KR100562762B1

KR100562762B1 - 무세포성적혈구대체물을제조하기위한방법및장치

Info

Publication number: KR100562762B1
Application number: KR1019980707685A
Authority: KR
Inventors: 리차드 이. 데워스킨; 마크 디. 더블데이
Original assignee: 노쓰필드 라보라토리스, 인코포레이티드
Priority date: 1996-03-28
Filing date: 1997-03-27
Publication date: 2006-10-04
Also published as: KR20000005058A

Abstract

본 발명은 본질적으로 테트라머가 없고, 실질적으로 지질이 없으며 중합되고, 피리독실화된 헤모글로빈의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 약 5리터 이하의 양으로 사람 환자에게 주입될 수 있는, 본질적으로 테트라머가 없고, 실질적으로 지질이 없으며, 중합되고, 피리독실화된 헤모글로빈 생성물에 관한 것이다.

Description

무세포성 적혈구 대체물을 제조하기 위한 방법 및 장치

본 발명은 적혈구 대체 생성물 즉, 헤모글로빈 생성물을 제조하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본질적으로 테트라머를 포함하지 않고, 교차 결합되고, 중합되고, 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 포함하는 무세포성 적혈구 대체물에 관한 것이며, 이 헤모글로빈 용액은 스트로마 오염물질을 포함하지 않는다.

오랜 시간 동안, 혈액 은행은 외상으로 인한 수술동안 또는 다른 상황에서 대체용의 전혈을 제공해 왔다. 그러나, 사람 혈액 제공자로부터 수득된 전혈은 다양한 사용에 적합하지 않다. 특히, 전혈의 사용은 혈액 제공자의 혈액형에 대한 요건, 안정성 및 저장 수명 문제, 및 바이러스 및 다른 오염물질에 의해 발생하는 독소 때문에 문제가 있다. 이러한 문제는 특히, 군대에서의 혈액의 사용과 같은 비상 사태와 관련있다. 따라서, 혈액 제공자로부터 수득된 전혈에 대한 대체물의 개발에 많은 노력을 기울여 왔다. 이러한 개발에 의해 사람 또는 다른 포유 동물 공급원으로부터의 혈액에 대한 다양한 변형물이 생성되었다. 산소 운반 및 가역적인 산소(또는 리간드) 결합력을 갖는 스트로마를 포함하지 않는 헤모글로빈은 당해 분야에 공지되어 있다. 독성 문제가 혈액 대체물로서의 사용을 방해하기 때문에, 스트로마를 포함하지 않는 헤모글로빈은 무독성이면서 유용한 약제학적 생성물을 제공하기 위한 추가적인 변형을 필요로 한다.

이러한 변형은 (1) 스트로마 및 스트로마 오염물질을 포함하지 않거나, 실질적으로 포함하지 않는 헤모글로빈의 생성; (2) 피리독실화; (3) 중합 또는 교차 결합; (4) 테트라머의 제거; 및 (5) 일산화탄소 또는 그 밖의 리간드에 의한 변형을 포함한다.

그러나, 이러한 기술로 제조된 헤모글로빈 용액은 생명을 유지하는 데 충분한 산소량을 운반할 수 있는 반면에, 바람직하지 않은 많은 부작용 및 특성을 유발시킨다. 예를 들어, 주요 부작용은 신장 기능의 감소이다. 이러한 변화는 세균 내독소 또는 적혈구 막(스트로마)의 단편과 같은 바람직하지 않은 오염물질의 존재에 기인한 것으로 여겨진다. 상기와 같은 오염물질이 실제로 신장 변화를 초래할수 있지만, 상기 오염물질을 본질적으로 포함하지 않는 헤모글로빈 용액도 여전히 상당한 신장 기능장애를 초래한다. 신장 기능장애의 원인은 생리학적으로 허용되지 않은 양의 중합되지 않은 헤모글로빈 테트라머이다. 테트라머 헤모글로빈 주입으로 인한 또 다른 바람직하지 않은 부작용으로는 혈관 수축, 혈색소뇨증, 심장 박동수의 저하, 평균 동맥 혈압의 증가 및 특히, 복강으로의 주입물(infusate)의 유출이 있다.

실제로, 공지된 헤모글로빈 유도된 혈액 대체물중에서 전적으로 독성 문제를 피하는 데 성공적이었던 것은 없었다. 이러한 생성물은 또한, 환자에 투여된 후, 허용될 수 없을 정도의 낮은 반감기를 갖는다. 이러한 반감기는 짧은 기간에 걸쳐 반복적으로 혈액 용량의 교환을 필요로 한다. 따라서, 환자에게 무독성이고, 투여후 상당한 반감기를 갖는 헤모글로빈 생성물이 실질적으로 필요하다. 물론, 이러한 생성물은 전혈에 의해 달성되는 것과 유사한 방식으로 산소를 조직에 가역적으로 운반할 수 있어야 한다.

발명의 요약

본 발명은 사람에게 무독성이고, 사람에게 투여할 경우, 15시간 이상의 실질적인 반감기를 갖는 헤모글로빈 대체물을 제공하는 데에 있다. 본 발명의 헤모글로빈 생성물은 바이러스 및 다른 독성의 오염물질을 포함하지 않을 뿐만 아니라 스트로마를 포함하지 않으며, 피리독실화되고, 중합되어 있다. 또한, 이러한 생성물은 실질적으로 백혈구(화이트 블러드 셀(white blood cell) 및 혈소판이 없다.

본 발명은 또한, 본 발명의 헤모글로빈 대체물을 제조하는 방법을 포함한다. 상기 방법은 혈액으로부터 백혈구 및 혈소판을 제거하고; 적혈구를 세척하고, 용해시키고; 여과 및 열처리에 의해 스트로마 오염물질 및 스트로마를 제거하고; 탈산소 형태의 헤모글로빈을 제조하고; 피리독실화시키고 중합시키고; 추가로 정제하고 농축시키고; 탈산소화시키는 단계를 포함한다. 그 후, 생성된 헤모글로빈 생성물은 제형화되어, 정상적인 생리학적 범위내에 다양한 수준의 전해질을 갖는 헤모글로빈 생성물을 제공한다.

본 발명은 또한 피리독실화되고, 중합된 헤모글로빈의 수성 제형을 제공하며, 여기에서, 헤모글로빈은 도 3에 도시된 분자량 프로필을 갖는 테트라머 물질을 함유하는 글루타르알데히드 중합된 헤모글로빈이다. 이러한 제형은 무세포성 적혈구 대체물을 제조하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 일면에서, 먼저 제형이 정제되어 테트라머가 제거된 후, 적당량의 전해질과 혼합되어 생리학적으로 허용되는 무세포성 적혈구 대체물이 생성되며, 그 후, 이 적혈구 대체물은 산소 운반체의 주입을 필요로 하는 환자를 치료하는 데 사용될 수 있다.

도면의 간단한 설명

도 1은 피리독실화 및 중합화를 위해 제조된 탈산소화된 헤모글로빈 용액을 생성시키기 위해 사용된 방법 및 장치의 일부를 도시한 개략도이다.

도 2는 피리독실화 및 중합 반응으로 개시되어, 탈산소화되고, 정제되고, 피 리독실화되고, 중합된 헤모글로빈 생성물을 생성시키는 방법 및 장치의 일부, 및 생리학적 수준의 전해질을 갖는 최종 헤모글로빈 생성물을 제형화하는 데에 사용된 방법 및 장치의 일부를 도시한 개략도이다.

도 3은 정제 전에 글리신 처리 후, 중합된 물질의 HPLC 트레이싱(tracing)이다. 중합된 생성물은 체류 시간(RT) 15,57, 16.08, 17,00 및 18.19에서 피크를 나타낸다. 테트라머 물질은 RT 19.88 및 20.51에서 피크를 나타낸다. 이러한 물질의 76 2%가 중합체이다.

