauptfraktionierung von Plasma nach Verfahren 6 von Cohn J.Am.Chem.Soc., Bd. 68, Seite 459-75 (1946); Eneycl. of Chem.
Techn. Bd. 3, Seite.584-88 (2. Auflage 1964), erhält.
Cohn Präzipitat IV-4 besteht hauptsächlich aus Albumin zusammen
mit etwa χ- und ß-Globulinen. Weiterhin finden sich in dieser
Fraktion die Esteraseaktivität von Plasma und ein Teil des Hvpertensino.gens und Transferrins der Globuline ο Außerdem sind
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darin bestimmte Mengen restlicher Gerinnungs-faktoren (hauptsächlich Prothrombin) und von Lipiden anwesend.
Cohn Präzipitat IV-4 findet als Streckmittel des Plasmavolumens ('plasma volume expander") Verwendung. Für eine solche Verwendung
ist es zweckmäßig, daß das Produkt von Ge rinnung s faktor en unc'.
Lipiden frei und an Albumin reich ist.
*
Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zum Fraktionieren von Cohn Präzipitat IV-4 zwecks Entfernung von restlichen Gerinnungsfaktoreri und Lipiden und zur Herstellung eines an Albumin, Transferrin und anderen c<~ und ß-Globulinen reichen Konzentrates, das zur intravenösen Verabreichung geeignet ist..
Ziel der vorliegenden Erfindung ist daher die Schaffung eines Verfahrens zum Fraktionieren von Cohn Präzipitat IV-4 zwecks Entfernung von restlichen Gerinnungsfaktoreri und Lipiden und zur Herstellung eines an Albumin, Transferrin und anderen c<~ und ß-Globulinen reichen Konzentrates, das zur intravenösen Verabreichung geeignet ist..
Erfindungsgemäß werden die restlichen Gerinnungsfraktoren und
Lipide von Cohn Präzipitat IV-4 durch Adsorption mit Calciuraphosphat
und Fibrinogen entfernt, worauf das Produkt weiter durch Ausfällung mit bestimmten Blockmischpolymerisaten, die
Äthylenoxid-Propylenglykol-Koiidensationsprodukte sind, konzentriert
wird.
Zur leichteren Entfernung von Gerinnungsfaktoren und Lipiden aus dem Cohn Präzipitat IY-4 ist es zweckmäßig, das Ausgangsmaterial
in wässriger Lösung, vorzugsweise normaler physiologischer Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) auf eine Konzentration von etwa 1-2 %
Protein zu suspendieren.
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Die Adsorption mit Calciumphosphat erfolgt durch Einstellung des pH-Wertes des erneut suspendierten Cohn IV-4 Präzipitates auf
etwa 6,5-7,5. und gründliches Mischen mit etwa 0,5-2 % Calciumphosphat.
Das bevorzugte Calciumphosphat ist Tricalciumphosphat der Formel C:uo(OH)2(PO^)g, Der erhaltene Niederschlag wird von
der Mischung, z.B. durch Zentrifugieren, abgetrennt und verworfen.
Dann wird der zurückgehaltenen überstehenden Flüssigkeit Fibrinogen auf eine Konzentration von etwa 0,05-0,2 % zugefügt
und gründlich in die Suspension eingemischt. Anschließend wird die erhaltene Mischung zur Fraktionierung mit den Blockmischpoly-.
merlsäten verwendet. .
Die erfindungsgemäß als Blockmischpolymerisate verwendeten .
Äthylenoxid-Propylenglykol-Kondensationsprodukte können durch
Kondensieren von Äthylenoxid mit einem Polyoxypropylenpolymerisat hergestellt werden. Eine Beschreibung der Herstellung dieser
Blockmischpolymerisate findet sich in der US-Patentschrift 2 674 619. Diese Blockmischpolymerisate können durch die folgende
Formel dargestellt werdenι
HO(CH2CH2O)a(CHCH2O)b(CH2CH2O)cH
Erfindungsgemäß enthalten diese Blockmischpolymerisate zweckmäßig
mindestens 50 % Äthylenoxid im Molekül und haben ein hydrophobes Polyoxypropylengrundmolekulargewicht von mindestens
950. Materialien mit weniger als 50 % Äthylenoxid und Produkte mit einem hydrophoben Grundmolekulargewicht unter 950 haben
nicht die gewünschte Löslichkeit und nicht-toxischen Eigenschaften.
