ES2347805T3 - Metodos para aumentar la estabilidad hemodinamica usando composiciones que transportan oxigeno. - Google Patents

Abstract

Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) con una afinidad por el oxígeno superior a la de la sangre completa para su utilización en un método de aumento de la estabilidad hemodinámica de un paciente normovolémico sometido a intervención quirúrgica.

Description

CAMPO TÉCNICO

La presente invención se refiere a métodos para aumentar la estabilidad hemodinámica de un paciente que se somete a intervención quirúrgica administrando una composición que comprende un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina. En una realización, la presente invención, se refiere a la utilización de hemoglobinas modificadas con óxido de polialquileno con cooperativismo reducido y una gran afinidad por el oxígeno para aumentar la descarga de oxígeno como medida preventiva para evitar las complicaciones relacionadas con la estabilidad hemodinámica durante la intervención quirúrgica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La sangre es el medio para suministrar oxígeno y nutrientes y retirar los productos residuales de los tejidos. La sangre se compone de plasma en el que están en suspensión los glóbulos rojos (RBC o eritrocitos), los glóbulos blancos (WBC) y las plaquetas. Los glóbulos rojos comprenden aproximadamente el 99º% de las células en la sangre, y su principal función es el transporte de oxígeno a los tejidos y la eliminación del dióxido de carbono de los mismos.

El ventrículo izquierdo del corazón bombea la sangre a través de las arterias y de las arteriolas más pequeñas del sistema circulatorio. La sangre entra a continuación en los capilares donde se produce la mayoría del suministro de oxígeno, del intercambio de nutrientes y de la extracción de los productos residuales celulares. (véase, p. ej., A. C. Guyton, “Human Physiology And Mechanisms of Disease” (3ªed.,

W. B. Saunders Contiene., Filadelfia. Pa.), págs. 228-229 (1982)). Después, la sangre circula a través de las vénulas y de las venas en su retorno a la aurícula derecha del corazón. Aunque la sangre que vuelve al corazón es pobre es oxígeno en comparación con la que se bombea desde el corazón, cuando en descanso, la sangre que retorna todavía contiene aproximadamente el 75% del contenido de oxígeno original.

La proteína hemoglobina realiza la función de oxigenación reversible (es decir, el suministro de oxígeno) de los RBC. En los mamíferos, la hemoglobina tiene un peso molecular (P.M.) de aproximadamente 64.000 Daltons y está compuesta de aproximadamente 6% de hemo y 94% de globina. En su forma natural, contiene dos pares de subunidades (es decir, es un tetrámero), conteniendo cada una un grupo hemo y una cadena polipeptídica de globina. En solución acuosa la hemoglobina está presente en equilibrio entre las formas tetrámera (P.M. 64.000 Daltons) y dimérica

(P.M. 32.000 Daltons). Fuera de los RBC, los dímeros son excretados prematuramente por los riñones (vida media en el plasma de aproximadamente 2 a 4 horas). Junto con la hemoglobina, los RBC contienen estroma (membrana de RBC), que comprende proteínas, colesterol y fosfolípidos.

Debido a la demanda de productos sanguíneos en hospitales y otras instalaciones, se ha dirigido extensa investigación al desarrollo de sustitutos de la sangre. Un “sustituto de la sangre” es un producto sanguíneo que es capaz de transportar y suministrar oxígeno a los tejidos. Los transportadores de oxígeno basados en la hemoglobina (HBOC) son sustitutos de la sangre que contienen hemoglobinas. Los HBOC tienen numerosas utilizaciones, incluyendo el reemplazamiento de la pérdida de sangre durante los procedimientos quirúrgicos y después de la hemorragia aguda, y para procedimientos de reanimación después de lesiones traumáticas. Esencialmente los HBOC pueden utilizarse para cualquier propósito en el que la sangre de bancos se administra actualmente a los pacientes. Véase, p. ej., las Pat. de EE.UU. nº 4.001.401 de Bonson et al., y nº 4.061.736 de Morris et al.).

El desarrollo de los HBOC es especialmente importante dado el hecho de que el suministro de sangre humana actual es limitado. Por esta razón la sangre humana se utiliza normalmente en circunstancias en las que es clínicamente necesaria. Esto normalmente significa que la sangre humana no es apropiada para uso profiláctico, tal como “dopado de sangre” (es decir, administración de sangre completa con el fin de aumentar el rendimiento incrementando la capacidad de transporte de oxígeno de la sangre). Por consiguiente, ni la utilización de sangre completa ni los HBOC para indicaciones profilácticas están extendidos, y en la mayoría de los casos se considera que es una práctica algo cuestionable.

La administración de los HBOC a pacientes antes de la intervención quirúrgica ha sido sugerida anteriormente en combinación con la extracción de sangre autógena de los pacientes (es decir, hemodilución normovolémica aguda o “ANH”) que podría ser devuelta después en el procedimiento, si se necesita, o después de la intervención quirúrgica. Véase, por ejemplo, el procedimiento PCT WO 98/37909. Dichos pacientes se consideran en la presente memoria que no son “normovolémicos” en el momento de la intervención quirúrgica. Sin embargo, este procedimiento no se dirige a la necesidad de medidas profilácticas para evitar los efectos primarios perjudiciales de los procedimientos quirúrgicos tal como la estabilidad hemodinámica, y solamente se dirige a los efectos secundarios a la pérdida de sangre asociada a la intervención quirúrgica.

Aumentar la estabilidad hemodinámica durante la intervención quirúrgica que requiere anestesia general es importante por dos razones fundamentales. En primer lugar, la inestabilidad hemodinámica producida por la pérdida de sangre o por otros factores puede conducir a lesión tisular e incluso la muerte. Por ejemplo, la hipotensión hemorrágica y el choque anafiláctico son condiciones que proceden de una pérdida de sangre significativa que conduce a la oxidación reducida de los tejidos. Para los pacientes con dichas afecciones, es deseable y con frecuencia crítico para su supervivencia estabilizar su presión sanguínea y aumentar la cantidad de oxígeno suministrado a los tejidos del cuerpo por sus sistemas circulatorios.

En segundo lugar y aun más importante, la inestabilidad hemodinámica, aún menor y transitoria, puede afectar la recuperación posquirúrgica del paciente. Esta inestabilidad puede ocurrir en cualquier parte en todo el cuerpo, y se manifiesta a menudo como un “episodio hipotensor”, que normalmente se registra como una disminución de la presión sanguínea. Dichos episodios pueden producirse como resultado de fluctuaciones de propiedades hemodinámicas localizadas durante la anestesia general, aunque no exista ninguna pérdida de sangre. Estos episodios pueden producir lesiones cognitivas y otras complicaciones que empeoran la recuperación tras la intervención quirúrgica. Por ejemplo, los pacientes en edad avanzada que experimentan procedimientos quirúrgicos invasivos tales como artroplastias de cadera se beneficiarían de cualquier tratamiento profiláctico que mejorase su estabilidad hemodinámica durante la intervención quirúrgica. Además, dichos pacientes con frecuencia no son candidatos adecuados para ANH, y aumentando su estabilidad hemodinámica cabría esperar que disminuya su necesidad de transfusiones utilizando sangre de donantes.

La utilización de expansores de plasma y reposiciones de la volemia para mantener la estabilidad hemodinámica está generalizada. Sin embargo, estas soluciones que no transportan oxígeno solamente diluyen la capacidad de oxígeno de la sangre, incluso sin ANH simultáneo, y pueden de hecho producir inestabilidad hemodinámica en algunos casos. Además de los expansores de plasma y de las reposiciones de la volemia, se han sugerido también soluciones cristaloides para su utilización en el mantenimiento de la estabilidad hemodinámica. Sin embargo, la administración de estas soluciones puede dar como resultado una excesiva retención de agua y edema, que puede producir además fluctuaciones en las propiedades hemodinámicas.