도 4는 본 발명의 헤모글로빈 생성물의 HPLC 트레이싱이다. 중합된 헤모글로빈은 RT 15.7, 16,33, 17.32 및 18.56에서 피크를 나타낸다. 테트라머는 RT 21.18에서 피크를 나타낸다.

도 5는 본 발명에서 사용된 칼럼 크로마토그래피 정제 방법을 도시한 개략도 이다.

도 6은 본 발명에서 사용된 막 여과 정제 방법을 도시하는 개략도이다.

바람직한 구체예의 상세한 설명

본 발명은 실질적으로 스트로마, 스트로마 오염물질 및 그 밖의 오염물질을 포함하지 않는, 본질적으로 테트라머를 포함하지 않으며, 교차결합되고, 중합되고, 피리독실화된 헤모글로빈을 포함하는 무세포성 적혈구 대체물에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 "교차결합된"이란 용어는 분자의 모양, 크기, 기능 또는 물리적 특성을 변화시키기 위해 분자 상에 또는 분자 내에, 또는 분자들 사이에 분자 "브릿지"가 화학적으로 생성됨을 의미한다. 교차결합된 분자는 중합되거나 중합되지 않을 수 있는데, 즉 교차결합된 분자는 테트라머성일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 "테트라머"란 용어는 분자량이 약 64Kd인 헤모글로빈 분자를 의미한다; 즉, 네이티브(native) 및 분자내적으로 교차결합된 헤모글로빈 분자 모두를 의미한다.

본 명세서에서 사용된 "본질적으로 테트라머를 포함하지 않는"이란 용어는 포유동물내에 투여된 테트라머에 대한 생물학적 반응이 더 이상 존재하지 않는 테트라머 오염에 대한 순도의 수준을 나타낸다. 주요 기준은 약제학적으로 유효량, 즉 약 99% 이상의 순도 수준(약 1% 미만의 테트라머가 존재함)이 주입되는 경우, 신장 기능에 있어서 변화가 없는 것이다. 본 발명에 의해 생성된 바람직한 생성물은 전체 헤모글로빈(THb)의 중량을 기준으로 하여 약 0,8% 이하의 테트라머를 함유한다. 바꿔말하면, 본 발명에 따른 본질적으로 테트라머를 포함하지 않는 생성물은 생리학적으로 허용되는 양의 중합되지 않은 헤모글로빈 테트라머를 함유한다. 특히, 본 발명의 바람직한 생성물은 약 0,5% 미만의 테트라머를 함유하며; 특히, 본 발명의 가장 바람직한 생성물은 약 0.3 내지 0.4%의 테트라머를 함유한다. 이러한 양의 테트라머는 생리학적으로 허용되는 것으로 밝혀졌다.

본 명세서에서 사용되는 "초정제된 생성물" 또는 "정제된 생성물"이란 용어는 "본질적으로 테트라머가 없는"이란 용어와 동일한 의미를 갖는다.

본 명세서에서 사용되는 전체 헤모글로빈(THb)(%)이란 용액 100mL 당 헤모글로빈의 그램으로 정의된다.

본 명세서에서 사용되는 "중합 용액"이란 용어는 생화학적으로 적합한 캐리어 중의 글루타르알데히드, 이미도 에스테르, 디아스피린 또는 그 밖의 물질과 같은 "교차결합성" 또는 중합제를 함유하는 용액을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 중합된이란 용어는 분자 또는 테트라머 서브유닛 사이에 분자 브릿지가 생성됨을 의미하며, 이렇게 생성되는 중합된 분자의 크기 및 중량은 네이티브 또는 테트라머 헤모글로빈에 대하여 증가된다. 중합된 헤모글로빈은 테트라머 헤모글로빈이 아니다.

본 명세서에서 사용되는 헤모글로빈 용액은 적혈구 내에 함유되어 있지 않은 테트라머 헤모글로빈 또는 중합된 헤모글로빈 분자의 용액을 의미한다. 이러한 용액은 적혈구 스트로마 또는 스트로마 오염물질을 함유하지 않거나 실질적으로 포함하지 않을 필요가 없다. 그러나, 바람직한 중합된 헤모글로빈 용액은 적혈구 스트로마 및 스트로마 오염물질이 함유되어 있지 않다.

"반투과성 막"이란 용어는 일부 분자 종에 대해 투과성이지만 그 밖의 종에 대해선 불투과성인 막을 의미하는데, 즉 특정 분자량을 배제시키는 선택적 필터로서 작용하는 막을 의미한다.

본 발명에 따른 방법의 생성물인, 열처리되고 바이러스적으로 불활성화된 테트라머 헤모글로빈으로부터 생성된, 테트라머(네이티브 또는 분자내 교차결합되어 있음) 헤모글로빈, 스트로마 및 다양한 그 밖의 오염물질을 본질적으로 포함하지 않는 중합되고 피리독실화된 헤모글로빈 용액은 치료적으로 및 임상적으로 유용할 뿐만 아니라 생리학적으로 허용된다. 본 발명의 생성물은 산소 운반 특성에 필요한 가역적인 산소 결합력을 갖는다. 가장 주목할 만하게도, 본 발명의 생성물은 전혈과 유사한 산소-헤모글로빈 해리 곡선(P₅₀)을 갖는 깃과 상호관련된 용법에서의 우수한 로딩 및 언로딩 특성을 입증한다. 본 발명의 생성물은 폐를 통과하는 모세혈관 내에서 고친화력으로 산소와 결합한 다음, 산소를 체내 조직에 적절하게 방출시킨다. 본 발명의 생성물은 또한 수용자에 대한 적합성 연구를 필요로 하지 않는다.

본 발명의 생성물은 또한 사람에게 투여된 경우 약 15시간 이상 및 더욱 바람직하게는 약 24시간의 반감기를 갖는다. 이러한 헤모글로빈 생성물은 약 3.0L 이하 및 심지어 약 5.0L 이하의 양으로 환자에게 주입될 수 있다. 바꿔말하면, 본 발명의 헤모글로빈 생성물은 혈관 수축, 신독성, 혈색소뇨증, 또는 합성 또는 반합성 산소 캐리어 및 혈액 대체물의 정맥내 투여와 관련된 그 밖의 문제를 유발함이 없이 본질적으로 사람 환자의 혈액 부피 전부를 보충하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 환자에게 무독성이며, 스트로마 및 테트라머를 함유하지 않고, 중합되고, 피리독실화된 헤모글로빈 생성물을 적어도 약 5.0L 이하의 양으로 환자, 바람직하게는 사람 환자에게 수혈하는 방법을 포함한다. 이러한 방법은 주입 또는 수혈을 위해 주입 기기 또는 그 밖의 유사 장치에 환자 또는 피검자를 연결시키는 것을 포함한다.

본 발명의 방법은 용액중의 전체 헤모글로빈의 중량을 기준으로 하여 약 1 중량% 이하, 및 더욱 바람직하게는 약 0.8 중량% 이하의 테트라머 수준을 갖는 생성물이 수득된다는 점에서 독특하다. 본 발명의 방법은 실질적으로 미생물 및 바이러스 항원 및 병원균을 함유하지 않는 최종 생성물이 생성될 수 있는 추가의 잇점을 제공한다. 즉, 이러한 미생물 및 바이러스 항원 및 병원균은 검출불가능한 수준까지 감소된다. 본 발명의 생성물은 미국 약전 XXIII장 <71>에 설명된 분석에 의해 측정된 바와 같이 무균성이다. 이러한 항원 및 병원균의 예로는 세균, 리케치아, 진균, 원생동물, 바이러스 및 그 밖의 생물체가 있다. 가장 중요한 것은, 본 발명의 방법이 간염 및 후천성 면역 결핍증 (AIDS)을 유발하는 바이러스를 함유하지 않는 생물학적 생성물을 제공한다는 것이다.

