DE69722422T2

DE69722422T2 - Verfahren und vorrichtung zur herstellung eines zellfreien ersatzes roter blutzellen

Info

Publication number: DE69722422T2
Application number: DE69722422T
Authority: DE
Inventors: E. Richard DeWOSKIN; D. Marc DOUBLEDAY
Original assignee: NORTHFIELD LAB; Northfield Laboratories Inc
Current assignee: NORTHFIELD LAB; Northfield Laboratories Inc
Priority date: 1996-03-28
Filing date: 1997-03-27
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2017-03-28
Also published as: BG102810A; NZ538045A; CA2250274A1; EP0928294A1; RU2203087C2; ES2200177T3; PL187923B1; DK0928294T3; US6498141B2; US20100197566A1; JP2000507947A; BR9708388A; CA2250274C; PT928294E; BG63919B1; OA10884A; AP1028A; US20020025343A1; NO324121B1; US20050065067A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verfahren und eine Vorrichtung zur Herstellung von roten Blutkörperchen-Substitutionsprodukten, d. h. Hämoglobinprodukten. Sie betrifft ferner ein zellfreies Substitutionsprodukt für rote Blutkörperchen, das eine im Wesentlichen Tetramer-freie, quervernetzte, polymerisierte, pyridoxylierte Hämoglobinlösung umfasst, die frei von Stroma-Kontaminationen ist.
Beschreibung des Standes der Technik
Über viele Jahre stellten Blutbanken Gesamtblut für einen Austausch während eines operativen Eingriffs aufgrund einer Verletzung oder im Fall anderer Situationen bereit. Jedoch ist das aus menschlichen Spendern gewonnene Gesamtblut für eine Vielzahl von Verwendungen ungeeignet. Insbesondere ist die Verwendung von Gesamtblut aufgrund des Erfordernisses einer Donor-Typisierung, aufgrund Stabilitäts- und Lagerungsproblemen und aufgrund einer durch Viren und andere Kontaminationen hervorgerufene Toxizität problematisch. Diese Probleme treffen besonders auf Notfallsituationen zu, wie die Verwendung von Blut beim Militär. Dementsprechend wurde intensiv versucht, Substitutionsprodukte für aus menschlichen Spendern gewonnenes Gesamtblut zu entwickeln. Diese Entwicklung führte zu verschiedensten Modifikationen bei Blut aus menschlichem oder anderen Säugerquellen. Stroma-freies Hämoglobin weist bekanntermaßen Fähigkeiten eines Sauerstofftransports und einer reversiblen Sauerstoff- (oder Ligand-) Bindung auf. Da Toxizitätsprobleme einen Einsatz als Blut-Substitutionsprodukt verhinderten, machte Stroma-freies Hämoglobin weitere Modifikationen erforder lich, um ein nicht-toxisches verwendbares pharmazeutisches Produkt bereitzustellen.
Diese Modifikationen umfassen (1) ein Befreien oder im Wesentlichen Befreien des Hämoglobins von Stroma und Stroma-Kontaminationen, (2) eine Pyridoxylierung, (3) eine Polymerisation oder Vernetzung, (4) ein Entfernen von Tetrameren und (5) eine Modifikation mit Kohlenmonoxid oder anderen Liganden.
Jedoch weisen durch diese Verfahren hergestellte Hämoglobinlösungen viele unerwünschte Nebenwirkungen und Eigenschaften auf, obwohl sie in der Lage sind, ausreichende Mengen an Sauerstoff zu transportieren, um ein Leben zu unterstützen. Zum Beispiel ist eine hauptsächliche störende Nebenwirkung eine Senkung der Nierenleistung. Man vermutete, dass diese Veränderungen auf dem Auftreten unerwünschter Kontaminationen wie bakterielles Endotoxin oder Fragmente von Membranen roter Blutkörperchen (Stroma) beruhen. Während Kontaminationen wie diese in der Tat Nierenveränderungen hervorrufen können, erzeugen Hämoglobinlösungen, die im Wesentlichen frei von den vorstehend genannten Kontaminationen sind, immer noch eine wesentliche Fehlfunktion der Nieren. Die Ursache für die Fehlfunktion der Nieren wurde physiologisch nicht-annehmbaren Mengen von nicht-polymerisiertem Hämoglobin-Tetramer zugeschrieben. Weitere unerwünschte Nebenwirkungen einer Infusion von tetramerem Hämoglobin sind eine Vasokonstriktion, Hämoglobinurie, Senkung der Herzfrequenz, Erhöhung des mittleren arteriellen Blutdrucks und Extravasation von Infusat, insbesondere in die Peritonealhöhle.
In der Praxis war kein bekanntes, von Hämoglobin abgeleitetes Blut-Substitutionsprodukt bei einer vollständigen Vermeidung von Toxizitätsproblemen erfolgreich. Diese Produkte weisen auch eine nicht-annehmbare niedrige Halbwertszeit nach Verabreichung an menschliche Patienten auf. Solche Halbwertszeiten erfordern einen wiederholten Austausch des Blutvolumens über kurze Zeiträume. Dementsprechend besteht ein wesentlicher Bedarf für Hämoglobinprodukte, die für Patienten nicht-toxisch sind und nach einer Verabreichung wesentliche Halbwertszeiten aufweisen. Natürlich müssen diese Produkte in der Lage sein, reversibel Sauerstoff zu Geweben in einer Weise zu transportieren, die ähnlich zu der von Gesamtblut ist.
Die US-A-5,464,814 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung eines Hämoglobinpolymers mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 120 000 Da.
Die EP-A-361 720 beschreibt eine Lösung eines Blut-Substitutionsprodukts auf Hämoglobinbasis. Keine Molekulargewichtsverteilung ist beschrieben.
Die US-A-5,194,590 beschreibt polymerisiertes Hämoglobin mit einem Molekulargewichtsbereich von 120 000 bis 600 000 Da. Der durchschnittliche Wert beträgt etwa 120 000 Da.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Erfindungsgemäß werden Hämoglobin-Substitutionsprodukte bereitgestellt, die für Menschen nicht-toxisch sind und wesentliche Halbwertszeiten von mindestens 15 Stunden bei einer Verabreichung an Menschen aufweisen. Die erfindungsgemäßen Hämoglobinprodukte sind Stroma-frei, pyridoxyliert und polymerisiert und sie sind frei von viralen und anderen toxischen Kontaminationen. Ferner sind diese Produkte im Wesentlichen frei von Leukozyten (weiße Blutkörperchen) und Blutplättchen.
Die Erfindung umfasst auch Verfahren für eine Herstellung der erfindungsgemäßen Hämoglobin-Substitutionsprodukte. Diese Verfahren beinhalten ein Entfernen von Leukozyten und Blutplättchen aus Blut, Waschen und Lysieren der roten Blutkörperchen, Entfernen von Stroma-Kontaminationen und Stroma durch Filtration und Hitzebehandlung, Herstellen der Desoxy-Form des Hämoglobins, Pyridoxylieren und Polymerisieren, weitere Aufreinigung und Konzentration und Desoxidation. Das resultierende Hämoglobinprodukt kann sodann formuliert werden, um ein Hämoglobinprodukt mit Mengen an verschiedenen Elektrolyten bereitzustellen, die sich innerhalb der normalen physiologischen Bereiche befinden.