Por consiguiente, hay necesidad de métodos para aumentar la estabilidad hemodinámica que puede producir episodios hipotensores transitorios que no disminuyen la capacidad de transporte de oxígeno intrínseca de la sangre. De acuerdo con este objetivo, la presente invención se refiere a un procedimiento de aumentar la estabilidad hemodinámica administrando las composiciones que comprenden transportadores de oxígeno basados en la hemoglobina tales como las hemoglobinas modificadas con óxido de polialquileno formuladas especialmente.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a la utilización de una composición en el tratamiento de un paciente normovolémico que está sometido a intervención quirúrgica para aumentar la estabilidad hemodinámica. En una realización, la invención se refiere a un método para aumentar la estabilidad hemodinámica de un paciente normovolémico que está siendo sometido a intervención quirúrgica que comprende: a) administrar una composición que contiene un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) con una afinidad por el oxígeno superior a la de la sangre completa para el paciente en relación con la intervención quirúrgica; y b) controlar la estabilidad hemodinámica del paciente. Dicha administración, puede suceder antes, durante o después de la intervención quirúrgica, o cualquiera de sus combinaciones. Además, la estabilidad hemodinámica puede medirse antes, durante o después de la intervención quirúrgica, o cualquiera de sus combinaciones. Además, el control de la estabilidad hemodinámica del paciente, puede tomar muchas formas, tal como el control de la presión sanguínea de un paciente. En una realización, la estabilidad hemodinámica se caracteriza porque la presión sistólica permanece por encima de 90 mm Hg.

El HBOC de la presente invención puede tomar muchas formas tal como hemoglobina modificada por óxido de polialquileno, que puede obtenerse de fuentes naturales o sintéticas, incluyendo fuentes recombinantes. Además, la fuente de hemoglobina puede proceder de seres humanos o de otros animales no humanos.

En otra realización de la presente invención, el HBOC tiene una afinidad por el oxígeno mayor del doble que la sangre completa, la cual puede incluir los HBOC con P50 entre 4 y 15.

En otro aspecto, la presente invención incluye la utilización de un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) en la preparación de un medicamento para aumentar la estabilidad hemodinámica de un paciente normovolémico que está siendo sometido a intervención quirúrgica, en la que el HBOC tiene una afinidad por el oxígeno mayor que la sangre completa. Dicha utilización puede comprender además un aumento de la descarga de oxígeno como medida preventiva para impedir la inestabilidad hemodinámica asociada a la intervención quirúrgica. Las características de los HBOC y la administración del medicamento, son, por ejemplo, como se describió anteriormente.

Otros aspectos de la invención se describen a lo largo de toda la memoria.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La Figura 1, representa el cromatograma por FPLC de MalPEG-Hb y de la hemoglobina exenta de estromas (SFH).

La Figura 2, representa las curvas de equilibrio del oxígeno para MalPEG-Hb, SFH y sangre completa.

La Figura 3, representa la tasa de supervivencia de las ratas después de la administración de varias soluciones de ensayo.

La Figura 4, representa la diuresis de pacientes que reciben MalPEG-Hb o lactato de Ringer.

La Figura 5, representa los signos vitales de pacientes que reciben MalPEG-Hb antes de la anestesia.

La Figura 6, representa el porcentaje de pacientes que reciben MalPEG-Hb o un placebo que presenta episodios hipotensores durante la intervención quirúrgica.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a los métodos para aumentar la estabilidad hemodinámica de una persona que está siendo sometida a intervención quirúrgica mediante la administración de una composición que comprende un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina. En una realización, la presente invención se refiere a la utilización de hemoglobinas modificadas con óxido de polialquileno con cooperativismo reducido y una elevada afinidad por el oxígeno para aumentar la descarga de oxígeno como medida preventiva para impedir las complicaciones relacionadas con la estabilidad hemodinámica durante la intervención quirúrgica.

Para facilitar la comprensión de la invención publicada en la descripción siguiente, se definen a continuación numerosos términos.

Definiciones

El término “hemoglobina” se refiere generalmente a la proteína dentro de los glóbulos rojos transportadora de oxígeno. Cada molécula de hemoglobina tiene 4 subunidades, 2 cadenas � y 2 cadenas �, que están dispuestas en una estructura tetrámera. Cada subunidad contiene además un grupo hemo, el cual es el centro que contiene hierro que se une al oxígeno. De este modo, cada molécula de hemoglobina puede unir 4 moléculas de oxígeno.

La expresión “hemoglobina modificada” incluye, pero no se limita a, la hemoglobina alterada por una reacción química tal como la reticulación intra- e intermolecular, la manipulación genética, la polimerización y/o la conjugación con otros grupos químicos (p. ej., óxidos de polialquileno por ejemplo polietilenglicol, u otros aductos tales como proteínas, péptidos, carbohidratos, polímeros sintéticos o similares). En esencia, la hemoglobina está “modificada” si se ha alterado alguna de sus propiedades estructurales o funcionales a partir de su estado natural. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “hemoglobina” por sí mismo se refiere tanto a la hemoglobina natural, no modificada, como a la hemoglobina modificada.

La expresión “hemoglobina modificada en superficie” se utiliza para referirse a la hemoglobina descrita anteriormente a la que se han unido grupos químicos tales como dextrano u óxido de polialquileno, más habitualmente por enlace covalente. La expresión “hemoglobina oxigenada modificada en superficie” se refiere a la hemoglobina que está en estado “R” cuando está modificada en superficie.

La expresión “hemoglobina sin estroma” se refiere a la hemoglobina de la que se han eliminado todas las membranas de los glóbulos rojos.

El término “metahemoglobina” se refiere a una forma oxidada de hemoglobina que contiene hierro en estado férrico y no puede funcionar como transportador de oxígeno.

El término “MalPEG-Hb” se refiere a la hemoglobina a la que se ha conjugado PEG activado con malemidilo. Dicho MalPEG puede ser citado además por la fórmula siguiente:

Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH3)m Fórmula I

en la que Hb se refiere a la hemoglobina tetrámera, S es un grupo tiol en superficie, Y es el enlace covalente de succinimido entre Hb y Mal-PEG, R falta o es un grupo alquilo, amida, carbamato o fenilo (dependiendo de la fuente de materia prima y del método de síntesis química), [O-CH2-CH2]n son las unidades de oxietileno que constituyen el eje central del polímero PEG, en la que n define la longitud del polímero

(p. ej., P.M. = 5000) y OCH3 es el grupo metoxi terminal. La expresión “expansor de plasma” se refiere a cualquier solución que pueda administrarse a un paciente para aumentar el volumen del plasma.

La expresión ”capacidad para transportar oxígeno” o simplemente “capacidad de oxígeno”, de un sustituto de sangre se refiere a su capacidad para transportar oxígeno, pero no se correlaciona necesariamente con la eficacia con la que se suministra oxígeno. La capacidad de transporte de oxígeno de un sustituto de sangre que contiene hemoglobina se calcula generalmente a partir de la concentración en hemoglobina, ya que es sabido que cada gramo de hemoglobina se une a 1,34 ml de oxígeno. De este modo, la concentración en hemoglobina en g/dl multiplicada por el factor 1,34 proporciona la capacidad del oxígeno en ml/dl. La concentración en hemoglobina puede medirse por cualquier método conocido como por ejemplo utilizando el fotómetro de �-hemoglobina (HemoCue, Inc., Angelholm, Suecia). Asimismo, la capacidad del oxígeno puede medirse por la cantidad de oxígeno liberado de una muestra de hemoglobina o de sangre utilizando, por ejemplo, un instrumento con celda de combustible (p. ej., Lex-O2-Con, Lexington Instruments, Waltham, Massachusetts).

La expresión “afinidad por el oxígeno” se refiere a la avidez con la que un transportador de oxígeno tal como la hemoglobina se une al oxígeno molecular. Esta característica está definida por la curva de equilibrio del oxígeno que relaciona el grado de saturación de las moléculas de hemoglobina con el oxígeno (eje Y) con la presión parcial de oxígeno (eje X). La posición de esta curva está indicada por el valor P50, presión parcial de oxígeno a la que el transportador de oxígeno está medio saturado con oxígeno y está inversamente relacionada con la afinidad por el oxígeno.

Por consiguiente cuanto menor es la P50, mayor será la afinidad por el oxígeno. La afinidad por el oxígeno de la sangre completa (y de los componentes de la sangre completa, tales como los glóbulos rojos y la hemoglobina), así como cualquier transportador de oxígeno, puede medirse por varios métodos conocidos en la técnica. (Véase, p. ej., Winslow et al., J. Biol. Chem. 252 (7): 2331-37 (1997)). La afinidad por el oxígeno puede determinarse también utilizando un analizador HEMOXTM disponible en el mercado (TCS Scientific Corporation, New Hope, Pensilvania). (Véase, p. ej., Vandergriff y Shrager en “Methods in Enzymology” (Everse, et al., Ed.) 232:460 (1994)).