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In dieser Hinsicht sind die erfindungsgemäß verwendeten Blockmischpolymerisate
mit den als Blutplasmaersatz und zum Betrieb von Herz-Lungen-Maschinen der US-Patentschriften 3 450 502,
3 577 522 und 3 590 125 verwendeten Materialien verwandt und.
umfassen dif:se.
Beispiele geeigneter Blockmischpolymerisate sind die "Pluronic" Polyole F-38 und F-68 der Firma Wyandotte Chemicals Corp. F-38
enthält 80 % hydrophile Polyoxyäthyleneinheiten im Molekül, und die hydrophobe Polyoxypropylengrundlage hat ein Molekulargewicht
von 950. F-68 enthält ebenfalls 80 % hydrophile Poloxyäthyleneinheiten
im Molekül, hat jedoch ein hydrophobes Molekulargewicht von 1750. Das Gesamtmolekulargewicht dieser beiden "Pluronic"
Polyole beträgt 4750 bzw. 8750. Eine weitere Beschreibung
dieser Polyole findet sich im Bulletin der Wyandotte Chemicals Corp. "The Pluronic Grid", 6. Auflage, das hiermit in die vorliegende
Anmeldung mit aufgenommen wird.
Die Ausfällung mit den obigen Blockmischpolymerisaten erfolgt
bei zwei unterschiedlichen Konzentrationswerten, jeweils bei unterschiedlichem pH-Wert. Zuerst wird die zur Behandlung mit
Fibrinogen und Calciumphosphat zurückgehaltene Mischung auf
einen pH-Wert von 6-7 eingestellt und gründlich mit dem Blockmischpolymerisat auf eine Konzentration von etwa 13,5-17,5 %
gemischt. Dann wird der erhaltene Niederschlag, z.B. durch Zentrifugieren,
von der Mischung abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit zurückgehalten. Zweitens wird die letztgenannte
überstehende Flüssigkeit gründlich mit dem Blockmischpolymerisat auf eine Endkonzentration von etwa 18-20 % gemischt. Dann
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wird die Suspension auf etwa 3-5-C. abgekühlt, der pH-Wert wird
mit Acetatpuffer (0,8 molares Natriurnacetat, 4n~Essigsäure;
pH = 4) auf-4-5 eingestellt und die Suspension wiederum gründlich
gemischt. Der erhaltene Niederschlag wird z.B. durch Zentrifugieren abgetrennt und als gewünschtes, gereinigtes Cohn
Präzipitat IV-4 zurückgehalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die überstehende Flüssigkeit aus der Behandlung mit Fibrinogen
und Calciumphosphat anfänglich mit dem Blockmischpolymerisat zur Ausfällung von Eininogen bei einer dritten Konzentration
behandelt. Dieses Protein kann Bradykinin freisetzen, das wiederum
bekanntlich ein Absinken des Blutdruckes verursachen kann. Das Kininogen wird durch gründliches Mischen der zurückgehaltenen
überstehenden Flüssigkeit mit dem Blockmischpolymerisat
bei "einer Konzentration von etwa 4-6 % und.einem pH-Wert von etwa
4-5 entfernt. Der erhaltene Niederschlag wird von der Mischung,-z.B.
durch Zentrifugieren, abgetrennt und die überstehende Flüssigkeit zur Behandlung mit dem Blockmischpolymerisat bei
den beiden höheren Konzentrationen wie oben zurückgehalten«
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die vorliegende Erfindung,
ohne sie zu beschränken.
B e i s ρ i e I - 1
B e i s ρ i e I - 1
Eine Cohn Fraktion IV-4 Paste wurde in normaler physiologischer
Kochsalzlösung (0,9 % NaCl) auf eine Konzentration von 1,5- g %
(g/100 ecm) suspendiert, der pH-Wert wurde auf 7 gehalten.
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Es wurde Tricalciumphosphat /JSa1 Q (OH)2 (PO^) g J/ auf eine Konzentration
von 1,5 g % zugefügt und die Suspension1gründlich 60
Minuten bei Zimmertemperatur (etwa 25°C.) gemischt. Dann wurde die Mischung zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Anschließend
vcirde zur zurückgehaltenen überstehenden Flüssigkeit
Fibrinogen auf eine Konzentration von 0,1 g % zugefügt, und es wurde weitere 60 Minuten bei Zimmertemperatur gemisieht. Die
Mischung wurde für die nächste Stufe aufgehoben.