Erfindungsgemäß wird auch eine wässrige Formulierung von pyridoxyliertem, polymerisiertem Hämoglobin bereitgestellt, wobei das Hämoglobin ein Glutaraldehyd-polymerisiertes Hämoglobin mit tetramerem Material ist, das das Molekulargewichtsprofil von 3 aufweist. Diese Formulierung kann für eine Herstellung eines zellfreien rote Blutkörperchen-Substitutionsprodukts verwendet werden. In diesem Aspekt wird die Formulierung zuerst aufgereinigt, um Tetramer zu entfernen, und sodann mit geeigneten Mengen an Elektrolyten vereinigt, um ein physio logisch verträgliches, zellfreies rote Blutkörperchen-Substitutionsprodukt herzustellen, das sodann für eine Behandlung eines menschlichen Patienten eingesetzt werden kann, der eine Infusion eines Sauerstoffträgers benötigt.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine schematische Darstellung, die den Teil des Verfahrens und der Ausstattung zeigt, der eingesetzt wird, um zu einer desoxidierten Hämoglobinlösung zu gelangen, die für eine Pyridoxylierung und Polymerisation hergestellt wird.
2 ist eine schematische Darstellung, die den Teil des Verfahrens und der Vorrichtung zeigt, der mit einer Pyridoxylierung und Polymerisation beginnt und zu einem desoxidierten, aufgereinigten, pyridoxylierten, polymerisierten Hämoglobinprodukt führt. Ferner ist der Teil des Verfahrens und der Vorrichtung gezeigt, der für eine Formulierung des endgültigen Hämoglobinprodukts mit physiologischen Mengen an Elektrolyten eingesetzt wird.
3 ist ein HPLC-Nachweis von polymerisiertem Material nach einer Glycinbehandlung vor einer Aufreinigung. Das polymerisierte Produkt ist durch Peaks bei den Verzögerungszeiten (RT) 15,57, 16,08, 17,00 und 18,19 angezeigt. Tetramers Material ist durch Peaks bei RT 19,88 und 20,51 angezeigt. Polymer macht 76,2% dieses Materials aus.
4 ist ein HPLC-Nachweis des erfindungsgemäßen Hämoglobinprodukts. Polymerisiertes Hämoglobin ist durch die Peaks bei RT 15,7, 16,33, 17,32 und 18,56 angezeigt. Tetramer ist durch den Peak bei RT 21,18 angezeigt.
5 ist eine schematische Darstellung, die ein Säulenchromatographie-Aufreinigungsverfahren zeigt, das erfindungsgemäß verwendet wird.
6 ist eine schematische Darstellung, die ein Membranfiltrations-Aufreinigungsverfahren zeigt, das erfindungsgemäß eingesetzt wird.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUTNGSFORM
Die Erfindung betrifft ein zellfreies rote Blutkörperchen-Substitutionsprodukt, das ^ein im Wesentlichen Tetramer-freies, vernetztes, polymerisiertes, pyridoxyliertes Hämoglobin umfasst, das im Wesentlichen frei von Stroma, Stroma-Kontaminationen und anderen Kontaminationen ist.
Der Begriff "vernetzt" betrifft das chemische Einbringen molekularer "Brücken" auf oder in ein Molekül oder zwischen Moleküle mit dem Zweck, die Gestalt, Größe, Funktion oder physikalischen Eigenschaften des Moleküls zu verändern. Vernetzte Moleküle können polymerisiert oder nicht-polymerisiert sein, d. h. vernetzte Moleküle können tetramer sein.
Der Begriff "Tetramer" betrifft Hämoglobinmoleküle mit einem Molekulargewicht von etwa 64 kDa. Das heißt, der Begriff betrifft sowohl native als auch intramolekular vernetzte Hämoglobinmoleküle.
Der Begriff "im Wesentlichen Tetramer-frei" bezeichnet den Reinheitsgrad im Hinblick auf eine Tetramer-Kontamination, bei dem bestimmte biologische Reaktionen gegenüber Tetramer, das einem Säuger verabreicht wurde, nicht mehr auftreten. Ein Hauptkriterium ist das Ausbleiben von Veränderungen der Nierenfunktion bei einer Infusion pharmazeutisch wirksamer Mengen, d. h. bei einem Reinheitsgrad von etwa 99% oder mehr (weniger als etwa 1% Tetramer ist vorhanden). Das bevorzugte durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellte Produkt enthält nicht mehr als etwa 0,8% Tetramer, basierend auf dem Gewicht des Gesamthämoglobins (THb). Anders ausgedrückt, ein im Wesentlichen Tetramer-freies Produkt gemäß der Erfindung enthält nicht mehr als physiologisch verträgliche Mengen an nicht-polymerisiertem Hämoglobin-Tetramer. Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Produkte enthalten weniger als etwa 0,5% Tetramer und die am meisten bevorzugten erfindungsgemäßen Produkte enthalten etwa 0,3–0,4% Tetramer. Solche Mengen an Tetramer erwiesen sich als physiologisch verträglich.
Die Begriffe "ultra-aufgereinigtes Produkt" oder "aufgereinigtes Produkt" haben die gleiche Bedeutung wie der Begriff "im Wesentlichen Tetramer-frei".
Prozent Gesamthämoglobin (THb) ist hier als Gramm Hämoglobin/100 ml Lösung definiert.
Der Begriff "Polymerisierungslösung" betrifft hier eine Lösung mit einem "Vernetzungs-" oder Polymerisationsmittel wie Glutaraldehyd, Imidoester, Diaspirin oder andere in einem biochemisch geeigneten Träger.
Der Begriff polymerisiert betrifft hier das Einbringen molekularer Brücken zwischen Moleküle oder tetramere Untereinheiten, wobei die Größe und das Gewicht des resultierenden polymerisierten Moleküls im Hinblick auf natives oder tetrameres Hämoglobin erhöht sind. Polymerisiertes Hämoglobin ist kein tetrameres Hämoglobin.
"Lösung von Hämoglobin" betrifft hier eine Lösung von tetramerem Hämoglobin oder polymerisierten Hämoglobinmolekülen, wobei die Moleküle nicht in einem roten Blutkörperchen enthalten sind. Eine solche Lösung muss nicht von roten Blutkörperchen-Stroma oder Stroma-Kontaminationen frei sein oder im Wesentlichen frei sein. Jedoch sind bevorzugte polymerisierte Hämoglobinlösungen von roten Blutkörperchen-Stroma und Stroma-Kontaminationen frei.
Der Begriff "semipermeable Membran" betrifft eine Membran, die für manche molekulare Spezies permeabel, für andere jedoch nicht permeabel ist, d. h. eine Membran, die als selektiver Filter fungiert, der bestimmte Molekulargewichte ausschließt.
Das Produkt des erfindungsgemäßen Verfahrens, eine polymerisierte, pyridoxylierte Hämoglobinlösung, die im Wesentlichen frei von tetramerem (nativem oder intramolekular-vernetztem) Hämoglobin, Stroma- und verschiedenen anderen Kontaminationen ist und ausgehend von hitzebehandeltem, viral-inaktiviertem tetramerem Hämoglobin hergestellt wird, ist physiologisch verträglich sowie therapeutisch und klinisch einsetzbar. Das Produkt weist eine reversible Sauerstoff-Bindungsfähigkeit auf, die für Sauerstoff-Transporteigenschaften notwendig ist. Am bemerkenswertesten ist, dass das Produkt gute Beladungs- und Entladungseigenschaften bei der Verwendung aufweist, was damit korreliert, dass es eine Sauerstoff-Hämoglobin-Dissoziationskurve (P₅₀) aufweist, die ähnlich zu der von Gesamtblut ist. Das Produkt bindet Sauerstoff mit hoher Affinität in den Kapillaren durch die Lungen und setzt sodann Sauerstoff für die Gewebe im Körper in angemessener Weise frei. Das Produkt macht auch keine Kompatibilitätsuntersuchungen mit dem Empfänger erforderlich.