La expresión “componente transportador de oxígeno” se refiere extensamente a una sustancia capaz de transportar oxígeno en el sistema circulatorio del cuerpo y suministrar por lo menos una parte de este oxígeno a los tejidos. En las realizaciones preferidas, el componente transportador de oxígeno es la hemoglobina natural o modificada, y se denomina también en la presente memoria “transportador de oxígeno basado en la hemoglobina” o “HBOC”.

La expresión “parámetros hemodinámicos” se refiere extensamente a las mediciones indicadoras de presión sanguínea, estado del caudal y del volumen, incluyendo las mediciones directas tales como presión sanguínea, gasto cardíaco, presión auricular derecha, presión diastólica final ventricular izquierda, así como mediciones indirectas de taquicardia, isquemia, bradicardia, problemas de conducción, equilibrio fluido, peso, tiempo en la UCI y función renal.

El término “cristaloide” se refiere a moléculas pequeñas (habitualmente inferiores a 10 Å) tales como sales, azúcares y tampones. Independientemente de los coloides, los cristaloides no contienen ningún componente oncóticamente activo y se equilibran entre la circulación y los espacios intersticiales muy rápidamente.

El término “coloide” (en contraste con “cristaloide”) se refiere a moléculas mayores (normalmente mayores de 10 Å) que se equilibran a través de membranas biológicas dependiendo de su tamaño y carga e incluye proteínas tales como albúmina y gelatina, así como almidones tales como penta-almidón y hepta-almidón.

La expresión “presión osmótica del coloide” se refiere a la presión ejercida por un coloide para equilibrar el equilibrio del fluido a través de una membrana.

La expresión “estable a la auto-oxidación” se refiere a la capacidad de un HBOC para mantener un índice bajo de auto-oxidación. Un HBOC se considera estable a 24ºC si la relación metahemoglobina/hemoglobina total no aumenta más del 2% después de 10 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 24ºC). Por ejemplo, si el índice de auto-oxidación es 0,2 h-1, entonces si el porcentaje inicial de metahemoglobina es del 5%, y el HBOC se consideraría estable a temperatura ambiente durante 10 horas, si este porcentaje no aumentó por encima del 7%.

La expresión “relación metahemoglobina/hemoglobina total” se refiere a la relación de hemoglobina oxidada a hemoglobina total.

El término “mezcla” se refiere a una combinación de dos o más sustancias sin existencia de una reacción mediante la cual perderían sus propiedades individuales; el término “solución” se refiere a una mezcla líquida; la expresión “solución acuosa” se refiere a una solución que contiene algo de agua y puede contener además una o más sustancias líquidas con agua para formar una solución multicomponente; el término “aproximadamente” se refiere al valor actual que está dentro de un intervalo, p. ej., 10% del valor indicado.

El término “polietilenglicol” o “PEG” se refiere a polímeros líquidos o sólidos de fórmula química general H(OCH2CH2)nOH, en la que n es mayor o igual a 4, y sus variantes, tal como PEG que está activado sustituido y/o insustituído.

El término “perfusión” se refiere a la circulación de fluido a tejidos y órganos por arterias y capilares.

La expresión “estabilidad hemodinámica” se refiere al funcionamiento estable en los mecanismos de circulación, es decir, a la estabilidad durante un período dado de cualquier parámetro hemodinámico.

La expresión “episodios hipotensores” se caracteriza por o se debe a la hipotensión localizada o generalizada, es decir una reducción de la presión sanguínea, que puede definirse además cuantitativamente como una presión sistólica inferior a 90 mm Hg o una reducción de la presión sanguínea inferior al 75% del valor de referencia.

El significado de otra terminología utilizada en la presente memoria debería ser comprendido fácilmente por alguno de los expertos razonables en la materia.

Naturaleza del suministro y consumo de oxígeno

Aunque la utilización con éxito de las composiciones y métodos de la presente invención no requiere comprensión de los mecanismos subyacentes de suministro y consumo de oxígeno, el conocimiento básico en cuanto a alguno de estos supuestos mecanismos, puede ayudar a comprender la exposición siguiente. Se ha supuesto generalmente que los capilares son los transportadores primarios de oxígeno a los tejidos. Sin embargo, en cuanto al tejido en reposo, los descubrimientos actuales indican que existe aproximadamente un equirreparto entre la liberación de oxígeno arterial y capilar. Es decir, se cree que la hemoglobina en el sistema arterial suministra aproximadamente un tercio de su contenido en oxígeno en la red arterial y un tercio en los capilares, mientras que el resto sale en la microcirculación por el sistema venoso.

Las propias arterias y arteriolas son zonas de utilización de oxígeno. Por ejemplo, la pared arterial requiere energía para efectuar la regulación de la circulación sanguínea por contracción contra la resistencia vascular. De este modo, la pared arterial es normalmente una zona significativa para la difusión del oxígeno fuera de la sangre. Sin embargo, las composiciones de suministro de oxígeno actuales (p. ej., HBOC) pueden liberar demasiado de su contenido en oxígeno en el sistema arterial, y de este modo provocan una reducción autorreguladora en la perfusión capilar. Por consiguiente, la eficacia de suministro de oxígeno de un sustituto de la sangre puede realmente impedirse por tener demasiado oxígeno o demasiado poca afinidad por el oxígeno.

La cantidad de consumo de oxígeno por la pared vascular, es decir, la combinación de oxígeno necesario para el trabajo mecánico y el oxígeno necesario para síntesis bioquímicas, puede determinarse midiendo el gradiente de las paredes vasculares. Véase p. ej., Winslow, et al., en “Advances in Blood Substitutes” (1997), Birkhauser, Ed., Boston, MA, págs. 167-188. La tecnología presente permite mediciones precisas de la presión parcial de oxígeno en varios vasos sanguíneos. El gradiente medido es directamente proporcional a la cantidad de utilización de oxígeno por el tejido en la zona de medición. Dichas mediciones demuestran que la pared vascular tiene una utilización de oxígeno de referencia que aumenta con los aumentos en la inflamación y constricción, y se reduce por relajación.

El gradiente de la pared vascular es inversamente proporcional a la oxigenación del tejido. La vasoconstricción aumenta el gradiente de oxígeno (metabolismo tisular), mientras que la vasodilatación reduce el gradiente. Los gradientes mayores son indicadores del hecho de que la pared celular utiliza más oxígeno, aunque está disponible menos oxígeno para el tejido. El mismo fenómeno se cree que está presente en toda la microcirculación.

Relación entre la vasoconstricción y la afinidad por el oxígeno

Lo razonable para desarrollar un HBOC con gran afinidad por el oxígeno se basa, en parte, en pasados estudios que utilizan células exentas de hemoglobinas como alternativas a las transfusiones de glóbulos rojos. Algunos de los efectos fisiológicos de estas soluciones continúan siendo entendidos de forma incompleta. De éstos, quizás la mayor parte de la controversia es la propensión a originar vasoconstricción que puede manifestarse como hipertensión en los animales y el hombre (Amberson, W., “Clinical experience with hemoglobin-saline solutions”, Science 106: 117-117 (1947)) (Keipert, P., A. Gonzales, C. Gómez, V. Macdonald, J. Hess, y R. Winslow, “Acute changes in systemic blood pressure and urine output of conscious rats following exchange transfusión with diaspirin-crosslinked between hemoglobin solution”, Transfusion 33:70 1-708, (1993)). La hemoglobina humana reticulada entre las cadenas � con dibromosalicil-fumarato (��Hb) fue desarrollada por el ejército de EE.UU. como sustituto modelo de glóbulo rojo, pero el ejército la abandonó después de la demostración de graves aumentos en la resistencia vascular pulmonar y generalizada (Hess, J., V. Macdonald, A. Murray, V. Coppes, y C. Gomez, “Pulmonary and systemic hypertension after hemoglobin administratio”, Blood 78: 356A (1991)). Una versión comercial de este producto fue abandonada también después de una prueba clínica en fase III decepcionante (Winslow, R. M. “��-Crosslinked hemoglobin: Was failure predicted by preclinical testing?” Vox sang 79: 1-20 (2000)).

