NL194909C

NL194909C - Werkwijze voor de bereiding van gepolymeriseerd hemoglobine en celvrij vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes op basis daarvan.

Info

Publication number: NL194909C
Application number: NL8720283A
Authority: NL
Original assignee: Northfield Lab
Priority date: 1986-06-20
Filing date: 1987-06-12
Publication date: 2003-07-04
Also published as: JPH01501471A; GB2200639A; FR2600255A1; CA1298783C; WO1987007832A1; JP2983544B2; NL194909B; US4826811A; FR2600255B1; PT85133A; IL82890A0; EP0271542A1; PT85133B; NL8720283A; GB8801735D0; DE3790322T1; GB2200639B; EP0271542B1; DE3790322C2

Description

1 194909

Werkwijze voor de bereiding van gepolymeriseerd hemoglobine en celvrij vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes op basis daarvan

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor de bereiding van een stromavrij, verknoopt, gepolyme-5 riseerd en gepyridoxyleerd hemoglobine, waarbij men rode bloedlichaampjes lyseert, het stroma van de rode bloedlichaampjes verwijdert, het verkregen hemoglobine pyridoxyleert en behandelt met een polymerisatiemiddel en het gepolymeriseerde hemoglobine zuivert. De uitvinding heeft tevens betrekking op het met een dergelijke werkwijze verkregen celvrije vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit EP-A-0.078.961. Volgens de aldaar beschreven werkwijze 10 behandelt men een uit rode bloedlichaampjes verkregen hemoglobineoplossing met een zuurstof verbruikend reductiemiddel, een ’’effector" (pyridoxal), een verknopingsmiddel (dialdehyde) en een reductiemiddel, en verwijdert men niet verknoopt hemoglobine vervolgens door ultrafiltratie, zodanig dat het gehalte aan niet-verknoopt hemoglobine niet meer dan 15% bedraagt.

Stromavrij hemoglobine heeft het vermogen zuurstof reversibel te binden en te transporteren en is dus 15 geschikt als bloedvervangingsmiddel. Omdat problemen met de giftigheid het gebruik als bloedvervangingsmiddel in de weg stonden, waren verdere aanpassingen aan stromavrij hemoglobine nodig om te komen tot een niet-giftig, 4.001.200, 4.001.401 en 4.053.590 wordt een gepolymeriseerd, verknoopt, stromavrij hemoglobine geopenbaard als bloedvervangingsmiddel dat zuurstof naar de weefsels en de organen moet brengen en als bloedplasmazwelmiddel. Het pyridoxyleren van het stromavrije hemoglobine 20 blijkt een gunstige invloed te hebben op het vermogen zuurstof reversibel te binden en blijkt de stabiliteit en de houdbaarheid van het biologische product te verhogen (J. Surgical Research 30,14-20 (1981)). Gepyridoxyleerd, met glutaaraldehyd gepolymeriseerd hemoglobine is beschreven in LR. Sehgal, et al, In Vitro and In Vivo Characteristics of Polymerized, Pyridoxylated Hemoglobin Solution, Fed. Proc. 39, 2383 (1980); L.R. Sehgal, et al, Preparation and In Vitro Characteristics of Polymerized, Pyridoxylated Hemoglo-25 bin, Transfusion 23(2), 158 (maart-april 1983). Verder is de werking van het gepolymeriseerde, gepyridoxy-~~~ leerde hemoglobine als zuurstofdrager geopenbaard in L.R. Seghal, et al, Polymerized, Pyridoxylated Hemoglobin: A Red Cell Substitute with Normal Oxygen Capacity, Surgery 95(4), 433-38 (april 1984); LR. Sehgal, et al, An Appraisal of Polymerized, Pyridoxylated Hemoglobin as an Acellular Oxygen Carrier, Advances in Blood Substitute Research 19-28 (Alan R. Liss, Inc. 1983).

30 Jarenlang is door onderzoekers gemeld dat volgens uiteenlopende technieken bereide hemoglobine-oplossingen weliswaar in staat zijn voldoende hoeveelheden zuurstof te dragen om het leven in stand te houden, maar toch ongewenste bijeffecten hebben. Het meest verontrustende neveneffect is een verminderde werking van de nieren. Verondersteld werd dat deze veranderingen het gevolg zijn van de aanwezigheid van ongewenste contaminanten zoals bacterieel endotoxine of brokstukken van de membranen van 35 rode cellen (stroma). Hoewel contaminanten als deze inderdaad wijzigingen in de nierwerking met zich kunnen brengen, leiden hemoglobine-oplossingen die nagenoeg vrij zijn van de bovenbedoelde contaminanten toch nog tot een aanzienlijke verstoring van de nierfunctie. Ook al is deze storing tijdelijk en omkeerbaar, toch kan deze in een ziektetoestand zoals bij shock door bloedverlies, wanneer de nier bij deze toestand van geringe bloedtoevoer toch al in gevaar is, bijzonder alarmerend zijn. De oorzaak van de 40 verstoorde nierfunctie wordt toegeschreven aan fysiologisch onaanvaardbare hoeveelheden niet-gepolymeriseerd hemoglobine-tetrameer. Andere ongewenste bijeffecten van de infusie van tetrameer hemoglobine zijn vergiftiging van de nier, vaatvernauwing, hemoglobinurie, vermindering van de hartslag, verhoging van de gemiddelde slagaderlijke bloeddruk en extravasatie van infuusvloeistof, in het bijzonder in de buikvliesholte.

45 In de praktijk is er tot nu toe geen bekend, van hemoglobine afgeleid, bloedvervangingsmiddel erin geslaagd toxiciteitsproblemen volledig te vermijden. De volgens de stand van de techniek bereide producten blijken uiteenlopende hoeveelheden hemoglobine-tetrameer te bevatten. De bereidingswijze volgens de Amerikaanse octrooischriften 4.001.200, 4.001.401 en 4.053.590 levert bijvoorbeeld geen therapeutisch bruikbaar product. Ten eerste is er, net als bij andere werkwijzen, sprake van een ongewenste grote 50 hoeveelheid niet-gepolymeriseerd hemoglobinetetrameer in het uiteindelijke product. Ten tweede kunnen er te veel verontreinigingen, zoals giftig rest-tolueen, in de oplossing achterblijven doordat deze tijdens de bereiding niet volledig zijn verwijderd. Ten derde zal het product dat volgens de beschrijving een P^ van 100-120 mm Hg heeft, fysiologisch onwerkzaam zijn omdat de hemoglobine-oplossing geen zuurstof in de longen zal opnemen. Tenslotte leiden grotere hoeveelheden polymeren met hoger molecuulgewicht tot een 55 product met een grote gevoeligheid voor gelering zodat de daaropvolgende stappen van filtrering en zuivering moeilijk of niet uitvoerbaar zijn dan alleen in onaanvaardbaar verdunde oplossingen.

Bekende bloedvervangingsmiddelen op basis van stromavrij hemoglobine, zoals bovengenoemde 194909 2

Europese octrooiaanvrage 0.078.961 en de Amerikaanse octrooischriften 4.001.200, 4.001.401 en 4.053.590, blijken echter nog enkele ongewenste bijeffecten te hebben, zoals een verminderde nierfunctie, hemoglubinurie, extravasatie van infuusvloeistof, vaatvemauwing en andere hart- en vaatproblemen. Gevonden is nu een werkwijze die leidt tot een bloedvervangingsmiddel dat deze bijeffecten niet of veel 5 minder vertoont. De werkwijze volgens de uitvinding zoals vermeld in de aanhef wordt gekenmerkt door een afsluitende zuiveringsstap waarin men het gepolymeriseerde hemoglobine behandelt met haptoglobins, totdat het gezuiverde gepolymeriseerde hemoglobine een gehalte aan niet-gepolymeriseerd hemoglobine (tetrameer) van minder dan 2% bevat. Het met deze werkwijze verkregen product behoort eveneens tot de uitvinding.

