JP2983544B2 - 非細胞性赤血球代替品 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の分野 本発明は約14トル〜約22トルのP₅₀を有する、本質的
にストローマ異物を含有していない、四量体不含で、架
橋し、かつ重合したピリドキシル化ヘモグロビン溶液か
らなる非細胞性赤血球代替品に関する。更に、該非細胞
性赤血球代替品の製法に関する。 関連文献の説明 数年来、ストローマ不含ヘモグロビンが酸素運搬及び
可逆酸素（又はリガンド）結合能力を有していること
は、該分野において公知である。毒性問題が血液代替品
としての使用を妨げているので、ストローマ不含ヘモグ
ロビンは非毒性で、有用な医薬品を提供するためにもつ
と改良を必要とした。米国特許第4001200号；同第40014
01号及び同第4053590号明細書中には重合し、架橋した
ストローマ不含ヘモグロビンが、組織及び器官に酸素を
運搬するための血液代替品として、かつ血漿増量剤とし
て記載されている。ストローマ不含ヘモグロビンのピリ
ドキシル化は可逆酸素結合能力を有利に改め、生物学的
生成物の安定性及び貯蔵寿命を増大することを示した。
J.Surgical Research第30巻、第14〜20頁（1981年）。
グルタルアルデヒドと重合した、ピリドキシル化ヘモグ
ロビンは、L.R.Sehgal等著、“In Vitro and In Vivo C
haracteristics of Polymerized,Pyridoxylated Hemogl
obin Solution"、Fed.Rroc.第39巻、第2383頁（1980
年）;L.R.Sehgal等著、Preparation and In Vitro Char
acteristics of Polymerized、Pyridoxylated Hemoglob
in、Transfusion第23（２）巻、第158頁（1983年３月〜
４月）中に記載され、かつ特徴ずけられている。更に、
重合したピリドキシル化ヘモグロビンの、酸素運搬者と
して働らく能力はL.R.Sehgal等著、Polymerized,Pyrido
xylated Hemoglobin:A Red Cell Substitute With Norm
al Oxygeu Capacity、Surgery第95（４）巻：第433〜43
8頁（1984年４月）;L.R.Sehgal等著、An Appraisal of
Polymerized、Pyridoxylated hemoglobin as an Acellu
lar Oxygen Carrier,Advances in Blood Substitute Re
search第19〜28頁（Alan R.Liss,Inc.1983）に開示され
た。 数年の研究において、種々の技術によつて製造される
ヘモグロビン溶液は、一方では生命を支持するために十
分量の酸素を運ぶ能力を有しているが、不所望な副作用
も有しているということが報告されている。最も問題と
なる副作用は腎機能における低下である。この変化はバ
クテリア内毒素又赤血球細胞膜のフラグメント（ストロ
ーマ）のような不所望な異物の存在によると思われる。
このような異物は本当に腎の変性を引き起こすことがで
きるが、一方前記異物を本質的に含有しないヘモグロビ
ン溶液もなお事実上の腎機能障害をひきおこす。この機
能障害は一時的なものであり、もとに戻るものである
が、これは出血性シヨツクのような、又は腎がすでにこ
のように低い血流状態における危険にあるような病的な
状態においては非常に大変なことである。腎障害の原因
は生理学的に認容できない量の非重合ヘモグロビン四量
体にある。四量体ヘモグロビンの注入の他の不所望な副
作用な腎毒性、血管収縮、血球素尿症、心摶度数の抑
制、平均動脈血圧の上昇及び特に腹腔中への注入物の溢
出である。 公知のいずれのヘモグロビン由来血液代替品も毒性問
題を完全に回避することに成功していない。公知技術に
より製造されたこれらの製品は変化する量でヘモグロビ
ン四量体を含有していることが見い出された。例えば、
米国特許第4001200号、同第4001401号及び同第4053590
号明細書による製法は、臨床的に有用な生成物を提供し
ない。第１に、他の方法のように最終生成物に不所望な
多量の非重合ヘモグロビン四量体が存在する。第２に、
毒性残留トルエンのような異物を製造の間完全に除去す
ることができないので、このような異物が溶液中にあま
りにも多く残る。第３に、100〜120mmHgのP₅₀を有して
いると述べられている生成物は、このヘモグロビン溶液
が肺の酸素を捕獲しないという点で生理学的に非機能的
である。最後に、高い分子量重合体の割合の増加は高い
ゲル化不安定な生成物を生産し、その後の濾過及び精製
の工程が困難であるか、又は認容できない希釈溶液中で
行なう他は不可能である。 本発明の概要 非細胞性赤血球代替品として臨床的に有用な非毒性ヘ
モグロビン溶液を提供することは本発明の重要な課題で
ある。 もう１つの課題は、受血者との適合性検討を必要とし
ない、可逆性酸素結合能を有する非毒性ヘモグロビン溶
液を提供することである。 更なる課題は、通常の酸素運搬能を有する、非変性ヘ
モグロビン四量体を本質的に不含の純粋な重合体ヘモグ
ロビン溶液を提供することである。 もう１つの課題は微生物及びウイルス性抗体及び病原
体を十分に不含にすることのできる一時的酸素キヤリヤ
ーを提供することである。 前記の及びその他の課題を考慮して、ここで本発明は
十分にストローマ及び他の異物を含有していない、本質
的に四量体不含で、架橋し、かつ重合した、ピリドキシ
ル化ヘモグロビンを提供する。 図面の説明 添付図面に関しては、公知文献から出発し、本発明を
図示する14枚の図面を提出し、これらにつき以降詳細に
説明する： 第１図はピリドキシル化のバツチ法を示す概略図であ
る； 第２図は本発明による膜促進ピリドキシル化及び重合
の概略図である。 第3A、3B及び3C図はSDS−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動により分離された本質的に四量体不含で、架橋
し、かつ重合したピリドキシル化ヘモグロビンの密度測
定走査線を示すグラフ図である； 第４図はゲル濾過カラムから得られた架橋し、重合し
たピリドキシル化ヘモグロビンの溶離パターンを示す； 第５図はゲル濾過カラムから得られた本質的に四量体
不含で、架橋し、重合したピリドキシル化ヘモグロビン
の溶離パターンを示す； 第6A図はオキシヘモグロビンに関するスペクトル曲線
を示すグラフである； 第6B図は酸化した、本質的に四量体不含で、架橋し、
重合したピリドキシル化ヘモグロンビで得られたスペク
トル曲線を示すグラフである； 第７図は本質的に四量体不含で、架橋し、重合したピ
リドキシル化ヘモグロビンのヘモグロビン濃度とコロイ
ド浸透圧（COP）との間の関数を記載したグラフであ
る； 第８図は本質的に四量体不含で、架橋し、重合したピ
リドキシル化ヘモグロビンに関するオキシ−ヘモグロビ
ン解離曲線を示すグラフである； 第９図は高圧液体クロマトカラムからの本質的に四量
体不含で、架橋し、重合したピリドキシル化ヘモグロビ