La explicación más comúnmente avanzada para la vasoconstricción producida por las células sin hemoglobina es que se une fácilmente al factor relajante derivado del endotelio, óxido nítrico (NO). De hecho, l se han producido hemoglobinas recombinantes con afinidad reducida por el NO que parecen ser menos hipertensoras en experimentos con ratas de carga máxima (Doherty, D. H., M. P. Doyle, S. R. Curry,

R. J. Vali, T. J. Fattor, J. S. Olson, y D. D. Lemon, “ Rate of reaction with nitric oxide determines the hypertensive effect of cell-free hemoglobin”, Nature Biotechnology 16: 672-676 (1998)) (Lemon, D. D., D. H. Doherty, S. R. Curry, A. J. Mathews, M. P. Doyle,

T. J. Fattor, y J. S. Olson, “ Control of the nitric oxide-scavenging activity of hemoglobin”, Art Cells, Blood Subs. e Immob. Biotech 24: 378 (1996)).

Sin embargo, los estudios sugieren que el enlace al NO puede no ser la única explicación para la vasoactividad de la hemoglobina. Se ha observado que determinadas moléculas grandes de hemoglobina, tal como las modificadas con polietilenglicol (PEG), estaban prácticamente libres del efecto hipertensor, aun cuando sus índices de fijación al NO eran idénticos a los de ��Hb fuertemente hipertensora (Rohlfs, R. J., E. Bruner, A. Chiu, A. Gonzales, M. L. Gonzales, D. Magde, M. D. Magde, K. D. Vandergriff, y R. M. Winslow, “Arterial blood pressure responses to cellfree hemoglobin solutions and the reaction with nitric oxide”, J. Biol. Chem. 273: 12128-12134 (1998)). Además se observó que la PEG-hemoglobina era extraordinariamente eficaz para prevenir las consecuencias de la hemorragia cuando se dan como exanguinotransfusión antes de la hemorragia (Winslow, R. M., A.Gonzales, M. Gonzales, M. Magde, M. McCarthy, R. J. Rohlfs, y K. D. Vandergriff “Vascular resistance and the efficacy of red cell substitutes”, J. Appl. Physiol 85: 9931003 (1998)).

Este efecto protector se correlaciona con la falta de hipertensión, lo que sugiere que la vasoconstricción es responsable del funcionamiento decepcionante de muchos de los productos basados en la hemoglobina estudiados hasta la fecha. Basándose en estas observaciones se desarrolló una hipótesis para explicar la vasoconstricción, como alternativa, o posiblemente además del efecto del enlace al NO. Aunque no se desea estar ligado por ninguna teoría en particular, se cree que un componente sustancial del efecto vasoactivo de la hemoglobina es una respuesta refleja a la difusión de la hemoglobina en el espacio sin células. Esta hipótesis se probó en un sistema capilar in vitro, y se demostró que la PEG-hemoglobina, que tiene una constante de difusión reducida, transfería oxígeno de manera similar a la de los glóbulos rojos naturales (McCarthy, M. R., K. D. Vandergriff y R. M. Winslow, “ The role of facilitated diffusion in oxygen transport by cell-free hemoglobin: Implications for the design of hemoglobin-based oxygen carriers”, Biophysical Chemistry 92: 103-117 (2001)). Cabría esperar que la afinidad por el oxígeno desempeñe una función en su difusión facilitada por la hemoglobina en el espacio del plasma, ya que el cambio en la saturación desde la hemoglobina hasta las paredes vasculares es un determinante del gradiente de difusión o de la propia hemoglobina.

La afinidad por el oxígeno de las células exentas de hemoglobina puede desempeñar una función adicional en la regulación del tono vascular ya que la liberación de O2 a las paredes vasculares en las arteriolas desencadenará vasoconstricción (Lindbom, L., R. Tuma y K. Arfors, “ Influence of oxygen on perfusión capillary density and capillary red cell velocity in rabbit skeletal muscle”, Microvasc. Res. 19: 197-208 (1980)). En el pliegue cutáneo del hámster, el PO2 de dichos vasos está comprendido en el intervalo de 20 a 40 Torr, donde la curva de equilibrio del oxígeno de los glóbulos rojos normal está muy inclinada (Intaglietta, M., P. Johnson y

R. Winslow, “Microvascular and tissue oxygen distribution”, Cardiovasc. Res. 32: 632643 (1996)). Por lo tanto desde un punto de vista teórico, puede ser importante que el P50 de la célula exenta de hemoglobina sea menor que el de los glóbulos rojos (es decir, afinidad mayor por el O2), con objeto de evitar la liberación de O2 en los vasos reguladores arteriales.

Descarga de oxígeno

Además de la afinidad por el oxígeno las propias propiedades de fijación del oxígeno, es decir, el cooperativismo y los efectos alostéricos, pueden desempeñar una función crucial en las capacidades de descarga de oxígeno de los HBOC. Se ha observado que el enlace de polialquileno a la hemoglobina produce una “impermeabilización” general de la estructura de la globina. Esto se atribuye a los efectos osmóticos de tener una carcasa hidrófila rodeando la hemoglobina, y puede también depender de la naturaleza y posición de los grupos de enlace utilizados para unirse al óxido de polialquileno. El juicio más convencional es que el diseño de los HBOC debería imitar las características de la hemoglobina natural. Sin embargo, se ha descubierto inesperadamente que la perturbación de la configuración cuaternaria de la hemoglobina puede presentar ventajas, particularmente en el contexto de la descarga de oxígeno.

Se considera que una proteína es “alostérica” si sus características cambian como resultado de la unión a una molécula efectora, es decir a un ligando, en su zona alostérica. En el caso de la hemoglobina, el ligando es el oxígeno. Cada subunidad del tetrámero de hemoglobina es capaz de unirse a una molécula de oxígeno. Esta subunidad también existe en una de dos configuraciones, tensada (T) o relajada (R). En el estado R el oxígeno se puede unir más fácilmente que en el estado T.

La hemoglobina presenta un efecto concertado, o cooperativismo, entre las subunidades individuales que se unen al oxígeno. El enlace del oxígeno a una subunidad provoca un cambio de configuración en esta unidad que da lugar a que las restantes zonas activas presenten un aumento de afinidad por el oxígeno. Por consiguiente, cada molécula de oxígeno sucesiva que se une a la molécula de hemoglobina se acopla más fácilmente que la anterior, hasta que la molécula de hemoglobina haya conseguido el estado R o “de ligando”, con cuatro moléculas de oxígeno acopladas.

Por el contrario, la hemoglobina natural presenta un efecto concertado en cuanto a su eficacia para liberar oxígeno. La primera molécula está más estrechamente unida y tiene más energía para ser “descargada” que la siguiente, y así sucesivamente. Por consiguiente, las enseñanzas convencionales hacia el diseño de sustitutos sanguíneos que imitan el cooperativismo de la hemoglobina natural puede afectar desfavorablemente su capacidad para liberar oxígeno una vez unida.

La presente invención se refiere al descubrimiento de que los HBOC, con menos, no más, cooperativismo que la hemoglobina natural son inesperadamente más útiles en aplicaciones que implican la descarga de oxígeno. Por consiguiente, una composición para su utilización en el aumento de la estabilidad hemodinámica debe ser capaz de liberar fácilmente su oxígeno una vez llegue a su posición objetivo, pero no debe contener demasiada capacidad liberadora de oxígeno para evitar efectos vasoconstrictores. En resumen, la composición ideal para el tratamiento profiláctico a propósito de un procedimiento quirúrgico para aumentar la estabilidad hemodinámica contiene necesariamente una hemoglobina modificada con menos cooperativismo que la hemoglobina natural, pero que está formulada en una composición con una afinidad por el oxígeno mucho mayor (p. ej., menos de la mitad del P50) en comparación con la sangre completa.