생리학적 특성에 관한 한은, 적어도 약 5.0L 이하의 양이 주입되는 경우, 본 발명의 생물학적 생성물은 혈관수축, 신독성, 혈색소뇨증 및 생리학적으로 바람직하지 않은 양의 테트라머 헤모글로빈을 함유하는 공지된 헤모글로빈 용액의 정맥내 투여와 관련된 그 밖의 문제를 유발시키지 않는다. 본 명세서에 기재된 방법에 의해 제조된 생성물이 정맥내 투여는 유의할 만한 소변 생성의 감소, 사구체 여과율의 감소, 복강 내로의 유출 및 생성된 소변 색깔의 변화를 일으키지 않았다.

따라서, 본 발명의 방법은 외상, 심근 경색, 발작, 급성 빈혈, 및 완전 산소화 혈액에 대한 폐의 손상 또는 부전으로 인한 저산소혈증, 저산소증 또는 말기 저산소증과 같은 산소 결핍 질환의 치료에 유용한 무세포성 적혈구 대체물을 제공한다. 본 발명의 생성물은 또한 소생용 유체 (예를 들어, 외상, 특히 출혈성 쇼크), 혈관내 증량제 또는 교환수혈이 필요한 임의의 질병 또는 의학적 질환의 치료에 유용하다. 의학적 치료 뿐만 아니라, 본 발명의 생성물은 이식용 장기를 보존하는 데에 유용할 수 있다.

본 발명의 방법은 하기 과정을 포함한다:

1. 적혈구 흡출 및 여과

2. 세포 세척/용해

3. 열처리

4. 한외여과 농축

5. 탈기

6. 화학적 변형

7. 정제

8. UP 폴리(poly) 농축

9. 탈산소화

10. 제형화

본 발명의 방법에서 바람직한 출발 물질은 유효기간이 지난 사람 전혈 또는 패킹된 적혈구이다. 부가하여, 유효기간이 경과되지 않은 혈액(기간내)이 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 백(bag) 상에 표시된 만료일을 지나서 2주 이상 동안 보관된 전혈은 본 발명의 방법에서 사용되지 않는다. 만료후 2주 이상 경과된 전혈이 사용되면 헤모글로빈을 추출하고 스트로마 단백질 및 오염물질과 같은 세포성 잔류물을 제거하기가 더 어려워진다.

본 명세서에 설명된 모든 방법은 당업 분야의 기술 내에서 가능한 약간의 변형을 가하여 그 밖의 포유동물 혈액에 적용할 수 있다. 대부분의 방법은 약 2℃ 내지 약 8℃, 바람직하게는 약 4℃에서 수행될 수 있다.

적혈구 흡출 및 여과 동안에, 적혈구(RBC)를 무균적으로 혈액 내에 공기를 도입시키지 않으면서 도너 백으로부터 추출하고, 백혈구 및 혈소판 양이 감소된 RBC 현탁액을 생성시키기 위하여 일련의 필터에 통과시킨다. 그런 다음, 생성된 현탁액을 세포 세척/용해시킨다.

현탁액을 일산화탄소 분위기 하에서 약 1% NaCl 용액과 함께 세척하여 남아 있는 혈장 단백질을 제거하였다. 그런 다음, 세척된 RBC를 주사용수(WFI)로 처리하여 세포를 용해시키고, 생성되는 혼합물을 교차 흐름 여과 유닛을 사용하여 정화시켰다. 그런 다음, 정화된 생성물을 열처리하여 여과에 의해 분리된 추가의 스트로마 물질을 침전시켰다. 본 과정의 생성물은 THb가 약 3%(w/v)인 스트로마를 포함하지 않는 헤모글로빈(SFH) 용액이다.

카르복시헤모글로빈을 함유하는 열처리된 스트로마를 포함하지 않는 헤모글로빈 용액을 농축시키고 탈기시켜 데옥시헤모글로빈을 함유하는 SFH 용액을 수득하였다. 탈기는 먼저 카르복시헤모글로빈 용액을 약 16시간 동안 산소로 포화시켜 산소화된 헤모글로빈 및 헤모글로빈 전체 중량을 기준으로 하여 약 7 중량%의 카르복시헤모글로빈을 함유하는 용액을 수득하는 것을 포함한다. 이어서, 산소를 질소, 아르곤 또는 헬륨과 함께 배출시켜 유리 헤모글로빈(즉, 비복합체화 헤모글로빈) 및 헤모글로빈의 전체 중량을 기준으로 하여 약 7 중량%의 옥시헤모글로빈을 함유하는 용액을 형성시킨다. 생성되는 탈기된 용액을 여과하고 화학적 변형을 위해 용기 내로 옮긴다.

탈기시킨 후에, 스트로마를 포함하지 않는 헤모글로빈 용액을 약 1:1 내지 3:1의 피리독살-5'-포스페이트 대 헤모글로빈의 몰비로 피리독살-5'-포스페이트(P5P)를 사용하여 피리독실화시킨다. 또한, 스트로마를 포함하지 않는 헤모글로빈을 2-노르-2-포르밀 피리독살-5'-포스페이트를 사용하여 피리독실화시킬 수 있다. 시아노보로하이드라이드 나트륨 또는 바람직하게는 소듐 보로하이드라이드와 같은 환원제를 피리독실화 혼합물에 첨가시킨다. 과량의 시약 및 염을 피로겐을 포함하지 않는 물에 대해 투석시키거나, 바람직하게는, WFI를 사용하여 투석여과시킴으로써 분리시킨다. 그런 다음, 피리독실화된 헤모글로빈을 글루타르알데히드 용액으로 중합시킨다.

스트로마를 포함하지 않는 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 수성 글루타르알데히드 용액을 사용하여 중합시킨다. 중합반응 시간 및 글루타르알데히드 첨가량은 헤모글로빈 용액의 부피, 요망되는 중합체 수율 및 요망하는 분자량 분포에 좌우된다. 일반적으로, 중합반응 시간이 증가할 수록 중합체의 수율 및 분자량 분포가 증가된다. 헤모글로빈의 전체 중량을 기준으로 하여, 약 75 중량%의 중합체의 수율은 약 16 내지 18시간 후에 수득된다. 중합반응의 바람직한 종말점은 크기 배제 HPLC에 의해 모니터링된 바와 같이 용액이 약 75 중량%의 중합체를 함유하는 지점으로서 정의된다. 또한, 종말점은 용액이 헤모글로빈의 전체 중량을 기준으로 하여 중합체의 약 65%를 함유하는 지점, 즉 2.5시간으로서 정의된다.

중합반응은 수성 글리신을 첨가함으로써 켄칭(quench)된다. 완충액은 가능한 한 빨리 첨가되어야 한다. 그런 다음, 교차결합을 소듐 보로하이드라이드 수용액을 가능한 한 빨리 첨가함으로써 안정화시킨다. 이어서, 이러한 중합된 용액을 농축시킨후, 산소 분위기 하에서 투석여과시켜 용액을 산소화시킨다. 최종적으로, 용액이 약 4 중량%의 헤모글로빈을 함유할 때까지 물을 용액에 첨가시킨다.

본 발명에 따른 중합반응은 하기의 실시예 1 및 도 3에 나타난 바와 같이 분자량 범위가 협소한 높은 수율의 중합체를 생성시킨다.