ンの溶離パターンを記載したグラフである。 第10図は本質的に四量体不含で、架橋し、重合したピ
リドキシル化ヘモグロビンのヘモグロビン濃度と溶液粘
度との関係を記載したグラフである；そして 第11図はストローマ不含ヘモグロビン（SFH）及び本
質的に四量体不含で、架橋し、重合したピリドキシル化
ヘモグロビンの血漿消失曲線を記載したグラフである。 発明の詳細な説明 本発明は本質的にストローマ及び他の異物を含有して
いない、本質的に四量体不含で、架橋し、重合したピリ
ドキシル化ヘモグロビンからなる非細胞性赤血球代替品
な関する。 本発明の目的に関して、「架橋し、」とは、分子の形
状、大きさ、機能又は物理的特性を変化させる目的で分
子上又は分子中、又は分子間は分子“ブリツジ”を化学
的に設置することを意味する。「本質的に四量体不含」
とは哺乳動物に適用した四量体に一定の生理学的応答が
もはや生じない四量体含量に関する純度の程度を示す。
主な基準は、薬学的に有効な量を注入する時腎機能に変
化が起こらないことであり、すなわち約98％以上の純度
のレベル（四量体約２％より少量が存在）である。“超
精製”又は“精製”生成物とは本質的に四量体不含であ
ると同じ意味を有する。「重合溶液」とは“架橋”又は
重合剤、例えばグルタルアルデヒド、イミドエステル、
ジアスピリン又は他のものを生化学的に好適な担持剤中
に含有する溶液である。「半透過膜」とは一定の分子種
類に透過性であり、他のものに透過性でない膜を意味
し、かつ約30000ドルトン以上の分子量を排除する選択
性フイルターとして働らく膜である。 本発明による方法の生成物である、四量体（天然の）
ヘモグロビン及び種々の他の異物を本質的に含有してい
ない重合したピリドキシル化ヘモグロビン溶液は生理学
的に認容性であり、かつ治療上及び臨床的に有用であ
る。該生成物は酸素運搬特性に必要である可逆的な酸素
結合能を有している。最も著しいことは、該生成物が使
用において全血に類似の酸素−ヘモグロビン解離曲線
（P₅₀）を有していることに関係する良好な取込み及び
放出性を示す。該生成物は肺を通る毛細管中で結合酸素
に対して高い親和性を示し、次いで体中で組織に酸素を
十分に放出する。該生成物は受血者との適合性検討も必
要としない。 本発明の方法は重合ヘモグロビンの分別及び精製にお
いて従来未公知の程度に四量体汚染のない生成物が得ら
れるという点で特別である。本発明の方法は、微生物又
はビールス性抗原及び病原体を十分に不含の最終生成物
が生じるという利点を提供する。そのような抗原及び病
原体は、例えばバクテリア、リケツチヤ、真菌類、原生
動物、ビールス及びその他の生物である。際も重要であ
るのは、生物学的生成物は肝炎や後天性免疫不全症候群
（AIDS）をひきおこすビールスを十分に不含にすること
ができるということである。四量体ヘモグロビン及び種
々の他の異物に関して純粋な生成物は広い臨床的利用
性、使用の容易さ及び安全性を有した。 生理学的特性に関するかぎり、本発明の生物学的生成
物は血管収縮、腎毒性、血球素尿症及びその他の四量体
ヘモグロビンを不所望な量含有する公知ヘモグロビン溶
液を静脈内投与することにより起こる問題をひきおこさ
ない。記載した生成物の静脈内投与に関して、結果は尿
生産において認めうるほどの減少も、糸球体濾過率にお
ける認めうる減少も、腹腔中への認めうる溢出も、かつ
生産尿の色の認めうる変化も示されなかつた。 従つて、本発明の非細胞性赤血球代替品は傷害、心筋
梗塞、卒中、急性貧血及び十分に血液を酸化するための
肺の損傷又は不全による血中酸素減少、低酸素症又は末
期低酸素症のような酸素不足症の治療に有用性を見い出
した。該製品は人工蘇生液（例えば傷害、特に出血シヨ
ツク）、血管内容積拡張剤又は交換輸血を必要とするす
べての症状又は医学的状況の治療における有用性も見い
出された。医学的治療に加えて、該製品は移植のための
器官の保存にも使用することができる。 更に、本発明は、本質的に四量体不含で、実質的にス
トローマ不含で、架橋し、重合したピリドキシル化ヘモ
グロビンの薬学的な有効量を、非毒性で、薬学的に認容
性のキヤリヤーと組合わせて、そのような治療を必要と
する哺乳動物に静脈内投与することにより、医薬治療の
ためにこの生物学的製品を用いる方法をも含む。交換輸
血は例えば敗血症、自巳免疫症等のような一定の状態又
は疾病の治療において常用の方法を用いて、本発明の非
細胞性赤血球代替品と患者の血液との交換を伴なう。薬
学的に効果的な量は特定の症状又は行なわれている医学
的状況に必要とされる治療及び例えば患者の体重のよう
な典型的な投与量パラメーターにより変化する。一般
に、薬学的に有効な量は、もちろん医師及び実地におい
て医学的に有用な他のスタツフにより考えられる投与範
囲である。ある状況においていかに投与量を選択するか
は医学の分野において熟練した人には明らかである。薬
学的に認容性の担体は有利に非毒性で、不活性で、かつ
ヘモグロビンと適合するものである。そのような担体の
例は水、平衡塩溶液、生理学的塩溶液（例えば乳酸加リ
ンゲル液、ハルトマン溶液（Hartman′s solution）
等）、ブドウ糖溶液等を挙げることができるが、これに
限定されない。 本発明方法において有利な出発材料は期日を過ぎた人
血である。有利に、バツグに押された有効期間消滅日を
８週間以上すぎて貯蔵されていたならば、その血液をこ
の方法には使用しない。ここで記載されているすべての
方法は、この分野での熟練者の範囲内で最少の改変で、
他の哺乳動物に適用可能である。 全工程は約２℃〜約８℃、有利に約５℃で実施するの
がよい。期日を過ぎた血液を0.9％塩化ナトリウムのよ
うな等張塩溶液約２〜約５倍容量で洗浄する。洗浄液は
場合により抗生物質、例えばペニシリン、ストレプトマ
イシン、ゲンタマイシン、ポリミキシンＢスルフエート
等を含有していてもよい。抗生物質の添加は該方法に必
須ではないが、該方法を非薬学的環境で実施する場合最
少にバクテリア汚染される。 赤血球を洗浄し、パツクし、集めて、アルカリ金属燐
酸塩緩衝剤（例えば燐酸ナトリウム）又は発熱物質不含
水で溶解する。次の工程では、溶液から赤血球ストロー
マを分離する。赤血球ストローマの除去は微孔性濾過に
より行なわれる。有利な方法は中空フアイバーカートリ
ツジでの交差流濾過（cross−flow filtration）の使用
である。交差流濾過システムの例はペリコン・システム
（Pellicon System;Millipore Corp.,Bedford,MA）;HF
−ラブ15ウルトラフイルトレーシヨンシステム（HF−La
b15ultrafiltration System;Romicon Corp.,Woburn.M
A）;KF200−100クロスフロウ（KF200−100KROSFIOW;Mic
rogon,Lagona Hills,CA）又はDC−30システム（Amicon,
Danvers,Mass）である。システムは後の例に記載されて
いるより小さいバツチにも、大きいバツチにも適用可能
である。 次の工程において、ストローマ不含溶液をヘモグロビ
ンに対して約2:1〜4:1のモル比で燐酸５′ピリドキサル
を用いてピリドキシル化する。有利に、ピリドキシル化