Componente transportador de oxígeno

En las realizaciones preferidas, el transportador de oxígeno (es decir, el componente transportador de oxígeno) es un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina, o HBOC. La hemoglobina puede ser natural (inalterada); modificada posteriormente por una reacción química tal como la reticulación intra- o intermolecular, la polimerización o la adición de grupos químicos (p. ej., óxidos de polialquileno u otros aductos); o puede ser modificada genéticamente. Los genes de alfa y beta-globina humana se han clonado y secuenciado. Liebhaber, et al., P. N. A. S., 77: 7054- 7058 (1980); Marotta, et al., J. Biol. Chem. 353: 5040-5053 (1977) (ADNc con beta-globina). Además, muchas hemoglobinas modificadas producidas por recombinación se han producido ahora utilizando mutagénesis dirigida al sitio, aunque estas variedades de hemoglobinas “mutantes” se describieron con afinidades por el oxígeno elevadas. Véase, p. ej., Nagai, et al., P. N. A. S., 82: 7252- 7255 (1985).

Los HBOC que se utilizan en la práctica de la presente invención, tienen afinidades por el oxígeno mayores que la sangre completa normal (procedentes de la misma fuente animal que la del paciente, que puede no ser necesariamente un ser humano), que está también expresada como un P50 inferior al de la sangre completa. La sangre completa se considera generalmente que tiene una P50 aproximadamente de 28 Torr. En una realización, los HBOC de la presente invención, tienen un P50 menor que la mitad que el de la sangre completa, lo que se considera que es una “afinidad por el oxígeno elevada”. Dichos HBOC con afinidad por el oxígeno elevada pueden tener una P50 de 4 a 15, tal como 10, 7, etc.

La presente invención, no está limitada por la fuente de hemoglobina. Por ejemplo la hemoglobina puede proceder de animales y de seres humanos. Las fuentes preferidas de hemoglobina para determinadas aplicaciones son seres humanos, vacas y cerdos, así como fuentes de animales distintos de mamíferos, tales como anélidos, reptiles, etc. Además, la hemoglobina puede ser producida por otros métodos, incluyendo las síntesis química y técnicas recombinantes. La hemoglobina puede añadirse a la composición del producto sanguíneo en forma libre, o puede encapsularse en una vesícula, tal como una partícula sintética, microesfera o liposoma. Los componentes preferidos transportadores de oxígeno de la presente invención deberían estar exentos de estroma y exentos de endotoxina. Ejemplos representativos de componentes transportadores de oxígeno se dan a conocer en numerosas Patentes de Estados Unidos publicadas, incluyendo la Pat. de EE.UU. nº 4.857.636 de Hsia; la Pat. de EE. UU. nº 4.600.531 de Walder, la Pat. de EE.UU nº 4.061.736 de Morris et al.; la Pat. de EE.UU nº 3.925.344 de Mazur; la Pat. de EE.UU nº 4.529.719 de Tye; la Pat. de EE.UU nº 4.473.496 de Scannon; la Pat. de EE.UU nº 4.584.130 de Bocci et al.; la Pat. de EE.UU nº 5.250.665 de Kluger et al.; la Pat. de EE.UU nº 5.028.588 de Hoffman et al., la Pat. de EE.UU nº 4.826.811 y la Pat. de EE.UU nº 5.194.590 de Sehgal et al.

Además de las fuentes de hemoglobina mencionadas anteriormente, se ha descubierto recientemente que la hemoglobina de caballo puede presentar determinadas ventajas como componente transportador de oxígeno en las composiciones de la presente invención. Una ventaja es que las cantidades comerciales de sangre de caballo están fácilmente disponibles a partir de las cuales puede purificarse la hemoglobina de caballo. Otra ventaja inesperada es que la hemoglobina de caballo presenta propiedades químicas que pueden aumentar su utilidad en los sustitutos de sangre de la presente invención.

Los informes previos han indicado que la hemoglobina de caballo auto-oxida a la metahemoglobina más rápido que la hemoglobina humana, lo que haría menos deseable como componente del sustituto de sangre. Véase, p. ej., J. G. McLean e I. M.

Lewis, Research in Vet. Sci., 19: 259-262 (1975). Para minimizar la auto-oxidación, McLean y Lewis utilizaron un agente reductor glutatión, después de la lisis de glóbulos rojos. Sin embargo, la hemoglobina que se utiliza para preparar las composiciones de la presente invención, independientemente de si la fuente de hemoglobina es humana

o de caballo, no requieren la utilización de agentes reductores para evitar la auto-oxidación después de la lisis de glóbulos rojos.

Más recientemente, se ha descrito que la hemoglobina de caballo tiene una afinidad por el oxígeno que es diferente de la hemoglobina humana. Véase, p. ej., M. Mellegrini, et al. Eur. J. Biochem., 268: 3313-3320 (2001). Dicha diferencia debería desalentar la selección de la hemoglobina de caballo para preparar sustitutos de sangre que imitan a la hemoglobina humana. Sin embargo, cuando se incorporan en las composiciones de la presente invención, no se observa ninguna diferencia significativa (inferior al 10%) en la afinidad por el oxígeno entre los conjugados que contienen hemoglobina humana y de caballo. Por consiguiente, contrario a estas propiedades aparentemente indeseables, en las composiciones de la presente invención, la hemoglobina de caballo puede ser equivalente a la hemoglobina humana.

Para su utilización en la presente invención, el HBOC tiene una afinidad por el oxígeno que es mayor que la sangre completa, y preferentemente el doble que la sangre completa o alternativamente, más que la de hemoglobina exenta de estroma (SFH) cuando se mide en las mismas condiciones. En la mayoría de los casos, esto significa que el HBOC en el sustituto de sangre tendrá un P50 inferior a 10, y más preferentemente inferior a 7. En estado libre, SFH tiene un P50 de aproximadamente 15 Torr, mientras que el P50 de la sangre completa es de aproximadamente 28 Torr. Se ha sugerido anteriormente que aumentando la afinidad por el oxígeno y por consiguiente reduciendo el P50, puede aumentar el suministro de oxígeno a los tejidos, aunque ello implicaba que un P50 inferior al de SFH no sería aceptable. Véase Winslow, et al., en “Advances in Blood Substitutes” (1977), Birkhauser, Ed., Boston, MA, en pág 167, y Patente de EE.UU. nº 6.054.427. Esta sugerencia contradice la creencia mantenida ampliamente de que las hemoglobinas modificadas para su utilización como sustitutos de sangre tendrían afinidades por el oxígeno menores, y tendrían un P50 que es aproximado al de la sangre completa. Por consiguiente, muchos investigadores han utilizado fosfato de piridoxilo para aumentar el P50 de la SFH desde 10 a aproximadamente 20 a 22, ya que la hemoglobina piridoxilada libera más fácilmente el oxígeno en comparación con SFH.

Existen muchos métodos científicos diferentes para preparar los HBOC con afinidad por el oxígeno elevada (es decir, aquellos con los P50 inferiores a SFH). Por ejemplo, los estudios han identificado los restos de aminoácidos que desempeñan una función en la afinidad por el oxígeno, tal como �-93 cisteína, y así la mutagénesis dirigida al sitio puede ahora transportarse fácilmente para manipular la afinidad por el oxígeno al nivel deseado. Véase la Patente de EE.UU. nº 5.661.124. Muchos otros métodos se discuten en la patente de EE. UU. nº 6.054.427.

Toxicidad asociada a la hemoglobina

La hemoglobina es conocida porque presenta auto-oxidación cuando cambia de manera reversible desde la forma ferrosa (Fe+2) a la férrica (Fe+3) o metahemoglobina. Cuando sucede esto, el oxígeno molecular se disocia de la oxihemoglobina en forma de anión superóxido (O2-). Esto produce además desestabilización del complejo hemo-globina y eventual desnaturalización de las cadenas de globina. Tanto la formación del radical oxígeno como la desnaturalización de la proteína se cree que desempeñan una función en la toxicidad in vivo de los HBOC (Vandegriff, K. D., Blood Substitutes, Physiological Basis of Efficacy, págs. 105130, Winslow et al., Ed., Birkhauser, Boston, MA (1995)).