Das Produkt weist auch eine Halbwertszeit bei einer Verabreichung an Menschen von mindestens etwa 15 Stunden und mehr bevorzugt etwa 24 Stunden auf. Dieses Hämoglobinprodukt kann in Patienten in Mengen von bis zu etwa 3,0 l und sogar bis etwa 5,0 l infundiert werden. Anders ausgedrückt, das erfindungsgemäße Hämoglobinprodukt kann eingesetzt werden, um im Wesentlichen das gesamte Blutvolumen eines menschlichen Patienten aufzufüllen, ohne dass eine Vasokonstriktion, renale Toxizität, Hämoglobinurie oder andere Probleme auftreten, die mit einer intravenösen Verabreichung von synthetischen oder semisynthetischen Sauerstoffträgern und Blut-Substitutionsprodukten assoziiert sind. Daher beinhaltet die Erfindung ein Verfahren zum Transfundieren eines Patienten, vorzugsweise eines menschlichen Patienten, mit einer Menge eines Stroma-freien, Tetramerfreien, polymerisierten, pyridoxylierten Hämoglobinprodukts, die für den Patienten nicht-toxisch ist, wobei die Menge bis mindestens etwa 5,0 l beträgt. Ein solches Verfahren beinhaltet ein Anschließen des Patienten oder des Lebewesens an eine Infusionsvorrichtung oder an eine andere derartige Ausstattung für ein Infundieren oder Transfundieren des Patienten.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch einzigartig, dass ein Produkt erhalten wird, das eine Menge an Tetramer von nicht mehr als etwa 1% und mehr bevorzugt nicht mehr als etwa 0,8 Gew.-%, basierend auf dem Gewicht des Gesamthämoglobins in der Lösung, aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet den weiteren Vorteil, dass das Endprodukt im Wesentlichen von mikrobiellen und viralen Antigenen und Pathogenen befreit werden kann. Solche mikrobielle und virale Antigene und Pathogene werden auf nicht-nachweisbare Mengen reduziert, d. h. das Produkt ist steril, wie bestimmt durch die in der United States Pharmacopoeia, XXIII Kapitel 71 beschriebene Analyse. Beispiele für solche Antigene und Pathogene umfassen beispielsweise Bakterien, Rickettsien, Pilze, Protozoen, Viren und andere Organismen. Am wichtigsten ist, dass durch das Verfahren ein biologisches Produkt bereitgestellt wird, das frei von Viren ist, die Hepatitis und erworbenes Immundefizienzsyndrom (AIDS) hervorrufen.
Sofern die physiologischen Eigenschaften betroffen sind, verursacht das erfindungsgemäße biologische Produkt bei einer Infusion in Mengen von bis zu mindestens etwa 5,0 l keine Vasokonstriktion, renale Toxizität, Hämoglobinurie und andere Probleme, die mit einer intravenösen Verabreichung von bekannten Hämoglobinlösungen in Verbindung stehen, die physiologisch unerwünschte Mengen an tetramerem Hämoglobin enthalten. Eine intravenöse Verabreichung des Produkts, das durch das hier beschriebene Verfahren hergestellt wird, führt zu keiner spürbaren Verringerung der Harnproduktion, keiner spürbaren Verringerung der glomerulären Filtrationsrate, keiner spürbaren Extravasation in die Peritonealhöhle und keiner spürbaren Veränderung der Farbe des produzierten Harns.
Daher stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein zellfreies rote Blutkörperchen-Substitutionsprodukt bereit, das bei einer Behandlung einer Verletzung, eines myokardialen Infarkts, von Schlaganfall, akuter Anämie und Sauerstoffdefizienz-Erkrankungen wie Hypoxämie, Hypoxie oder Hypoxie im Endstadium aufgrund einer Beeinträchtigung oder eines Versagens der Lunge, Blut vollständig mit Sauerstoff zu versorgen, verwendbar ist. Das Produkt kann auch bei der Behandlung einer jeglichen Erkrankung oder eines jeglichen medizinischen Zustands eingesetzt werden, die J der eine wieder belebende Flüssigkeit (z. B. Trauma, insbesondere hämorrhagischer Schock), einen intravaskulären Volumenexpander oder eine Austauschtransfusion erforderlich macht. Zusätzlich zu einer medizinischen Behandlung kann das Produkt bei einer Konservierung von Organen für Transplantationen verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst die nachstehenden Behandlungen:

1. Absaugen von roten Blutkörperchen und Filtration
2. Waschen der Zellen/Lyse
3. Hitzebehandlung
4. Einkonzentrieren durch Ultrafiltration
5. Entgasen
6. chemische Modifikation
7. Aufreinigung
8. UP-Poly-Konzentration
9. Desoxidieren
10. Formulieren

Das bevorzugte Ausgangsmaterial in dem erfindungsgemäßen Verfahren ist veraltetes menschliches Gesamtblut oder verpackte rote Blutkörperchen. Ferner kann nicht-veraltetes Blut (nicht abgelaufen) auch verwendet werden. Vorzugsweise wird Cesamtblut nicht in dem Verfahren verwendet, wenn es länger als 2 Wochen über das Ablaufdatum, das auf dem Beutel angegeben ist, gelagert wurde. Die Verwendung von Gesamtblut, das mehr als 2 Wochen abgelaufen ist, stellt eine weitere Schwierigkeit bei der Extraktion des Hämoglobins und Entfernung zellulärer Überbleibsel wie Stroma-Proteine und Kontaminatienen dar.
Alle hier beschriebenen Verfahren sind auf anderes Säugerblut mit möglicherweise kleineren Modifikationen, die für den Fachmann Routine sind, anwendbar. Der größte Teil des Verfahrens kann bei etwa 2°C bis etwa 8°C, vorzugsweise etwa 4°C durchgeführt werden.
Während des Absaugens von roten Blutkörperchen und der Filtration werden die roten Blutkörperchen (RBC) aseptisch von Spenderbeuteln ohne ein Einbringen von Luft in das Blut extrahiert und über eine Reihe von Filtern geleitet, um zu einer RBC-Suspension mit verringerten Mengen an Leukozyten und Blutplättchen zu gelangen. Die resultierende Suspension wird dann einem Waschen/Lysieren der Zellen unterzogen.
Die Suspension wird unter Kohlenmonoxid mit einer Lösung mit etwa 1% NaCl gewaschen, um restliche Plasmaproteine zu entfernen. Die gewaschenen RBC werden sodann mit Wasser für eine Injektion (WFI) behandelt, um die Zellen zu lysieren und das resultierende Gemisch wird mit Hilfe einer Querstrom-Filtrationseinheit geklärt. Das geklärte Produkt wird sodann hitzebehandelt, um zusätzliches Stromamaterial auszufällen, das durch Filtration entfernt wird. Das Produkt dieses Verfahrens ist eine Stroma-freie Hämoglobin (SFH)-Lösung mit einem THb-Gehalt von etwa 3% (w/v).
Die hitzebehandelte und Stroma-freie Hämoglobinlösung mit Carboxyhämoglobin wird einkonzentriert und entgast, um eine SFH-Lösung mit Desoxyhämoglobin zu erhalten. Ein Entgasen beinhaltet zuerst ein Absättigen der Carboxyhämoglobinlösung mit Sauerstoff für etwa 16 Stunden, um eine Lösung mit sauerstoffgesättigtem Hämoglobin und etwa 7 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht des Hämoglobins, von Carboxyhämoglobin zu erhalten. Sodann wird der Sauerstoff mit Stickstoff, Argon oder Helium entfernt, um eine Lösung mit freiem Hämoglobin, d. h. nicht-komplexiertem Hämoglobin, und etwa 7 Gew.-%, basierend auf dem Gesamtgewicht an Hämoglobin, von Oxyhämoglobin herzustellen. Die resultierende entgaste Lösung wird abfiltriert und in ein Gefäß für eine chemische Modifikation überführt.