はトリス塩酸緩衝剤のような酸緩衝剤の存在が約0.1M最
終濃度及びグルタチオン約1gm/Lで行なう。該溶液をガ
ス交換機を用いてヘリウム、窒素又は他の不活性ガス
で、有利には窒素ガスタンク又は液体窒素タンクを用い
て完全に脱酸素する。溶液をポンプで吸い上げるために
使用する任意の管は有利に酸素不透過又は最少限に透過
性である。例えばタイゴン（Tygon）Ｂ−44管（Cole−P
almer Co.,シカゴ,IL）、ナトリウムシアノボロハイド
ライド又は有利にナトリウムボロハイドライドのような
還元剤を脱酸素溶液に加える。過剰の試薬をＣ−DAK1.3
（Cordis Dow Corp.,miami,FL）又はTH−15（Terumo Co
rp.,東京、日本）のような腎透析フイルターを用いて発
熱物質不含水に対して透析することによつて除去するこ
とができる。あるいは分子量30000ドルトン以下のもの
を分離する限外濾過カートリツジを使用することもでき
る（カートリツジはAmicon Corp.,Romicon,Milliporeか
ら市販のものである）。 次に、ストローマ不含、ピリドキシル化ヘモグロビン
溶液を25％グルタルアルデヒド（E.M.Grade,Polyscienc
es,Warington、PA）を用いて重合する。ストローマ不
含、ピリドキシル化ヘモグロビン溶液を腎透析フイルタ
ー又は他の好適な膜フイルターを通してグルタルアルデ
ヒドにさらした。重合の期間及び加えるグルタルアルデ
ヒドの量はヘモグロビン溶液の容量、所望のポリマー収
量及び所望の分子量分布に依存する。一般に、重合時間
がより長ければ、ポリマーの分子量分布はより高く、そ
の収量はより大であり、かつ最終溶液のCOPはより低
い。典型的に、ポリマーの収量70％は3.5〜４時間でほ
ぼ得られる。これが有利な重合の最終点である。収量80
〜90％は７時間後に得られるが、ポリマーの著しく高い
分子量分布が得られる（第3C図）。 本発明により実施する時、重合工程は高い収量でポリ
マーを生産する。確かな医学的有用性を有する生成物を
生産するために、反応のスピードを制御し、重合の間の
相互作用の表面を制御し、平均が分子量約120000ドルト
ンである。せまい分子量範囲の生成物を製造することが
重要である。重合反応はコロイド浸透圧計、例えばIL18
6（Instrumentation Laboratories,Danvers,MA）又はウ
エスカー・コロイド・オスモメーター（Wescor Colloid
Osmometer;Wescor,Logan,Utah）を用いてコロイド浸透
圧における低下により、高圧液体クロマトグラフイー
（HPLC）により、又は任意の優れた公知技術により監視
することができる。痕跡量の高分子量分子はドデシル硫
酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS−P
AGE）により測定されるので存在してよい。 本発明の工程のピリドキシル化及び重合工程において
半透過性膜界面で、生化学的担体（すなわち、水、塩、
糖、他の小さい分子又はイオン）は静水圧力、流体力学
的圧力、浸透圧力又はコロイド浸透圧力に応じて膜を横
切つて前後に自由に動く。活性剤（例えば重合剤、還元
剤、ピリドキシル化剤等）の分子又はイオンはその寸法
及び重量によりいくらか自由でなく膜を横切る。ヘモグ
ロビン分子はそこなわれていない膜を全く横切ることは
できない。この構成は結果としてヘモグロビン分子又は
他の出発材料の活性剤への制御された暴露を生ぜしめ
る。変えることができる変数はヘモグロビン溶液の流
速、溶液中のヘモグロビン濃度、活性剤の濃度及び活性
剤の流速である。前記の変数に加えて、時間、温度及び
表面積のような変数は反応成分、反応及び効率の広い範
囲に関して、この構成を改良するために変化させること
ができる。全体の反応は生理学的に認容性の媒体中で行
なうことができる。更に、ヘモグロビン溶液は希釈環境
又はイオン性環境において全く著しい変化を経験するこ
となく反応の中を動くことができる。 第１図は概略的に、ピリドキシル化のバツチ法を示
す。ストローマ不含ヘモグロビン及び燐酸５′ピリドキ
サルを含有する試薬の溶液６を混合容器５に加える。pH
をpH電極７により調節し、監視する。容器５はベント又
はガス抜きバルブ11を有する。電気モーター９、モータ
ーシヤフトを混合シヤフトに結合するための自在継手9a
及び攪拌子10からなる環状ミキサーのような攪拌装置が
連続的な混合を提供する。溶液６をポンプ４を用いて膜
状ガス交換器１を介して容器５から取り出し、次いで容
器５に戻す。窒素源８は溶液６を脱酸素するために膜状
ガス交換器１を介して一定の窒素流を供給する。該膜状
ガス交換器１はガス放出のためのベント３を有する。還
元剤を含有する溶液をシリンジ開口部２を介して加え
る。脱酸素ヘモグロビンの溶液の循環は所望の収量のピ
リドキシル化ヘモグロビンが得られるまでポンプ４によ
り提供される一定のポンプ活動により、この構成の中で
継続する。 第２図は本発明による膜技術法を用いるピリドキシル
化及び重合それぞれの概略図である。ピリドキシル化に
関しては、ストローマ不含ヘモグロビン及び燐酸５′ピ
リドキサルの溶液を混合容器又は第２貯蔵器18に加え
る。第２貯蔵器18はベント又はガス抜きバルブ17を有す
る。電気モーター16、自在継手16a及び攪拌子20からな
る環状ミキサーのような攪拌装置が連続的な攪拌を供給
する。最初に、溶液19は開口部31及び32が締められてい
る間、ポンプにより２つの脱酸素通路を連続的に通る。
同時に、溶液19はポンプ15により第２貯蔵器18から出て
膜状ガス交換器13を通り、かつポンプ21により膜状ガス
交換器23及び腎透析膜フイルター27を通過し、次いで第
２貯蔵器18に戻る。窒素源12及び24は膜状ガス交換器13
及び23を介してそれぞれ脱酸素溶液19に一定の窒素流を
供給する。膜状ガス交換器13及び23はガス放出のための
ベント14及び22を備えている。pHは電線26を介してpHメ
ーターに接続しているpH電極25により監視される。脱酸
素後、開口部31及び32は開放される。還元剤30を含有す
る溶液を容器又は第１貯蔵器29からポンプ28により腎透
析膜フイルター27を通し、第１貯蔵器29に戻す。 ピリドキシル化が完了した後、還元剤30を含有する溶
液を発熱物質不含水に交換する。発熱物質不含水をポン
プ28を用いて腎透析膜フイルター27を通し、過剰試薬を
透析し、第１貯蔵器29に戻す。開口部31及び32をクラン
プにより閉じ、溶液19を脱酸素の間連続的に循環させ
る。 重合の間、開口部31及び32は開いている。ストローマ
不含ピドキシル化ヘモグロビンの溶液19を装置を通して
一定に循環させる。第１貯蔵容器29中の発熱物質不含水
を重合剤30を含有する重合溶液と置きかえる。次いで、
重合溶液をポンプ28を用いて腎透析膜フイルター27通
し、第１貯蔵容器29に戻す。なくなつた場合、重合剤を
第１貯蔵容器に段階的に加える。 基本的に、ピリドキシル化のための還元剤を含有する
溶液又は重合剤を含有する重合溶液を第１貯蔵容器29か
ら腎臓透析膜フイルター27中の半透過膜の片側に供給、
一方脱酸素ヘモグロビン溶液又はピリドキシル化、脱酸