그런 다음, 중합되고 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 칼럼 크로마토그래피, 예를 들어 막 여과와 같은 여과, 또는 둘 모두에 의해 정제시켜 용액으로부터 남아있는 중합되지 않은(테트라머) 헤모글로빈을 제거시킨다. 그런 다음, 정제되고 중합된 헤모글로빈 용액을 기체 교환용으로 준비된 한외여과 장치를 사용하여 약 6%까지 농축시킨다.

그런 다음, 농축된 용액을 질소로 탈산소화시킨다. 탈산소화는, 용액 중의 옥시헤모글로빈의 양이 전체 헤모글로빈의 약 16 중량% 미만이 될 때까지 약 10 내지 12℃에서 일어난다.

그런 다음, 생성된 탈산소화되고 정제되고 중합된 헤모글로빈 용액을 냉각된 용기 중에서 질소 분위기 하에서 한외여과에 의해 농축시킨다. pH를 약 8.8 내지 9.0으로 조정하고, 전해질의 양을 필요에 따라 정상 혈장의 전해질 양을 나타내는 수준으로 조정할 수 있다. 또한, 글루타티온, 아스코르베이트 또는 글루코오스와 같은 통상적인 산화방지제를 또한 임의로 첨가할 수 있다. 용액을 소망하는 수준, 바람직하게는 10 중량%의 중합되고, 피리독실화되고, 정제되고, 테트라머를 포함하지 않고 스트로마를 포함하지 않는 헤모글로빈 까지 농축시킨 후, 용액을 여과에 의해 멸균시키고 살균 이동 장치를 통해 적당한 약제학적으로 허용되는 용기내로 옮긴다.

생성된 헤모글로빈 용액의 특징을 하기에 기재한다:

하기 실시예들은 본 발명의 특정한 일면을 입증한다. 그러나, 본 실시예들은 단지 예시를 위한 것이며 본 발명의 조건 및 범위를 완전히 한정하려는 것이 아님을 이해하여야 한다. 모든 온도는 달리 기술하지 않는 한 섭씨 온도로 표현된다. 달리 언급하지 않는 한, 전체 헤모글로빈(THb)의 모든 비율은 중량/부피(w/v)로서 표현된다. 또한 보편적인 반응 조건(예를 들어, 온도, 반응 시간)이 제공되는 경우, 일반적으로 그다지 편리하지 않을지라도, 이들의 특정 범위를 초과하는 조건 및 미만인 조건 모두가 사용될 수 있음이 인지되어야 한다.

대조적으로 언급되지 않는 한, 본 발명의 방법에서 사용되는 모든 용기 및 탱크는 316-L 스테인레스 스틸, 바람직하게는 고도로 연마되어서 쉽고 빠르게 세정되는, 약제학적 등급의 스테인레스 스틸로 제조된다. 여러 가지 연결파이프 및 관은 동일한 스테인레스 스틸 또는 약제학적 등급의 테플론 또는 실리콘 관으로 제조된다. 본 방법에서 사용되는 필터 및 막은 밀리포어 인코포레이티드(Millipore, Inc.), 팔-필트론(Pall-Filtron), 또는 큐노 인코포레이티드(Cuno Inc.)로부터 구입할 수 있다.

본 발명의 생성된 생성물의 반감기는 포유동물, 예를 들어 사람의 생체내에서 결정된다. 전형적으로, 포유동물에게 생성물을 주입한후 일정한 간격으로 혈액 샘플을 포유동물로부터 채혈하였다. 그런 다음, 생성물의 양을 혈액 샘플을 원심분리하고, 혈장 부분을 압착시키고, 분광 광도계로 혈장 헤모글로빈 수준을 측정한 후, 포유동물에 남아있는 생성물의 양을 생성물의 반감기에 상호관련시킴으로써 결정한다.

본 발명에 따른 크기별 배제 크로마토그래피 HPLC를 하기와 같이 수행한다:

샘플을 0.2M의 인산칼륨 완충액(pH 6.9)으로 0.2 g/dl까지 희석시키고, 0.2μ 필터를 통해 여과시키고 하기의 성분으로 이루어진 HPLC 시스템에 주입시킨다(시스템 흐름 순서대로):

1. 파마시아(Pharmacia) 모델 2248 펌프

- 이동상은 0.2M 인산칼륨(pH 6.9)임

- 유속은 1.0mL/분(min)임.

2. 45cm PEEK 또는 티타늄 관, 0.010 (I.D.)

3. 200㎕ PEEK 샘플 루프를 갖는 레오다인(Rheodyne) 모델 7725i 주입기

4. 18cm PEEK 또는 티타늄 관, 0.010 (I.D.)

5. 업처치(Upchurch) 모델 A431 0.5μ 필터

6. 9cm PEEK 또는 타타늄 관, 0.010 (I.D.)

7. 페노메넥스 비오세프(Phenomenex Biosep) SEC S-3000 75 x 7.8mm 가아드(Gaurd) 칼럼

8. 24cm PEEK 또는 타타늄 관, 0.010 (I.D.)

9. 페노메넥스 비오세프 SEC S-3000 600 x 7.8mm 분석 칼럼

10. 23cm PEEK 또는 타타늄 관, 0.010 (I.D.)

11. 파마시아 우비코드(Uvicord) SD UV 검출기

- 파장: 280nm

- 흐름 셀: 8㎕ 부피, 2.5mm 경로길이

- 범위: 2 AUFS

- 시간 상수: 10초

280nm에서의 피크 흡광도는 LKB 2221 적분기에 의해 기록되고, 이 적분기는 개개의 피크 영역을 적분하고 각각의 중합체 종에 대한 전체 헤모글로빈 영역을 계산한다.

본 발명은 하기의 비제한적 실시예에 의해 추가로 이해될 수 있다.

실시예 1

도 1과 관련하여, 유효기간이 지난 혈액(전혈 또는 패킹된 적혈구)의 도너 백(20)을 적합한 무균성 흡출 장치(22)에 넣는다. 적합한 흡출 장치의 예로는 두 개의 흡출 스테이션을 갖는 시스템이 있다. 도너 백(donor bag)을 흡출 스테이션에 위치시키게 되면, 흡출 장치의 바늘은 도너백에 구멍을 내고, 1%(w/v) 염화나트륨 수용액 약 150ml를 도입시키고 감압 또는 진공하에서 도너 백으로부터 유효기간이 지난 혈액을 흡출시킨다. 폭이 100μ인 필터(24) 및 후속적으로 직렬로 연결된 폭이 5μ인 두 개의 필터(26)를 통해 흡출된 혈액을 통과시켰다. 폭이 5μ인 필터를 혈액이 통과할 때, 백혈구가 혈액으로부터 제거되었다. 전형적으로는, 유효기간이 지난 전혈 중의 약 170 유닛을 도 1에 도시된 바와 같이 흡출시키고 여과시키고 후속적으로 탱크 1로 옮겼다. 그런 다음, 필터는 1%(w/v) 염화나트륨 수용액 약 75리터로 세척하였다.

혈액을 탱크 1에 도입시키기 전에, 탱크 1을 1% 염화나트륨 수용액 약 70L로 채웠다. 유효기간이 지난 전혈 170 유닛을 모두 흡출시키고, 여과시키고, 옮기고, 필터를 세정시킨 후, 탱크는 약 250리터의 4% 전체 헤모글로빈 용액을 함유하였다. 흡출 및 여과 단계 동안에, 탱크 1은 감압, 즉 20-28" Hg의 진공으로 유지시켰다. 일단 유효기간이 지난 모든 혈액이 탱크 1에 전달되면, 진공은 차단되고 일산화탄소가 상기 탱크내로 도입되어 탱크는 일산화탄소의 분위기를 함유하였다.