10

De uitvinding wordt toegelicht, mede aan de hand van 14 figuren waarin: figuur 1 een schematische weergave van de ladingsgewijze uitvoering van de pyridoxylering is; figuur 2 een schematische weergave van de pyridoxylering en polymerisering met behulp van een membraan volgens de uitvinding is; 15 figuren 3A, 3B en 3C grafische weergaven zijn van een dichtheidsmeting van in wezen tetrameervrij, verknoopt, gepolymeriseerd en gepyridoxyleerd hemoglobine dat is afgescheiden door elektroforese op SDS-polyacrylamidegel; figuur 4 een elutiepatroon van verknoopt, gepolymeriseerd en gepyridoxyleerd hemoglobine verkregen met een gelfiltratiekolom weergeeft; 20 figuur 5 een elutiepatroon van in wezen tetrameervrij, verknoopt, gepolymeriseerd en gepyridoxyleerd hemoglobine verkregen met een gelfiltratiekolom weergeeft; figuur 6A een grafiek is die de spectrale curve voor oxyhemoglobins weergeeft; figuur 6B een grafiek is die de spectrale curve welke is verkregen met geoxygeneerd, in wezen tetrameervrij, verknoopt, gepolymeriseerd en gepyridoxyleerd hemoglobine weergeeft; 25 figuur 7 een grafiek is die het verband tussen de hemoglobineconcentratie van het in wezen tetrameer-- vrije, verknoopte, gepolymeriseerde en gepyrodoxyleerd hemoglobine en de colloïde osmotische druk (COP) weergeeft; figuur 8 een grafiek is die de dissociatiecurve van oxyhemoglobine voor een in wezen tetrameervrij, verknoopt, gepolymeriseerd en gepyridoxyleerd hemoglobine weergeeft; 30 figuur 9 een grafiek is die het elutiepatroon van in wezen tetrameervrij, verkoopt, gepolymeriseerd en gepyridoxyleerd hemoglobine van een hoge-druk-vloeistofchromatografiekolom weergeeft; figuur 10 een grafiek is die het verband tussen de hemoglobineconcentratie van het in wezen tetrameer-vrije, verknoopte, gepolymeriseerde en gepyridoxyleerde hemoglobine en de viscositeit van de oplossing weergeeft; en 35 figuur 11 een grafiek is die de plasma-verdwijningskromme voor stromavrij hemoglobine (SFH) en in wezen tetrameervrij, verknoopt, gepolymeriseerd en gepyridoxyleerd hemoglobine weergeeft.

In het kader van de uitvinding wordt onder de term ”verknoopt” verstaan de chemische invoering van moleculaire "bruggen” of op in een molecuul of tussen moleculen met het oog op wijziging van de vorm, de 40 afmeting, de functie of de fysische eigenschappen van het molecuul. De term in wezen tetrameervrij duidt op een zuiverheidsgraad met betrekking tot contaminatie met tetrameer waarbij bepaalde biologische reeponsen op aan een zoogdier toegediend tetrameer niet langer aanwezig zijn. Een belangrijk criterium is het ontbreken van wijzigingen in de nierfunctie bij infusie van farmaceutisch effectieve hoeveelheden, dat wil zeggen bij een zuiverheid van ongeveer 98% of beter (minder dan ongeveer 2% tetrameer aanwezig). De 45 begrippen "ultra gezuiverd” of "gezuiverd” product hebben dezelfde betekenis als in wezen tetrameervrij.

De term polymerisatieoplossing duidt op een oplossing die een "verknopingsmiddel” of polymerisatiemiddel zoals glutaaraldehyd, imidoesters, diaspirine of andere in een biologisch geschikte drager bevat. De term halfdoorlatend membraan duidt op een membraan dat doorlatend is voor sommige moleculaire deeltjes en niet voor andere en, in het bijzonder, op een membraan dat als een selectief filter werkt dat moleculen van 50 ongeveer 30.000 dalton en meer tegenhoudt

Het voortbrengsel van de werkwijze volgens de uitvinding, een oplossing van gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine dat wezenlijk vrij is van tetrameer (natief) hemoglobine en verschillende andere contaminanten, is fysiologisch aanvaardbaar en therapeutisch en klinisch bruikbaar. Het voortbrengsel heeft het vermogen zuurstof reversibel te binden hetgeen nodig is voor zuurstoftransport. Als belangrijk- 55 ste kenmerk heeft het voortbrengsel goede beladings- en ontladingskenmerken in het gebruik hetgeen overeenkomt met het hebben van een zuurstof-hemoglobine-dissociatiecurve (P^) die gelijkt op die van natuurlijk bloed. Het voortbrengsel heeft een sterke neiging tot het binden van zuurstof in de haarvaten in de * 3 194909 longen en geeft vervolgens de zuurstof op de juiste wijze aan de weefsels in het lichaam af. Het voortbrengsel vergt ook geen onderzoek naar de verenigbaarheid met de ontvanger.

De werkwijze volgens de uitvinding is bijzonder doordat het een product oplevert dat in een tot nu toe bij de fractionering en zuivering van polymere hemoglobinen onbekende mate vrij is van verontreiniging met 5 tetrameer. Een ander voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding is dat daarmee het eindproduct nagenoeg vrij van microbiële en virale antigenen en ziektekiemen kan worden gemaakt. Tot dergelijke antigenen en ziektekiemen behoren bijvoorbeeld bacteriële, rickettsiële, schimmelachtige, protozoTsche, virale en andere organismen. Het belangrijkste is dat het biologische product nagenoeg vrij kan worden gemaakt van virussen die hepatitis en verworven afweerdeficiëntie (AIDS) veroorzaken. Een van tetrameer 10 hemoglobine en verschillende andere contaminanten vrij product heeft een zeer ruime klinische bruikbaarheid, gebruiksgemak en veiligheid.

Wat betreft de fysiologische eigenschappen: het biologische product volgens de uitvinding veroorzaakt geen vaatvemauwing, niervergiftiging, hemoglobinurie of andere problemen die samenhangen met de intraveneuze toediening van bekende hemoglobine-oplossingen die ongewenste hoeveelheden tetrameer 15 hemoglobine bevatten. Resultaten hebben aangetoond dat bij intraveneuze toediening van het hier beschreven product geen merkbare vermindering in de urineproductie, geen merkbare glomerulaire filtratiesnelheid, geen waarneembare extravasatle in de buikvliesholte en geen waarneembare kleurverandering van de geproduceerde urine optreden.

Daardoor is het acellulaire vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens de uitvinding bruikbaar 20 voor de behandeling van trauma, hartspierinfarct, beroerte, acute anemie en verstoringen in de zuurstofvoorziening, zoals hypoxemie, hypoxie en therminale hypoxie die het gevolg zijn van het feit dat de volledige oxygenering van het bloed door de long is gestoord of onderbroken. Het product is ook toepasbaar bij de behandeling van ziekten of medische omstandigheden die een reanimatievloeistof (bijvoorbeeld bij trauma, in het bijzonder shock door bloedverlies), intravasculaire volumevergroter of uitwisselingstransfusie 25 vereisen. Het product kan niet alleen van nut zijn voor een medische behandeling maar ook voor het bewaren van organen voor transplantaties.

Dit biologische product kan worden toegepast voor geneeskundige behandeling waarbij aan een zoogdier dat aan een dergelijke behandeling behoefte heeft intraveneus een farmaceutisch doeltreffende hoeveelheid van dit wezenlijk tetrameervrij, nagenoeg stromavrij, verknoopt, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglo-30 bine in combinatie met een niet-giftige, farmaceutisch aanvaardbare drager wordt toegediend. Een uitwisselingstransfusie brengt in wezen mee het vervangen van het bloed van de patiënt door het acellulaire vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens de uitvinding met gebruikmaking van gangbare werkwijzen voor de behandeling van bepaalde toestanden of storingen zoals bloedvergiftiging, autoimmunisatie-aandoeningen en dergelijke. De farmaceutisch doeltreffende hoeveelheid is afhankelijk van 35 de gewenste therapie voor de desbetreffende ziekte of medische toestand en van typische doseringsparam-eters zoals het lichaamsgewicht van de patiënt. In het algemeen is de farmaceutisch doeltreffende hoeveelheid uiteraard het doseringsgebied dat door artsen en ander geneeskundig personeel In de praktijk klinisch zinvol wordt geacht. Voor een medisch deskundige is het duidelijk hoe in een gegeven situatie een doseringshoeveelheid moet worden gekozen. De farmaceutisch aanvaardbare drager is bij voorkeur niet 40 giftig, inert en verenigbaar met hemoglobine. Voorbeelden van dergelijke dragers zijn onder meer water, in evenwicht gebrachte zoutoplossing, fysiologische zoutoplossing (bijvoorbeeld gelactateerde Ringer's oplossing, Hartman’s oplossing en dergelijke), dextrose-oplossing en dergelijke.