素ヘモグロビン溶液を、それぞれポンプにより第２貯蔵
容器18から前記膜の反応側に供給する。還元剤又は重合
剤を含有する溶液の１部は膜を横切つて拡散し、膜の他
の側のヘモグロビンをピリドキシル化又は重合する。拡
散しない還元剤又は重合剤を含有する溶液の１部は第１
貯蔵器29に戻る。同様にして、ピリドキシル化又は重合
ヘモグロビンを含有する脱酸素ヘモグロビン溶液は第２
貯蔵容器18に戻る。この操作を所望の生成物収量が達せ
られるまで続ける。 重合の最後に、溶液中に非重合四量体ヘモグロビン濃
度を任意の好適な濾過及び文献公知の精製技術により著
しく減少させることができる。本質的に、すべての残留
未変化四量体の除去はポンプにより重合した溶液を中空
フアイバー限外濾過カートリツジを通し、次いでゲルク
ロマトグラフイーにより精製することにより又はゲルク
ロマトグラフイー単独により行なうことができる。 未変化四量体ヘモグロブリンの残留痕跡量は、ハプト
グロビン単独を添加することにより、中空フアイバー限
外濾過カートリツジ及び／又はゲルクロマトグラフイー
を使用した後ハプトグロビンで処理することにより、又
はゲル結合ハプトグロビンを用いる親和性クロマトグラ
フイーにより除去することにより、本発明に従つて複合
体を形成することができる。ハプトグロビンは重合ヘモ
グロビンの存在においても四量体ヘモグロビンと非可逆
的に結合する。ハプトグロビンはヘモグロビンと1:1の
モル比で結合している。複合が自由溶液中で行なわれる
ならば、ヘモグロビン1gを結合するためにハプトグロビ
ン1.3〜1.5gを要求する。あるいは、ハプトグロビンは
活性化アガロースゲルに結合されることができる。 最終溶液のpHを約９に調節し、濃縮電解質で平衡を保
持し、正常血漿のpHを再現する。臨床的に使用する場
合、添加することのできる電解質はナトリウム、カリウ
ム、塩素、カルシウム、マグネシウム等であるが、これ
に限定されない。 グルタチオン、アスコルビン酸塩又はグルコースのよ
うな常用の酸化防止剤も有利に添加することができる。
最終溶液を生物学的生成物に適用するために好適な任意
の公知技術を用いて滅菌することができる。 近似の量又は範囲における本発明の溶液の重大な特性
を比較の目的で全血の特性と並べて示す： 次の例は本発明の一定の態様を示す。しかしながら、
これらの例は例示を目的としており、本発明の条件及び
範囲を限定する目的のものではない。すべての温度は他
に記載のない限り「℃」で表わす。代表的な反応条件
（例えば、温度、反応時間）が与えられている時、あま
り有利ではないが、この特定された範囲の上又は下の両
方の条件を使用することができることを認めるべきであ
る。 本発明の更なる理解は次の限定しない例から得ること
ができる。これらの例は約５℃と大気圧で実施された。 例 １ ストローマ不含四量体ヘモグロビン溶液の製造 期間の過ぎた人血を、溶液１あたり次の抗生物質を
含有する0.9％塩化ナトリウム溶液で２回洗浄した： ペニシリン 50.000 U ストレプトマイシン 50mg ゲンタマイシン 40mg 硫酸ポリミキシンＢ 2.5mg 赤血球（RBC）を等容量の前記溶液で２回洗浄し、15
分間2500gで遠心分離する。バフイーコート層の95％以
上を血漿抽出器（Fenwal Laboratories,Morton Grove,I
L）で除去した。洗浄し、集合した赤血球をプールし、
発熱物質不含水３〜４容量で溶解した。洗浄した赤血球
100単位が20〜24％のヘマトクリツトで容量15〜20に
なつた。 洗浄赤血球15〜20を冷発熱物質不含水40〜80に注
ぐ。このように作られた溶解物質をポンプにより0.1μ
中空フアイバーカートリツジ２〜４個を通した。空気作
動ポンプを使用した（LP30、Amicon Corp.,Danvers,M
A）。0.1μ分離カートリツジはロミコン社（Romicon In
c.;Rohm and Haas Co.の子会社、Woburn.MA01801）から
市販されている。本質的に赤血球ストローマ不含のヘモ
グロビンは赤血球の他の酵素含有物と共に限外濾過とし
てフイルターを通過する。濾液の１部をこの工程の間数
回遠心分離した。沈殿物の不存在が良好な膜の完全性を
反映する。本質的にストローマ不含ヘモグロビンの97％
回収が得られた。 この第１の分離工程の間、溶解体容量を12〜15に減
少させ、ヘモグロビンの必要な回収が遂げられるまで発
熱物質不含水を添加することにより、その容量に保持し
た。該工程と同時に、ヘモグロビンを有する限外濾過液
を30k分離中空フアイバーカートリツジフイルター（H10
P30、Amicon Corp.、Danvers,MA）３〜４個及びLP30エ
ヤーポンプを用いて濃縮した。限外濾液を濃縮して、約
20〜22g/dlの最終ヘモグロビン濃度にした。 例 ２ ストローマ不含四量体ヘモグロビン溶液の製法（二者択
一的方法） 期限切れ血液の個々の単位を0.9％塩化ナトリウム溶
液で満たした。赤血球及びバフイーコートを沈殿させる
ため一夜放置した。次いで、上澄液とバフイーコートを
抽出した。 次いで、集合細胞を0.9％塩化ナトリウム溶液３〜５
容量に注いだ。該細胞を洗浄し、0.2μ中空フアイバー
交差流フイルター（K205−KROSFLOW、Microgon Corp.,L
aguna Beach、CA）及びエヤーポンプ（LP30、Amicon Co
rp.、Denver、MA）を用いて濃縮した。次いで、集合細
胞を発熱物質不含水３〜５倍容量を添加して溶解した。
次いで、交叉流濾過を再び開始し、四量体ヘモグロビン
を赤血球の酵素含有物と共に限外濾液中に集め、一方ス
トローマはフイルターに保持された。 濾液の一部を該工程の間数回遠心分離した。沈殿物が
ないことは良好な膜の完全さを反映する。本質的にスト
ローマ不含ヘモグロビンの97％回収が達せられた。この
工程と同時に、ヘモグロビンを含有する限外濾液を30k
分離中空フアイバーカートリツジフイルター（H10P30、
Amicon Corp.,Danvers、MA）及びLP30エヤーポンプを用
いて濃縮した。限外濾過液は最終ヘモグロビン濃度約20
〜22g/dlに濃縮された。 例 ３ ストローマ不含ヘモグロビンのピリドキシル化−混合バ
ツチ法 ストローマ不含ヘモグロビン溶液を例１又は２の方法
により製造した。次の試薬を一緒に混合した： １ 燐酸５′ピリドキサル−ヘモグロビンに対してモル
比4:1; ２ トリスHCl緩衝剤−ヘモグロビン溶液中最終濃度0.1
モル； ３ グルタチオン−1g/溶液； ４ アスコルビン酸−0.2g/； ５ グルコース 0.5g/；及び ６ 抗生物質−例１に記載したと同じ抗生物質。 前記の試薬を最少容量の発熱物質不含水中に溶かし、
pHを7.25〜745に調節した。前記混合物をヘモグロビン
溶液に加えた。ヘモグロビン溶液のpHを５℃で0.1N NaO
Hを用いて7.35〜7.45に調節した。最後に、ヘモグロビ
ン濃度を17.5〜18.5g/dlに調節した。 次いで、溶液（18〜20）をガス密ステンレススチー
ル貯蔵容器に移した。該溶液の脱酸素は膜ガス交換器
（William Harvey,Bently Laboratories、Shiley Sales