탱크 1을 도 1에 도시된 바와 같이 0.65μ 접선 흐름 필터(28)에 연결시켰다. 250 리터의 4% 전체 헤모글로빈 용액의 초기 충전은 접선 흐름 필터를 통한 미소여과에 의해 약 125 L의 8% 전체 헤모글로빈 용액으로 농축되었다. 이러한 지점에서의 헤모글로빈 용액의 pH는 약 6 내지 6.5이다. 8% 전체 헤모글로빈으로 농축시킨 후, 1%(w/v) 염화나트륨 수용액을 첨가함으로써 세척하고, 염화나트륨 용액이 첨가되는 속도와 동일한 속도로 여과물을 투석여과시켜 제거하였다. 전형적으로 헤모글로빈 용액 125L를 1% 염화나트륨 수용액 약 8배 용적(약 1,000L)으로 세척하였다. 세척후에, 용액을 약 70L, 즉 약 14% 전체 헤모글로빈으로 농축하고, "주사용 물"(WFI)을 첨가하여 용액의 용적이 약 l80L가 되게 하였다. WFI가 첨가됨에 따라, 세포가 팽창 및 파열되어, 용액내로 헤모글로빈이 방출되었다. 생성된 헤모글로빈 용액의 농도는 약 5% 전체 헤모글로빈(THb)이었다.

생성된 용액을 탱크 1에 있는 동안 정화시켰다. 용액을 먼저 약 50L로 농축시키고, 여과물을 탱크 2로 옮겼다. 필터를 가로질러 용액을 펌핑시킨 경우, 적혈구 스트로마 오염물질 및 세포벽 물질은 보유되고 필터에 의해 제거되었다. 탱크 1에 잔류하는 50L 용액을 약 2.5 용적의 WFI로 세척(투석여과)하였다 이러한 2.5 용적의 세척액을 탱크 2에 첨가하였다. 그런 후, 탱크 1에 잔류하는 물질을 약 20L로 농축시키고 여과물을 탱크 2에 첨가하였다. 탱크 2에서 생성된 용적은 3.3%전체 헤모글로빈 용액 약 280L였다.

그런 다음, 생성된 스트로마를 포함하지 않는 헤모글로빈 용액을 약 10시간이상 동안 약 60 내지 62℃의 온도로 탱크 2 내에서 열처리하였다. 열처리 동안에, 용액을 적당하게 교반시켰다. 용액이 가열되어 약 55℃를 통과할 때, 침전물이 형성되었다.

그런 다음, 생성된 3.3% THb(w/v) 스트로마를 포함하지 않는 열처리된 헤모글로빈 용액을 0.2μ 필터(30) 이어서 0.1μ필터(32)를 통해 여과시키고 탱크 3으로 옮겼다. 그런 다음, 여과된 헤모글로빈 용액을 약 18% THb로 농축시키고, 후속적으로 4배 용적의 WFI(180L)로 투석여과시켰다. 10킬로달톤(kd) 분자량 한외필터(34)를 사용하여 농축 및 투석여과를 수행하였다. 한외필터(34)와 결합된 배관(35)은 여과물을 수집하였다. 이 지점에서, 18% 전체 헤모글로빈 용액 45L는 약 6 내지 6.5의 pH에서 헤모글로빈 1g 당 50ng 미만의 인지질, 헤모글로빈 1g 당 2ng 미만의 당지질, 1% 미만의 메트헤모글로빈, 내독소 1ml 당 약 0.03 미만의 내독소를 함유하였다. 용액중의 이러한 헤모글로빈은 카르복시헤모글로빈이었다.

그런 다음, 생성된 카르복시헤모글로빈 용액을 카르복시헤모글로빈이 먼저 산소화되고 이어서 탈산소화되는 탱크 4로 옮겼다. 탱크 4는 산소 및 질소 가스 라인에 결합된 가스 분무 링, 탱크 바닥으로부터 탱크 4의 상부에 위치한 계량화된 분무 장치로의 공급물, 및 포움이 액체내로 농축되고 탱크 4로 다시 공급되는 포움캔(36)내로 탱크 4에서 발생된 포움이 공급되도록 포움 캔(1)에 연결된 포움 오우버플로우 수집기를 갖추고 있다. 탱크 4는 탱크 용적의 약 3분의 1을 채우는 한 세트의 폴 링(Pall Ring)을 포함한다. 포움 캔(36)은 가스 제거용 가스 구멍을 포함한다. 탱크 4내 용액은 13% 전체 헤모글로빈 용액이었다.

제 1 산소화 단계 동안에, 용기내에서 가스의 균일한 분포를 갖도록 하기에 충분한 속도로 용액을 통해 산소를 살포하였다. 가스를 약 25L/분 속도로 용기(200L 용적)에 살포하였다. 생성된 용액이 전체 헤모글로빈 중량을 기준으로 하여 5% 미만의 카르복시헤모글로빈을 함유하도록 약 16시간 동안 카르복시헤모글로빈의 산소화 반응을 수행하였다. 약 10℃의 온도에서 산소화 반응을 수행하였다. 탱크 4에서 발생된 포움을 포움 캔(36)에서 수집하고, 침전시킨 후, 생성된 용액을 탱크 4로 다시 옮겼다.

산소화 반응을 수행한 후, 약 6시간 동안 질소의 유사한 흐름으로 또는 전체 헤모글로빈의 중량을 기준으로 하여 10% 미만의 옥시헤모글로빈이 용액중에 잔류할 때까지 용액을 살포하였다. 약 10℃의 온도 및 약 6 내지 6.5의 pH에서 질소 살포를 수행하였다. 또한, 카르복시헤모글로빈을 막 교환기를 사용하여 데옥시헤모글로빈으로 전환시킬 수 있었다. 포움 단계로부터 일반적으로 예견될 수 있는 바와 같이 실질적으로 어떠한 헤모글로빈의 변성도 없음에 주의하여야 한다. 생성된 탈 산소화된 용액은 화학적인 변형을 위해 새로 제조되었다.

도 2를 보면, 데옥시헤모글로빈 용액을 화학적으로 변형시키기 위해 탱크 5로 옮겼다. 그런 다음 1:1 내지 3:1의 P5P 대 헤모글로빈 몰비로 피리독실-5-포스페이트(P5F)(93.75g/L) 수용액을 약 4℃ 용액에서 데옥시헤모글로빈을 함유하는 탱크 5에 첨가하였다. P5P 대 헤모글로빈의 몰비는 2:1이 바람직하다. 약 4℃의 온도에서 피리독실화 반응을 수행하였다. P5F 용액을 약 1분 이상 동안 첨가하고 약 15분 동안 혼합시킨 후, 소듐 보로하이드라이드/수산화나트륨 용액을 소듐 보로하이드라이드 대 헤모글로빈의 몰비 약 20:1로 헤모글로빈 용액에 첨가하였다. 적합한 소듐 보로하이드라이드/수산화나트륨 수용액은 2리터 당 수산화나트륨 0.8g 및 2리터 당 소듐 보로하이드라이드 90.8g을 함유하였다. 보로하이드라이드 용액을 약 1분 동안 가능한 한 신속하게 첨가한 후, 1시간 동안 교반시켰다. 생성된 피리독실화된 헤모글로빈 용액 50L를 10K 달톤 한외필터(38)를 사용하여 후속적으로 투석여과시켜서 4배 용적의 WFI로 과량의 반응물을 제거하였다. 한외필터(38)에 결합된 배관(40)을 사용하여 필터(38)로부터 여과물을 수집하였다.