Het uitgangsmateriaal voor de werkwijze volgens de uitvinding is bij voorkeur verouderd menselijk bloed. Bij voorkeur wordt het bloed in deze werkwijze niet gebruikt indien het langer dan acht weken na de op de 45 zak gestempelde vervaldatum bewaard is geweest. Alle hier beschreven werkwijzen zijn toepasbaar op ander zoogdierbloed, eventueel met kleine, voor de deskundigen bekende aanpassingen.

De volledige werkwijze kan worden uitgevoerd bij ongeveer 2°C tot ongeveer 8°C, bij voorkeur bij ongeveer 5°C. Het verouderde bloed wordt met ongeveer twee tot ongeveer vijf volumes van een isotone zoutoplossing zoals 0,9% natriumchloride gewassen. De wasoplossing kan eventueel antibiotica, bijvoor-50 beeld penicilline, streptomycine, gentamycine, polymyxine-B-sulfaat en dergelijke bevatten. Toevoeging van antibiotica is niet essentieel voor de werkwijze maar kan, indien de werkwijze wordt uitgevoerd in een niet-farmaceutische omgeving, de besmetting met bacteriën minimaliseren.

De rode bloedcellen worden gewassen en gelyseerd, hetzij met een alkalimetaalfosfaatbuffer (bijvoorbeeld natriumfosfaat) of met pyrogeenvrij water. De volgende stap is het afscheiden van het stroma van de 55 rode bloedcellen uit de oplossing. De verwijdering van het stroma van de rode cellen kan geschieden door filtratie met microporiën. Een werkwijze die de voorkeur heeft is het gebruik van ’’cross-flow” filtratie met holle-vezelpatronen. Voorbeelden van cross-flow filtratiesystemen zijn het Pellicon systeem (Millipore Corp., 194909 4

Bedford, MA); het HF-Lab 15 ultrafiltratiesysteem (Romicon Corp., Wobum, MA); het KF200-100 KROS-FLOW (Microgon, Lagona Hills, CA) of het DC-30-systeem (Amicon, Danvers, Mass). De systemen zijn ook beschikbaar voor kleinere en grotere ladingen dan die welke in het onderstaande voorbeeld beschreven is.

In de volgende stap wordt de stromavrije hemoglobine-oplossing met pyridoxal-5'-fosfaat in een 5 molverhouding van ongeveer 2:1 tot 4:1 ten opzichte van hemoglobine gepyridoxyleerd. Het is gewenst de pyridoxylering te doen plaatsvinden in aanwezigheid van een zure buffer zoals Tris-hydrochloridebuffer in een eindconcentratie van ongeveer 0,1 M en ongeveer 1 g/l glutathion. De oplossing wordt met een gaswisselaar met-helium, stikstof of-een-ander inert-gas, bij-voorkeur-met-stikstof-uit een gastank of een vloeistoftank, volledig gedeoxygeneerd. Alle slangen die wordt gebruikt om de oplossing te verpompen 10 dienen bij voorkeur ondoorlatend of minimaal doorlatend te zijn voor zuurstof, zoals Tygon B-44 slangen (Cole-Palmer Co., Chicago, IL). Aan de gedeoxygeneerde oplossing wordt een reductiemiddel zoals natriumcyanoboorhydride of bij voorkeur natriumboorhydride toegevoegd. Een overmaat aan reagentia kan door dialyse met behulp van een nierdialysefilter zoals C-DAK 1.3 (Cordis Dow Corp., Miami, FL) of TH-15 (Terumo Cor., Tokio, Japan) tegen pyrogeenvrij water worden verwijderd. In plaats daarvan kunnen 15 ultrafiltratiepatronen met een molecuulgewicht-afkapping van niet meer dan 30.000 dalton worden gebruikt (deze patronen zijn verkrijgbaar bij Amicon Corp., Romicon, Millipore).

Vervolgens wordt de stromavrij gepyridoxyleerde hemoglobine-oplossing met 25% glutaaraldehyd (E.M. Grade, Polysciences, Warington, PA) gepolymeriseerd. De stromavrije, gepyridoxyleerde hemoglobine-oplossing wordt via een nierdialysefilter of een ander geschikt membraanfilter aan glutaaraldehyd blootge-20 steld. De duur van de polymerisatie en de hoeveelheid toegevoegd glutaaraldehyd zijn afhankelijk van het volume van de hemoglobine-oplossing, de gewenste opbrengst aan polymeren en de gewenste molecuulgewichtsverdeling. In het algemeen geldt dat hoe langer de polymerisatietijd is hoe groter de molecuulgewichtsverdeling van polymeren, hoe groter de opbrengst ervan en hoe lager de colloTdale osmostische druk van de eindoplossing is. Kenmerkend wordt in 3,5 tot 4 uur ongeveer een opbrengst van 25 70% aan polymeren verkregen. Dit is bij voorkeur het eindpunt van de polymerisatie. Een opbrengst van 80 tot-90% kan in 7 uur worden bereikt, maar leidt tot een aanzienlijk hogere molecuulgewichtsverdeling van de polymeren (figuur 3C).

De polymeriseringswerkwijze leidt, wanneer deze wordt uitgevoerd volgens de uitvinding, tot een hoge opbrengst aan polymeren. Om een product met een betrouwbare klinische bruikbaarheid te bereiden is het 30 zeer belangrijk dat de snelheid van de reactie en het oppervlak van interactie tijdens de polymerisatie zodanig worden geregeld dat een product met een smal molecuulgewichtsgebied, waarvan het gemiddelde tussen 120.000 en 600.000 dalton ligt, wordt verkregen. De polymerisatiereactie kan worden gevolgd aan de hand van de afname van de colloïde osmotische druk met behulp van een oncometer zoals IL 186 (Instrumentation Laboratories, Danvers,-LA) of Wescor Colloid Osmometer (Wescor, Logan, Utah), 35 hoge-druk-vloeistofchromatografie (HPLC) of enige andere aan de deskundige bekende, geschikte techniek. Geringe hoeveelheden moleculen met hoog molecuulgewicht kunnen blijkens bepaling met natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) aanwezig zijn.

In het vlak van het halfdoorlatende membraan bij de pyridoxylerings- en polymeriseringsstappen van de werkwijze volgens de uitvinding is de biochemische drager (d.w.z. water, zouten, suikers of andere kleine 40 moleculen of ionen) in hoge mate vrij om als reactie op hydrostatische, hydrodynamische, osmotische of oncotische krachten door het membraan heen en weer bewegen. De moleculen of ionen van de werkzame stof (d.w.z. polymerisatiemiddelen, reductiemiddelen, pyridoxyleringsmiddelen e.d.) zijn als gevolg van hun grotere omvang en gewicht wat minder vrij om door het membraan te bewegen. De hemoglobinemoleculen kunnen het intacte membraan in het geheel niet passeren. Deze opzet leidt tot een beheerste onderwerping 45 van hemoglobinemoleculen of andere uitgangsstoffen aan de actieve stof. De variabelen die kunnen worden gewijzigd zijn de vloeisnelheid van de hemoglobine-oplossing, de concentratie van het hemoglobine in oplossing, de concentratie van de actieve stof en de vloeisnelheid van de actieve stof. Naast de genoemde variabelen kunnen variabelen zoals de tijd, temperatuur en werkzaam oppervlak worden gewijzigd teneinde deze opzet aan te passen voor een breed scala aan reactanten, reacties en rendementen. De gehele 50 reactie kan in een fysiologisch aanvaardbaar medium plaatsvinden. Verder kan de hemoglobine-oplossing door de reactie lopen zonder dat belangrijke wisselingen in verdunning of ionomgeving worden ondervonden.

