ES2200177T3 - Procedimiento y aparato para preparar un sustituto acecular de globlulo rojo. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA UN PROCESO PARA LA PREPARACION DE HEMOGLOBINA BASICAMENTE LIBRE DE TETRAMERO, BASICAMENTE LIBRE DE ESTROMA, POLIMERIZADO, PIRODOXILADO. TAMBIEN SE PRESENTA UN PRODUCTO DE HEMOGLOBINA BASICAMENTE LIBRE DE TETRAMERO, BASICAMENTE LIBRE DE ESTROMA, POLIMERIZADO, PIRODOXILADO QUE SE INFUNDE EN PACIENTES HUMANOS EN UNA CANTIDAD DE HASTA ALREDEDOR DE 5 LITROS.

Description

Procedimiento y aparato para preparar un sustituto acelular de glóbulo rojo.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos y aparatos para preparar productos sustitutos de glóbulos rojos, a saber, productos de hemoglobina. Se refiere además a un sustituto acelular de glóbulos rojos que comprende una solución de hemoglobina piridoxilada, polimerizada, reticulada, exenta esencialmente de tetrámeros, que está exenta de contaminantes de estroma.

Descripción de la técnica relacionada

Durante varios años, los bancos de sangre han proporcionado sangre completa para transfusiones durante intervenciones quirúrgicas debidas a traumatismos o por otras circunstancias. Sin embargo, la sangre completa obtenida de donantes humanos no es adecuada para diversas utilizaciones. En particular, la utilización de sangre completa es problemática debido al requisito del grupo sanguíneo del donante y de la toxicidad producida por virus y otros contaminantes. Estos problemas son especialmente relevantes para situaciones de urgencia, tales como la utilización por los militares. Por consiguiente, se han dedicado muchos esfuerzos al desarrollo de sustitutos de sangre completa obtenida a partir de donantes humanos. Este desarrollo ha producido varias modificaciones a la sangre de procedencia humana o de otros mamíferos. La hemoglobina exenta de estroma es conocida en la técnica por sus aptitudes para el transporte de oxígeno y de unión reversible al oxígeno (o ligando). Debido a que los problemas de toxicidad han excluido su utilización como sustituto de sangre, la hemoglobina exenta de estroma ha necesitado modificaciones adicionales para proporcionar un producto no tóxico, farmacéuticamente útil.

Estas modificaciones incluyen (1) hacer que la hemoglobina esté exenta o sustancialmente exenta de estroma y de contaminantes de estroma; (2) piridoxilación; (3) polimerización o reticulación; (4) eliminación del tetrámero y (5) modificación con monóxido de carbono u otros ligandos.

Sin embargo, las soluciones de hemoglobina preparadas mediante estas técnicas, mientras que son capaces de transportar suficientes cantidades de oxígeno para mantener la vida, han sido acosadas con muchos efectos secundarios y propiedades indeseables. Por ejemplo, un principal efecto secundario problemático consiste en la disminución del funcionamiento del riñón. Estos cambios se piensa que son debidos a la presencia de contaminantes no deseados tales como la endotoxina bacteriana o los fragmentos de membranas de glóbulos rojos (estroma). Mientras que los contaminantes como los citados pueden producir de hecho alteraciones renales, las soluciones de hemoglobina prácticamente exenta de los contaminantes anteriores producen todavía una disfunción renal sustancial. La causa de la disfunción renal se ha atribuido a cantidades fisiológicamente inaceptables de tetrámero de hemoglobina no polimerizado. Otros efectos secundarios indeseables de la infusión de hemoglobina tetrámera son la vasoconstricción, la hemoglobinuria, la disminución del ritmo cardíaco, la elevación de la presión sanguínea media arterial y el extravasado del infundido especialmente en la cavidad peritoneal.

En la práctica, ningún sustituto de sangre derivado de hemoglobina ha tenido éxito para evitar totalmente los problemas de toxicidad. Estos productos también presentan periodos de conservación inaceptablemente bajos después de la administración a pacientes humanos. Tales periodos de conservación requieren transfusiones del volumen sanguíneo de forma repetida durante periodos de tiempo cortos. Por consiguiente, existe una necesidad fundamental de productos de hemoglobina que no sean tóxicos para los pacientes y que presenten periodos de conservación considerables después de la administración. Desde luego, estos productos deben ser capaces de transportar de forma reversible el oxígeno a los tejidos de una manera similar a la que se consigue con la sangre completa.

El documento US-A-5.464.814 describe un procedimiento para preparar un polímero de hemoglobina de un peso molecular medio de aproximadamente 120.000 Da.

El documento EP-A-361.720 da a conocer una solución de un sustituto de sangre basado en hemoglobina. No se describe ninguna distribución del peso molecular.

El documento US-A-5.194.590 describe hemoglobina polimerizable en un intervalo de peso molecular de 120.000 a 600.000 Da. La media es de aproximadamente 120.000 Da.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona sustitutos de hemoglobina que no son tóxicos para pacientes humanos y que presentan periodos de conservación considerables de 15 horas, por lo menos, cuando se administran a pacientes humanos. Los productos de hemoglobina de la invención están exentos de estroma, piridoxilados y polimerizados además de estar exentos de contaminantes víricos y de otros tóxicos. Además, estos productos están exentos considerablemente de leucocitos (glóbulos blancos) y plaquetas.

La presente invención también abarca procedimientos para preparar los sustitutos inventivos de hemoglobina. Los procedimientos incluyen la eliminación de leucocitos y plaquetas de la sangre; lavando y lisando los glóbulos rojos; eliminando los contaminantes del estroma y el estroma por filtración y tratamiento con calor; preparando la forma desoxi de la hemoglobina; piridoxilación y polimerización; además de purificación y concentración; y desoxigenación. El producto resultante se puede formular a continuación para proporcionar un producto de hemoglobina con concentraciones de varios electrolitos dentro de márgenes fisiológicos normales.

La invención también proporciona una formulación acuosa de hemoglobina piridoxilada, polimerizada, en la que la hemoglobina es una hemoglobina polimerizada con glutaraldehído que contiene material tetrámero, que presenta el perfil de peso molecular de la Figura 3. Esta formulación se puede utilizar para preparar un sustituto de glóbulos rojos acelulares. En este aspecto, la formulación se purifica en primer lugar para eliminar el tetrámero y a continuación se combina con cantidades apropiadas de electrolitos para producir un sustituto de glóbulos rojos, acelular, fisiológicamente aceptable que puede, por consiguiente, ser utilizado para tratar un paciente humano que requiere una infusión de un transportador de oxígeno.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 es un diagrama esquemático que representa una parte del procedimiento y del equipo utilizado para producir una solución de hemoglobina desoxigenada preparada por piridoxilación y polimerización.