Corp.,Irvine、CA）を使用して行なつた。窒素ガスを
約170／分の流速で交換器を通して溶液中に通気し
た。ヘモグロビン溶液をポンプにより流速４〜６／分
でガス交換器を通した。酸素の適切な除去は５％より低
いO₂飽和度と定義され、これは１容量％より低い酸素含
量である（IL282、Co−oximeter、Instrumentation Lab
oratories、Lexington、MAによる）。これは４〜８時間
で完了した（第１図参照）。 脱酸素したヘモグロビン溶液に、溶液１あたりナト
リウムボロハイドライド0.02M（最終濃度）を加えた。
ナトリウムボロハイドライドを0.001N NaOH300〜500m
より少量中に溶かした。これをヘモグロビン溶液中にガ
ス交換器のシリンジ口から流速約100m／時間で注入し
た。ステンレススチール貯蔵容器中のガス抜きバルブを
圧力形成を避けるために開口しておいた。NaBH₄の添加
に続けて、該溶液脱酸素に保持した。ピリドキシ化ヘモ
グロビン約70〜80％の最大収率が６〜10時間で得られ
た。該収率は酸素−ヘモグロビン解離曲線（P₅₀）にお
ける移動を測定することにより決定された。 過剰の試薬を腎透析フイルター（Ｃ−DAK1.3、Cordis
Dow Corp.,Miami、FI又はTH−15、Terumo、東京、日
本）を用いて発熱物質不含水に対して透析することによ
り除去した。該溶液を、膜酸素交換器（Oxygenator）を
系中に保持することにより、透析の間脱酸素を保持し
た。酸素交換器を通過するN₂流速は約100／分であつ
た。 例 ４ ストローマ不含ヘモグロビンのピリドキシル化−膜促進
法 ストローマ不含ヘモグロビン溶液を例１又は２の方法
により製造した。次の試薬を一緒に混合した： １ 燐酸５′ピリドキサル−ヘモグロビンに対してモル
比2:1; ２ トリス−HCl緩衝剤−ヘモグロビン溶液中最終濃度
0.1M; ３ グルタチオン−1g/溶液； ４ アスコルビン酸−0.2g/； ５ グルコース 0.5g/；及び ６ 抗生物質−例１に記載したと同じ抗生物質。 前記試薬を発熱物質不含水最少容量中に溶かし、pHを
7.35〜7.45に調節した。前記混合物をヘモグロビン溶液
に加えた。ヘモグロビン溶液のpHを５℃で0.1N NaOHを
用いて7.35〜7.45に調節した。ヘモグロビン濃度を17.5
〜18.5g/dlに調節した。 次いで、溶液（18〜20）をガス密ステンレススチー
ル貯蔵容器に移した。溶液の脱酸素を１個又は複数個の
膜ガス交換器（William Harvey、Bently Laboratorie
s、Shiley Saleys Corp.,Irvine、CA）を用いることに
より完了した。窒素ガスを交換器を通して流速約170
／分で溶液中に通気した。ヘモグロビン溶液をポンプに
より流速４〜６／分でガス交換器を通した。酸素の好
適な除去は５％より低いO₂飽和度と定義され、これは１
容量％より低い酸素含量である（IL282、Co−oximete
r、Instrumentation Laboratories、Lexington、MAによ
る）。これは４〜８時間で完了した。 この工程において、膜酸素交換器又はガス交換器23を
腎透析フイルター27（Terumo、TH−15）と直列にした
（第２図参照）。透析フイルターの外側部分を締め、脱
酸素の間水の損失を防いだ。 脱酸素の最終点が達せられた時、5g％ナトリウムボロ
ハイドライド溶液３を透析フイルターの外側にポンプ
により送つた。このようにして、ピリドキシル化は迅速
に終了した。ピリドキシル化ヘモグロビンの収率75〜80
％が１時間30分で得られ、かつ、85〜90％の最高収率が
２〜３時間で得られた。この収率は酸素−ヘモグロビン
解離曲線（P₅₀）における移動を測定することにより決
められた。 過剰の試薬は系中の腎透析フイルター（Ｃ−DAK1.3、
Cordis Dow Corp.、Miami、FL又はTH−15、Terumo、東
京、日本）を用いて、発熱物質不含水に対して透析する
ことにより除去した。該溶液を透析の間脱酸素に保持し
た。酸素交換器を通過するN₂流速は約100／分であつ
た。 例 ５ ストローマ不含ピリドキシル化ヘモグロビンの重合 ストローマ不含ピリドキシル化ヘモグロビン溶液を例
３又は４の方法により製造した。該透析溶液に次のもの
を加えた： １ 0.1M燐酸ナトリウム緩衝剤（最終濃度） ２ 例１に記載したと同じ抗生物質；及び ３ グルタチオン−1g/。 上記の化学物質をピロゲン不含水500m中に溶かし、
ヘモグロビン溶液に加えた。５℃で、0.5N NaOHを用い
て、溶液のpHを8.0に調節した。ヘモグロビン濃度を0.1
M燐酸塩緩衝液を添加することにより14〜15g/dlに調節
した。該溶液を、膜酸素交換器を系に保持することによ
り、脱酸素状態に保持した。約170／分のN₂流速が保
持された。 ヘモグロビン溶液をポンプを用いて混合容器又は第２
貯蔵容器18から膜酸素交換器又はガス交換器23を介して
腎透析フイルター27（第２図参照）中に流速５〜７／
分で送つた。サンプリングを酸素交換器のシリンジ口を
通して行なつた。オキシヘモグロビンのパーセンテージ
が、コオキシメトリー（Co−oximetry）により測定した
時10％より大であるならば、重合は開始しなかつた。該
溶液を腎透析膜により重合した。重合溶液を10容量に
し、これは次のものを含有した： １ 0.1M燐酸ナトリウム緩衝液（ヘモグロビン溶液にお
けると同じ最終濃度）； ２ 抗生物質−ヘモグロビン溶液におけると同じ濃度； ３ グルタチオン−1g/；及び ４ 25％グルタルアルデヒド溶液125〜225m（ヘモグ
ロビン１モルあたり約14.8〜18.1モルグルタルアルデヒ
ド）。 重合溶液の浸透圧はヘモグロビン溶液の浸透圧とほぼ
同じであつた。 脱酸素ヘモグロビン溶液の流れはまず、透析フイルタ
ーを介して確立され、一方発熱物質不含水は外側を循環
した。所望の流速になつたら、重合溶液を外側に循環さ
せた。該溶液をポンプを用いて流速0.4〜0.6／分にし
た（Cole−Palmer pumps、7018ポンプヘツド）。貯蔵容
器中のヘモグロビン溶液を工程の間中十分に混合した。 その後、重合剤（25％グルタルアルデヒド）を次のス
ケジュールにより重合溶液に加えた： 時間 １時間 75m 時間 ２時間 50m 時間 ３時間 50m 時間 ４時間 50m 時間 ５時間 50m 時間 ６時間 25m 時間 ７時間 10m 重合をコロイド浸透圧（COP）の低下により監視し
た。COPが約40トルに近づいた時反応を中止した。重合
溶液の透析フイルターの外側を放水し、発熱物質不含水
をポンプにより入れた。発熱物質不含水に対する透析は
約２時間行なわれた。ポリマーの約80〜90％収量が得ら
れた。 例 ６ ストローマ不含、重合、ピリドキシル化ヘモグロビンの
超精製 ストローマ不含、重合、ピリドキシル化ヘモグロビン
溶液を例５により製造した。未変性四量体の除去は三工
程で行なわれた。 工程1:限外濾過 重合溶液をポンプにより分子量100000ドルトン分離
（Amicon）の中空フアイバー限外濾過カートリツジ３〜
４個を通した。限外濾液のヘモグロビン濃度が十分に0.