Schematisch geeft figuur 1 de ladingsgewijze methode van pyridoxylering weer. Een oplossing van stromavrij hemoglobine en reagentia waaronder pyridoxal-5'-fosfaat 6 wordt aan het mengvat of de houder 5 55 toegevoegd. De pH wordt bijgesteld en gevolgd met een pH-elektrode 7. De houder 5 heeft een uitlaat of ontluchtklep 11. Een roerinrichting zoals een toroïde-menger die een elektromotor 9, universele koppelingen 9a voor het koppelen van de motoras aan de roerassen en roerder 10 omvat zorgt voor ononderbroken 5 194909 menging. De oplossing 6 wordt met behulp van een pompinrichting 4 uit de houder 5 door de membraan-gaswisselaar 1 gepompt en vervolgens naar de houder 5 teruggeleid. Een stikstofbron 8 voert een constante stroom stikstof door de membraangaswisselaar 1 zodat de oplossing 6 wordt gedeoxygeneerd.

De membraangaswisselaar 1 bevat uitlaat 3 voor de afvoer van gassen. Een oplossing die een reductie-5 middel bevat wordt door spuittoevoer 2 toegevoegd. De omloop van de oplossing van gedeoxygeneerd hemoglobine door deze opstelling door middel van constante pompwerking van de pompinrichting 4 gaat door totdat de gewenste opbrengst aan gepyridoxyleerd hemoglobine is verkregen.

Figuur 2 illustreert schematisch een opstelling voor het pyridoxyleren respectievelijk polymeriseren met behulp van de membraantechniek volgens de uitvinding. Voor het pyridoxyleren wordt een oplossing van 10 stromavrij hemoglobine en reagentia waaronder pyridoxal-5'-fosfaat 19 aan het mengvat of tweede reservoir 18 toegevoegd. Het tweede reservoir 18 heeft een uitlaat of ontluchtklep 17. Een roerinrichting zoals een toroTde menger die een elektromotor 16, universele koppelingen 16a en roerder 20 omvat, zorgt voor ononderbroken menging. Aanvankelijk wordt oplossing 19 continu door twee deoxygeneringsleidingen gepompt, waarbij doorgangen 31 en 32 dichtgeklemd zijn. Tegelijkertijd wordt de oplossing 19 door 15 pompinrichting 15 uit het tweede reservoir 18 door een membraangaswisselaar 13 en door pompinrichting 21 door membraangaswisselaar 23 en een nïerdialysemembraanfilter 27 gepompt en vervolgens naar het tweede reservoir 18 teruggevoerd. De stikstofbronnen 12 en 24 zorgen voor een constante stikstofstroom door membraangaswisselaars 13 respectievelijk 23 ter deoxygenering van oplossing 19. Voor de afvoer van gassen bevatten de membraangaswisselaars 13 en 23 uitlaten 14 en 22. De pH wordt door pH-elektrode 20 25, die via een elektrische leiding 26 met een pH-meter is verbonden, gecontroleerd. Na deoxygenering worden de toegangen 31 en 32 geopend. Een reductiemiddel bevattende oplossing 30 wordt door pompinrichting 28 uit vat of eerste reservoir 29 door het nierdialysemembraanfilter 27 gepompt en naar het eerste reservoir 29 teruggevoerd.

Wanneer de pyridoxylering is voltooid is wordt de reductiemiddel bevattende oplossing 30 vervangen 25 door pyrogeenvrij water. Het pyrogeenvrije water wordt dan door pompinrichting 28 door nierdialyse- -membraanfilter 27 gepompt om-de overmaat reagentia te dialyseren-en vervolgens naar-het-eerste-reservoir 29 teruggevoerd. De toegangen 31 en 32 worden met klemmen gesloten en oplossing 19 wordt continu rondgeleid en daarbij gedeoxygeneerd.

Voor de polymerisatie worden de toegangen 31 en 32 geopend. De oplossing van stromavrij, gepyridoxy-30 leerd hemoglobine 19 wordt constant door de opstelling rondgeleid. Het pyrogeenvrije water in het eerste reservoir 29 wordt vervangen door een polymerisatie-oplossing, die een polymerisatiemiddel 30 bevat. De polymerisatie-oplossing wordt dan door pompinrichting 28 door het nierdialysemembraanfilter 27 gepompt en naar het eerste reservoir 29 teruggevoerd. Naarmate polymerisatiemiddel wordt onttrokken, wordt het stapsgewijs aan het eerste reservoir toegevoegd.

35 In principe wordt de oplossing die een reductiemiddel bevat voor de pyridoxylering op de polymerisatie-oplossing die een polymerisatiemiddel bevat uit een eerste reservoir 29 naar een zijde van een halfdoor-latend membraan in het nierdialysemembraanfilter 27 gepompt terwijl de gedeoxygeneerde hemoglobine-oplossing respectievelijk de gepyridoxyleerde, gedeoxygeneerde hemoglobine-oplossing uit een tweede reservoir 18 naar de tegenover liggende zijde van het membraan wordt gepompt Een deel van de oplossing 40 die een reductiemiddel of polymerisatiemiddel bevat, diffundeert door het membraan en pyridoxyleert of polymeriseert het hemoglobine aan de andere zijde van het membraan. Het gedeelte van de oplossing dat een reductiemiddel of polymerisatiemiddel bevat dat niet diffundeert wordt aan het eerste reservoir 29 teruggevoerd. Evenzo wordt de gedeoxygeneerde hemoglobine-oplossing die hetzij het gepyridoxyleerde hetzij het gepolymeriseerde hemoglobine bevat naar het tweede reservoir 18 teruggevoerd. Dit proces gaat 45 ononderbroken door totdat de gewenste opbrengst aan product is verkregen.

Aan het eind van de polymerisatie kan de concentratie aan niet-gepolymeriseerd tetrameer hemoglobine in de oplossing belangrijk worden verlaagd door een aan de deskundige bekende geschikte filtrering of zuivering. Verwijdering van vrijwel al het overblijvende niet-gemodificeerde tetrameer kan geschieden doordat men de gepolymeriseerde oplossing door ultrafiltratiepatronen met holle vezels pompt en vervol-50 gens door middel van gelchromatografie, of in plaats daarvan met alleen gelchromatografie zuivert

De overblijvende sporen niet-gemodificeerd tetrameer hemoglobine kunnen volgens de uitvinding worden gecomplexeerd door alleen toevoeging van haptoglobine, behandeling met haptoglobine na toepassing van ultrafiltratiepatronen met holle vezels en/of gelchromatografie of verwijdering door middel van affiniteits-chromatografie met aan gel gebonden haptoglobine. Haptoglobine bindt zich irreversibel aan tetrameer 55 hemoglobine, ook in aanwezigheid van gepolymeriseerd hemoglobine. Haptoglobine bindt hemoglobine in een molverhouding van 1:1. Indien de complexering in een vrije oplossing wordt uitgevoerd is er 1,3-1,5 g haptoglobine nodig om 1 g hemoglobine te binden. Het haptoglobine kan in plaats daarvan ook aan een 194909 6 geactiveerd agarosegel worden gebonden.

De pH van de eindoplossing wordt ingesteld op ongeveer 9 en in evenwicht gebracht met elektrolytcon-centraties die overeenkomen met die van normaal plasma. Voor klinische toepassing kunnen als elektrolyten onder meer worden toegevoegd natrium, kalium, chloride, calcium, magnesium en dergelijke. Eventueel 5 kunnen ook gangbare antioxydanten zoals glutathion, ascorbaat of glucose worden toegevoegd. De eindoplossing kan volgens elke bekende techniek die voor toepassing op biologische producten geschikt is, worden gesteriliseerd.

De essentiële eigenschappen van de oplossing volgens de uitvinding in benaderde hoeveelheden of gebieden worden hieronder ter vergelijking weergegeven naast die van normaal bloed.

10

Gepolymeriseerd HB Normaal bloed

Hb 7-18 g/dl 12-15 g/dl 15 02-draagvermogen 9,7-25,0 vol.% 16,6-20,9 vol.%

Bindlngscoëfficiënt (bij 37°C) 1,30 ml/g Hb 1,32 ml/g Hb ΡΜ (bij pC02 40 torr, pH 7,4, 37°C) 1,9-2,9 kPa 3,5 kPa

Methemogloblne minder dan 15% minder dan 2%

Colloïde smotische druk 0,9-4,0 kPa 2,7-33 kPa 20 Totaal fosfolipidegehalte minder dan 0,004 mg/ml

Viscositeit (bij 25°C) 3,2 mPa.s (8 g/dl) 3,5 mPa.s (hematocriet=45%)

De onderstaande voorbeelden werden uitgevoerd bij ongeveer 5°C en atmosferische druk.