La Figura 2 es un diagrama esquemático que representa una parte del procedimiento y del aparato comenzando por la piridoxilación y polimerización y dando como resultado un producto polimerizado de hemoglobina, desoxigenado, purificado, piridoxilado y una parte del procedimiento y aparato utilizado para formular el producto de hemoglobina final que tiene concentraciones fisiológicas de electrolitos.

La Figura 3 es un gráfico de HPLC de material polimerizado después del tratamiento con glicina antes de la purificación. El producto está indicado con picos en los tiempos de retención (RT) 15,57, 16,08, 17,00 y 18,19. El material tetrámero está indicado por los picos a RT de 19,88 y 20,51. El polímero es 76,2% de este material.

La Figura 4 es un gráfico de HPLC del producto de hemoglobina de la invención. La hemoglobina polimerizada está indicada por los picos a RT de 15,7,16,33, 17,32 y 18,56. El tetrámero está indicado por los picos a RT 21,18.

La Figura 5 es un diagrama esquemático que representa el procedimiento de purificación por cromatografía en columna empleado en la invención.

La Figura 6 es un diagrama esquemático que representa el procedimiento de purificación por filtración en membrana empleado en la invención.

Descripción detallada de la forma de realización preferida

La presente invención se refiere a un sustituto de glóbulos rojos que comprende hemoglobina fundamentalmente exenta de tetrámeros, reticulada, polimerizada, piridoxilada, que está sustancialmente exenta de estroma, de contaminantes de estroma y de otros contaminantes.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "reticulado" significa la sustitución química de "puentes" moleculares en o dentro de una molécula, o entre moléculas con el fin de alterar la forma, en tamaño, la función o las propiedades físicas de la molécula. Las moléculas reticuladas pueden estar polimerizadas o no polimerizadas, es decir, las moléculas reticuladas pueden ser tetrámeras.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "tetrámero" se refiere a moléculas de hemoglobina con un peso molecular de aproximadamente 64 Kd; esto es, el término se refiere tanto a las moléculas de hemoglobina naturales como a las reticuladas intramolecularmente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "esencialmente exento de tetrámero" indica el nivel de pureza con respecto a la contaminación del tetrámero al cual no se presentan ya determinadas respuestas biológicas al tetrámero administrado a un mamífero. Un criterio principal es la ausencia de alteraciones en la función renal cuando se infunden cantidades farmacéuticamente eficaces, esto es, a un nivel de pureza de aproximadamente 99% o mejor (está presente menos de aproximadamente el 1% de tetrámero). El producto preferido producido por el procedimiento inventivo contiene no más de aproximadamente 0,8% de tetrámero basado en el peso de hemoglobina total (THb). En otras palabras, un producto esencialmente exento de tetrámero según la invención contiene no más que cantidades fisiológicamente aceptables de tetrámero no polimerizado de hemoglobina. Los productos particularmente preferidos de la invención contienen menos de aproximadamente el 0,5% de tetrámero; los productos más particularmente preferidos de la invención contienen aproximadamente del 0,3 al 0,4% de tetrámero. Se ha observado que dichas cantidades de tetrámero son fisiológicamente aceptables.

Tal como se utiliza en la presente memoria, los términos "producto ultrapurificado" o "producto purificado" tienen el mismo significado que el término "esencialmente exento de tetrámero".

Tal como se utiliza en la presente memoria, el % de hemoglobina total (THb) se define como gramos de hemoglobina/100 ml de solución.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "solución de polimerización" significa una solución que contiene un agente "reticulante" o polimerizante, tales como glutaraldehído, imidoésteres, diaspirina u otros, en un excipiente bioquímicamente adecuado.

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término polimerizado significa la colocación de puentes moleculares entre moléculas o subunidades tetrámeras, en las que el tamaño y el peso de la molécula polimerizada resultante aumenta con respecto a la hemoglobina natural o tetrámera. La hemoglobina polimerizada no es hemoglobina tetrámera.

Por solución de hemoglobina, tal como se utiliza en la presente memoria, se entiende una solución de hemoglobina tetrámera o moléculas polimerizadas de hemoglobina, en la que las moléculas no están contenidas dentro de glóbulos rojos. Dicha solución necesita estar exenta o sustancialmente exenta de estroma de glóbulos rojos o contaminantes de estroma. Sin embargo, las soluciones preferidas de hemoglobina polimerizada están exentas de estroma de glóbulos rojos y de contaminantes de estroma.

El término "membrana semipermeable" significa una membrana permeable a determinadas especies moleculares y no a otras, y, a saber, una membrana que actúa como filtro selectivo excluyendo determinados pesos moleculares.

El producto del procedimiento según la presente invención, solución de hemoglobina polimerizada, piridoxilada, esencialmente exenta de hemoglobina tetrámera (natural o intramolecularmente reticulada), de estroma y de diversos otros contaminantes, producidos a partir de hemoglobina tetrámera, tratada con calor, inactivada víricamente, es fisiológicamente aceptable además de terapeúticamente y clínicamente útil. El producto presenta capacidad reversible de unión al oxígeno que es necesaria para las propiedades de transporte de oxígeno. Más notablemente, el producto demuestra buenas propiedades de carga y descarga en el uso que se correlacionan al tener una curva de disociación oxígeno-hemoglobina (P_{50}) similar a la sangre completa. El producto se une al oxígeno con gran afinidad en los capilares a través de los pulmones y a continuación libera oxígeno en los tejidos del cuerpo. El producto tampoco necesita estudios de compatibilidad con el receptor.

El producto presenta asimismo una vida media cuando se administra a pacientes humanos de aproximadamente por lo menos 15 horas y más preferentemente de aproximadamente 24 horas. Este producto de hemoglobina se puede infundir en pacientes en cantidades de hasta aproximadamente 3,0 l e incluso hasta aproximadamente 5,0 l. En otras palabras, el producto de hemoglobina de la inventiva se puede utilizar para rellenar prácticamente todo el volumen sanguíneo de pacientes humanos sin producir vasoconstricción, toxicidad renal, hemoglobinuria u otros problemas asociados a la administración intravenosa de portadores sintéticos o semisintéticos de oxígeno y sustitutos de la sangre. Por lo tanto, la invención incluye un procedimiento para practicar una transfusión a un paciente, preferentemente un paciente humano, con una cantidad de producto de hemoglobina exento de estroma, exento de tetrámero, polimerizado, piridoxilado, que no es tóxico para el paciente, en el que la cantidad es hasta por lo menos aproximadamente 5,0 l. Dicho procedimiento incluye conectar el paciente o sujeto a un dispositivo de infusión o a otro equipo para infusionar o transfusionar al paciente.