1％を下まわり、少なくとも２時間の間そのレベルに留
まる時、この工程を止めた。この段階で、重合ヘモグロ
ビン溶液は約90％純粋であつた。 工程2:ゲル濾過 約95〜98％純度のポリマー溶液が生じる第２の精製工
程は次のようなゲルクロマトグラフイーにより完了し
た。 ２本のクロマトグラフイーバイオプロセスカラム
（chromatography bioprocess columns;Pharmacia Fine
Chemicals、Piscataway、NJ）60cm×25cmをACA−54ウ
ルトロゲル（ACA−54Ultrogel;LKB Instruments、Gaith
ersburg、MD）約55で満たした。このゲルは分子量900
00ドルトンの排除限界を有した。該カラムをこれらの間
のデツドスペースが最少になるように直列に接続する
と、約105cmの有効ゲル長さが得られる。 ヘモグロビン濃度６〜10g/dlを有する工程１からの重
合ヘモグロビン溶液１の半分を約３／時間の流速で
カラムに負荷した。負荷の後、緩衝液（５℃で0.1M燐酸
ナトリウムpH7.40）を使用し、流速3.0／時間でヘモ
グロビンを溶離するために使用した（第４図）。カラム
から溶離した重合ヘモグロビン溶液の最初の2.0を保
有した。残りの溶液を捨てた。カラムの２フラクシヨ
ンをH1P100カートリツジ１〜３個を有するアミコン（Am
icon）CH−２限外濾過システムを用いて濃縮した（第５
図）。超精製した溶液を濃縮した。重合した溶液の四量
体濃度を減少させることが必要な場合、工程２を繰り返
した。 第３工程：親和性クロマトグラフイー ハプトグロビン（Hp）を次のような活性化アガロース
ゲルに結合した： ハプトグロビン（80％より純粋）をCnBr活性化セフア
ロース4B（Pharmacia Fine Chemicals、Piscataway、N
J）に沈殿したゲル1mあたりHp3mgの割合で加えた。セ
フアロース１容量あたりカツプリング緩衝剤（0.1M炭酸
水素ナトリウム、0.3M NaCl、pH7.9）４容量を加えた。
混合物を４℃で１夜おだやかに攪拌した。この反応の収
量は沈殿したゲル1mあたりHp2mgであつた。Hp親和性
ゲルの過剰（遊離四量体ヘモグロビンに対し）を重合し
たピリドキシル化ヘモグロビン溶液に加え、おだやかに
４℃で１〜４時間攪拌した。次いで該溶液をおだやかに
遠心分離し（２分間、4000g）、上澄液を回収した。付
加的な洗浄及び遠心分離を実施し、重合したヘモグロビ
ンを最大限回収した。このようにして得られた、重合し
た、ピリドキシル化ヘモグロビンの99.5％より多くが未
変性四量対ヘモグロビン不含でもあつた。 変法3:ハプトグロビンとの複合 重合し、ピリドキシル化したヘモグロビ溶液から、ハ
プトグロビン（Hp）と複合することにより未変性四量体
ヘモグロビンの最終痕跡量を除去した。ハプトグロビン
を遊離四量体ヘモグロビンに1:1のモル比で加えた。該
溶液を約２時間室温で混合した。 例 ７ 超精製し、ストローマ不含の、重合し、ピリドキシル化
したヘモグロビンの医薬組成物 超精製し、ストローマ不含の、重合し、ピリドキシル
化したヘモグロビン溶液を例６の方法により製造した。
５℃での溶液のpHを0.5N NaOHを用いて約9.02に調節
し、電解質濃縮物で平衡にして最終溶液中で次の濃度が
得られた： Na 140 mEq/ Ｋ 4.0 mEq/ Cl 100 mEq/ Ca⁺⁺ 5.0 mEq/ Mg 1.5 mEq/ グルタチオン 1g/ 酵素混合物を該溶液に加え、これを酸化に対して安定
した。これは最終溶液１あたり定まつた量よりほぼ少
なくない量を含有する： １ グルコース−６−燐酸 0.3g ２ グルコース−６−燐酸デヒドロゲナーゼ 0.20mg ３ フエロドキシン 6 mg ４ フエロドキシンNADPレダクターゼ 3 mg ５ NADP 40 mg ６ カタラーゼ 0.2g 最終ヘモグロビン濃度を７〜18g/dlに調節した。 例 ８ 滅菌法 例６により製造した、精製し、重合し、ピリドキシル
化したヘモグロビンをパル・プロフイル・フイルター
（Pall Profile Filter;Pall Corp.,Glen Cove,NY）で
次のような濾過工程を用いて滅菌した。 フイルター媒体はポリプロピレンであつた。最終0.22
μ滅菌フイルターはナイロンであつた。すべてのフイル
ターは医薬用品質であつた。 このように滅菌された溶液は血液観点プレート上（37
℃/4日間又は25℃/10日間）又はチオグリコレート液汁
中で全く成長を示さなかつた。該溶液は非薬学的環境で
製造する時、リムルス・アメーバサイテ・リゼイト・テ
スト（Limulus Amoebacyte Lysate test）により、痕跡
量の菌体内毒素（0.25mg/m）を有していた。 例 ９ 生化学的特性 四量体不含の重合し、ピリドキシル化したヘモグロビ
ンはベツクマンDU記録分光光度計（Beckman Instrument
s、Lincolnwood、IL）から得られる正常吸収スペクトル
を示した（第6B図）。該溶液を正常ヘモグロビン濃度
（12〜14g/dl）に再構成すると認容性コロイド浸透圧
（COP）（14.5〜22.5トル）を有する溶液が生じた（第
７図）。第７図のために、ヘモグロビン濃度をIL282コ
オキシメーター（Co−oximeter;Instrumentation Labor
atories,Danvers、MA）で測定した。COPをウエスカー
（Wescor）コロイド浸透圧計モデル4400（Boyce Scient
ific Inc.、Hanover Park、IL）により測定した。比較
のために、非変性ストローマ不含ヘモグロビン（SFH）
により得られた曲線も示した。重合の工程はヘモグロビ
ンの酸素結合能力を変えなかつた（1.30cc/g）。正常ヘ
モグロビン濃度に再構成する時、該生成物は正常な酸素
運搬能力を有する。 pH、pCO₂及び温度の生理学的条件下に測定する時、生
成物のP₅₀は14〜22トルの範囲であつた。生成物に関す
る典型的なオキシ−ヘモグロビン解離曲線を第８図に示
す。サンプルをpH7.40、温度37℃及びpCO₂40トルの標準
条件下に行なつた。連続的な曲線をヘム−ｏ−スキヤン
（Hem−Ｏ−Scan）酸素解離分析装置（Travenol Labora
tories、Deerfield、Illinois）によりつくつた。 HPLCにより、生成物の分子量分布は120000〜600000ド
ルトンの範囲に現われた（第９図）。このデータから概
算した平均分子量は約120000であつた。第９図はHPLCカ
ラム（TSKゲル、type G4000 S.W.,Varian Instruments