4배 용적, 즉 200L의 WFI로 투석여과시킨 후, 헤모글로빈을 중합시켰다. 피리독실화된 헤모글로빈을 함유하는 탱크 5에 4.5% 전체 헤모글로빈 용액(약 175L의 헤모글로빈 용액)을 제조하기에 충분한 WFI를 첨가하였다. 글루타르알데히드 용액을 약 24:1의 글루타르알데히드 대 헤모글로빈의 몰비로 피리독실화된 헤모글로빈 용액에 첨가하였다. 글루타르알데히드 용액을 계량화된 펌핑에 의해 약 2.5시간 이상 동안 헤모글로빈 용액에 첨가하였다. 약 18시간 동안 중합 반응을 지속시켰다. 목적하는 분자량 분포는 약 75% 중합체 및 25% 테트라머였다. 목적하는 중합체는 약 600,000 미만의 분자량을 가지며, 주요 분획의 분자량은 100,000 내지350,000 였다.

중합 반응이 목적하는 분자량 분포(약 18시간 이후)에 도달되었을 때, 글리신 수용액(약 l66g/L)을 약 140:1의 글리신 대 헤모글로빈의 몰비로 헤모글로빈 용액에 (켄칭과 같이) 첨가하였다. 생성된 중합되고 글리신-천칭된 헤모글로빈 생성물의 HPLC 트레이싱을 도시한 도 3을 참조하라. 그런 다음, 형성된 용액을 약 10분 동안 혼합한 후, 소듐 보로하이드라이드/히드록사이드 용액(상기 확인된 농도를 가짐)을 소듐 보로하이드라이드 대 헤모글로빈의 몰비를 28:1로 하여 헤모글로빈 용액에 첨가하였다. 이 생성된 혼합물을 약 1시간 동안 교반시켰다. 그런 다음, 용액을 약 50ℓ로 농축시키고(한외필터 (38)), 4배 용적(200ℓ)의 WFI로 세척하였다. 상기 기재된 바와 동일한 몰비로 소듐 보로하이드라이드의 추가 분취액을 농축된 용액에 첨가하고 1 시간 동안 다시 혼합한다. 생성된 용액을 4배 용적(200 ℓ)의 WFI로 세척하여, 중합되고, 피리독실화된 스트로마를 포함하지 않는 헤모글로빈을 생성시켰으며, 이를 열처리하였다.

생성된 용액을 산소 분위기 하에서 방치시킴으로써 산소화시킨 후, 정제 시스템(42)으로 옮겼다. 정제는 크로마토그래피, 여과, 바람직하게는 막여과(다이아필트레이션), 또는 여과 및 칼럼 크로마토그래피를 결합하여 달성될 수 있다.

1가지 구체예에서, 용액을 도 5에 도시된 바와 같이, 크로마토그래피 공급 용기인 탱크 6으로 옮겼다. 이러한 구체예에서, 생성된 옥시헤모글로빈 용액을 탱크 6에서 약 200ℓ(총 헤모글로빈 4%)로 희석하고, 염화물의 농도를 염화나트륨 용액으로 22mM로 조정하였다. 나트륨 용액의 조정은 필요하지 않았다.

그런 다음, 생성된 헤모글로빈 용액의 40ℓ 분취액 5개를 칼럼(44)을 사용하여 크로마토그래피하였다. 칼럼(44)은 테트라머보다 중합체에 친화성이 더 큰 황색 염료(미메틱 옐로우 넘버 1(Mimetic Yellow No.1)으로서 어피니티 크로마토그래피 리미티드사(Affinity Chromatography, Ltd)로부터 입수할 수 있음)로 개질된 아 가로오스 겔인 친화성 겔을 함유한다.

크로마토그래피를 하기와 같이 수행하였다. 40ℓ의 산소화되고 중합되고 피리독실화된 스트로마를 포함하지 않는 헤모글로빈 용액을 칼럼(44)에 로딩시켰다. 칼럼을 30mM의 NaCl 완충액의 15 칼럼 용적(약 750ℓ)으로 세척하여 테트라머를 제거하였다. 이후, 칼럼을 약 250ℓ의 300mM 염화나트륨 완충액으로 세척하여 중합체를 세척하였다. 중합체 분획을 탱크 7에서 수집하였다. 원하지 않는 분획을 배관(46)으로 보냈다. 각각의 분취액을 제거한 후, 칼럼을 15mM HCl 용액(150ℓ)로 재생성시키고, 30mM NaCl(250ℓ)로 재평형시키고, 공급 용액의 또 다른 분취액(40ℓ)를 칼럼에 로딩시켰다. 칼럼을 다시 30mM NaCl로 세척한 후 300mM NaCl로 세척하였다. 40ℓ 분취액의 헤모글로빈 용액을 칼럼에 첨가하고, 탱크 6이 비워질 때까지 크로마토그래피하였다.

탱크 7에 수집된 분획을 배관(50)과 연결된 필터(48)를 사용하여 약 40ℓ(총 헤모글로빈의 6%)로 한외여과(농축)시켰다. 농축된 헤모글로빈 용액을 탈산소화를 위해 기체 교환 탱크 8로 옮겼다.

다르게는, 용액을 도 6에 도시된 바와 같이 여과 재순환 용기(10)로 옮겼다. 이후, 헤모글로빈을 탱크 10에서 약 4% THb로 희석한다. 이후 4% THb 용액을 10mM NaCl과 팔-필트론(Pall-Fltron)사에서 시판되는 분자량 300,000의 필터(52)를 사용하여 투석여과시켰다. 여과를 약 97%의 헤모글로빈이 필터를 통해 탱크 11에 전달될 때까지 계속하였다.(물질의 약 3%, 즉, 고분자량 중합체가 탱크 10에 보유된다). 헤모글로빈의 양은 코옥시미터(cooximeter)를 사용하여 분광학적으로 측정하였다.

탱크 11 중에 생성된 물질은 약 2 내지 4%의 THb이며, THb를 기재로 하는 약 7 내지 10%의 테트라머를 함유하였다. 이후, 2 내지 4%의 THb를 배관 또는 트랩(56)과 연결된 10mM NaCl과 팔-필트론사에서 시판되는 분자량 100,000의 필터(54)를 사용하여 투석여과시켰다. 여과는 바이오세프(BioSep) SEC-S3000 600 x 7.8mm 칼럼을 사용하여 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정되는 테트라머의 수준이 헤모글로빈 중량의 0.8% 미만이 될 때까지 계속한다. 생성된 정제된 헤모글로빈 용액은 초기에 탱크 11에 잔류하며, 이후 탈산소화를 위해 기체 교환 탱크 8로 옮겼다.

기체 교환 탱크 8은 탱크 4와 동일한 탱크, 또는 바람직하게는 상이한 탱크일 수 있다. 기체 교환 탱크 8은 도 1의 기체 교환 탱크 4와 실질적으로 동일하게 설치되며, 탱크 4와 동일한 형태로 포움 캔(58) 및 포움 캔(36)에 부착될 수 있다. 탈산소화는 약 10℃에서 질소 살포 및 약 7.5의 pH 용액으로 약 2.5 시간 후에 달성된다. 질소 살포를 총 헤모글로빈의 중량을 기준으로 하여 옥시헤모글로빈의 약 16% 미만이 용액에 잔류할 때까지 계속하였다. 그런 다음 생성된 데옥시헤모글로빈 용액을 제형화를 위해 탱크 9에 옮겼다.