El procedimiento de la presente invención es único porque proporciona un producto con una concentración de tetrámero de no más de aproximadamente el 1% y, más preferentemente, no más de aproximadamente el 0,8% en peso basado en el peso de hemoglobina total en la solución. El procedimiento de la presente invención proporciona una ventaja adicional en que puede hacer que el producto final esté prácticamente exento de antígenos y patógenos microbianos y víricos. Es decir tales antígenos y patógenos microbianos y víricos se reducen a concentraciones indetectables. El producto es estéril según se determina por análisis indicado en la Farmacopea de Estados Unidos, capítulo XXIII <71>. Ejemplos de dichos antígenos y patógenos, incluyen, por ejemplo, bacterias, rickettsias, hongos, protozoos, virus y otros organismos. De forma más significativa, el procedimiento proporciona un producto biológico exento de virus que produce hepatitis y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).

Por lo que se refiere a las propiedades fisiológicas, el producto biológico de la presente invención, cuando se infunde en cantidades de hasta por lo menos aproximadamente 5,0 l, no produce vasoconstricción, toxicidad renal, hemoglobinuria y otros problemas implicados en la administración intravenosa de conocidas soluciones de hemoglobina que contienen cantidades fisiológicamente indeseables de hemoglobina tetrámera. La administración intravenosa del producto producido por el procedimiento descrito en la presente memoria no produce ningún descenso apreciable en la producción de orina, ningún descenso apreciable en la tasa de filtración glomerular, ni ningún cambio apreciable en el color de la orina producida.

Por consiguiente, el procedimiento de la invención proporciona un sustituto acelular de glóbulos rojos útil para el tratamiento de traumatismos, infarto de miocardio, apoplejia, anemia de corta duración y trastornos por insuficiencia de oxígeno, tales como hipoxemia, hipoxia o hipoxia en etapa final debidas a la alteración o fallo del pulmón en la sangre completamente oxigenada. El producto también es útil para el tratamiento de cualquier enfermedad o estado médico que requiera un fluido reanimativo (p. ej.: traumatismo, choque específicamente hemorrágico), un expansor del volumen intravascular o una transfusión de intercambio. Además del tratamiento médico, el producto puede ser útil en la conservación de órganos para trasplantes.

El proceso inventivo comprende los siguientes procedimientos:

1. aspiración y filtración de glóbulos rojos

2. lavado/lisis de células

3. tratamiento con calor

4. concentración por ultrafiltración

5. desgasificación

6. modificación química

7. purificación

8. policoncentración de UP

9. desoxigenación

10. formulación

El material de partida preferido en el procedimiento de la presente invención es sangre humana completa caducada o glóbulos rojos concentrados. Además, se pueden utilizar también sangre (sin fecha) no caducada. Preferentemente, no se utiliza sangre completa en este procedimiento si ha estado almacenada durante más de 2 semanas después de la fecha de expiración indicada en la bolsa. La utilización de sangre completa caducada en más de 2 semanas proporciona una dificultad adicional en la extracción de hemoglobina y en la separación de los restos celulares tales como las proteínas y contaminantes del estroma.

Todos los procedimientos descritos en la presente memoria son aplicables a otras sangres de mamífero con posibles modificaciones menores dentro de la experiencia en la materia. La mayoría de los procesos se pueden realizar a aproximadamente 2ºC hasta aproximadamente 8ºC, con preferencia aproximadamente a 4ºC.

Durante la aspiración y filtración de los glóbulos rojos, se extraen los glóbulos rojos (RBC) asépticamente de las bolsas del donante sin introducir aire a la sangre y se pasan a través de una serie de filtros para producir una suspensión de RBC con cantidades reducidas de leucocitos y plaquetas. La suspensión resultante se somete a continuación a lavado/lisis celular.

La suspensión se lava en atmósfera de monóxido de carbono con una solución de NaCl aproximadamente al 1% para eliminar las proteínas residuales del plasma. Los RBC lavados se tratan a continuación con agua para inyectables (WFI), para lisar las células y la mezcla resultante se clarifica utilizando una unidad de filtración de flujo cruzado. El producto clarificado se trata a continuación con calor para precipitar el material adicional del estroma que se elimina por filtración. El producto de este procedimiento es una solución de hemoglobina exenta de estroma (SFH) con una THb de aproximadamente 3% (p/v).

La solución de hemoglobina tratada con calor y exenta de estroma que contiene carboxihemoglobina, se concentra y se desgasifica para dar una solución de SHF que contiene desoxihemoglobina. La desgasificación implica en primer lugar saturar la solución de carboxihemoglobina con oxígeno durante aproximadamente 16 horas para dar una solución de hemoglobina oxigenada y aproximadamente el 7% en peso, basado en el peso total de hemoglobina, de carboxihemoglobina. Posteriormente, el oxígeno es impulsado con nitrógeno, argón o helio para formar una solución que no contiene hemoglobina, es decir, hemoglobina no acomplejada y aproximadamente el 7% en peso, basado en el peso total de hemoglobina, de oxihemoglobina. La solución desgasificada resultante se filtra y se transfiere a un recipiente para su modificación química.

Después de la desgasificación, la solución de hemoglobina exenta de estroma se peridoxila utilizando
piridoxal-5'-fosfato (P5P) en una relación molar de piridoxal-5'-fosfato a hemoglobina de aproximadamente 1:1 a 3:1. Por otra parte, la hemoglobina exenta de estroma se puede piridoxilar utilizando piridoxal-5'-fosfato de
2- Nor-2 formilo. Un agente reductor, tal como cianoborohidruro de sodio o preferentemente borohidruro de sodio, se añade a la mezcla de piridoxilación. Los reactivos en exceso y las sales se eliminan por diálisis frente a agua exenta de pirógenos o, preferentemente, diafiltración con WFI. La hemoglobina piridoxilada se polimeriza a continuación con una solución de glutaraldehído.

La solución de hemoglobina piridoxilada, exenta de estroma se polimeriza utilizando una solución acuosa de glutaraldehído. La duración de la polimerización y la cantidad de glutaraldehído añadido depende del volumen de solución de hemoglobina, del rendimiento deseado de polímeros y de la distribución deseada de peso molecular. En general, los tiempos más prolongados de polimerización aumentan el rendimiento y la distribución del peso molecular de los polímeros. Un rendimiento de aproximadamente el 75% en peso de polímeros, basado en el peso total de hemoglobina, se obtiene en aproximadamente 16 a 18 horas. El punto final preferido de la polimerización se define como el punto en el que la solución contiene aproximadamente el 75% en peso de polímeros, basado en el peso de hemoglobina total, controlado por HPLC por exclusión de tamaño. Como alternativa, el punto final se define como el punto en el que la solución contiene aproximadamente el 65% de polímeros, basado en el peso total de hemoglobina, es decir, aproximadamente 2,5 horas.