Nach dem Entgasen wird die Stroma-freie Hämoglobinlösung mit Hilfe von Pyridoxal-5'-phosphat (P5P) bei einem Molverhältnis von Pyridoxal-5'-phosphat zu Hämoglobin von etwa 1 : 1 bis 3 : 1 pyridoxyliert. Alternativ kann das Stroma-freie Hämoglobin mit Hilfe von 2-Nor-2-formylpyridoxal-5'-phosphat pyridoxyliert werden. Ein Reduktionsmittel wie Natriumcyanoborhydrid oder vorzugsweise Natriumborhydrid wird zu dem Pyridoxylierungsgemisch hinzugefügt. Überschussreagenz und Salze werden durch Dialyse gegen Pyrogen-freies Wasser oder vorzugsweise Diafiltration mit WFI entfernt. Das pyridoxylierte Hämoglobin wird sodann mit einer Glutaraldehydlösung polymerisiert.
Die Stroma-freie pyridoxylierte Hämoglobinlösung wird mit Hilfe einer wässrigen Glutaraldehydlösung polymerisiert. Die Polymerisationsdauer und die Menge an zugegebenem Glutaraldehyd sind vom Volumen der Hämoglobinlösung, dem gewünschten Gehalt an Polymeren und der gewünschten Molekulargewichtsverteilung abhängig. Im Allgemeinen erhöhen längere Polymerisationszeiten die Ausbeute und die Molekulargewichtsverteilung der Polymere. Eine Ausbeute von etwa 75 Gew.-% an Polymeren, basierend auf dem Gesamtgewicht an Hämoglobin, wird innerhalb von etwa 16–18 Stunden erhalten. Der bevorzugte Endpunkt der Polymerisation ist als derjenige Punkt definiert, bei dem die Lösung etwa 75 Gew.-% an Polymeren, basierend auf dem Gesamtgewicht an Hämoglobin, enthält, wie durch Größenausschluss-HPLC überwacht wird. Alternativ ist der Endpunkt als derjenige Punkt definiert, bei dem die Lösung etwa 65% Polymere, basierend auf dem Gesamtgewicht an Hämoglobin, enthält, d. h. etwa 2,5 Stunden.
Die Polymerisationsreaktion wird durch Zugabe von wässrigem Glycin abgestoppt. Der Puffer muss so rasch wie möglich hinzugefügt werden. Die Vernetzuangen werden sodann durch Zugabe, erneut so rasch wie möglich, einer Lösung von wässrigem Natriumborhydrid stabilisiert. Diese polymerisierte Lösung wird sodann einkonzentriert und sodann unter Sauerstoff diafiltriert, um die Lösung mit Sauerstoff zu sättigen. Schließlich wird Wasser zu der Lösung hinzugefügt, bis die Lösung etwa 4 Gew.-% Hämoglobin enthält.
Eine Polymerisation gemäß der Erfindung führt zu einer hohen Ausbeute an Polymeren mit einem engen Molekulargewichtsbereich, wie in 3 und Beispiel 1 nachstehend gezeigt ist.
Die polymerisierte pyridoxylierte Hämoglobinlösung wird sodann durch Säulenchromatographie, Filtration wie Membranfiltration oder beides aufgereinigt, um restliches nicht-polymerisiertes (tetrameres) Hämoglobin aus der Lösung zu entfernen. Die aufgereinigte polymerisierte Hämoglobinlösung wird sodann auf etwa 6% mit Hilfe einer Ultrafiltrationsvorrichtung für eine Vorbereitung des Gasaustausches einkonzentriert.
Die einkonzentrierte Lösung wird sodann mit Hilfe von Stickstoff desoxidiert. Die Desoxidierung findet bei etwa 10–12°C statt, bis die Menge an Oxyhämoglobin in der Lösung weniger als etwa 16 Gew.-% des Gesamthämoglobins beträgt.
Die resultierende desoxidierte, aufgereinigte und polymerisierte Hämoglobinlösung wird sodann durch Ultrafiltration unter Stickstoff in einem gekühlten Gefäß einkonzentriert. Der pH-Wert wird auf etwa 8,8–9,0 eingestellt und die Mengen an Elektrolyten können wie notwendig auf Mengen eingestellt werden, die denjenigen von normalem Plasma entsprechen. Zusätzlich können herkömmliche Antioxidationsmittel wie Glutathion, Ascorbat oder Glucose gegebenenfalls auch hinzugegeben werden. Nach dem Einkonzentrieren der Lösung auf die gewünschte Menge, vorzugsweise etwa 10 Gew.-% polymerisiertes, pyridoxyliertes, aufgereinigtes, Tetramer-freies, Stroma-freies Hämoglobin, wird die Lösung durch Filtration sterilisiert und mit Hilfe einer sterilen Überführungsvorrichtung in geeignete pharmazeutisch verträgliche Behältnisse überführt.
Die Eigenschaften der sich ergebenden Hämoglobinlösung sind nachstehend gezeigt:
Die nachstehenden Beispiele zeigen bestimmte erfindungsgemäße Aspekte. Jedoch dienen diese Beispiele nur einer Veranschaulichung und besagen nicht, dass sie vollständig die Bedingungen und den Umfang der Erfindung bestimmen. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben, es sei denn, es ist anders spezifiziert. Wenn nicht anders angegeben, sind alle Prozentangaben wie von Gesamthämoglobin (THb) in Gewicht/Volumen (w/v) ausgedrückt. Wenn typische Reaktionsbedingungen (wie Temperatur, Reaktionszeiten) angegeben wurden, können die Bedingungen, die sich über und unter diesen spezifischen Bereichen befinden, auch verwendet werden, obwohl dies im Allgemeinen weniger günstig ist.
Wenn nicht anders angegeben, bestehen alle Gefäße und Behälter, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, aus 316-L-Edelstahl, vorzugsweise der pharmazeutischen Güte eines solchen Edelstahls, der stark aufpoliert wurde und daher einfach und schnell gereinigt werden kann. Die verschiedenen Schlauch- und Röhrenverbindungen bestehen aus dem gleichen Edelstahl oder aus Teflon oder Silikon von pharmazeutischer Güte. Die Filter und Membranen, die in dem Verfahren eingesetzt werden, können von Millipore Inc., Pall-Filtron oder Cuno Inc. bezogen werden.
Die Halbwertszeit des erfindungsgemäßen resultierenden Produkts wird in vivo in Säugern wie Menschen bestimmt. Typischerweise wird eine Blutprobe aus dem Säuger eine gewisse Zeit nach einer Infusion des Säugers mit dem Produkt entfernt. Die Menge des Produkts wird sodann durch Zentrifugieren der Blutprobe, Ausdrücken des Plasmaanteils, Bestimmen der Plasma-Hämoglobinmengen durch spektrophotometrische Mittel und sodann Korrelieren der Menge an Produkt, das in dem Säuger verbleibt, zu der Halbwertszeit des Produkts bestimmt.