En la mayoría de los HBOC existe una correlación negativa entre la afinidad por oxígeno y la oxidación de la hemoglobina, es decir, cuanto mayor es la afinidad por el oxígeno, menor es la velocidad de auto-oxidación. Sin embargo, los efectos de modificaciones diferentes de la hemoglobina sobre la afinidad por el oxígeno y la velocidad de auto-oxoidación no son siempre predecibles. Además, el equilibrio óptimo entre la afinidad por el oxígeno y la velocidad de auto-oxoidación no está bien comprendido.

En una realización, las composiciones de la presente invención contienen conjugados de óxido de polialquileno-Hb, tal como los conjugados de polietilenglicol-Hb que presentan velocidades muy bajas de auto-oxidación a temperatura ambiente. Cuando se mide una velocidad de auto-oxidación, este valor debería ser tan bajo como fuera posible (es decir, 0,2% por hora de hemoglobina total, más preferentemente 0,1% por hora de hemoglobina total, a temperatura ambiente durante por lo menos 3 horas, y más preferentemente por lo menos 10 horas). De este modo, los HBOC ilustrativos de la presente invención permanecen estables durante la administración y/o el almacenamiento a temperatura ambiente.

Modificaciones del componente transportador de oxígeno

En una realización ilustrativa, el componente transportador de oxígeno es la hemoglobina modificada con óxido de polialquileno (PAO). Los PAO adecuados comprenden, entre otros, óxido de polietileno ((CH2CH2O)n), óxido de polipropileno ((CH(CH3)CH2O)n) o un copolímero de óxido de polietileno/óxido de polipropileno ((CH2CH2O)n-(CH(CH3)CH2O)n). En el campo médico son bien conocidos otra cadena lineal, ramificada y polímeros sintéticos opcionalmente sustituidos que serían adecuados en la práctica de la presente invención.

Aún más frecuentemente, el grupo químico unido a la hemoglobina es el polietilenglicol (PEG), debido a su aceptación farmacéutica y disponibilidad comercial. Los PEG son polímeros de forma química general H(OCH2CH2)nOH, en la que n es generalmente mayor o igual a 4. Las formulaciones de PEG son seguidas habitualmente por un número que corresponde a su peso molecular medio. Por ejemplo, PEG-200 tiene un peso molecular medio de 200 y puede tener un intervalo de peso molecular de 190 a 210. Los PEG están disponibles en el mercado en numerosas formas diferentes, y en muchos casos vienen preactivados y listos para conjugarse con proteínas.

Un aspecto importante de las realizaciones ilustrativas de la presente invención es que la modificación de la superficie tiene lugar cuando la hemoglobina está en estado oxigenado o “R”. Esto se lleva a cabo fácilmente dejando que la hemoglobina se equilibre con la atmósfera (o, alternativamente, puede realizarse la oxidación activa) antes de la conjugación. Realizando la conjugación con la hemoglobina oxigenada, aumenta la afinidad por el oxígeno de la hemoglobina resultante. Dicha etapa se considera generalmente que está contraindicada, ya que muchos investigadores describen la desoxigenación antes de la conjugación para disminuir la afinidad por el oxígeno. Véase, por ejemplo, la Pat. de EE.UU. nº 5.234.903.

Aunque en muchos aspectos el funcionamiento de las hemoglobinas modificadas por PAO es independiente del enlace entre la hemoglobina y el modificador (p. ej., PEG), se cree que el tipo de enlazadores tales como los sustituyentes del enlazador C1 a C6, alifático o aromático, insaturado, más rígido, pueden cambiar la preparación y/o las características de los conjugados cuando se compara con los que tienen diferentes enlaces, tales como los modos de acoplamiento más deformables cuando se compara con los enlazadores rígidos recién descritos.

El número de PEG que debe añadirse a la molécula de hemoglobina puede variar, dependiendo del tamaño del PEG. Sin embargo, el tamaño molecular de la hemoglobina modificada resultante debería ser suficientemente grande para impedir que se elimine por los riñones para conseguir la deseada vida media. Blumenstein, et al., determinaron que este tamaño se consigue por encima de un peso molecular de

84.000 Daltons. (Blumenstein, et al., en “Blood Substitutes and Plasma Expanders”, Alan R. Liss, editores, Nueva York, Nueva York, págs. 205-212 (1978)). En la presente, los autores conjugaron la hemoglobina con dextrano de peso molecular variable. Ellos describieron que un conjugado de hemoglobina (con un peso molecular de 64.000 Daltons) y dextrano (con un peso molecular de 20.000 Daltons) “se eliminaba lentamente de la circulación y de manera insignificante por los riñones”, pero aumentando el peso molecular por encima de 84.000 Daltons no se alteraron las curvas de eliminación. Por consiguiente, tal como determinaron Blumenstein, et al.; es preferible que el HBOC tenga un peso molecular de por lo menos 84.000 Daltons.

En una realización de la presente invención, el HBOC es un “MalPEG-Hb”, que representa la hemoglobina a la que se ha conjugado PEG activado con maleimidilo. Dicho MalPEG-Hb puede citarse además mediante la fórmula siguiente:

Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH3)m Fórmula I

en la que Hb se refiere a la hemoglobina tetrámera, S es un grupo tiol en superficie, Y es el enlace covalente de succinimido entre Hb y Mal-PEG, R falta o es un grupo alquilo, amida, carbamato o fenilo (dependiendo de la fuente de materia prima y del procedimiento de síntesis química), [O-CH2-CH2]n son las unidades de oxietileno que forman el eje central del polímero PEG, en la que n define la longitud del polímero (

p. ej., P.M. = 5000) y O-CH3 es el grupo metoxi terminal.

Formulación

Los HBOC de la presente invención se formulan mezclando el HBOC y otros excipientes opcionales con una solución acuosa adecuada o “diluyente” (es decir, el que es farmacéuticamente aceptable para inyección intravenosa). Aunque la concentración del transportador de oxígeno en el diluyente puede variar según la aplicación, y en particular se basa en la dilución esperada después de la administración, en las realizaciones preferidas, a causa de las demás propiedades de las composiciones de la presente invención que proporcionan el aumento del suministro de oxígeno y efectos terapéuticos, es normalmente innecesario para la concentración de hemoglobina en un HBOC que sea aproximadamente 6 g/dl, y puede ser entre 0,1 y 4 g/dl.

Los diluyentes adecuados pueden incluir además, entre otros, proteínas, glucoproteínas, polisacáridos y otros coloides. No se pretende que estas realizaciones se limiten a ningún diluyente específico. Así, se pretende que el diluyente comprenda soluciones acuosas de albúmina exentas de células, otros coloides u otros componentes que no transportan oxígeno. En algunas realizaciones, la solución acuosa puede tener una viscosidad de por lo menos 2,5 cP. En otras realizaciones, la viscosidad de la solución acuosa está comprendida entre 2,5 y 4 cP.

La administración de las composiciones descritas en la presente, pueden producirse en cualquier momento, “a propósito de la intervención quirúrgica”, incluyendo tanto como un día antes, durante o un día después de la intervención quirúrgica.

Aplicaciones clínicas

La presente invención se refiere a los HBOC, tales como los conjugados de hemoglobina modificados con PAO que pueden presentar menos cooperativismo que la hemoglobina natural que están formulados en composiciones con P50 menores que la sangre completa, lo que en algunas realizaciones son menores de la mitad de P50 de la sangre completa. Dichas composiciones son útiles para aumentar la estabilidad hemodinámica en pacientes normovolémicos, que se someten a intervención quirúrgica. Pueden administrarse utilizando los mismos parámetros de administración que son bien conocidos en la técnica para expansores de plasma, aumentadores de volumen y similares. La estabilidad hemodinámica puede controlarse antes, durante o después de la intervención quirúrgica, o cualquier combinación de los mismos. Así, el aumento de estabilidad hemodinámica no se limita necesariamente a la medición de las propiedades hemodinámicas del paciente sólo durante el propio procedimiento quirúrgico y puede observarse en cualquier momento después de la administración.

La población de pacientes que puede beneficiarse de la práctica del procedimiento de la presente invención es “pacientes normovolémicos que se someten a intervención quirúrgica”. Así, en una realización, el presente método de la invención se refiere a la administración de las composiciones a pacientes que han experimentado extracción de sangre durante un tratamiento de hemodilución normovolémica aguda (ANH). Éste se basa en el descubrimiento de que los pacientes que reciben estas composiciones a propósito de un procedimiento quirúrgico es menos probable que necesiten una transfusión de sangre durante o después de la intervención quirúrgica. Por consiguiente, los procedimientos de la presente invención son, en un aspecto, una alternativa a la ANH.