Group、Palo Alto、CA）からの溶離パターンを記載し
ている。使用された溶離緩衝液は0.1M塩化ナトリウムを
含有する0.1M燐酸ナトリウム、pH7.0（25℃）（オスモ
ル濃度＝353mOsm）。サンプルのヘモグロビン濃度を約
3.0g/dlに調節した。注入されたサンプル容量は0.1m
であつた。流速は1m／分であつた。〔HPLCポンプ（モ
デル2150）、UVモニター（モデル2238 Uvicord S II）
及び記憶積分器（モデル2220）はLKB Instruments、Gai
thersburg、MDにより製造された〕。 SDS−PAGEにより特徴付けられた生成物は４本の重合
バンドを示した（第3A図）。これは分子量120000で約58
％、分子量192000で26％、分子量256000で11％、分子量
320000で４％を示した。より高い分子量のポリマーの痕
跡量はゲル上に可視であつた。第3A、3B及び3C図はLKB
メモ306（LKB Instruments、Gaithersburg、MD）中に記
載された方法を用いるSDS−ポリアクリルアミドゲルに
より分割された本発明の生成物の密度計走査線を表わ
す。この走査線は重合の異なる段階でのヘレナ・クイツ
ク・スキヤン（Helena Quick Scan）Ｒ及びＤ（Helena
Laboratories、Beaumont,Texas）から得られた。 生成物の粘度は重合で変化した。最終生成物は約8g/d
lのヘモグロビン濃度で3.1センイポアズの粘度を有し
た。この値は全血の粘度と比較可能であつた。第10図は
生成物のヘモグロビン濃度と溶液の粘度との関係を示し
た。測定は温度25℃及び剪断速度450秒^-1でブルツクフ
イールド・モデルLVT粘度計（Brookfield Engineering
Laboratories Inc.、Stoughon、MA）を用いて行なつ
た。 赤血球膜中に存在する燐脂質は薄層クロマトグラフイ
ー（TLC）により最終生成物中に発見されなかつた。遊
離脂肪酸の痕跡量が時折のバツチに関するTLCプレート
上に可視であつた。 生成物中のメテモグロビンレダクターゼ活性は工程に
おいてほぼ不変化であつた。最終生成物と同様に出発溶
解物は1.0〜2.0uの範囲の酵素活性を有した。酵素活性
の１単位（ｕ）はヘモグロビン1gあたり１分間還元され
たフエロシアニド・メテモグロビン複合体１μＭとして
定義した。 例10 生理学的及び生物学的アツセイ Ａ 腎変性 麻酔をかけていないヒヒで行なつた比較研究は四量体
ヘモグロビを２〜３％より多量に含有する溶液の注入が
注入前のレベルに比較して約50％の尿生産の低下及び約
15％の糸球体濾過率（クレアチニン・クレアランス）の
低下を惹起した。本質的に四量体不含のピリドキシル
下、重合ヘモグロビン溶液の注入はほとんど影響を与え
なかつた。 Ｂ 血圧効果 ヒヒにおいて、心摶度数の約25％の低下、及び平均動
脈圧の約14％の上昇は５〜７％より多量の四量体ヘモグ
ロビンを含有するヘモグロビン溶液の注入と関係した。
これは四量体の本来の血管収縮神経活性であり、本質的
に四量体不含のピリドキシル化、重合ヘモグロビン溶液
を注入する時は全く示されなかつた。 Ｃ 溢出 ヘマトリツク０％に対して、四量体ヘモグロビンで交
換輸血したヒヒの腹腔中には四量体ヘモグロビン溶液２
までが観察された。ヘマトクリツト０％に対して、本
質的に四量体不含のピリドキシル化重合ヘモグロビン溶
液で交換輸血した動物の腹腔中にはヘモグロビン含有液
体がほとんど観察されなかつた。 Ｄ ビールス抗原の破壊 ここで開示した方法に関する有利な出発物質である、
人赤血球の100単位のプールは、試験においてビールス
ヘパテイテイスＢ表面抗原に関してプラスであつた。こ
の抗原の破壊は例５に記載されたような重合１〜２時間
後に起きた。 Ｅ 尿中のヘモグロビン存在の減少 ヒヒへの四量体ヘモグロビン含有ヘモグロビン溶液の
注入は尿中への四量体ヘモグロビンの排泄をひきおこし
た。注入した四量体ヘモグロビンの量が循環ハプトグロ
ビンによりヘモグロビン四量体を結合するヒヒの能力を
越えた時、四量体ヘモグロビンの排泄が生じた。生じた
尿はヘモグロビンに特徴的な深い赤色を示し、尿100m
あたりヘモグロビン１〜2gを含有した。四量体ヘモグロ
ビン溶液は生体内（マウス、ヒヒが試験動物であつた）
半減期２〜４時間を示した。本質的に四量体ヘモグロビ
ン不含ピリドキシル化重合ヘモグロビン溶液（四量体２
％より少量存在）の注入は尿の色を僅かに又は感知でき
ない程の変化をもたらす（尿100mあたり30mgより少量
のヘモグロビン）。ハプトグロビン処理した重合し、ピ
リドキシル化したヘモグロビン溶液（99.5％より多く四
量体不含）は非常に多量の治療投与量で霊長動物に注入
しても、尿の色に変化は生じない。 本発明方法で製造された生成物の半減期は約24時間で
あつた（第11図）。第11図は非変性ストローマ不含ヘモ
グロビン（SFH）及び本発明の生成物に関する血漿消失
曲線（半減期）を記載している。乳酸加リンゲル液中の
SFH又は本質的に四量体不含で、架橋し、重合したピリ
ドキシル化ヘモグロビン溶液を体重1kgあたり1gを、ヘ
モグロビン濃度約７〜約14g/dlで６匹の成体雄ヒヒに静
脈内投与した。血漿ヘモグロビン濃度をIL282、コオキ
シメーター（Co−oximeter）によりSFHの場合には２時
間間隔で、本発明の生成物の場合６時間間隔で測定し
た。測定は被験血漿からすべてのヘモグロビンが消失す
るまで続けられた。 前記のように、ここでは例示の目的で本発明の有利な
実施態様を詳説したが、本発明はこれに限定はされな
い。該分野における専門家に明らかな他の変法、分岐し
た方法及び同等の方法は本発明範囲のものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 デ ウオスキン，リチヤード イー. アメリカ合衆国 イリノイ 60056 マ ウント プロスペクト ノース ウエス トゲイト ロード 290 (72)発明者 モス，ジエラルド エス. アメリカ合衆国 イリノイ 60035 ハ イランド パーク サクソニイ ドライ ブ 1042 (72)発明者 ガウルド，ステーブン エイ. アメリカ合衆国 イリノイ 60035 ハ イランド パーク チエロキー ロード 629 (72)発明者 ローズン，アーサー エル. アメリカ合衆国 イリノイ 60091 ウ イルメツト シラー コート 2323 (72)発明者 セーガル，ハンザ アメリカ合衆国 イリノイ 60422 フ ロスムーア ダグラス ドライブ 1426 (56)参考文献 特開 昭52−154515（ＪＰ，Ａ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 １．本質的に四量体不含で、実質的にストローマ不含