Größenausschlusschromatographie-HPLC erfolgt erfindungsgemäß wie folgt: Die Probe wird mit 0,2 M Kaliumphosphatpuffer mit einem pH-Wert von 6,9 auf 0,2 g/dl verdünnt, durch einen 0,2 μ-Filter filtriert und in ein HPLC-System injiziert, das aus den nachstehenden Bestandteilen (in Reihenfolge eines Systemflusses) besteht:

1. Pharmacia Modell 2248-Pumpe
– mobile Phase ist 0,2 M Kaliumphosphat, pH 6,9
– Flussrate beträgt 1,0 ml/min
2. 45 cm PEEK- oder Titan-Schlauchverbindung, 0,010 in. i. D.
3. Rheodyne Modell 7725i-Injector mit 200 μl PEEK-Probenschleife 4. 18 cm PEEK- oder Titan-Schlauchverbindung, 0,010 in. i. D.
5. Upchurch Modell A431 0,5 μ-Filter
6. 9 cm PEEK- oder Titan-Schlauchverbindung, 0,010 in. i. D.
7. Phenomenex Biosep SEC 5-3000 75 × 7,8 mm Guard-Säule
8. 24 cm PEEK- oder Titan-Schlauchverbindung, 0,010 in. i. D.
9. Phenomenex Biosep SEC 5-3000 600 × 7,8 mm analytische Säule
10. 23 cm PEEK- oder Titan-Schlauchverbindung, 0,010 in. i. D.
11. Pharmacia Uvicord SD UV-Detektionsvorrichtung

Wellenlänge: 280 nm

Flusszelle: 8 μl Vol., 2,5 mm Weglänge

Bereich: 2 AUFS

Zeitkonstante: 10 Sekunden

Die Peak-Absorption bei 280 nm wird mit einem LKB 2221-Integrator aufgezeichnet, der die einzelnen Peak-Flächen integriert und den gesamten Hämoglobinbereich für jede polymere Spezies berechnet.
Die nachstehenden nicht-begrenzenden Beispiele erläutern weiter die Erfindung.
BEISPIEL 1
Unter Bezug auf 1 werden Spenderbeutel 20 mit abgelaufenem Blut (Gesamtblut oder verpackte rote Blutkörperchen) in eine geeignete aseptische Absaugvorrichtung 22 gegeben. Ein Beispiel einer geeigneten Absaugvorrichtung ist ein System mit zwei Absaugstationen. Sobald ein Spenderbeutel in die Absaugstation gegeben wurde, punktiert eine Nadel in der Absaugvorrichtung den Spenderbeutel, bringt etwa 150 ml einer 1%igen (w/v) wässrigen Natriumchloridlösung ein und saugt das abgelaufene Blut aus dem Spenderbeutel unter vermindertem Druck oder Vakuum ab. Das abgesaugte Blut wird durch einen 100 μ-Tiefenfilter 24 und sodann durch zwei 5 μ-Tiefenfilter 26 in Serie geleitet. Bei einem Durchtritt des Bluts durch die 5 μ-Tiefenfilter werden Leukozyten aus dem Blut entfernt. Typischerweise werden etwa 170 Einheiten von abgelaufenem Gesamtblut abgesaugt, filtriert und sodann in den Tank 1, wie in 1 gezeigt, überführt. Die Filter werden sodann mit etwa 75 l einer 1%igen (w/v) wässrigen Natriumchloridlösung gespült.
Vor einem Einbringen des Bluts in den Tank 1 wird der Tank 1 mit etwa 70 l einer 1%igen wässrigen Natriumchloridlösung beladen. Nachdem alle 170 Einheiten des abgelaufenen Gesamtbluts abgesaugt, filtriert und überführt wurden und die Filter gespült wurden, enthält der Tank etwa 250 l einer 4%igen Gesamthämoglobinlösung. Während des Absaugens und des Filtrierens wird der Tank 1 bei vermindertem Druck, d. h. einem Vakuum von 20–28'' Hg, gehalten. Sobald das gesamte abgelaufene Blut in den Tank 1 überführt wurde, wird das Vakuum abgestellt und Kohlenmonoxid wird in den Tank eingebracht, so dass der Tank eine Kohlenmonoxid-Atmosphäre enthält.
Tank 1 wird an einen 0,65 μ-Tangentialflussfilter 28, wie in 1 gezeigt, angeschlossen. Die anfängliche Beladung mit 250 l einer 4%igen Gesamthämoglobinlösung wird auf etwa 125 l einer 8%igen Gesamthämoglobinlösung durch Mikrofiltration durch den Tangentialflussfilter einkonzentriert. Der pH-Wert der Hämoglobinlösung beträgt bei diesem Punkt etwa 6 bis 6,5. Nach einem Einkonzentrieren auf 8% Gesamthämoglobin wird die Lösung durch Zugabe einer 1%igen (w/v) Natriumchloridlösung, Diafiltrieren und Entfernen des Filtrats bei der gleichen Geschwindigkeit, bei der die Natriumchloridlösung hinzugefügt wird, gewaschen. Die 125 l Hämoglobinlösung werden typischerweise mit etwa 8 Volumina der 1%igen Natriumchloridlösung (etwa 1000 l) gewaschen. Nach dem Waschen wird die Lösung auf etwa 70 l, d. h. etwa 14% Gesamthämoglobin, einkonzentriert und "Injektionswasser" (WFI) wird hinzugefügt, um das Volumen der Lösung auf etwa 180 l zu bringen. Bei der Zugabe des WFI schwellen die Zellen an und brechen auf, wobei das Hämoglobin in die Lösung freigesetzt wird. Die Konzentration der sich ergebenden Hämoglobinlösung beträgt etwa 5% Gesamthämoglobin (THb).
Die sich ergebende Lösung wird geklärt, während sie sich immer noch in Tank 1 befindet. Die Lösung wird zuerst auf etwa 50 l einkonzentriert und das Filtrat in den Tank 2 überführt. Bei einem Pumpen der Lösung über den Filter werden rote Blutkörperchen-Stroma-Kontaminationen und Zellwandmaterial zurückgehalten und durch den Filter entfernt. Die verbleibenden 50 l der Lösung in Tank 1 werden mit etwa 2,5 Volumina WFI gewaschen (diafiltriert). Diese 2,5 Volumina an Waschlösung werden zu Tank 2 hinzugegeben. Das Material, das in Tank 1 verbleibt, wird sodann auf etwa 20 l einkonzentriert und das Filtrat zu Tank 2 hinzugefügt. Das sich in Tank 2 ergebende Volumen beträgt etwa 280 l einer 3,3%igen Gesamthämoglobinlösung.
Die sich ergebende Lösung an Stroma-freiem Hämoglobin wird sodann in Tank 2 bei einer Temperatur von etwa 60–62°C über einen Zeitraum von etwa 10 Stunden hitzebehandelt. Während dieses Zeitraums wird die Lösung mäßig gerührt. Sobald die Lösung beim Erhitzen eine Temperatur von etwa 55°C überschreitet, bildet sich ein Niederschlag.
Die sich ergebende 3,3% THb (w/v) Stroma-freie, hitzebehandelte Hämoglobinlösung wird sodann durch einen 0,2 μ-Filter 30, gefolgt von einem 0,1 μ-Filter 32, filtriert und in den Tank 3 überführt. Die filtrierte Hämoglobinlösung wird sodann auf etwa 18% THb einkonzentriert und sodann mit 4 Volumina WFI (180 l) gewaschen und diafiltriert. Die Konzentration und Diafiltration erfolgt mit Hilfe eines 10 Kilodalton (kDa)-Molekulargewicht-Ultrafilters 34. Der mit dem Ultrafilter 34 verbundene Ablauf 35 sammelt das Filtrat. An diesem Punkt enthalten die 45 l einer 18%igen Gesamthämoglobinlösung weniger als 50 ng Phospholipid pro Gramm Hämoglobin, weniger als 2 ng Glykolipid pro Gramm Hämoglobin, weniger als 1% Methämoglobin, weniger als etwa 0,03 Endotoxin-Einheiten pro Milliliter bei einem pH-Wert von etwa 6 bis 6,5. Dieses Hämoglobin in der Lösung ist Carboxyhämoglobin.