En otro aspecto, el presente método de la invención puede además producir el beneficio indirecto de un paciente normovolémico que está siendo sometido a intervención quirúrgica que requiere menos administración de vasopresores durante la intervención quirúrgica para aumentar la presión sanguínea, porque su presión sanguínea está estabilizada eficazmente durante la intervención quirúrgica debido a la administración profiláctica del HBOC a propósito de la intervención quirúrgica.

EJEMPLOS

Una versión similar de los tres ejemplos siguientes se da a conocer en la Solicitud de Patente de EE.UU. nº 2003/0162693, que se publicó en 28 de agosto de 2003. Como en todos los ejemplos, se utiliza MalPEG-Hb como modelo de HBOC. La producción y disponibilidad de otros HBOC son bien conocidos en la bibliografía científica, con todo la capacidad para realizar pruebas clínicas en pacientes humanos está regulada minuciosamente y es imposible de realizar utilizando múltiples formas de HBOC. Así, basándose en las enseñanzas presentadas en la presente memoria sería bien entendido por un experto en la materia que el alcance de la presente invención no se limita a la utilización de MalPEG-Hb, y los HBOC con similares características

(p. ej., una afinidad por el oxígeno mayor que la hemoglobina natural, y en particular la hemoglobina modificada por PAO) sería también adecuado para la utilización.

Ejemplo 1 Producción de hemoglobina exenta de estroma

Etapa 1: Adquisición de glóbulos rojos caducados

Se adquirieron concentrados de glóbulos rojos caducados en un provedor comercial, tal como, el Banco de Sangre de San Diego o el American Red Cross. Preferiblemente, el material caducado se recibe no más de 45 días a partir del tiempo de la extracción. Los concentrados de RBC (pRBC) se almacenan a 4 ± 2ºC hasta el tratamiento posterior (1 a 7 días). En todas las unidades se identificó la infección vírica y se sometieron a análisis del ácido nucleico antes de su uso.

Etapa 2: Mezcla de la sangre caducada

Se mezclan los concentrados de glóbulos rojos en un recipiente esterilizado en un medio limpio. Se anota el volumen de concentrados de glóbulos rojos, y se determina la concentración de hemoglobina utilizando un co-oxímetro disponible en el mercado u otro procedimiento reconocido en la técnica.

Etapa 3: Leucocitopenia

Se realiza la leucocitopenia (es decir, la eliminación de los glóbulos blancos) utilizando filtración en membrana. Se hacen recuentos inicial y final de leucocitos para controlar la eficacia de este proceso.

Etapa 4: Separación de células y lavado de células

Se lavan los glóbulos rojos con seis volúmenes de cloruro sódico al 0,9%. El proceso se lleva a cabo a 4 ± 2ºC. El lavado de las células se analiza para comprobar la eliminación de los componentes del plasma por un análisis espectrofotométrico de albúmina.

Etapa 5: Lisis de glóbulos rojos y eliminación del residuo celular

Se lisan los glóbulos rojos lavados al menos 4 horas o durante la noche a 4 ± 2ºC en agitación utilizando 6 volúmenes de agua. Se procesa el lisado en frío para purificar la hemoglobina. Esto se consigue tratando el lisado a través de una membrana de 0,16 �m. La hemoglobina purificada se recoge en un vaso despirogenado esterilizado. Todas las etapas en este proceso se realizan a 4 ± 2ºC.

Etapa 6: Eliminación vírica La eliminación vírica se lleva a cabo por ultrafiltración a 4 ± 2ºC.

Etapa 7: Concentración e intercambio de disolvente

La hemoglobina purificada procedente del lisado y ultrafiltración se intercambia en lactato de Ringer (LR) o solución salina tamponada con fosfato (PBS, pH 7,4) utilizando una membrana 101D. La hemoglobina se concentra a continuación utilizando la misma membrana hasta una concentración final de 1,1–1,5 mM (en tetrámero). Se utilizan 10 a 12 volúmenes de LR o PBS para el intercambio de disolvente. Este proceso se lleva a cabo a 4 ± 2ºC. El pH de la solución preparada en LR se ajusta a 7,0-7,6.

Etapa 8: Filtración estéril

Hemoglobina en PBS o Lactato de Ringer (LR) se filtra estéril a través de una cápsula con filtro desechable de 0,45 o 0,2 �m y se almacena a 4 ± 2ºC antes de realizar la reacción de modificación química.

En la técnica son bien conocidos otros métodos de purificación de la hemoglobina. Además, la utilización de un agente reductor (p. ej., glutatión u otro agente reductor que contenga tiol) para prevenir la auto-oxoidación después de la lisis celular normalmente es innecesaria.

Ejemplo 2 Modificación de hemoglobina exenta de estroma

Etapa 1: Tiolación

La tiolación se lleva a cabo utilizando un exceso molar de 10 veces de iminotiolano sobre la hemoglobina durante 4 horas a 4 ± 2ºC con agitación continua.

Condiciones de reacción:

imagen1 Hemoglobina 1 mM (tetrámero) en LR (pH 7,0-7,5) o PBS ( pH 7,4)

imagen1 iminotiolano 10 mM en LR (pH 7,0-7,5) o PBS ( pH 7,4)

La relación de SFH:iminotiolano 1:10 y la duración de la reacción se utilizaron para maximizar el número de grupos de tiol PEGilados y para minimizar la heterogeneidad del producto.

Etapa 2: PEGilación de hemoglobina tiolada

La hemoglobina tiolada se PEGila utilizando un exceso molar de 20 veces de Mal-PEG (con un enlazador alquilo o fenilo) basándose en la concentración de partida de hemoglobina tetrámera. La hemoglobina en primer lugar se deja que se equilibre con la atmósfera para oxigenar la hemoglobina. La reacción tienen lugar durante 2 horas a 4 ± 2ºC con agitación continua.

Condiciones de reacción:

imagen1 Hemoglobina tiolada 1 mM en LR o PBS ( pH 7,4)

imagen1 Mal-PEG-Hb 20 mM en LR o PBS ( pH 7,4)

Etapa 3: Eliminación de los reactivos sin reaccionar

La Hb-PEGilada se trata a través de una membrana de 70 kD para eliminar los reactivos o la hemoglobina sin reaccionar en exceso. Se lleva a cabo una filtración en 20 volúmenes para asegurar la eliminación de los reactivos sin reaccionar, lo cual se controla por cromatografía con exclusión de tamaño a 540 nm y 280 nm. La concentración de proteínas se diluye hasta 4 g/dl. El pH se ajusta a 7,3 ± 0,3 utilizando NaOH 1 N.

Etapa 4: Filtración estéril

El producto MalPEG-Hb final se filtra estéril utilizando una cápsula de un solo uso esterilizada de 0,2 �m y se recoge en un vaso despirogenado esterilizado a 4 ± 2ºC.

Etapa 5: Formulación de MalPEG-Hb La Hb PEGilada se diluye hasta 4 g/dl LR, pH ajustado a 7,4 ± 0,2.

Etapa 6: Relleno estéril

La composición sustituta de la sangre final se filtra estéril (0, 2 �m) y se divide en alícuotas por peso en viales de vidrio esterilizados y se cierra con tapones de goma esterilizados con sellos embutidos en una campana extractora con flujo laminar y se almacenan a – 80ºC hasta su utilización.

Ejemplo 3 Análisis fisicoquímico de MalPEG-Hb

Metodología para análisis fisicoquímico

La homogeneidad y el tamaño molecular del sustituto de sangre MalPEG-Hb se caracterizan por Cromatografía Líquida (CL). Se utiliza CL analítica para evaluar la homogeneidad de la hemoglobina PEGilada y el grado de eliminación de Mal-PEG sin reaccionar. La absorbancia a 540 nm se utiliza para evaluar la hemoglobina y resuelve la hemoglobina PEGilada de la hemoglobina sin reaccionar por la posición del pico. Se utiliza la absorbancia a 280 nm para resolver la hemoglobina PEGilada de la Mal-PEG libre, que se absorbe en el espectro ultravioleta (UV) debido a las estructuras anulares en MalPEG.