La reacción de polimerización se enfría bruscamente mediante la adición de glicina acuosa. El tampón se debe añadir tan rápidamente como sea posible. Las reticulaciones se estabilizan a continuación añadiendo, otra vez tan rápidamente como se posible, una solución de borohidruro de sodio acuoso. Esta solución polimerizada se concentra posteriormente y a continuación se filtra por diálisis en una atmósfera de oxígeno para oxigenar la solución. Se añade, por último, agua a la solución hasta que la solución contiene aproximadamente el 4% en peso de hemoglobina.

La polimerización según la invención produce un rendimiento en polímeros con un peso molecular estrecho que oscila tal como se muestra en la Figura 3 y en el Ejemplo 1 más adelante.

La solución de hemoglobina piridoxilada, polimerizada, se purifica a continuación por cromatografía en columna, filtración, p. ej.: filtración en membrana, o ambas, para eliminar la hemoglobina residual no polimerizada (tetrámera) de la solución. La solución de hemoglobina polimerizada purificada se concentra a continuación hasta aproximadamente el 6% utilizando un aparato de ultrafiltración en preparación para intercambio de gases.

La solución concentrada se desoxigena a continuación con nitrógeno. La desoxigenación tiene lugar a aproximadamente 10 a 12ºC, hasta que la cantidad de oxihemoglobina en la solución es menor de aproximadamente el 16% en peso de la hemoglobina total.

La solución resultante de hemoglobina desoxigenada, purificada y polimerizada se concentra a continuación por ultrafiltración en atmósfera de nitrógeno, en un recipiente enfriado. El pH se ajusta a aproximadamente 8,8 a 9,0, y las cantidades de electrolitos se pueden ajustar según sea necesario a concentraciones representativas del plasma normal. Además, se pueden añadir opcionalmente antioxidantes convencionales tales como glutation, ascorbato o glucosa. Después que se concentra la solución a la concentración deseada, preferentemente alrededor del 10% en peso de hemoglobina polimerizada, piridoxilada, purificada, exenta de tetrámeros, exenta de estroma, se esteriliza la solución por filtración y se transfiere mediante un aparato de transferencia estéril en recipientes adecuados farmacéuticamente aceptables.

Las propiedades de la solución resultante de hemoglobina se muestran a continuación:

	Hemoglobina polimerizada
Hemoglobina total (g/dl)^{1}	9,5-12,0
Metahemoglobina (% de Hb total)^{1}	<8,0
Carboxihemoglobina (% de Hb total)^{1}	<5,0
P_{50} (torr)^{1}	23-32
Osmolalidad (mmol/kg)^{2}	280-360
Sodio (mmol/l)^{3}	135-155
Potasio (mmol/l)^{3}	3,5-4,5
Cloruro (mmol/l)^{3}	85-110
Hierro libre (ppm)^{4}	<2,0
P. molecular dist.-pico de 128 Kd (%)^{5}	10-24
P. molecular dist.-pico de 192 Kd (%)^{5}	18-30
P. molecular dist.-pico de 256 Kd (%)^{5}	45-70

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	Hemoglobina polimerizada
Tetrámero (64 K) (%)^{5}	<0,8
Endotoxina (EU/ml)^{6}	<0,03
Fosfolípidos (ng/Hb)^{7}	<50
Glicolípidos (ng/Hb)^{7}	<2
^{1} Concentración de hemoglobina polimerizada determinada espectrosfotométricamente.
^{2} Concentración de hemoglobina polimerizada determinada por osmometría.
^{3} Concentración de hemoglobina polimerizada determinada por electrodo de ion específico.
^{4} Concentración de hemoglobina polimerizada determinada por absorción atómica.
^{5} Determinado por HPLC de exclusión de tamaño.
^{6} Determinado por LAL utilizando un análisis disponible en el comercio de Associates of Cape Cod,
los componentes del análisis tienen los nº de catálogos 100-5, 800-1 y 3100-5.
^{7} Determinado por HPTLC.

Los ejemplos siguientes demuestran determinados aspectos de la presente invención. Sin embargo, debe entenderse que estos ejemplos se incluyen con fines ilustrativos únicamente y no pretenden ser totalmente definitivos en relación con las condiciones y el alcance de la presente invención. Todas las temperaturas se expresan en grados Celsius, a menos que se especifique de otra manera. Todos los porcentajes, p. ej.: de hemoglobina total (THb), a menos que se indique de otra manera, se expresan en peso/volumen (p/v). También se debería reconocer que cuando se han dado las condiciones de reacción típicas (p. ej.: temperatura, tiempos de reacción), se pueden utilizar las condiciones que están por encima y por debajo de estos intervalos específicos, aunque generalmente de forma menos conveniente.

A menos que se indique lo contrario, todos los recipientes y depósitos utilizados en el proceso inventivo se construyeron de acero inoxidable 316-L, preferentemente de un grado farmacéutico de dicho acero inoxidable que ha sido muy pulido y, por consiguiente, se limpia fácil y rápidamente. Las diversas tuberías y tubos de conexión están fabricados con el mismo acero inoxidable o de Teflon o tubería de silicona de grado farmacéutico. Los filtros y membranas utilizados en el proceso se pueden adquirir en Millipore Inc., Pall-Filtron o Cuno Inc.

La vida media del producto resultante de la invención se determina in vivo en mamíferos, p. ej.: humanos. Típicamente, se extrae una muestra de sangre de un mamífero, un periodo de tiempo después que el mamífero se ha infundido con el producto. Se determina a continuación la cantidad de producto centrifugando la muestra de sangre, expresando la porción de plasma, determinando espectrofotométricamente las concentraciones de hemoglobina en el plasma y a continuación correlacionando la cantidad de producto que permanece en el mamífero con la vida media del producto.

La cromatografía por exclusión de tamaño, HPLC, según la invención se realiza como sigue:

Se diluye la muestra con tampón de fosfato de potasio 0,2 M, pH 6,9 a 0,2 g/dl, se filtra a través de un filtro de 0,2 \mu y se inyecta en un sistema HPLC que consta de los siguientes componentes (en orden del flujo del sistema):

1. Bomba Pharmacia modelo 2248
	- la fase móvil es fosfato de potasio 0,2 M, pH 6,9
	- el caudal es 1,0 ml/minuto
2. Tubería PEEK o de titanio de 45 cm, 0,010 pulg. I.D.
3. Inyector Rheodyne modelo 7725i con un bucle para muestras PEK de 200 \mul
4. Tubería PEEK o de titanio de 18 cm, 0,010 pulg. I.D.
5. Filtro Upchurch modelo A431 de 0,5 \mu
6. Tubería PEEK o de titanio de 9 cm, 0,010 pulg. I.D.