Die resultierende Carboxyhämoglobinlösung wird sodann in den Tank 4 überführt, wo das Carboxyhämoglobin zuerst mit Sauerstoff gesättigt und sodann desoxidiert wird. Tank 4 ist mit einem Gasspülring, der an Sauerstoff- und Stickstoffgasleitungen angeschlossen ist, einer Zuführung von dem Tankboden zu einer Dosiersprühvorrichtung am oberen Ende von Tank 4 und einem Schaum-Überfließsammler, der an das Schaumgefäß 1 angeschlossen ist, ausgestattet, so dass in Tank 4 entstehender Schaum in das Schaumgefäß 36 geleitet wird, wo der Schaum in Flüssigkeit kondensiert und in Tank 4 rückgeführt wird. Tank 4 enthält ferner einen Satz an Pall-Ringen, die etwa ein Drittel des Tankvolumens ausfüllen. Das Schaumgefäß 36 beinhaltet eine Gasbelüftung für ein Entfernen von Gas. Die Lösung in Tank 4 ist eine 13%ige Gesamthämoglobinlösung.
Während eines ersten Sauerstoffsättigungsschritts wird Sauerstoff durch die Lösung bei einer Geschwindigkeit gespült, die ausreicht, um eine gleichmäßige Dispersion des Gases in dem Gefäß zu erreichen. Das Gefäß mit einem Volumen von 200 l wird bei einer Geschwindigkeit von etwa 25 l/min mit Gas bespült. Eine Sauerstoffsättigung des Carboxyhämoglobins erfolgt für einen Zeitraum von etwa 16 Stunden, so dass die sich ergebende Lösung weniger als 5% Carboxyhämoglobin, basierend auf dem Gewicht des Gesamthämoglobins, enthält. Die Sauerstoffsättigung erfolgt bei einer Temperatur von etwa 10°C. Der in Tank 4 entstehende Schaum wird in dem Schaumgefäß 36 gesammelt und nach einem Setzen wird die sich ergebende Lösung in den Tank 4 rückgeführt.
Nach einer Sauerstoffsättigung wird die Lösung mit einem ähnlichen Fluss an Stickstoff etwa 6 Stunden gespült oder bis weniger als 10% Oxyhämoglobin, basierend auf dem Gewicht an Gesamthämoglobin, in der Lösung verbleibt. Die Stickstoffspülung erfolgt bei einer Temperatur von etwa 10°C und einem pH-Wert von etwa 6 bis 6,5. Alternativ könnte Carboxyhämoglobin in Desoxyhämoglobin mit Hilfe eines Membranaustauschers umgewandelt werden. Es wird bemerkt, dass im Wesentlichen kein Denaturieren des Hämoglobins auftritt, wie man normalerweise von dem Schäumungsschritt erwarten würde. Die sich ergebende desoxidierte Lösung wird nun für eine chemische Modifikation vorbereitet.
Unter Verweis auf 2 wird die Desoxyhämoglobinlösung in Tank 5 für eine chemische Modifikation überführt. Zu Tank 5 mit der Desoxyhämoglobinlösung bei etwa 4°C wird sodann eine wässrige Lösung an Pyridoxyl-5-phosphat (P5P) (93,75 g/l) bei einem Molverhältnis von P5P zu Hämoglobin von 1 : 1 bis 3 : 1 gegeben. Ein Molverhältnis von P5P zu Hämoglobin von 2 : 1 ist bevorzugt. Die Pyridoxylierung erfolgt bei einer Temperatur von etwa 4°C. Die P5P-Lösung wird typischerweise über einen Zeitraum von etwa 1 Minute hinzugefügt und etwa 15 Minuten gemischt, worauf eine Natriumborhydrid/Natriumhydroxid-Lösung zu der Hämoglobinlösung bei einem Molverhältnis an Natriumborhydrid zu Hämoglobin von etwa 20 : 1 hinzugefügt wird. Eine geeignete wässrige Natriumborhydrid/Natriumhydroxid-Lösung enthält 0,8 g Natriumhydroxid pro 2 l und 90,8 g Natriumborhydrid pro 2 l. Die Borhydridlösung wird so rasch wie möglich über einen Zeitraum von 1 Minute hinzugegeben und sodann 1 Stunde gerührt. Die sich ergebende 50 l-Lösung an pyridoxyliertem Hämoglobin wird sodann mit Hilfe eines 10 kDa-Ultrafilters 38 diafiltriert, um Überschussreaktanden mit 4 Volumina WFI zu entfernen. Der Ablauf 40, der mit dem Ultrafilter 38 verbunden ist, sammelt das Filtrat von dem Filter 38.
Nach Diafiltration mit 4 Volumina, d. h. 200 l, WFI wird das Hämoglobin polymerisiert. Zu Tank 5 mit dem pyridoxylierten Hämoglobin wird genügend WFI hinzugegeben, um eine 4,5%ige Gesamthämoglobinlösung (etwa 175 l Hämoglobinlösung) herzustellen. Eine Glutaraldehydlösung wird zu der pyridoxylierten Hämoglobinlösung bei einem Molverhältnis von Glutaraldehyd zu Hämoglobin von etwa 24 : 1 hinzugefügt. Die Glutaraldehydlösung wird typischerweise über einen Zeitraum von etwa 2,5 Stunden mit Hilfe einer Dosierpumpe zu der Hämoglobinlösung hinzugegeben. Die Polymerisationsreaktion erfolgt etwa 18 Stunden lang. Die angestrebte Molekulargewichtsverteilung ist etwa 75% Polymer und 25% Tetramer. Die angestrebten Polymere weisen Molekulargewichte von weniger als etwa 600 000 mit einer Hauptfraktion der Molekulargewichte in einem Bereich von 100 000 bis 350 000 auf.
Sobald die Polymerisationsreaktion die angestrebte Molekulargewichtsverteilung erreicht hat (nach etwa 18 Stunden), wird wässriges Glycin (etwa 166 g/l) zu der Hämoglobinlösung bei einem Molverhältnis von Glycin zu Hämoglobin von 140 : 1 hinzugefügt (um abzustoppen); vgl. 3, die einen HPLC-Nachweis des resultierenden polymerisierten, mit Glycin abgestoppten Hämoglobinprodukts zeigt. Die sich ergebende Lösung wird sodann etwa 10 Minuten gemischt, worauf eine Natriumborhydrid/Natriumhydroxid-Lösung (mit der vorstehend beschriebenen Konzentration) zu der Hämoglobinlösung bei einem Molverhältnis von Natriumborhydrid zu Hämoglobin von 28 : 1 hinzugegeben wird. Das sich ergebende Gemisch wird etwa 1 Stunde gerührt. Die Lösung wird sodann auf etwa 50 l (Ultrafilter 38) einkonzentriert und mit 4 Volumina (200 l) WFI gewaschen. Eine weitere Menge an Natriumborhydrid bei dem gleichen Molverhältnis wie vorstehend beschrieben wird zu der einkonzentrierten Lösung hinzugegeben und erneut 1 Stunde gemischt. Die sich ergebende Lösung wird mit 4 Volumina WFI (200 l) gewaschen, was zu einem polymerisierten, pyridoxylierten, Stroma-freien Hämoglobin führt, das hitzebehandelt wurde.