제형화 탱크 9에서, 용액을 먼저 약 7%의 총 헤모글로빈으로 농축시키고, 4℃에서 pH를 약 8.8 내지 9.0으로 조절하였다. pH는 0.2M NaOH를 사용하여 조정하였다. 이후 전해질 용액을 pH 8.8 내지 9.0인 헤모글로빈 용액에 첨가하였다. 글 루코오스 및 글리신을 첨가하여 각각 약 5g/ℓ 및 1.75g/ℓ의 최종 농도를 달성하였다. 염화칼륨을 상기 용액에 첨가하여 약 3,5 내지 4,5mM의 칼륨 농도를 얻었다. 이후, 3M 염화나트륨을 첨가하여 85 내지 110 mM의 염화물 농도를 얻었다. 이후 소듐 락테이트를 첨가하여 135-155mM 농도의 나트륨 이온을 얻었다. 끝으로, 0.45몰의 아스코르브산 용액을 첨가하여 아스코르브산 농도를 약 1000㎎/ℓ 이하로 증가시켰다. 아스코르브산을 저장용 방부제/산화방지제로서 첨가하였다. 생성된 헤모글로빈 용액은 최종 삼투몰농도가 kg당 약 280 내지 360 밀리몰이었다.

이후, 제형화된 헤모글로빈 용액을 트랩(62)에 연결된 필터(60)을 사용하여 약 10%의 총 헤모글로빈으로 농축한 다음, 10% 헤모글로빈 용액을 필터(64)에 의해 여과하여 멸균시키고, 예비멸균된 백에 무균적으로 충전시켰다.

본 실시예, 배치(Batch) A에서 제조된 생성물의 특징을 표 1에 기재하였다. 또한, 모두 배치 A에 대해 상기 언급된 절차에 따라 제조된 배치 B 및 C의 특징을 표 1에 기재하였다.

[표 1]

상기에서는, 예시의 목적으로 본 발명의 바람직한 구체예를 상세하게 기재하였으나, 이에 제한되지 않는다. 본 명세서를 기준으로 하여 당업자들에게 자명한 모든 변형, 파생물 및 균등물은 하기 청구의 범위내에 포함되는 것으로 이해될 것이다.

Claims

사람 환자에게 주입될 수 있는 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액을 제조하는 방법으로서,

(a) 백혈구의 통과를 억제하기에 충분한 최소 평균 포어 크기를 갖는 필터를 통해 적혈구를 함유하는 혼합물을 여과시켜 백혈구를 제거하는 단계;

(b) 적혈구를 용해시키는 단계;

(c) 단계 (b)의 생성물에 일산화탄소를 첨가하고, 60 내지 62℃로 10시간 동안 가열하여, 열처리된 헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;

(d) 열처리된 헤모글로빈 용액을 여과시켜 가열에 의해 침전된 스트로마 및 스트로마 오염물질을 제거하는 단계;

(e) 10℃에서 열처리된 용액을 통과하도록 산소를 살포한 다음 질소를 살포하여 포움을 생성시킴으로써 열처리된 헤모글로빈 용액을 탈기시켜, 탈기되고 열처리된 헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;

(f) 탈기된 용액을 피리독실화시켜 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;

(g) 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 중합시켜 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액을 생성시키는 단계;

(h) 용액을 산소화시키는 단계;

(i) 용액을 정제하여 테트라머 헤모글로빈을 제거하고, 정제된 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈을 수거하는 단계(여기에서, 용액은 전체 헤모글로빈 중량을 기준으로 하여 0.8% 미만의 테트라머를 함유함);

(j) 정제된 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈을 탈산소화시키는 단계; 및

(k) 정제된 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액의 pH 및 전해질 수준을 생리학적 수준으로 조정하는 단계를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 탈기된 용액을 1:1 내지 3:1의 피리독살-5-포스페이트 대 헤모글로빈의 몰비로 피리독살-5-포스페이트와 접촉시킴으로써 탈기된 용액이 피리독실화됨을 특징으로 하는 방법.
제 1항에 있어서, 탈기된 용액을 약 2:1의 피리독살-5-포스페이트 대 헤모글로빈의 몰비로 피리독살-5-포스페이트와 접촉시킴으로써 탈기된 용액이 피리독실화됨을 특징으로 하는 방법.
제 2항에 있어서, 피리독살-5-포스페이트가 1시간 동안 헤모글로빈 및 헤모글로빈 및 보로하이드라이드와 접촉됨을 특징으로 하는 방법.
제 4항에 있어서, 피리독실화된 용액을 약 24:1의 글루타르알데히드 대 헤모글로빈의 몰비로 글루타르알데히드와 접촉시킴으로써 피리독실화된 용액 중의 헤모글로빈이 중합됨을 특징으로 하는 방법.
제 5항에 있어서, 피리독실화된 용액이 18시간 동안 글루타르알데히드와 접촉한후 켄칭됨을 특징으로 하는 방법.
사람 환자에게 주입될 수 있는 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액으로서, 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있는 용액:

(a) 유효기간이 지난 혈액 또는 유효기간이 지나지 않은 혈액을 감압에서 적합한 흡출 장치에 통과시켜 흡출된 혈액을 생성시키는 단계;

(b) 백혈구의 통과를 억제하기에 충분한 최소 평균 포어 크기를 갖는 일련의 필터를 통해 적혈구를 함유하는 혼합물을 여과시킴으로써 흡출된 혈액으로부터 백혈구를 제거하는 단계;

(c) 단계 (b)의 생성물에 일산화탄소를 첨가하여, pH가 6 내지 6.5인 헤모글로빈 용액을 생성시키는 단계;

(d) 단계 (c)의 용액을 1% 염화나트륨 용액으로 세척하여 세척된 용액을 수득하는 단계;

(e) 단계(d)의 세척된 용액을 물로 희석하여 용해된 세포의 용액을 형성시키는 단계;

(f) 용해된 세포의 용액을 필터를 통해 여과시켜, 스트로마 오염물질 및 세포벽 물질을 포함하지 않는 헤모글로빈 용액을 생성시키는 단계;

(g) 단계 (f)의 헤모글로빈 용액을 60 내지 62℃로 10시간 동안 가열하고 여과시켜 열처리되고 스트로마를 포함하지 않는 헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;

(h) 열처리되고 스트로마를 포함하지 않는 헤모글로빈 용액을 농축하고 투석 여과시켜 카르복시헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;

(i) 10℃에서 열처리된 용액을 통과하도록 산소를 살포한 다음 질소를 살포하여 카르복시헤모글로빈 용액을 탈기시켜 포움을 생성시킴으로써 탈기되고 열처리된 헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;

(j) 1:1 내지 3:1의 피리독살-5"-포스페이트 대 헤모글로빈의 몰비로 피리독살-5"-포스페이트를 사용하여 탈기된 용액을 피리독실화시킴으로써 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;

(k) 글루타르알데히드 수용액을 사용하여 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 중합시킴으로써, 65 내지 75%의 중합체 및 25 내지 35%의 테트라머의 중량 분포를 갖는 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액을 생성시키는 단계;

(l) 용액이 4 중량%의 헤모글로빈을 함유할 때까지 중합된 용액을 산소화시키고 희석시키는 단계;

(m) 단계 (1)의 용액을 정제하여 테트라머 헤모글로빈을 제거하고, 정제되고 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈을 수집하는 단계(여기에서, 용액은 전체 헤모글로빈 중량을 기준으로 하여 0.8% 미만의 테트라머를 함유함);

(n) 정제되고 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액을 질소로 탈산소화시키는 단계;

(o) 정제되고 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액의 pH 및 전해질 수준을 8.8 내지 9.0으로 조정하는 단계; 및

(p) 단계 (o)의 pH 조정된 용액을 농축시키고 멸균시키는 단계.
사람 환자에게 주입될 수 있는 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액을 제조하는 방법으로서, 하기의 단계를 포함하는 방법:

(a) 유효기간이 지난 혈액 또는 유효기간이 지나지 않은 혈액을 감압에서 적합한 흡출 장치에 통과시켜 흡출된 혈액을 생성시키는 단계;