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7. Precolumna Phenomenex Biosep SEC S-3000 75 \times 7,8 mm
8. Tubería PEEK o de titanio de 24 cm, 0,010 pulg. I.D.
9. Columna analítica Phenomenex Biosep SEC S-3000 600 \times 7,8 mm
10. Tubería PEEK o de titanio de 23 cm, 0,010 pulg. I.D.
11. Detector Pharmacia Uvicord SD UV
	- longitud de onda:	280 nm
	- célula de flujo:	vol.: 8 \mul., longitud de paso: 2,5 mm
	- intervalo:	2 AUFS
	- constante de tiempo:	10 segundos

La absorbancia del pico a 280 nm es registrada por un integrador LKB 2221, que integra las áreas de los picos individuales y calcula el área de la Hemoglobina total de cada especie polimérica.

Una comprensión adicional de la invención se puede obtener a partir de los ejemplos siguientes no limitativos.

Ejemplo 1

En relación ahora con la Fig. 1, las bolsas de donante 20 de sangre caducada (sangre total o glóbulos rojos concentrados) se colocan en un aparato de aspiración aséptica 22 adecuado. Como ejemplo de aparato de aspiración adecuado existe un sistema con dos posiciones de aspiración. Una vez se coloca una bolsa de donante en la posición de aspiración, una aguja en el aparato de aspiración pincha la bolsa del donante, introduce aproximadamente 150 ml de una solución de cloruro de sodio acuoso al 1% (p/v) y aspira la sangre caducada de la bolsa del donante a presión reducida o al vacío. La sangre aspirada se pasa a través de un filtro 24 de 100 \mu de espesor y posteriormente a través de filtros en serie 26 de 5 \mu de espesor. A medida que la sangre pasa a través de los filtros de 5\mu de espesor, se eliminan los leucocitos de la sangre. Típicamente, se aspiran aproximadamente 170 unidades de sangre total caducada, se filtran y se transfieren posteriormente al Depósito 1, tal como se muestra en la Fig. 1. Se lavan a continuación los filtros con aproximadamente 75 litros de solución acuosa de cloruro de sodio al 1% (p/v).

Antes de la introducción de la sangre en el Depósito 1, se carga el Depósito 1 con aproximadamente 70 l de una solución de cloruro de sodio al 1%. Después que se han aspirado, filtrado y transferido todas las 170 unidades de sangre completa caducada y se han enjuagado los filtros, el depósito contiene aproximadamente 250 litros de una solución de hemoglobina total al 4%. Durante las etapas de aspiración y filtración, el depósito se mantiene a presión reducida, es decir, un vacío de 20 a 28 '' de Hg. Una vez se ha transferido toda la sangre caducada al Depósito 1, se desconecta el vacío y se introduce monóxido de carbono en el depósito con el fin de que el depósito contenga una atmósfera de monóxido de carbono.

El Depósito 1 se acopla a un filtro de flujo tangencial 28 de 0,65 \mu tal como se muestra en la Fig. 1. La carga inicial de 250 litros de solución de hemoglobina total al 4% se concentra a aproximadamente 125 l de una solución de hemoglobina total al 8% mediante microfiltracción a través del filtro de flujo tangencial. El pH de la solución de hemoglobina en este momento es de aproximadamente 6 a 6,5. Después de concentrar la hemoglobina total al 8%, se lava la solución añadiendo una solución de cloruro de sodio al 1% (p/v), filtrando por diálisis y eliminando el filtrado a la misma velocidad que se añade el cloruro de sodio. Los 125 l de solución de hemoglobina se lavan típicamente con aproximadamente 8 volúmenes de solución de cloruro de sodio al 1% (aproximadamente 1.000 l). Después de lavar, se concentra la solución hasta aproximadamente 70 l, es decir, hemoglobina total al 14% aproximadamente y se añade "agua para inyectables" (WFI) para llevar el volumen de la solución hasta aproximadamente 180 l. Con la adición del WFI, las células se hinchan y se rompen liberando la hemoglobina en la solución. La concentración de la solución de hemoglobina resultante es aproximadamente el 5% de la hemoglobina total (THb).

La solución resultante se clarifica mientras permanece en el Depósito 1. La solución se concentra en primer lugar hasta aproximadamente 50 l y el filtrado se transfiere al Depósito 2. A medida que se bombea la solución a través del filtro, los contaminantes de estroma de glóbulos rojos y el material de la pared celular es retenido y eliminado por el filtro. Los 50 l restantes de solución en el Depósito 1 se lavan (se filtran por diálisis) con aproximadamente 2,5 volúmenes de WFI. Estos 2,5 volúmenes de lavado se añaden al Depósito 2. El material restante en el Depósito 1 se concentra a continuación hasta aproximadamente 20 l y se añade el filtrado al Depósito 2. El volumen resultante en el Depósito 2 es aproximadamente 280 l de una solución de hemoglobina total al 3,3%.

La solución resultante de hemoglobina exenta de estroma se trata a continuación con calor en el Depósito 2 a una temperatura de aproximadamente 60 a 62ºC durante un periodo de aproximadamente 10 horas. Durante este periodo, se agita la solución de forma moderada. A medida que se calienta la solución y sobrepasa una temperatura de aproximadamente 55ºC, se forma un precipitado.

La solución resultante de hemoglobina tratada con calor, de THb al 33% (p/v), exenta de estroma se filtra a continuación a través de un filtro 30 de 0,2 \mu, después por un filtro 32 de 0,1 \mu y se transfiere al Depósito 3. La solución de hemoglobina filtrada se concentra a continuación hasta aproximadamente THb al 18%, posteriormente se lava y se filtra por diálisis con 4 volúmenes de WFI (180 l). La concentración y la filtración por diálisis se realizan utilizando un ultrafiltro 34 para peso molecular de 10 kilodalton (kd). El desagüe 35 asociado al ultrafiltro 34 recoge el filtrado. En este momento, los 45 l de solución de hemoglobina total al 18% contienen menos de 50 ng de fosfolípido por gramo de hemoglobina, menos de 2 ng de glicolípido por gramo de hemoglobina, menos del 1% de metahemoglobina, menos de aproximadamente 0,03 unidades de endotoxina por mililitro a un pH de aproximadamente 6 a 6,5. Esta hemoglobina en solución es carboxihemoglobina.