Die sich ergebende Lösung wird dadurch mit Sauerstoff gesättigt, dass die Lösung unter Sauerstoff stehen gelassen wird, und sodann in ein Aufreinigungssystem 42 überführt. Die Aufreinigung kann durch Säulenchromatographie, Filtration, vorzugsweise Membranfiltration (Diafiltration) oder eine Kombination aus Filtration und Säulenchromatographie erfolgen.
In einer Ausführungsform wird die Lösung einem Chromatographie-Zuführgefäß, Tank 6, wie in 5 gezeigt, zugeführt. In dieser Ausführungsform wird die sich ergebende Lösung an Oxyhämoglobin sodann auf etwa 200 l (4% Gesamthämoglobin) in Tank 6 verdünnt und die Konzentration an Chlorid auf 22 mmol mit einer Natriumchloridlösung eingestellt. Keine Einstellung der Natriumkonzentration ist erforderlich.
Fünf 40 l-Mengen der sich ergebenden Hämoglobinlösung werden sodann mit Hilfe der Säule 44 chromatographisch aufgetrennt. Die Säule 44 enthält ein Affinitätsgel, das ein Agarosegel ist, das mit einem Gelbfarbstoff (käuflich verfügbar von Affinity Chromatography, Ltd. als Mimetic Yellow Nr. 1) mit einer höheren Affinität für das Polymer als für das Tetramer modifiziert wurde.
Die Chromatographie erfolgt wie folgt: 40 l sauerstoffgesättigter, polymerisierter, pyridoxylierter, Stroma-freier Hämoglobinlösung werden auf die Säule 44 geladen. Die Säule wird mit 15 Säulenvolumina (etwa 750 l) 30 mM wässrigem NaCl-Puffer gewaschen, um das Tetramer zu entfernen. Die Säule wird sodann mit etwa 250 l eines 300 mM Natriumchlorid-Puffers gewaschen, um das Polymer wegzuwaschen. Polymerfraktionen werden in Tank 7 gesammelt. Nicht-erwünschte Fraktionen werden in Richtung des Ablaufs 46 geschickt. Nach dem Entfernen eines jeden Aliquots wird die Säule mit 15 mM HCl-Lösung (150 l) regeneriert, erneut mit 30 mM wässriger NaCl-Lösung (250 l) equilibriert und ein weiteres Aliquot einer Zuführlösung (40 l) wird auf die Säule geladen. Die Säule wird erneut mit 30 mM NaCl gewaschen, gefolgt von 300 mM NaCl. 40 l-Aliquots an Hämoglobinlösung werden zu der Säule hinzugefügt und chromatographisch aufgetrennt, bis der Tank 6 leer ist.
Die gesammelten Fraktionen in Tank 7 werden mit Hilfe von Filter 48, der mit dem Ablauf 50 verbunden ist, auf ein Volumen von etwa 40 l (6% Gesamthämoglobin) ultrafiltriert (einkonzentriert). Die einkonzentrierte Hämoglobinlösung wird sodann in einen Gasaustauschtank 8 für eine Desoxidierung überführt.
Alternativ wird die Lösung einem Filtrations-Erneuerungsgefäß 10, wie in 6 gezeigt, zugeführt. Das Hämoglobin wird sodann auf etwa 4% THb in Tank 10 verdünnt. Die 4%ige THb-Lösung wird sodann mit Hilfe von 10 mM NaCl und einem 300 000-Molekulargewichtsfilter 52, der von Pall-Filtron käuflich verfügbar ist, diafiltriert. Die Filtration wird fortgesetzt, bis etwa 97% des Hämoglobinmaterials durch den Filter und in den Tank 11 getreten sind (etwa 3% des Materials, d. h. Polymere mit einem hohen Molekulargewicht werden in Tank 10 zurückgehalten). Die Menge an Hämoglobin wird spektrophotometrisch mit Hilfe eines Kooximeters bestimmt.
Das sich ergebende Material in Tank 11 ist etwa 2–4% THb und enthält etwa 7–10% Tetramer basierend auf THb. Die 2–4% THb werden sodann mit Hilfe von 10 mM NaCl und einem 100 000-Molekulargewichtsfilter 54, der von Pall-Filtron käuflich verfügbar ist und mit einem Ablauf oder einer Falle 56 verbunden ist, diafiltriert. Die Filtration wird fortgesetzt, bis die Menge an Tetramer, wie durch Größenausschlusschromatographie mit Hilfe einer BioSep SEC-53000 600 × 7,8 mm-Säule bestimmt, weniger als 0,8% der Hämoglobin-Gewichtsmasse beträgt. Die sich ergebende aufgereinigte Hämoglobinlösung verbleibt anfänglich in Tank 11 und wird sodann dem Gasaustauschtank 8 für eine Desoxidierung zugeführt.
Der Gasaustauschtank 8 kann der gleichen Tank wie Tank 4 sein oder er kann vorzugsweise ein anderer Tank sein. Der Gasaustauschtank 8 ist im Wesentlichen genauso wie der Gastaustauschtank 4 in 1 ausgestattet und ist mit dem Schaumgefäß 58, identisch zu Tank 4 und dem Schaumgefäß 36, verbunden. Eine Desoxidierung erfolgt in etwa 2,5 Stunden mit einer Stickstoffspülung bei etwa 10°C und einem pH-Wert in der Lösung von etwa 7,5. Die Stickstoffspülung wird fortgesetzt, bis weniger als etwa 16% Oxyhämoglobin, basierend auf dem Gewicht an Gesamthämoglobin, in der Lösung verbleiben. Die sich ergebende Desoxyhämoglobinlösung wird sodann in den Tank 9 für eine Formulierung überführt.
In dem Formulierungstank 9 wird die Lösung zuerst auf etwa 7% Gesamthämoglobin einkonzentriert und der pH-Wert auf etwa 8,8 bis 9,0 bei 4°C eingestellt. Der pH-Wert wird mit Hilfe von 0,2 M NaOH eingestellt. Elektrolytlösungen werden sodann zu der Hämoglobinlösung mit einem pH-Wert von 8,8 bis 9,0 hinzugegeben. Glucose und Glycin werden hinzugefügt, um Endkonzentrationen von etwa 5 g/l bzw. 1,75 g/l zu erreichen. Kaliumchlorid wird zu der Lösung hinzugefügt, um eine Kaliumkonzentration von etwa 3,5 bis 4,5 mmol zu erhalten. 3 M Natriumchlorid wird sodann hinzugegeben, um eine Chloridkonzentration von 85–110 mmol zu erhalten. Natriumlactat wird anschließend hinzugegeben, um eine Konzentration an Natriumionen von 135–155 mmol zu erhalten. Schließlich wird eine 0,45 M Ascorbinsäurelösung hinzugefügt, um die Ascorbinsäurekonzentration auf etwa 1000 mg/l zu erhöhen. Ascorbinsäure wird als Konservierungsmittel/Antioxidans für eine Lagerung hinzugefügt. Die sich ergebende Hämoglobinlösung weist eine abschließende Osmolalität von etwa 280–360 mmol/kg auf.
Die formulierte Hämoglobinlösung wird sodann auf etwa 10% Gesamthämoglobin mit Hilfe eines Filters 60, der an eine Falle 62 angeschlossen ist, einkonzentriert und die 10%ige Hämoglobinlösung wird sodann durch Filtration mit Hilfe des Filters 64 sterilisiert und aseptisch in vorsterilisierte Beutel eingefüllt.