Der pH-Wert der zurückgehaltenen Mischung wurde auf 6,5 eingestellt,
dann wurde "Pluronic" F-38 auf eine Konzentration von
17 g % zugefügt. Die Suspension wurde 1,5 Stunden bei Zimmertemperatur
gemischt und zentrifugiert. Der Niederschlag wurde verworfen, dann wurde "Pluronic" F-38 zur überstehenden Flüssigkeit
zugefügt, um seine Konzentration darin auf 19 g'% zu
erhöhen. Nach 1,5-stündigem Mischen bei Zimmertemperatur wurde
die Suspension auf 40C. abgekühlt. Der pH-Wert wurde mit Acetat- "
puffer (0,8 molares Natriumacetat in 4n-Essigsäure; pH = 4)
■auf 4,5 eingestellt. Es wurde weitere 30 Minuten bei 4°C. gemischt und die Mischung zentrifugiert. Der erhaltene Niederschlag
wurde von der überstehenden Flüssigkeit abgetrennt und in de-st. Wasser auf eine konzentration vpn 4 g % Protein suspendiert;
der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt. Das erneut suspendierte Produkt wurde als gewünschte gereinigte Cohn Fraktion IV-4
zurückgehalten.
Das obige gereinigte Produkt wurde auf einen Elektrolytengehalt von 140 meq Na+, 4,5 meq K+ und 100 meq Cl" pro 1 eingestellt.
Dann wurden 0,004 Mol Natriumcaprylat und 0,004 Mol Acetyl-
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tryptophanat als Stabilisator zugefügt und das Produkt 2 Stunden
auf 60°C. erhitzt, durch Filtrieren durch Asbestbäusche geklärt, steril durch 0,22■■/u "Millipore" Membranfilter filtriert und
weitere .10 Stunden auf 600C. erhitzt.
Das wie oben hergestellte Endprodukt enthielt etwa 50-60 % Albumin,
10-12 %Transferrin und 20-30 % ^- und ß-Globuline. Die
Thrombinaktivität lag unter 0,003 /U pro ecm. Nach Einstellung
auf eine Proteinkonzentration von 4 % hat das Endprodukt eine
Osmolarität ähnlich wie diejenige einer 5~%igen Albuminlösung.
B e i spiel 2
Eine Cohn Fraktion IV-4 Paste wurde in normaler physiologischer
Kochsalzösung auf eine Konzentration von etwa 1-1,5 g % gelöst, dann wurde der pH-Wert auf 7,2 - 0,1 eingestellt. Es wurden
etwa 0,5 g % Tricalciumphosphat zugefügt und die Suspension etwa
30 Minuten bei Zimmertemperatur gemischt. Die Mischung wurde zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag verworfen. Die
zurückgehaltene überstehende Flüssigkeit wurde mit einer Fibrinogenlösung
auf eine Konzentration von etwa 0,05 g % etwa 1-2 Stunden bei Zimmertemperatur gemischt.
Dann wade die Suspension auf 50C. abgekühlt und der pH-Wert mit
1N HCl auf 6,5 eingestellt. "Pluronic" F-38 wurde auf eine Konzentration
von 14 g %' zugefügt und die Suspension etwa 1-2
Stunden bei 5°C. gemischt und zentrifugiert. Der Niederschlag wurde verworfen und die überstehende Flüssigkeit filtriert.
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Das Filtrat wurde auf eine "Pluronic" F-38 Konzentration von
19 g % eingestellt, und der pH-Viert wurde mit Acetatpuffer auf
4,5 + 0,1 eingestellt. Die Suspension wurde 1-2 Stunden gemischt, bei 5°C. zentrifugiert und der erhaltene Niederschlag als gewünschte
gereinigte Cohn Fraktion IV-4 zurückgehalten.
Der obige Niederschlag wurde in dest. Wasser auf eine Konzentration
von 4,0 + 0,3 g % Protein suspendiert; der Elektrolyten-
-JL. ' mm, κ
gehalt (Na , K , Cl ) wurde auf denjenigen von normalem Plasma eingestellt; und der pH-Wert wurde auf 7,2 + 0,2 eingestellt. '
Die Suspension wurde dann 2 Stunden in Anwesenheit von Natriumcaprylat und Acetyltryptophanat als Stabilisator auf 60 C. erhitzt,
durch Filtrieren durch Aöbestbäusche geklärt, steril durch 0,22 /U "Millipore" Membranfilter filtriert und dann v/eitere 10
Stunden auf 60 C. erhitzt. Das Endprodukt wurde in 250 ecm Aliquoten
abgegeben.