La solución de carboxihemoglobina resultante se transfiere a continuación al Depósito 4, en el que se oxigena en primer lugar la carboxihemoglobina y a continuación se desoxigena. El Depósito 4 está equipado con un anillo barboteador de gas acoplado a las líneas de gases de oxígeno y nitrógeno, con una alimentación desde el fondo del depósito hasta un aparato de pulverización dosificada colocado en la parte superior del Depósito 4 y con un recogedor de espuma de rebose conectado al bidón de espuma 1, de modo que la espuma generada en el Depósito 4 se alimenta al bidón de espuma 36, en el que la espuma condensa dentro del líquido y se vuelve a alimentar al Depósito 4. El Depósito 4 incluye además una serie de anillos Pall que rellenan aproximadamente un tercio del volumen del depósito. El bidón de espuma 36 comprende un venteo de gas para la eliminación del gas. La solución en el Depósito 4 es una solución de hemoglobina total al 13%.

Durante una primera etapa de oxigenación, se burbujea oxígeno a través de la solución en una cantidad suficiente para tener una dispersión uniforme de gas en el recipiente. El depósito, de 200 l de volumen, se barbotea con gas a un caudal de aproximadamente 25 l/min. La oxigenación de la carboxihemoglobina, se realiza durante un periodo de aproximadamente 16 horas, de modo que la solución resultante contiene menos del 5% de carboxihemoglibina basada en el peso de hemoglobina total. La oxigenación se realiza a una temperatura de aproximadamente 10ºC. La espuma generada en el Depósito 4 se recoge en el bidón de espuma 36 y después de sedimentar, se vuelve a transferir la solución resultante al Depósito 4.

Después de la oxigenación, se barbotea la solución a un caudal de nitrógeno similar durante aproximadamente 6 horas o hasta menos del 10% de oxihemoglobina, basada en el peso de hemoglobina total que permanece en solución. El barboteo de nitrógeno se realiza a una temperatura de aproximadamente 10ºC y a un pH de aproximadamente 6 a 6,5. Como alternativa, la carboxihemoglobina, se podría transformar en desoxihemoglobina utilizando un intercambiador de membrana. Obsérvese que no existe prácticamente desnaturalización de hemoglobina como sería de esperar normalmente en la etapa de formación de espuma. La solución desoxigenada resultante se prepara ahora para la modificación química.

Con relación ahora a la Fig. 2, la solución de desoxihemoglobina se transfiere al Depósito 5 para la modificación química. A continuación se añade al Depósito 5 que contiene la solución de desoxihemoglobina a aproximadamente 4ºC, una solución acuosa de piridoxil-5-fosfato (P5P) (93,75 g/l) en una relación molar de P5P a hemoglobina de 1:1 a 3:1. Es preferible una relación molar de P5P a hemoglobina de 2:1. La piridoxilación se realiza a una temperatura de aproximadamente 4ºC. La solución de P5P se añade típicamente durante 1 minuto aproximadamente y se mezcla durante 15 minutos aproximadamente, después de lo cual se añade una solución de borohidruro de sodio/hidróxido de sodio a la solución de hemoglobina a una relación molar de borohidruro de sodio a hemoglobina de aproximadamente 20:1. Una solución acuosa adecuada de borohidruro de sodio/hidróxido de sodio contiene 0,8 g de hidróxido de sodio por cada 2 litros y 90,8 g de borohidruro de sodio por cada 2 litros. La solución de borohidruro se añade tan rápidamente como sea posible durante un periodo de aproximadamente 1 minuto y a continuación se agita durante una hora. Los 50 l de solución resultante de hemoglobina piridoxilada se filtran por diálisis posteriormente utilizando el ultrafiltro 38 de 10 K Dalton para eliminar el exceso de reaccionantes con 4 volúmenes de WFI. El desagüe 40 asociado al ultrafiltro 38 recoge el filtrado del filtro 38.

Después de la filtración por diálisis con 4 volúmenes, es decir, 200 l de WFI, se polimeriza la hemoglobina. Al Depósito 5 que contiene la hemoglobina piridoxilada se añade suficiente WFI para preparar una solución de hemoglobina total al 4,5% (aproximadamente 175 l de solución de hemoglobina). Se añade una solución de glutaraldehído a la solución de hemoglobina piridoxilada a una relación molar de glutaraldehído a hemoglobina de aproximadamente 24:1. La solución de glutaraldehído se añade a la solución de hemoglobina, típicamente, durante un periodo de aproximadamente 2,5 horas mediante una bomba dosificadora. Se deja que proceda la reacción de polimerización durante aproximadamente 18 horas. La distribución deseada del peso molecular es aproximadamente 75% de polímero y 25% de tetrámero. Los polímeros deseados tienen pesos moleculares inferiores a aproximadamente 600.000 con una fracción predominante de pesos moleculares que se sitúa en el intervalo de 100.000 a 350.000.

Cuando la reacción de polimerización alcanza la distribución de pesos moleculares deseada (después de aproximadamente 18 horas), se añade (como enfriamiento brusco) glicina acuosa (aproximadamente 166 g/l) a la solución de hemoglobina a una relación molar de glicina a hemoglobina de 140:1. Véase la Fig. 3 que es un gráfico de HPLC del producto polimerizado resultante de hemoglobina, enfriado bruscamente con glicina. La solución resultante se mezcla a continuación durante aproximadamente 10 minutos, después de los cuales se añade a la solución de hemoglobina una solución de borohidruro de sodio/hidróxido de sodio (con la concentración indicada anteriormente) a una relación molar de borohidruro de sodio a hemoglobina de 28:1. Esta mezcla resultante se agita durante aproximadamente 1 hora. La solución se concentra a continuación hasta aproximadamente 50 l (ultrafiltro 38) y se lava con 4 volúmenes (200 l) de WFI. Se añade a la solución concentrada una alícuota adicional de borohidruro de sodio en la misma relación molar indicada anteriormente y se mezcla de nuevo durante 1 hora. La solución resultante se lava con 4 volúmenes de WFI (200 l) produciendo hemoglobina polimerizada, piridoxilada, exenta de estroma que se ha tratado con calor.

Se oxigena la solución resultante dejando reposar la solución bajo una atmósfera de oxígeno y se transfiere posteriormente a un sistema de purificación 42. La purificación se puede conseguir por cromatografía en columna, filtración, preferentemente filtración en membrana (filtración por diálisis) o una combinación de filtración y cromatografía en columna.