25

Voorbeeld I

Bereiding van een oplossing van stromavrij tetrameer hemoglobine

Verouderd menselijk bloed werd tweemaal gewassen met een oplossing van 0,9% natriumchloride die de 30 volgende antibiotica per liter oplossing bevatte:

Penicilline 50.000 E

Streptomycins 50 mg 35 Gentamycine 40 mg

Polymixine-B-sulfaat 2,5 mg

De rode bloedcellen (RBC) werden tweemaal met gelijke volumes van de bovengenoemde oplossing 40 gewassen en 15 minuten bij 2.500 g gecentrifugeerd. Meer dan 95% van de leerachtige buitenlaag werd verwijderd met een plasma-extractor (Fenwal Laboratories, Morton Grove, IL). De gewassen en gepakte RBCs werden vervolgens verzameld en gelyseerd met 3 tot 4 volumes pyrogeenvrij water. Honderd eenheden gewassen RBCs resulteerden in een volume van 15-20 I met een hematocriet van 20-24%. Vijftien tot twintig liter gewassen RBCs werd in 40-80 liter koud pyrogeenvrij water gegoten. Het aldus 45 bereide lysaat werd vervolgens door 2 tot 4 holle-vezelpatronen van 0,1 μ gepompt. Daarbij werd een luchtpomp (LP30, Amicon Corp., Danvers, MA) gebruikt. De bij 0,1 μ afkappende patronen waren verkrijgbaar bij Romicon Ine., dochter van Rohm and Haas Co., Wobum, MA 01801. Het hemoglobine, dat wezenlijk vrij van RBC-stroma was, kwam met de overige enzyminhoud van de RBC als ultrafiltraat door het filter. Porties van het filtraat werden verscheidene malen tijdens dit proces gecentrifugeerd. De afwezigheid 50 van een neerslag duidde op een goede integriteit van het membraan.

Er werd een opbrengst van 97% in wezen stromavrij hemoglobine verkregen.

Tijdens de eerste scheidingsstap werd het lysaatvolume verlaagd tot 12-15 liter en door toevoeging van pyrogeenvrij water op dat volume gehouden totdat de benodigde hoeveelheid hemoglobine was gewonnen. Tegelijk met deze stap werd het ultrafiltraat dat het hemoglobine bevatte geconcentreerd met behulp van 3 55 tot 4 bij 30k afkappende patroonfilters met holle vezels (H10 P30, Amicon Corp., Danvers, MA) en een LP 30 luchtpomp. Het ultrafiltraat was tot een uiteindelijke hemoglobineconcentratie van ongeveer 20-22 g/dl geconcentreerd.

7 194909

Voorbeeld II

Bereiding van een oplossing van stromavrij tetrameer hemoglobine Alternatieve methode 5 Afzonderlijk eenheden verouderd bloed werden met 0,9% natriumchloride-oplossing gevuld. De rode cellen en leerachtige buitenlaag liet men gedurende de nacht uitzakken. De bovenstaande vloeistof en de leerachtige laag werden vervolgens geëxtraheerd.

De gepakte cellen werden vervolgens in 3-5 volumes 0,9% natriumchloride-oplossing gegoten. De cellen werden gewassen en geconcentreerd met behulp van een doorstroomfilter met holle vezels van 0,2 μ (K205 10 - KROSSFLOW, Microgon Corp., Laguna Beach, CA) en een luchtpomp (LP 30, Amicon Corp., Danvers, MA). De gepakte cellen werden vervolgens door toevoeging van 3-5 volumes pyrogeenvrij water gelyseerd. De doorstroomfiltratie werd vervolgens herhaald, waarbij het tetramere hemoglobine met de enzyminhoud van de rode cellen in het ultrafiltraat werd verzameld, terwijl het stroma door het filter werd vastgehouden. Porties van het filtraat werden tijdens dit proces verscheidene malen gecentrifugeerd. De afwezigheid 15 van een neerslag duidde op een goede integriteit van het membraan. Er werd een opbrengst van 97% aan in wezen stromavrij hemoglobine verkregen. Tegelijk met deze stap werd het ultrafiltraat dat het hemoglobine bevatte, met behulp van 3-4 patroonfilters met bij 30k afkappende holle vezels (H10 P30, Amicon Corp., Danvers, MA) en een LP 30 luchtpomp geconcentreerd. Het ultrafiltraat werd tot een uiteindelijke hemoglobineconcentratie van ongeveer 20-22 g/dl geconcentreerd.

20

Voorbeeld III

Pyridoxylering van het stromavrije hemoglobine Opstelling in gemengde lading 25 Volgens voorbeeld I of II werd een oplossing van stromavrij hemoglobine bereid. De volgende reagentia werden gemengd: 1. Pyridoxal-5'-fosfaat in een molverhouding van 4:1 ten opzichte van hemoglobine; 2. Tris-HCI-buffer- 0,1 M eindconcentratie in de hemoglobine-oplossing; 3. Glutathion — 1 g/1 oplossing; 30 4. Ascorbinezuur - 0,2 g/l; 5. Glucose 0,5 g/l; en 6. Antibiotica - dezelfde antibiotica als In voorbeeld I.

De bovenstaande reagentia werden in het kleinst mogelijke volume pyrogeenvrij water opgelost en de pH werd ingesteid op 7,25-7,45. Het bovenstaande mengsel werd aan de hemoglobine-oplossing toegevoegd. 35 De pH van de hemoglobine-oplossing werd met 0,1 N NaOH ingesteld op 7,35-7,45 bij 5°C. Uiteindelijk werd de hemoglobineconcentratie bijgesteld op 17,5-18,5 g/dl.

De oplossing (18-201) werd naar een gasdicht roestvrij stalen reservoir overgebracht. Deoxygenering van de oplossing geschiedde door middel van een membraangaswisselaar (William Harvey, Bently Laboratories, Shiley Sales Corp., Irvine, CA). Met een snelheid van ongeveer 170 l/min werd stikstofgas 40 door de wisselaar geborreld. De hemoglobine-oplossing werd met een snelheid van 4-6 l/min door de gaswisselaar gepompt. Een voldoende verwijdering van zuurstof werd bepaald als een 02-verzadiging van minder dan 5% en een zuurstofgehalte van minder 1 vol.% (met door IL 282 Co-oximeter, Instrumentation Laboratories, Lexington, MA). Dit werd bereikt in 4-8 uur (zie figuur 1).

Aan de gedeoxygeneerde hemoglobine-oplossing werd per liter oplossing 0,02 M natriumboorhydride 45 (eindconcentratie) toegevoegd. Het natriumboorhydride werd in niet minder dan 300-500 ml 0,001 N NaOH opgelost. Deze oplossing werd via de spuittoegang van de gaswisselaar met een snelheid van ongeveer 100 ml/uur in de hemoglobine-oplossing gepompt. In het roestvrij stalen reservoir werd een ontluchtklep opengelaten om drukopbouw te voorkomen. Na de toevoeging van het NaBH4 werd de oplossing zuurstofvrij gehouden. Een maximale opbrengst van ongeveer 70-80% gepyridoxyleerd hemoglobine werd verkregen in 50 6-10 uur. De opbrengst werd bepaald door meting van de verschuiving in de zuurstof-hemoglobine-dissociatiekromme (P^).

De overmaat aan reagentia werd verwijderd door dialyse tegen pyrogeenvrij water met behulp van een nierdialysefilter (C-DAK 1.3, Cordis Dow Corp., Miami, FL of TH-15, Terumo, Tokio, Japan). Tijdens de dialyse werd de oplossing zuurstofvrij gehouden met behulp van een membraanoxygenator. De 55 N2-stroomsnelheid door de oxygenator bedroeg ongeveer 100 l/min.

194909 8

Voorbeeld IV

Pyridoxylering van het stromavrije hemoglobine Opstelling met een membraan 5 Volgens de werkwijze van voorbeeld I of II werd een oplossing van stromavrij hemoglobine bereid. De volgende reagentia werden vermengd: 1. Pyridoxal-5'-fosfaat - met een molverhouding van 2:1 ten opzichte van hemoglobine; 2. Tris-HCI-buffer - 0,1 M eindconcentratie in de hemoglobine-oplossing; 3. Glutathion - 1 g/l oplossing; 10 4. Ascorbinezuur - 0,2 g/l; 5. Glucose 0,5 g/l; en 6. Antibiotica - dezelfde antibiotica als in voorbeeld I.