(b) 백혈구의 통과를 억제하기에 충분한 최소 평균 포어 크기를 갖는 일련의 필터를 통해 적혈구를 함유하는 혼합물을 여과시킴으로써 흡출된 혈액으로부터 백혈구를 제거하는 단계;

(c) 단계 (b)의 생성물에 일산화탄소를 첨가하여, pH가 6 내지 6.5인 헤모글로빈 용액을 생성시키는 단계;

(d) 단계 (c)의 용액을 1% 염화나트륨 용액으로 세척하여 세척된 용액을 수득하는 단계;

(e) 단계(d)의 세척된 용액을 물로 희석하여 용해된 세포의 용액을 형성시키는 단계;

(f) 용해된 세포의 용액을 필터를 통해 여과시켜, 스트로마 오염물질 및 세포벽 물질을 포함하지 않는 헤모글로빈 용액을 생성시키는 단계;

(g) 단계 (f)의 헤모글로빈 용액을 60 내지 62℃로 10시간 동안 가열하고 여과시켜 열처리되고 스트로마를 포함하지 않는 헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;

(h) 열처리되고 스트로마를 포함하지 않는 헤모글로빈 용액을 농축하고 투석 여과시켜 카르복시헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;

(i) 10℃에서 열처리된 용액을 통과하도록 산소를 살포한 다음 질소를 살포하여 카르복시헤모글로빈 용액을 탈기시켜 포움을 생성시킴으로써 탈기되고 열처리된 헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;

(j) 1:1 내지 3:1의 피리독살-5"-포스페이트 대 헤모글로빈의 몰비로 피리독살-5"-포스페이트를 사용하여 탈기된 용액을 피리독실화시킴으로써 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 수득하는 단계;

(k) 글루타르알데히드 수용액을 사용하여 피리독실화된 헤모글로빈 용액을 중합시킴으로써, 65 내지 75%의 중합체 및 25 내지 35%의 테트라머의 중량 분포를 갖는 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액을 생성시키는 단계;

(l) 용액이 4 중량%의 헤모글로빈을 함유할 때까지 중합된 용액을 산소화시키고 희석시키는 단계;

(m) 단계 (l)의 용액을 정제하여 테트라머 헤모글로빈을 제거하고, 정제되고 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈을 수집하는 단계(여기에서, 용액은 전체 헤모글로빈 중량을 기준으로 하여 0.8% 미만의 테트라머를 함유함);

(n) 정제되고 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액을 질소로 탈산소화시키는 단계;

(o) 정제되고 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 용액의 pH 및 전해질 수준을 8.8 내지 9.0으로 조정하는 단계; 및

(p) 단계 (o)의 pH 조정된 용액을 농축시키고 멸균시키는 단계.
(a) 9.5 내지 12.0 g/dl의 전체 헤모글로빈;

(b) 전체 헤모글로빈의 8% 미만의 전체 메트헤모글로빈;

(c) 전체 헤모글로빈의 5% 미만의 전체 카르복시헤모글로빈;

(d) 23 내지 32 토르의 산소-헤모글로빈 해리;

(e) 280 내지 360 mmol/kg의 삼투몰농도;

(f) 135 내지 155 mmol/L의 나트륨 농도;

(g) 3.5 내지 4.5 mmol/L의 칼륨 농도;

(h) 85 내지 110 mmol/kg의 염화물 농도;

(i) 2.0 ppm 미만의 전체 유리 철;

(j) 10 내지 24%의 약 128Kd 피크 분자량 분포;

(k) 18 내지 30%의 약 192Kd 피크 분자량 분포;

(l) 45 내지 70%의 약 256Kd 피크 분자량 분포;

(m) 0.8% 미만의 전체 테트라머,

(n) 0.03 EU/ml 미만의 내독소;

(o) 50 ng/Hb 미만의 인지질; 및

(P) 2 ng/Hb 미만의 당지질을 포함하는, 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 수용액.
전체 헤모글로빈의 10 내지 24 중량%의 분자량이 약 128Kd인 헤모글로빈 중합체,

전체 헤모글로빈의 18 내지 30 중량%의 분자량이 약 192Kd인 헤모글로빈 중합체, 및

전체 헤모글로빈의 45 내지 70 중량%의 분자량이 약 256Kd인 헤모글로빈 중합체를 포함하는 중합된 헤모글로빈 수용액.
제 10항에 있어서,

a) 9.5 내지 12.0 g/dl의 전체 헤모글로빈;

b) 전체 헤모글로빈의 8 중량% 미만의 전체 메트헤모글로빈;

c) 전체 헤모글로빈의 5 중량% 미만의 전체 카르복시헤모글로빈;

d) 135 내지 155 mmol/L의 나트륨 농도;

e) 3.5 내지 4.5 mmol/L의 칼륨 농도;

f) 85 내지 110 mmol/kg의 염화물 농도를 추가로 포함함을 특징으로 하는 중합된 헤모글로빈 수용액.
제 11항에 있어서,

g) 2.0ppm 미만의 전체 유리 철;

h) 전체 헤모글로빈의 0.8 중량% 미만의 전체 테트라머; 및

i) 0.03 EU/㎖ 미만의 내독소를 추가로 포함함을 특징으로 하는 중합된 헤모글로빈 수용액.
제 12항에 있어서,

j) 50ng/Hb 미만의 인지질; 및

k) 2ng/Hb 미만의 당지질을 추가로 포함함을 특징으로 하는 중합된 헤모글로빈 수용액.
제 11항에 있어서, 280 내지 360 mmol/kg의 삼투몰농도를 가짐을 특징으로 하는 중합된 헤모글로빈 수용액.
제 11항에 있어서, 23 내지 32 토르의 산소-헤모글로빈 해리를 가짐을 특징으로 하는 중합된 헤모글로빈 수용액.
제 10항에 있어서, 15시간의 사람 환자에서의 반감기를 가짐을 특징으로 하는 중합된 헤모글로빈 수용액.
제 10항에 있어서, 24 시간의 사람 환자에서의 반감기를 가짐을 특징으로 하는 중합된 헤모글로빈 수용액.
제 10항에 있어서, 100㎖ 내지 5ℓ의 양으로 사람 환자에게 주입된 경우에 신장 기능에 감지할 수 있는 정도의 저하를 초래하지 않음을 특징으로 하는 중합된 헤모글로빈 수용액.
제 10항에 있어서, 24시간의 사람 환자에서의 반감기를 가지고, 100㎖ 내지 5ℓ의 양으로 사람 환자에게 주입된 경우에 신장 기능에 감지할 수 있을 정도의 저하를 초래하지 않음을 특징으로 하는 중합된 헤모글로빈 수용액.
제 10항에 있어서, 헤모글로빈이 글루타르알데히드-중합된 헤모글로빈임을 특징으로 하는 중합된 헤모글로빈 수용액.
제 10항에 있어서, 16%의 분자량이 약 128kd인 헤모글로빈 중합체, 26%의 분자량이 약 192kd인 헤모글로빈 중합체, 및 58%의 분자량이 약 256kd인 헤모글로빈 중합체를 포함함을 특징으로 하는 중합된 헤모글로빈 수용액.
전체 헤모글로빈을 기준으로 16 중량%의 분자량이 약 128kd인 헤모글로빈 중합체, 전체 헤모글로빈을 기준으로 26 중량%의 분자량이 약 192kd인 헤모글로빈 중합체, 전체 헤모글로빈을 기준으로 58 중량%의 분자량이 약 256kd인 헤모글로빈 중합체를 포함하는 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 수용액.
제 22항에 있어서, 100㎖ 내지 1.5ℓ의 양으로 사람 환자에게 주입된 경우에 신장 기능에 감지할 수 있을 정도의 저하를 초래하지 않음을 특징으로 하는 피리독실화되고 중합된 헤모글로빈 수용액.