En una forma de realización, la solución se transfiere al recipiente de alimentación a la cromatografía, Depósito 6, tal como se muestra en la Figura 5. En esta forma de realización, la solución resultante de oxihemoglobina se diluye a continuación hasta aproximadamente 200 l (hemoglobina total al 4%) en el Depósito 6 y se ajusta la concentración de cloruro a 22 mM con solución de cloruro de sodio. No es necesario ningún ajuste de concentración de sodio.

A continuación se cromatografían cinco alícuotas de 40 l de solución de hemoglobina resultante utilizando la Columna 44. La Columna 44 contiene un gel de afinidad que es un gel de agarosa modificado con un colorante amarillo (disponible en el comercio en Affinity Chromatography, Ltd., como Mimetic Yellow nº 1) con mayor afinidad para el polímero que para el tetrámero.

La cromatografía se realiza de la forma siguiente. Se cargan 40 l de solución de hemoglobina oxigenada, polimerizada, piridoxilada, exenta de estroma en la Columna 44. Se lava la columna con 15 volúmenes de columna (aproximadamente 750 l) de tampón acuoso de NaCl 30 mM para eliminar el tetrámero. Se lava la columna a continuación con aproximadamente 250 l de tampón de cloruro de sodio 300 mM para lavar el polímero. Se recogen las fracciones de polímero en el Depósito 7. Las fracciones no deseadas se envían al desagüe 46. Después se elimina cada alícuota, se regenera la columna con solución HCl 15 mM (150 l), se reequilibra con NaCl acuoso 30 mM (250 l) y se carga a la columna otra alícuota de la solución de alimentación (40 l). Se lava de nuevo la columna con NaCl 30 mM, seguido de NaCl 300 mM. Se añaden alícuotas de 40 l de solución de hemoglobina a la columna y se cromatografía hasta que el Depósito 6 está vacío.

Se ultrafiltran (concentran) las fracciones recogidas en el Depósito 7 utilizando el filtro 48 asociado al desagüe 50, hasta un volumen de aproximadamente 40 l (6% de hemoglobina total). Se transfiere a continuación la solución concentrada de hemoglobina a un Depósito 8 de intercambio de gas para desoxigenación.

Como alternativa, se transfiere la solución a un recipiente de reciclo de la filtración 10, tal como se muestra en la Fig. 6. Se diluye a continuación la hemoglobina a aproximadamente THb al 4% en el Depósito 10. La solución de THb al 4% se filtra por diálisis a continuación utilizando NaCl 10 mM y un filtro 52 para peso molecular 300.000 disponible en el comercio en Pall-Filtron. Se continúa la filtración hasta que el 97% del material de hemoglobina pasa a través del filtro y dentro del Depósito 11. (En el Depósito 10 se retiene aproximadamente el 3% del material, es decir, los polímeros de elevado peso molecular). Se determina espectrofotométricamente la cantidad de hemoglobina utilizando un cooxímetro.

El material resultante en el Depósito 11 es aproximadamente el 2 al 4% de THb y contiene aproximadamente el 7 al 10% de tetrámero basado en la THb. El 2 al 4% de THb se filtra por diálisis a continuación utilizando NaCl 10 mM y un filtro 54 para peso molecular de 10.000, disponible en el comercio en Pall-Filtron asociado al desagüe o a la trampa 56. Se continúa la filtración hasta que la concentración de tetrámero, determinada por cromatografía por exclusión de tamaño utilizando una columna BioSep SEC-S3000 de 600 \times 7,8 mm, es menor del 0,8% de la masa de hemoglobina en peso. La solución de hemoglobina purificada resultante permanece inicialmente en el Depósito 11 y se transfiere posteriormente al Depósito 8 de intercambio de gas para desoxigenación.

El Depósito 8 de intercambio de gas puede ser el mismo depósito que el Depósito 4 o, preferentemente, un depósito diferente. El Depósito 8 de intercambio de gas está equipado esencialmente del mismo modo que el Depósito 4 de intercambio de gas de la Fig. 1 y está conectado al bidón de espuma 58 de una manera idéntica a la del Depósito 4 y el bidón de espuma 36. La desoxigenación se realiza aproximadamente en 2,5 horas con barboteo de nitrógeno a aproximadamente 10ºC y a un pH de solución de aproximadamente 7,5. El barboteo de nitrógeno se continúa hasta que aproximadamente menos del 16% de oxihemoglobina, basado en el peso de hemoglobina total, permanece en solución. La solución de desoxihemoglobina resultante se transfiere posteriormente al Depósito 9 para su formulación.

En el Depósito 9 de formulación, se concentra en primer lugar la solución hasta aproximadamente el 7% de hemoglobina total y se ajusta el pH hasta aproximadamente 8,8 a 9,0 a 4ºC. El pH se ajusta utilizando NaOH 0,2 M. Se añaden a continuación soluciones de electrolito a la solución de hemoglobina a pH 8,8 a 9,0. Se añaden glucosa y glicina para conseguir concentraciones finales de aproximadamente 5 g/l y 1,75 g/l respectivamente. Se añade a la solución cloruro de potasio para obtener una concentración en potasio de aproximadamente 3,5 a 4,5 mM. Se añade a continuación cloruro de sodio 3 M para obtener una concentración en cloruro de 85 a 110 mM. Posteriormente se añade lactato de sodio para obtener una concentración de ión sodio de 135 a 155 mM. Por último, se añade una solución de ácido ascórbico 0,45 molar para aumentar la concentración de ácido ascórbico hasta aproximadamente 1.000 mg/l. El ácido ascórbico se añade como conservante/antioxidante para el almacenamiento. La solución de hemoglobina resultante tiene una osmolalidad final de aproximadamente 280 a 360 mmol por kg.

La solución de hemoglobina formulada se concentra a continuación a aproximadamente el 10% de hemoglobina total utilizando el filtro 60 asociado a la trampa 62 y la solución de hemoglobina al 10% se esteriliza a continuación por filtración mediante el filtro 64 y se llena asépticamente en bolsas preesterilizadas.

En la Tabla 1 se muestran las propiedades del producto preparado en este ejemplo, Lote A. Además, en la Tabla 1 se muestran las propiedades de los Lotes B y C, preparados ambos según el procedimiento indicado anteriormente para el Lote A.

TABLA 1

		Lote
Prueba	A	B	C
Hemoglobina, g/dl	10,4	10,2	10,2
Metahemogloblina, %	4,6	6,0	5,6
Carboxihemoglobina, %	0,2	1,4	1,5
P_{50} (Torr, pH 7,35-7,45,	28,5	26,8	27,0
pCO_{2} 35-40 torr)
Osmolalidad, mmol/l	318	320	317
Sodio, mmol/l	142	144	142
Potasio, mmol/l	4,0	4,0	4,0
Cloruro, mmol/l	98	99	94
Hierro libre, ppm	0,7	1,2	1,4
Distribución del peso	128:16	128:11	128:16
molecular, % a cada PM	192:26	192:23	192:26
(Kd)	256^{8}:58	256^{8}:66	256^{8}:58
Tetrámero, %	0,4	0,3	0,4
Endotoxina, EU/ml	<0,03	<0,03	<0,03
^{8} El material comprende también una pequeña cantidad de material de elvado peso molecular.