De bovenstaande reagentia werden in het kleinst mogelijke volume pyrogeenvrij water opgelost en de pH werd ingesteld op 7,35-7,45. Het bovengenoemde mengsel werd aan de hemoglobine-oplossing toege-15 voegd. De pH van de hemoglobine-oplossing werd met 0,1 N NaOH ingesteld op 7,35-7,45 bij 5°C. De hemoglobineconcentratie werd bijgesteld tot 17,5-18,5 g/dl.

De oplossing (18-20 I) werd naar een gasdicht roestvrij stalen reservoir overgebracht. Deoxygenering van de oplossing geschiedde door middel van een membraangaswisselaar (William Harvey, Bently Laboratories, Shiley Sales Corp., Irvine, CA). Met een snelheid van ongeveer 170 l/min werd stikstofgas 20 door de wisselaar geborreld. De hemoglobine-oplossing werd met een snelheid van 4-6 l/min door de gaswisselaar gepompt. Een voldoende verwijdering van zuurstof werd bepaald als een 02-verzadiging van minder dan 5% en een zuurstofgehalte van minder 1 vol.% (met door IL 282 Co-oximeter, Instrumentation Laboratories, Lexington, MA). Dit werd bereikt in 4-8 uur.

Bij deze werkwijze was de membraanoxygenator of gaswisselaar 23 in serie geschakeld met een 25 nierdialysefilter 27 (Terumo, TH-15) (zie figuur 2). De uitwendige delen van het dialysefilter werden -vastgeklemd om waterverlies tijdens de deoxygenering te voorkomen.

Toen het eindpunt van de deoxygenering was bereikt, werd 3 liter van een 5 g.% natriumboorhydride-oplbssing aan de buitenzijde van het dialysefilter gepompt. Op deze wijze werd de pyridoxylering snel voltooid. In een half uur werd een opbrengst van 75-80% gepyridoxyleerd 16 hemoglobine verkregen en in 30 2-3 uur werd een maximale opbrengst van 85-90% verkregen. De opbrengst werd bepaald door meting van de verschuiving in de zuurstof-hemoglobine-dlssociatiekromme (P*,).

De overmaat reagentia werd verwijderd door dialyse tegen pyrogeenvrij water met behulp van het in serie geschakelde nierdialysefilter (C-DAK 1.3, Cordis Dow Corp., Miami, FL of TH-15, Terumo, Tokio, Japan). De oplossing werd gedurende de dialyse zuurstofvrij gehouden. De stikstofstroomsnelheid door de 35 oxygenator bedroeg ongeveer 100 l/min.

Voorbeeld V

Polymerisatie van stromavrij, gepyridoxyleerd hemoglobine 40 Volgens de werkwijze van voorbeeld III of IV werd een oplossing van stromavrij, gepyridoxyleerd hemoglobine bereid. Aan de gedialyseerde oplossing werden toegevoegd: 1. 0,1 M natriumfosfaatbuffer (eindconcentratie); 2. Antibiotica zoals genoemd in voorbeeld I; en 3. Glutathion - 1 g/l.

45 De bovenstaande chemicaliën werden in 500 ml pyrogeenvrij water opgelost en aan de hemoglobine-oplossing toegevoegd. De pH van de oplossing werd bij 5°C met 0,5 N NaoH ingesteld op 8,0. De hemoglobineconcentratie werd door toevoeging van 0,1 M fosfaatbuffer bijgesteld tot tussen 14-15 g/dl. De oplossing werd zuurstofvrij gehouden met behulp van de membraanoxygenator. Er werd een N2-stroom van ongeveer 170 l/min in stand gehouden.

50 De hemoglobine-oplossing werd uit het mengvat of tweede reservoir 18 door de membraanoxygenator of gaswisselaar 23 in een nierdialysefilter 27 gepompt (zie figuur 2) met een snelheid van ongeveer 5-7 l/min. Monsters werden getrokken door de spuittoegang aan de oxygenator. De polymerisatie werd niet gestart indien het percentage oxyhemoglobine zoals bepaald met co-oximetrie groter was dan 10%. De oplossing werd gepolymeriseerd over het nierdialysemembraan. De polymerisatieoplossing werd aangevuld tot een 55 volume van 101, en bevatte: 1. 0,1 M natriumfosfaatbuffer (dezelfde eindconcentratie als in de hemoglobine-oplossing); 2. Antibiotica - dezelfde concentratie als in de hemoglobine-oplossing; 9 194909 3. Glutathion - 1 g/l; en 4. 175-225 ml 25% glutaaraldehydoplossing (ongeveer 14,8-18,1 mol glutaaraldehyd per mol hemoglobine).

De osmolariteit van de polymerlsatieoplossing was ongeveer dezelfde als die van de hemoglobine-5 oplossing.

De stroom gedeoxygeneerde hemoglobine-oplossing werd eerst door het dialysefilter geleid terwijl pyrogeenvrij water aan de buitenzijde werd rondgeleid. Zodra de vereiste stroomsnelheid was ingesteld, werd de-polymerisatie-oplossing aan de buitenzijde rondgeleid.-De oplossing-werd-verpompt met een snelheid van ongeveer 0,4-0,6 l/min (Cole-Palmer pumps, 7018 pompkoppen). De hemoglobine-oplossing in 10 het reservoir werd gedurende het gehele proces grondig gemengd.

Vervolgens werd het polymerisatiemiddel (25% glutaaraldehyd) volgens het onderstaande schema aan de polymerlsatieoplossing toegevoegd:

Na 1 uur - 75 ml Na 2 uur - 50 ml 15 Na 3 uur - 50 ml Na 4 uur - 50 ml Na 5 uur - 50 ml Na 6 uur - 25 ml Na 7 uur-10 ml 20 De polymerisatie werd gevolgd aan de hand van de afname van de colloïde osmotische druk (COP). De reactie werd gestopt wanneer de COP ongeveer 5.3 kPa bereikte. Dit geschiedde door de polymerisatie-oplossing aan de buitenzijde van het dialysefilter te laten weglopen en pyrogeenvrij water in te pompen. De dialyse tegen pyrogeenvrij water werd gedurende ongeveer 2 uur uitgevoerd. Er werd een opbrengst van ongeveer 80-90% polymeren verkregen.

25 —Voorbeeld VI - - ------ - - -------------

Ultrazuivering van stromavrij, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine

Volgens de werkwijze van voorbeeld V werd een oplossing van stromavrij, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd 30 hemoglobine bereid. De verwijdering van niet-gemodificeerd tetrameer geschiedde in drie stappen: STAP 1: Ultrafiltratie

De gepolymeriseerde oplossing werd door 3 tot 4 ultrafiltratiepatronen met holle vezels met een molecuulgewichtafkapping van 100.000 dalton (Amicon) gepompt. Deze stap werd beëindigd wanneer de - -hemoglobineconeentratie in het ultrafiltraat duidelijk beneden 0,1% was en ten minste 2 uur beneden dat 35 niveau bleef. De oplossing van gepolymeriseerd hemoglobine was in dit stadium ongeveer 90% zuiver.

STAP 2: Gelfiltratie

De tweede zuiveringsstap die leidde tot een voor ongeveer 5-98% zuivere polymeeroplossing geschiedde door gelchromatografie en wel als volgt:

Twee bioproces-chromatografiekolommen van 60 cm x 25 cm (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, 40 NJ) werden gevuld met ongeveer 551ACA-54 Ultrogel (LKB Instruments, Gaithersburg, MD). Dit gel had een molecuulgewicht-uitsluitingsgrens van 90.000 dalton. De kolommen werden In serie verbonden met een minimale dode ruimte daartussen hetgeen resulteerde in een effectieve gellengte van ongeveer 105 cm.