Eine Cohn Fraktion IV-4 Paste wurde in normaler physiologischer Kochsalzlösung gelöst, mit Tricalciumphosphat adsorbiert und:
mit Fibrinogen behandelt (vgl. Beispiel 2).
Dann wurde die Suspension mit 1N HCl auf einen pH-Wert von 4,6 gebracht, und es wurde "Pluronic" F-38 auf eine Konzentration
von 5 % zugefügt. Nach 1-stündigem Mischen bei Zimmertemperatur
wurde die Mischung zentrifugiert und der Niederschlag verworfen. Dann wurde die "Pluronic" Polymerisatkonzentration auf 17 %
bei einem pH-Wert von 6,5 eingestellt und die Suspension 1-2
409883/1229
Stunden gemischt. Der durch Zentrifugieren erhaltene Niederschlag
wurde verworfen und die zurückgehaltene überstehende Flüssigkeit
auf eine "Pluronic11 Polymerisatkonzentration von 19 % eingestellt.
Nach 1-stündigem Mischen' wurde die Suspension auf 50C
abgekühlt und der pH-Wert mit Acetatpuffer auf 4,5 + 0,1 eingastellt.Es
wurde eine weitere Stunde gemischt, worauf die Suspension bei 50C zentrifugiert wurde. Der Niederschlag wurde in
dest. Wasser suspendiert, die Elektrolj^tenkonz entr ation wurde
auf diejenige von Plasma eingestellt und das Produkt wie in Beispiel 2 wärmebshandelt. Nach einer in vivo Verabreichung
durch Infusion bei Hunden wurde es'.als frei von kininartiger Wirksamkeit gefunden. Mit diesem Produkt wurde keine Blutdruck
senkende Wirkung festgestellt, was mit einem anderen Produkt, das mit Ausnahme der Behandlung mit dem "Pluronic" Polymerisat "
bei der Konzentration von 5 % gleich war, der Fall war. Bei .-S- ρ i el 4
Die Verfahren von Beispiel 1, 2 und 3 wurden wiederholt, wobei
anstelle von "Pluronic" F-38 eine äquivalente Menge "Pluronic"
F-68 verwendet wurde. Die Ergebnisse waren praktisch gleich.
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Claims (2)
1.- Verfahren zur Herstellung einer Blutfraktion mit hoher Konzentration
von Albumin und öl- und ß-Globulinen, die zur intravenösen
Verabreichung geeignet ist, dadurch gekennzeichnet, daß man Cohn Prdzipität IV-4 durch gründliches Mischen mit etwa
0,5-2 % Calciumphosphat fraktioniert, den erhaltenen Niederschlag
abtrennt und die zurückgehaltene überstehende Flüssigkeit gründlich mit etwa 0,05-0,2 % Fibrinogen und dann gründlich mit einem
Blockmischpolymerisat aus Äthylenoxid und Polyoxypropylenglykol mit einem Gehalt von mindestens etwa 50 % Äthylenoxid im Molekül
und einem hydrophoben Polyoxypropylengrundmolekulargewicht von mindestens etwa 950 auf eine Konzentration von etwa 13,5-17,5
% bei einem pH-Wert von etwa 6-7 mischt, den erhaltenen Niederschlag
davon abtrennt und die zurückgehaltene überstehende Flüssigkeit gründlich mit diesem Blockmischpolymerisat auf eine
Konzentration von etwa 18-20 % bei e'inem pH-Wert von etwa 4-5
mischt und den erhaltenen Niederschlag als gewünschte Blutfraktion gewinnt.
2.- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Blockmischpolymerisat etwa 80 % phydrophile Poloxyäthyleneinheiten
im Molekül enthält und ein hydrophobes Polyoxypropylengrundmolekulargewicht
von etwa 950 hat.
- 11 -
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Ά Α-
Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man noch die kininartige Aktivität aus .der
"Blutfraktion entfernt, indem man die überstehende, aus
der Behandlung mit Fibrinogen und Calciumphosphat gewonnene
!Flüssigkeit-mit dem Blockmischpolymerisat auf
eine Konzentration von etwa 4 - 6 fo bei einem pH-Wert
von etwa 4 - 5 gründlich mischt, den daraus erhaltenen Niederschlag abtrennt und die überstehende Flüssigkeit
zur Behandlung mit dem Blockmischpolymerisat bei den zwei höheren Konzentrationen verwendete
Der Patentanwalt :
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