En los puntos anteriores se ha proporcionado una descripción detallada de formas de realización preferidas de la presente invención con fines ilustrativos y no limitativos.

Claims (13)

1. Solución acuosa de hemoglobina piridoxilada, polimerizada con glutaraldehído, con un contenido en tetrámeros no superior al 0,8% en peso, basado en el peso de hemoglobina total en la solución y con una distribución de peso molecular, basada en el peso de hemoglobina total en la solución, de

\bullet

10 al 24% de polímero de hemoglobina con un peso molecular de aproximadamente 128 kd,

\bullet

18 al 30% de polímero de hemoglobina con un peso molecular de aproximadamente 192 kd, y

\bullet

45 al 70% de polímero de hemoglobina con un peso molecular de aproximadamente 256 kd, determinado por HPLC por exclusión de tamaño.

2. Solución de hemoglobina según la reivindicación 1, en la que la solución tiene una vida media en un paciente humano de aproximadamente 15 horas.

3. Solución de hemoglobina según la reivindicación 1, en la que la solución tiene una vida media en un paciente humano de aproximadamente 24 horas.

4. Solución de hemoglobina según la reivindicación 1, en la que la solución se puede infundir en una cantidad de hasta aproximadamente 5 litros.

5. Solución de hemoglobina según la reivindicación 1, en la que la solución es capaz de ser infundida en un paciente humano en una cantidad de hasta 3 litros sin producir una disminución en el funcionamiento del riñón, y la solución tiene una vida media en un paciente humano de aproximadamente 24 horas.

6. Solución según la reivindicación 1 que comprende:

(a) una hemoglobina total comprendida entre 9,5 y 12,0 g/dl;

(b) una metahemoglobina total inferior al 8% de la hemoglobina total;

(c) una carboxihemoglobina total inferior al 5% de la hemoglobina total;

(d) una disociación de oxígeno-hemoglobina comprendida entre 23 y 32 torr;

(e) una osmolalidad comprendida entre 280 y 360 mol/kg;

(f) una concentración de sodio comprendida entre 135 y 155 mmol/l;

(g) una concentración de potasio comprendida entre 3,5 y 4,5 mmol/l;

(h) una concentración de cloruro comprendida entre 85 y 110 mmol/kg;

(i) un hierro libre total inferior a 2,0 ppm;

(j) endotoxina inferior a 0,03 EU/ml;

(l) fosfolípidos inferior a 50 ng/Hb;

(m) glicolípidos inferior a 2 ng/Hb; y

(n) un contenido en tetrámero de 0,3 a 0,4%.

7. Solución según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la preparación de hemoglobina comprende aproximadamente el 16% de polímero de hemoglobina con un pico de peso molecular de aproximadamente 128 kd, aproximadamente el 26% de polímero de hemoglobina con un pico de peso molecular de aproximadamente 192 kd y aproximadamente el 58% de polímero de hemoglobina con un pico de peso molecular de aproximadamente 256 kd, determinados mediante HPLC por exclusión de tamaño.

8. Procedimiento para preparar una solución de hemoglobina piridoxilada, polimerizada con glutaraldehído según la reivindicación 1, que comprende las etapas siguientes:

(a)

eliminación de los leucocitos de la sangre por filtración a través de un filtro con un tamaño de poro medio mínimo suficiente para impedir el paso de leucocitos;

(b)

lavado del filtrado en una atmósfera de dióxido de carbono con solución de NaCl al 1% para eliminar las proteínas residuales del plasma;

(c)

lisis de glóbulos rojos diluyendo el filtrado lavado (b) con agua;

(d)

filtración de la suspensión obtenida para producir una solución de hemoglobina exenta de estroma y de material de la pared celular;

(e)

calentamiento de la solución de hemoglobina de (d) durante aproximadamente 10 horas hasta una temperatura aproximada de 60 a 62ºC y filtración de la solución de hemoglobina tratada con calor para eliminar el estroma adicional y los contaminantes con estroma precipitados en la etapa de calentamiento;

(f)

concentración y filtración por diálisis del filtrado, de la solución de hemoglobina tratada con calor para dar una solución de carboxihemoglobina;

(g)

desgasificación de la solución barboteando oxígeno y a continuación nitrógeno a través de la solución de hemoglobina a una temperatura de aproximadamente 10ºC para producir una espuma;

(h)

tratamiento de la solución desgasificada de (g) con 1 a 3 moles de piridoxal-5'-fosfato por mol de hemoglobina en presencia de un borohidruro y filtrado a continuación para dar una solución de hemoglobina piridoxilada;

(i)

tratamiento de la solución filtrada de la hemoglobina piridoxilada de (h) con una solución acuosa de glutaraldehído para dar la distribución molecular deseada de polímeros de hemoglobina y aproximadamente el 75% en peso de polímeros, basado en el peso total de hemoglobina;

(k)

adición rápida de una solución acuosa de glicina para enfriar bruscamente (detener) la reacción de polimerización y a continuación adición rápida de una solución acuosa de borohidruro de sodio para estabilizar las reticulaciones;

(l)

concentración de la solución obtenida en (k) y a continuación filtración por diálisis en atmósfera de oxígeno;

(m)

purificación de la solución de oxígeno obtenida en (l) para eliminar el tetrámero y desoxigenar la solución hasta que la cantidad de oxihemoglobina en la solución sea menor de aproximadamente el 16% en peso de la hemoglobina total; y

(n)

ajuste del pH y de las concentraciones de la solución obtenida en (m) para representar la del plasma normal.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que en la etapa (h) se piridoxila la solución desgasificada poniendo en contacto la solución desgasificada con piridoxal-5'-fosfato a una relación molecular de piridoxal-5'-fosfato a hemoglobina de 2:1.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el piridoxal-5'-fosfato se pone en contacto con hemoglobina y borohidruro durante aproximadamente una hora.

11. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que en la etapa (i) se polimeriza la hemoglobina en solución piridoxilada poniendo en contacto la solución piridoxilada con glutaraldehído a una relación molar de glutaraldehído a hemoglobina de aproximadamente 24:1.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que en la etapa (i) se pone en contacto la solución piridoxilada con glutaraldehído durante aproximadamente 18 horas.

13. Solución acuosa de hemoglobina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, como producto farmacéutico.