Een half tot een liter van de gepolymeriseerde hemoglobine-oplossing van stap 1 met een hemoglobine-concentratie van 6-10 g/dl werd met een snelheid van ongeveer 3 l/uur op de kolom gebracht. Na het laden 45 werd de buffer (0,1 M natriumfosfaat, pH 7,40 bij 5°C) gebruikt om het hemoglobine met een snelheid van 3,0 l/uur te elueren (figuur 4). De eerste 2,0 I van de oplossing van gepolymeriseerd hemoglobine die van de kolom werd geëlueerd werd vastgehouden. De overblijvende oplossing werd weggeworpen. De fractie van 2 I van de kolom werd met het Amicon CH-2 ultrafiltratiesysteem met 1 tot 3 H1P100 patronen geconcentreerd (figuur 5). De ultragezuiverde oplossing werd geconcentreerd. Stap 2 werd zonodig 50 herhaald om de verontreiniging met tetrameer in de gepolymeriseerde oplossing te verlagen.

STAP 3: Affiniteitschromatografie

Haptoglobine (Hp) werd als volgt aan een geactiveerd agarosegel gebonden.

Haptoglobine (meer dan 80% zuiver) werd aan met CNBr geactiveerd Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ) in een verhouding van 3 mg Hp/ml gesedimenteerd gel toegevoegd. Per 55 volume sepharose werden 4 volumes koppelingsbuffer (0,1 M natriumbicarbonaat, 0,3 M NaCI, pH 7,9) toegevoegd. Het mengsel werd gedurende een nacht kalm bij 4°C geroerd. De opbrengst van deze reactie was 2 mg Hp/ml gesedimenteerd gel. Een overmaat van het Hp-affiniteitsgel (ten opzichte van het vrije 194909 10 tetramere hemoglobine) werd aan de oplossing van gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine toegevoegd en 1 tot 4 uren kalm bij 4°C geroerd. De oplossing werd daarna kalm gecentrifugeerd (4.000 g gedurende 2 minuten) en de bovenstaande vloeistof werd geïsoleerd. Er werd verder gewassen en gecentrifugeerd om de opbrengst aan gepolymeriseerd hemoglobine zo groot mogelijk te maken. Het aldus 5 verkregen gepolymeriseerde, gepyridoxyleerde hemoglobine was voor meer dan 99,5% vrij van niet· gemodificeerd tetrameer hemoglobine.

ALTERNATIEVE STAP 3: Complexering met haptoglobins

De laatste sporen niet-gemodificeerd tetrameer hemoglobine werden-uit de oplossing van gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine verwijderd door complexering met haptoglobins (Hp). Haptoglobins 10 werd in een molverhouding van 1:1 aan vrij tetrameer hemoglobine toegevoegd. De oplossing werd ongeveer 2 uur bij kamertemperatuur gemengd.

Voorbeeld VII 15

Farmaceutisch preparaat van ultragezuiverd, stromavrij, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine Volgens de werkwijze van voorbeeld VI werd een oplossing van ultragezuiverd stromavrij, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine bereid. De pH van de oplossing werd bij 5°C met 0,5 NaOH op ongeveer 9,02 gebracht en met een elektrolytconcentraat in evenwicht gebracht tot de volgende concentraties in de 20 eindoplossing:

Na 140 mEq/1 K 4,0 mEq/1

Cl 100 mEq/l 25 Ca** 5,0 mEq/l

Mg 1,5 mEq/l

Glutathion 1 g/l 30 Aan de oplossing werd een enzymcocktail toegevoegd om deze te stabiliseren ten opzichte van oxidatie. Deze bevatte bij benadering niet minder dan de volgende hoeveelheden per liter eindoplossing: 1. Glucose - 6 - fosfaat - 0,3 g 2. Glucose - 6 - fosfaatdehydrogenase - 0,20 mg 3. Ferrodoxine - 6 mg 35 4. Ferrodoxine - NADP-reductase - 3 mg 5. NADP - 40 mg 6. Katalase - 0,2 g

De uiteindelijke hemoglobineconcentratie werd gebracht op 7-18 g/dl.

40 Voorbeeld VIII

Sterilisatietechniek

Het volgens de werkwijze van voorbeeld VI bereide gezuiverde gepolymeriseerde, gepyridoxyleerde hemoglobine werd volgens het onderstaande filtratieschema met de Pall Profile Filters (Pall Corp., Glen 45 Cove, NY) gesteriliseerd: 010 -> 007 -> 005 -» NR7P.(0,2 μ absoluut) 1 μ 0,7 μ 0,5 μ 0,2 μ 50

Het filtermedium was polypropyleen. Het uiteindelijke sterilisatiefiIter van 0,22 μ was van nylon. Alle filters waren van farmaceutische kwaliteit.

De aldus gesteriliseerde oplossing vertoonde geen groei op bloedagarplaten (37°C/4 dagen of 25°C/10 dagen) of in een thioglycolaatmedium. De oplossing bevatte spoorhoeveelheden (0,25 ng/ml) endotoxine, op 55 basis vein een Limulus Amoebacyte lysaattest, indien bereid in een niet-farmaceutische omgeving.

11 194909

Voorbeeld IX Biochemische kenmerken

Het tetrameervrije gepolymeriseerde, gepyridoxyleerde hemoglobine bevatte een met een Beekman DU 5 spectrofotometer (Beekman Instruments, Lincolnwood, IL) verkregen normaal absorptiespectrum (figuur 6B). De oplossing leidde bij reconstitutie tot een normale hemoglobineconcentratie (12-14 g/dl), tot een oplossing met en aanvaardbare colloïde osmotische druk (COP) (1,9-3,0 kPa) (figuur 7). Met het oog op figuur 7'werd de hemoglobineconcentratie bepaald op de IL 282 co-oximeter (Instrumentation Laboratories, Danvers, MA). De COP werd gemeten op de Wescor Colloid Osmometer Model 4400 (Boyce Scientific Inc., 10 Hanover Park, IL). Ter wille van de vergelijking is de met niet-gemodificeerd stromavrij hemoglobine (SFH) verkregen kromme ook afgebeeld. Het polymerisatieproces was niet van invloed op het zuurstof bindende vermogen van het hemoglobine (1,30 ml/g). Het product had bij reconstitutie tot een normale hemoglobineconcentratie een normaal zuurstof dragend vermogen.

De PgQ van het product lag tussen 14-22 torr wanneer deze-werd bepaald onder fysiologische omstan-15 digheden van pH, pC02 en temperatuur. Een kenmerkende oxy-hemoglobine-dissociatiekromme voor het product is weergegeven in figuur 8. Het monster werd onder standaardomstandigheden bij pH 7,40, temperatuur 37°C en pC02 40 torr opgenomen. De doorlopende kromme werd verkregen met de Hem-O-Scan zuurstofdissociatie-analysator (Travenol Laboratories, Deerfield, Illinois).

Op basis van HPLC bleek de molecuulgewichtsverdeling van het product te liggen tussen 120.000 en 20 600.000 dalton (figuur 9). Het uit de gegevens geschatte gemiddelde molecuulgewicht was ongeveer 120.000. Figuur 9 geeft het elutiepatroon van een HPLC-kolom (TSK gel, type G 4.000 S.W., Varian Instruments Group, Palo Alto, CA) weer. De gebruikte elutiebuffer was 0,1 M natriumfosfaat, pH 7,0 (bij 25°C) met 0,1 M natriumchloride (osmolariteit = 353 mOsm). De hemoglobineconcentratie van het monster werd ingesteld op ongeveer 3,0 g/di. Het geïnjecteerde monstervolume was 0,1 ml en de stroomsnelheid 25 1 ml/min (de HPLC-pomp Model 2150); UV-monitor (Model 2238 Uvicord Sll) en schrijvende integrator —(Model-2220) werden vervaardigd-door-LKB Instruments, Gaithersburg, MD).

Het met SDS-PAGE gekarakteriseerde product vertoonde 4 polymeerbanden (figuur 3A). Deze vertegenwoordigden ongeveer 58% met een molecuulgewicht van 120.000,26% met een molecuulgewicht van 192.000. 11% met een molecuulgewicht van 256.000 en 4% met een molecuulgewicht van 320.000. Op het 30 gel waren spoorhoeveelheden van polymeren met hoger molecuulgewicht zichtbaar. De figuren 3A, 3B en 3C geven densitometrische aftastingen weer van het product volgens de uitvinding dat met de in de LKB noot 306 (LKB Instruments, Gaithersburg, MD) beschreven techniek met behulp van SDS-polyacryl-amidegel-elektroforese is gescheiden. De aftasting werd verkregen met een Helena Quick Scan, R and D (Helena Laboratories, Beaumont, Texas) in verschillende stadia van de polymerisatie.