   で、架橋し、重合したピリドキシル化ヘモグロビンと、
   非毒性の薬学的に認容性のキャリヤーとからなり、メテ
   モグロビンレダクターゼ活性1.0〜2.0単位を有する、非
   細胞性赤血球代替品。 ２．該ヘモグロビンが9.7容量％〜25重量％の正常酸素
   運搬能を有する請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。 ３．該ヘモグロビンが実質的に血管収縮活性を有さない
   請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。 ４．該ヘモグロビンは実質的に病原体、ビールス性抗原
   及び微生物性抗原を含有しない請求項１記載の非細胞性
   赤血球代替品。 ５．該ヘモグロビンは尿生産において感知可能な減少を
   引き起さない請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。 ６．該ヘモグロビンは糸球体濾過率において感知可能な
   減少を引き起さない請求項１記載の非細胞性赤血球代替
   品。 ７．該ヘモグロビンは腹腔中に感知可能な溢出を引き起
   さない請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。 ８．該ヘモグロビンは生産された尿の色において感知可
   能な変化を引き起さない請求項１記載の非細胞性赤血球
   代替品。 ９．該ヘモグロビンは平均分子量120000ドルトンを有す
   る請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。 １０．該ヘモグロビンは７トル〜30トルのコロイド浸透
   圧を有する請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。 １１．該ヘモグロビンは290mOsM〜310mOsMのオスモル濃
   度を有する請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。 １２．該ヘモグロビンは7g/dl〜18g/dlのヘモグロビン
   濃度を有する請求項１記載の非細胞性赤血球代替品。 １３．血液から赤血球ストローマを分離し、ピリドキシ
   ル化し、重合し、かつ残留未変性四量体の本質的にすべ
   てを除去することからなる本質的に四量体不含で、実質
   的にストローマ不含で、架橋し、重合したピリドキシル
   化ヘモグロビンの製法において、このピリドキシル化
   が、燐酸５′ピリドキサルを含有する溶液を抽出したヘ
   モグロビンに加え、脱酸素し、還元剤を含有する溶液を
   ポンプにより連続的に第１の貯蔵容器から半透過性膜の
   第１の側に送り、燐酸５′ピリドキサルを含有する脱酸
   素ヘモグロビン溶液を連続的にポンプにより第２の貯蔵
   容器から前記膜の第２の側に送り、該還元剤の一部が前
   記膜を横切り拡散し、第２の側のヘモグロビンをピリド
   キシル化し、還元剤を含有する該溶液の未拡散部分を第
   １の貯蔵容器に戻し、ピリドキシル化、脱酸素ヘモグロ
   ビンを含有する脱酸素ヘモグロビン溶液を第２の貯蔵容
   器に戻すことよりなり、かつ残留未変性四量体の本質的
   にすべての除去が、重合した溶液をポンプにより中空フ
   ァイバー限外濾過カートリッジに通し、かつゲルクロマ
   トグラフィーにより精製することからなる、本質的に四
   量体不含で、実質的にストローマ不含で、架橋し、重合
   したピリドキシル化ヘモグロビンの製法。 １４．ピリドキシル化が燐酸５′ピリドキサルを含有す
   る溶液を抽出したヘモグロビンに加え、脱酸素し、還元
   剤を含有する溶液を加え、ピドキシル化し、脱酸素した
   ヘモグロビン70〜90％の収率が得られるまで混合し、過
   剰の試薬を除去することからなる請求項13記載の方法。 １５．ピリドキシル化が、抽出したヘモグロビンに燐酸
   ５′ピリドキサルを含有する溶液を加え、脱酸素し、還
   元剤を含有する溶液を加え、かつ30分〜10時間混合する
   ことからなる請求項13記載の方法。 １６．重合が、ピリドキシル化、脱酸素ヘモグロビンを
   重合溶液に、コロイド浸透圧が40トルに達するまで暴露
   し、かつ過剰の試薬を除去することになる請求項13記載
   の方法。 １７．重合がピリドキシル化、脱酸素ヘモグロビンを重
   合溶液に２時間〜７時間暴露することよりなる請求項13
   記載の方法。 １８．更に、重合剤を最初の時間に70ml〜80ml、２時間
   目に45ml〜55ml、３時間目に45ml〜55ml、４時間目に45
   ml〜55ml、５時間目に45ml〜55ml、６時間目に20ml〜30
   mlかつ７時間目に5ml〜15mlの各量で毎時間重合溶液に
   加え、８時間目に過剰の試薬を除去することからなる請
   求項16記載の方法。 １９．過剰の試薬の除去が透析により行われる請求項1
   4、16又は18記載の方法。 ２０．重合が、重合溶液をポンプにより連続的に第１の
   貯蔵容器から半透過性膜の第１の側に送り、ピリドキシ
   ル化、脱酸素ヘモグロビン溶液をポンプにより連続的に
   第２の貯蔵容器から該膜の第２の側に送り、該重合溶液
   の一部を該膜を横切って拡散し、ピリドキシル化ヘモグ
   ロビンを第２の側で重合し、重合溶液の未拡散部分を第
   １の貯蔵容器にもどし、かつ重合し、ピリドキシル化し
   たヘモグロビンを含有するヘモグロビン溶液を第２の貯
   蔵容器にもどすことよりなる請求項13記載の方法。 ２１．半透過膜が腎透析膜からなる請求項13又は20記載
   の方法。 ２２．重合溶液がヘモグロビン１モルあたりグルタルア
   ルデヒド14.8モル〜18.1モルを含有する請求項16、17又
   は20記載の方法。 ２３．残留未変性四量体の本質的にすべての除去が重合
   した溶液をポンプにより中空ファイバー限外濾過カート
   リッジを通すこと、ゲルクロマトグラフィーにより精製
   すること及びハプトグロビンで処理することよりなる請
   求項13記載の方法。 ２４．ハプトグロビンでの処理がハプトグロビンの添加
   又はゲル結合ハプトグロビンでの処理からなる請求項23
   記載の方法。 ２５．病原体、微生物性抗原及びビールス性抗原を実質
   的に含有しない請求項１記載の非細胞性赤血球代替品を
   製造する請求項13記載の方法。