Die Eigenschaften des in diesem Beispiel hergestellten Produkts, Charge A, sind in Tabelle 1 gezeigt. Weiterhin sind die Eigenschaften der Chargen B und C, beide gemäß dem vorstehend für Charge A beschriebenen Verfahren hergestellt, in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Vorstehend wurde eine detaillierte Beschreibung der bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsformen für eine Veranschaulichung und nicht für eine Begrenzung bereitgestellt.

Claims

Eine wässrige Lösung von pyridoxyliertem, Glutaraldehyd-polymerisiertem Hämoglobin, das einen Tetramer-Gehalt von nicht mehr als 0,8 Gew.-%, basierend auf dem Gewicht des gesamten Hämoglobins in der Lösung, und, basierend auf dem Gewicht des gesamten Hämoglobins in der Lösung, eine Verteilung des Molekulargewichts von – 10 bis 24% Hämoglobin-Polymer mit einem Molekulargewicht von etwa 128 kDa, – 18 bis 30% Hämoglobin-Polymer mit einem Molekulargewicht von etwa 192 kDa, und – 45 bis 70% Hämoglobin-Polymer mit einem Molekulargewicht von etwa 256 kDa, bestimmt durch Größenausschluss-HPLC, aufweist.
Hämoglobinlösung nach Anspruch 1, wobei die Lösung eine Halbwertszeit in einem menschlichen Patienten von etwa 15 Stunden aufweist.
Hämoglobinlösung nach Anspruch 1, wobei die Lösung eine Halbwertszeit in einem menschlichen Patienten von etwa 24 Stunden aufweist.
Lösung nach Anspruch 1, wobei die Lösung in einer Menge von bis zu etwa 5 l infundiert werden kann.
Hämoglobinlösung nach Anspruch 1, wobei die Lösung fähig ist, in einem menschlichen Patienten in einer Menge von bis zu etwa 3 l infundiert zu werden, ohne einen Abfall der Nierenleistung zu verursachen, und die Lösung eine Halbwertszeit in einem menschlichen Patienten von etwa 24 Stunden aufweist.
Lösung nach Anspruch 1, umfassend: (a) ein Gesamt-Hämoglobin von 9,5 bis 12,0 g/dl, (b) ein Gesamt-Methämoglobin von weniger als 8% des gesamten Hämoglobins, (c) ein Gesamt-Carboxyhämoglobin von weniger als 5% des gesamten Hämoglobins, (d) eine Sauerstoff-Hämoglobin-Dissoziation von 23 bis 32 torr, (e) eine Osmolalität von 280 bis 360 mol/kg, (f) eine Natriumkonzentration von 135 bis 155 mmol/l, (g) eine Kaliumkonzentration von 3,5 bis 4,5 mmol/l, (h) eine Chloridkonzentration von 85 bis 110 mmol/kg, (i) ein gesamtes freies Eisen von weniger als 2,0 ppm, (k) Endotoxin bei weniger als 0,03 EU/ml, (l) Phospholipide bei weniger als 50 ng/Hb, (m) Glycolipide bei weniger als 2 ng/Hb und (n) einen Tetramer-Gehalt von 0,3 bis 0,4%.
Lösung nach einem der Ansprüche 1 bis n, wobei die Hämoglobinzubereitung etwa 16% Hämoglobin-Polymer mit einem Molekulargewicht von etwa 128 kDa-Peak, etwa 26% Hämoglobin-Polymer mit einem Molekulargewicht von etwa 192 kDa-Peak und etwa 58% Hämoglobin-Polymer mit einem Molekulargewicht von etwa 256 kDa-Peak, bestimmt durch Größenausschluss-HPLC, umfasst.
Verfahren zum Herstellen einer wie in Anspruch 1 beanspruchten Lösung von pyridoxyliertem, Glutaraldehyd-polymerisiertem Hämoglobin, umfassend die Schritte: (a) Entfernen von Leukozyten vom Blut durch Filtration durch einen Filter mit einer minimalen mittleren Porengröße, die ausreicht, um die Passage von Leukozyten zu verhindern, (b) Waschen des Filtrats unter einer Kohlenstoffmonoxid-Atmosphäre mit einer 1%igen NaCl-Lösung, um restliche Plasmaproteine zu entfernen, (c) Lysieren der roten Blutzellen durch Verdünnen des gewaschenen Filtrats (b) mit Wasser, (d) Filtrieren der erhaltenen Suspension, um eine von Stroma- und Zellwand-Material freie Hämoglobinlösung herzustellen, (e) Erhitzen der Hämoglobinlösung von (d) für etwa 10 Stunden auf etwa 60 bis 62°C und Filtrieren der hitzebehandelten Hämoglobinlösung, um zusätzliches Stroma und stromale Verunreinigungen, die durch den Hitzeschritt ausgefällt werden, zu entfernen, (f) Konzentrieren und Diafiltrieren der filtrierten, hitzebehandelten Hämoglobinlösung, um eine Carboxy-Hämoglobin-Lösung zu ergeben, (g) Entgasen der Lösung durch Zerstäuben von Sauerstoff und sodann Stickstoff durch die Carboxy-Hämoglobin-Lösung bei einer Temperatur von etwa 10°C, um einen Schaum herzustellen, (h) Behandeln der entgasten Lösung von (g) mit 1 bis 3 mol Pyridoxal-5'-phosphat pro Mol Hämoglobin in Gegenwart eines Borhydrids und sodann Filtrieren, um eine Lösung von pyridoxyliertem Hämoglobin zu ergeben, (i) Behandeln der filtrierten Lösung von pyridoxyliertem Hämoglobin von (h) mit einer wässrigen Glutaraldehydlösung, um die gewünschte molekulare Verteilung von Hämoglobin-Polymeren und etwa 75 Gew.-% Polymere, basierend auf dem Gesamtgewicht des Hämoglobins, zu ergeben, (k) schnelles Zusetzen einer wässrigen Glycinlösung, um die Polymerisationsreaktion zu quenchen (zu stoppen), und sodann schnelles Hinzusetzen einer wässrigen Natriumbarhydridlösung, um die Quervernezungen zu stabilisieren, (l) Konzentrieren der aus (k) erhaltenen Lösung und sodann Diafiltrieren unter einer Sauerstoffatmosphäre, (m) Reinigen der aus (l) erhaltenen oxygenierten Lösung, um das Tetramer zu entfernen, und Deoxygenieren der Lösung, bis der Gehalt an Oxyhämoglobin in der Lösung weniger als etwa 16 Gew.-% des gesamten Hämoglobins beträgt, und (n) Einstellen des pH-Werts und der Elektrolytspiegel der aus (m) erhaltenen Lösung, um die von normalem Plasma darzustellen.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei in Schritt (h) die entgaste Lösung dadurch pyridoxyliert wird, dass die entgaste Lösung mit Pyridoxal-5'-phasphat bei einem molekularen Verhältnis von Pyridoxal-5'-phosphat zu Hämoglobin von 2 : 1 in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Pyridoxal-5'-phosphat mit dem Hämaglobin und Borhydrid etwa 1 Stunde in Kantakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei in Schritt (i) das Hämoglobin in der pyridoxylierten Lösung dadurch polymerisiert wird, dass die pyridoxylierte Lösung mit Glutaraldehyd bei einem molaren Verhältnis von Glutaraldehyd zu Hämoglobin von etwa 24 : 1 in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei in Schritt (i) die pyridoxylierte Lösung mit Glutaraldehyd etwa 18 Stunden in Kontakt gebracht wird.
Wässrige Hämoglobinlösung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 als ein Arzneimittel.