35 De viscositeit van het product veranderde met de polymerisatie. Het eindproduct had een viscositeit van 3,1 centipoise bij een hemoglobineconcentratie van ongeveer 8 g/dl. Deze waarde was vergelijkbaar met die van normaal bloed. Figuur 10 geeft het verband weer tussen de hemoglobineconcentratie van het product en de viscositeit van de oplossing. De metingen werden verricht met de Brookfield Model LVT viscometer (Brookfield Engineering Laboratories Inc., Stoughton, MA) bij een temperatuur van 25°C en een afschuif-40 snelheid van 450 sec1.

De fosfolipiden die in het membraan van de rode cellen aanwezig waren, waren met dunne-laag-chromatografie (DLC) niet in het eindproduct waarneembaar. In een enkele lading waren op de DLC-platen sporen van vrije vetzuren zichtbaar.

De methemoglobineredudase activiteit in het product was tijdens het proces zo goed ais ongewijzigd.

45 Zowel het uitgangslysaat als het eindproduct bezaten enzymactiviteiten tussen 1,0 en 2,0 u. Een eenheid van enzymactiviteit is gedefinieerd als 1 μΜ gereduceerd ferrocyanide-methemoglobinecomplex per gram hemoglobine minuut.

Voorbeeld X 50

Fysiologische en biologische bepalingen A. wijzigingen in de nier

Vergelijkende studies uitgevoerd met niet-verdoofde bavianen wezen erop dat infusie van een met meer dan 2-3% tetrameer hemoglobine verontreinigde oplossing een daling in de urineproductie van ongeveer 50% 55 en een daling in de glomerulaire filtratiesnelheid (verwijdering van creatinine) van ongeveer 15% veroorzaakte ten opzichte van de niveaus voor infusie. Infusie van een oplossing van gepyridoxyleerd, gepolymeri-seerd hemoglobine die in wezen vrij is van tetrameer gaf geen waarneembaar effect.

Claims

194909 12 B. Hemodynamische effecten Bij bavianen hield een daling van ongeveer 25% in de hartsnelheid en een stijging van ongeveer 14% in de gemiddelde slagaderdruk verband met de infusie van een oplossing van hemoglobine die was verontreinigd met meer dan 5-7% tetrameer hemoglobine. Dit was het gevolg van een primaire vaatvemauwende 5 werking van het tetrameer en deze was afwezig bij infusie van een oplossing van gepyridoxyleerd, gepolymeriseerd hemoglobine dat in wezen vrij was van tetrameer. C. Extravasatie In de buikholten van bavianen die een uitwisselingstransfusie tot een hematocriet van 0% met tetrameer hemoglobine hadden gehad werd tot 2 liter oplossing van tetrameer hemoglobine waargenomen. Weinig of 10 geen hemoglobine bevattende vloeistof werd waargenomen in de buikvliesholten van dieren die een uitwisselingstransfusie hadden gehad tot een hematocriet van 0% met een oplossing van gepyridoxyleerd, gepolymeriseerd hemoglobine dat in wezen vrij was van tetrameer. D. Afbraak van virale antigenen Een verzameling van 100 eenheden menselijke rode bloedlichamen, het uitgangsmateriaal bij voorkeur 15 voor de werkwijze volgens de uitvinding, bleek bij test positief op viraal hepatitis B oppervlakte anti-gen. Afbraak van dit antigen trad na 1-2 uur polymerisatie zoals beschreven in voorbeeld V op. E. Reductie van in urine aanwezig hemoglobine Infusie van een hemoglobine-oplossing die tetrameer hemoglobine bevatte in een baviaan leidde tot de uitscheiding van tetrameer hemoglobine in de urine. Dit deed zich voor zodra de massa aan toegediend 20 tetrameer hemoglobine het vermogen van de baviaan om hemoglobine tetrameer door middel van circulerend haptoglobine te binden had overschreden. De urine had daarbij een dieprode kleur die kenmerkend is voor hemoglobine en bevatte 1-2 g hemoglobine per 100 ml urine. Oplossingen van tetrameer hemoglobine hadden in vivo een halveringstijd van 2-4 uur (muizen en bavianen als proefdieren). Infusie van een oplossing van gepyridoxyleerd, gepolymeriseerd hemoglobine dat wezenlijk vrij was van 25 tetrameer hemoglobine (minder dan 2% tetrameer aanwezig) had weinig of geen waarneembare kleurverandering van de urine tot gevolg (minder dan 30 mg hemoglobine per 100 ml urine). Een met haptoglobine behandelde, gepolymeriseerde, gepyridoxyleerde hemoglobine-oplossing (meer dan 99,5% vrij van tetrameer) leverde geen verandering in de kleur van de urine, zelfs bij infusie in zeer grote therapeutische doses in de primaat. 30 De halveringstijd van het volgens de werkwijze van de uitvinding bereide product bedroeg ongeveer 24 uur (figuur 11). Figuur 11 geeft de plasma-verwijderingskromme (halveringstijd) weer voor het niet-gemodificeerde, stromavrije hemoglobine (SFH) en voor het product volgens de uitvinding. Een gram per kilogram lichaamsgewicht aan hetzij SFH hetzij een oplossing van wezenlijk tetrameervrij, verknoopt, gepolymeriseerd, gepyridoxyleerd hemoglobine in gelactateerde Ringer's oplossing met een hemoglobine-35 concentratie van ongeveer 7 tot ongeveer 14 g/dl, werd intraveneus aan zes volwassen mannelijke bavianen toegediend. De gehalten aan plasma-hemoglobine werden bepaald met de IL 282, co-oximeter met tussenpozen van 2 uur in het geval van SFH of met tussenpozen van 6 uur in het geval van het product volgens de uitvinding. De metingen werden voortgezet totdat alle hemoglobine uit het plasma van het proefiichaam was verdwenen. 40

1. Werkwijze voor de bereiding van een stromavrij, verknoopt, gepolymeriseerd en gepyridoxyleerd 45 hemoglobine, waarbij men rode bloedlichaampjes lyseert, het stroma van de rode bloedlichaampjes verwijdert, het verkregen hemoglobine pyridoxyleert en behandelt met een polymerisatiemiddel en het gepolymeriseerde hemoglobine zuivert gekenmerkt door een afsluitende zuiveringsstap waarin men het gepolymeriseerde hemoglobine behandelt met haptoglobine, totdat het gezuiverde gepolymeriseerde hemoglobine een gehalte aan niet-gepolymeriseerd hemoglobine (tetrameer) van minder dan 2% bevat.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat men tevens een zuivering door ultrafiltratie uitvoert.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat men tevens een zuivering door gelfiltratie uitvoert.

4. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes, dat een stromavrij, verknoopt, gepolymeriseerd en gepyridoxyleerd hemoglobine en een niet-giftige, farmaceutisch aanvaardbare bevat, met het kenmerk, 55 dat het gepolymeriseerde hemoglobine een gehalte aan niet-gepolymeriseerd hemoglobine (tetrameer) van minder dan 2% bevat, en is verkregen met de werkwijze volgens een der conclusies 1-3.

5. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens conclusie 4, met het kenmerk, dat het 13 194909 gepolymeriseerde hemoglobine een normaal zuurstofdragend vermogen van 9,7-25 vol.% heeft.

6. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens conclusie 4 of 5, met het kenmerk, dat het gepolymeriseerde hemoglobine een gemiddeld molecuulgewicht van 120.000 tot 600.000 dalton heeft.

7. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens een der conclusies 4-6, met het 5 kenmerk, dat het gepolymeriseerde hemoglobine een P^, van 1866 tot 2933 N/m2 heeft.

8. Acellulair vervangingsmiddel voor rode bloedlichaampjes volgens een der conclusies 4-7, met het kenmerk, dat het gepolymeriseerde hemoglobine een colloïde osmotische druk van 933 tot 4000 N/m2 heeft.

9. Acellulair vervangingsmiddel voorrede bloedlichaampjesvolgenseen-der conclusies 4-^8, met het kenmerk, dat het gepolymeriseerde hemoglobine een osmolariteit van 290 mOsM tot 310 mOsM heeft. Hierbij 10 bladen tekening