Se recogen los espectros ópticos utilizando espectrofotómetro con conjunto de diodos de exploración rápida (Milton Roy 2000 o Hewlett Packard modelo 8453) en las bandas de Soret y visible para análisis de concentración de hemoglobina y porcentaje de metahemoglobina por análisis de multicomponentes (Vandegriff K. D., y R. E.,

5 Shrager. Evaluation of oxygen equilibrium binding to hemoglobin by rapid-scanning spectrophotometry and singular value decomposition. Meth. Enzymol. 232: 460-485 (1994)).

La concentración de MalPEG-Hb y el porcentaje de metahemoglobina se determinan utilizando un co-oxímetro. Se determina la viscosidad utilizando un

10 reómetro. La presión osmótica del coloide se determina utilizando un osmómetro para coloides. Los parámetros de fijación de oxígeno se determinan a partir de las curvas de equilibrio de oxígeno. Las especificaciones ilustrativas para la composición sustituta de la sangre se presentan en la Tabla 1 a continuación:

15

Tabla 1

Prueba Especificación

Concentración de hemoglobina (g/dl) Metahemoglobina (%) pH Conductividad (mS/cm) Endotoxina (EU/ml) Tiempo de retención de FPLC (min) Amplitud del pico FPLC a media altura (min) Viscosidad (cPs) POC (mm Hg) P50 (Torr) Índice de Hill (a P50) Esterilidad

Número de zonas PEGiladas en MalPEG-Hb

4,2 ± 0,2 <10 7,4 ± 0,4 12 ±4 <0,5 43 ±3 6±2 2,5 ± 1,0 50 ±20 6±2 1,2 ± 0,5 Pasa

Para la modificación de la superficie, el número “m” en la Fórmula I es el 20 parámetro que define el número de polímeros PEG unidos a la superficie de la hemoglobina.

Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[O-CH2-CH2]n-O-CH3)m Fórmula I

Para determinar este número, se utiliza un análisis colorimétrico con ditiopiridina (Ampulski R., V. Ayers y S. Morell. Determination of the reactive sulfhydryl 5 groups in heme proteins with 4,4’-dipyridinesdisulfide. Biochem. Biophys. Acta., 163-169, 1969) para medir el número de grupos tiol disponibles en la superficie del tetrámero Hb antes y después de la tiolación y luego otra vez después de la PEGilación-Hb. La hemoglobina humana contiene 2 grupos tiol reactivos intrínsecos en los restos �93Cys, que se confirma por la reacción con ditiopiridina. Después de la

10 tiolación de SFH, a una relación de SFH:inminotiolano 1:10, el número de grupos tiol reactivos aumenta de 2 a 6 tioles referido a la reacción de ditiopiridina. Después de la reacción de PEGilación, el número de grupos tiol reactivos disminuye a 1,3. Esto indica que existen 4 a 5 zonas PEGiladas en MalPEG-Hb.

15 Análisis de cromatografía con exclusión por tamaño de MalPEG-Hb frente a SFH La FPLC se lleva a cabo para el análisis del producto final MalPEG-Hb. Los cromatogramas típicos se presentan en la Figura 1 para MalPEG-Hb en comparación con SFH sin modificar. El tiempo de retención para SFH es de aproximadamente 57 min. El tiempo de retención para MalPEG-Hb es de aproximadamente 44 min.

20 Características físicas y químicas de MalPEG-Hb Las propiedades físicas de MalPEG-Hb comparadas con la sangre y la hemoglobina humana sin modificar (SFH) se presentan a continuación en la Tabla 2.

25 Tabla 2

Sangre

SFH MalPEG-Hb

P50 (Torr)

28 15 5

N50 (índice de Hill)

2,9 2,9 1,2

Efecto Bor (� log P50/�pH)

-- -0,46 -0,20

Viscosidad (cPs)

4,0 0,9 2,5

POC (mm Hg)1

27 16 50

P.M. (kD)2

N/A 65 90

Radio Molecular (nm) 4000 3,22 9

1Determinada a 15 g/dl para la sangre completa y aproximadamente 4 g/dl para soluciones de hemoglobina. 2Determinada por mediciones por POC y FPLC

Afinidad por el oxígeno

5 Se midieron curvas de fijación de equilibrio hemoglobina-oxígeno durante el consumo enzimático del oxígeno (Anal. Biochem. 256: 107-116, 1998). MalPEG-Hb presenta una afinidad por el oxígeno elevada (P50 = 5 mm Hg) y bajo cooperativismo (n50 = 1,0-1,4). La Figura 2 presenta curvas representativas que comparan la hemoglobina sin estroma (SFH), MalPEG-Hb y sangre.

10

Viscosidad

Esta propiedad de la solución de MalPEG-Hb se debe a la fuerte interacción entre las cadenas de polietilenglicol y las moléculas de agua del disolvente. Esto se cree que es un atributo importante para un sustituto de sangre MalPEG-Hb por dos

15 razones: 1) la viscosidad mayor disminuye la constante de difusión tanto de la molécula de MalPEG-Hb como de las moléculas del ligando gaseoso que se difunden a través del disolvente, y 2) la viscosidad mayor aumenta la tensión de cizallamiento de la solución fluyendo contra la pared endotelial, produciendo la liberación de vasodilatadores para contrarrestar la vasoconstricción. Como se muestra en la Tabla

20 2, la viscosidad de la solución de MalPEG-Hb es 2,5 cPs.

Presión osmótica coloidal (POC) Se ha medido la POC de las soluciones de hemoglobina que contienen hemoglobina no modificada, intra-e intermolecularmente reticulada, o conjugada en

25 superficie con PEG para determinar sus propiedades de solución macromeolecular (Vandegriff, K. D., R. J. Rohlfs y R. M. Wislow. Colloid osmotic effects of hemoglobinbased oxygen carriers. En Wislow, R. M., K. D. Vandegriff y M. Intaglia, ediciones., Advances in Blood Substitutes Industrial Opportunities and Medical Challenges, Boston, Birkhauser, págs..207-232 (1997)). Las hemoglobinas tetrámeras presentan

30 un comportamiento de la solución casi ideal; mientras que las hemoglobinas conjugadas con PEG tienen actividad osmótica coloidal significativamente superior y presentan solución imperfecta (Vandegriff, K. D.,M. Mcarthy, R. J. Rohlfs y R. M. Wislow. Colloid osmotic properties of modified hemoglobins: chemically cross-linked versus polyethylene glicol surface conjugated. Biophys. Chem. 69: 23-30 (1997)).

35 Como se muestra en la Tabla 2, la POC de la solución MalPEG-Hb es 50.

Estabilidad

Se ha determinado la estabilidad de las soluciones de hemoglobina que contienen PEG-hemoglobina examinando la velocidad de auto-oxidación. A temperatura ambiente, la auto-oxidación de MalPEG-Hb aumentó desde aproximadamente 5% de MetHb hasta 5,5% de MetHb en 10 horas. La velocidad de auto-oxidación para MalPEG-Hb por consiguiente fue de 0,05% por hora.

Ejemplo 4 Estabilidad de MalPEG-Hb

El objeto de este estudio fue determinar la estabilidad de MalPEG-Hb durante una simulación de las condiciones de almacenamiento y manipulación ilustrativas. Se evaluó la estabilidad durante tres etapas de manipulación. La etapa I representaba la transferencia del almacenamiento congelado en el medio de producción en las condiciones de temperatura durante el transporte al local clínico (estudio de almacenamiento congelado). La etapa II representaba la descongelación de MalPEG-Hb durante 24 horas a +4ºC y el posterior almacenamiento a +4ºC durante 5 días (estudio refrigerado). La etapa III representaba la descongelación del MalPEG-Hb durante 24 horas a +4ºC y el posterior almacenamiento de MalPEG-Hb a temperatura ambiente durante varios días antes de la administración al paciente (estudio a temperatura ambiente).

Métodos experimentales

Se definió la estabilidad por la velocidad de oxidación del material de ensayo MalPEG-Hb. Se midió el porcentaje de metahemoglobina en la muestra utilizando cooximetría (IL Co-Oxímetro 682, GMI, INC., Ramsey, Minnesota). Se hicieron mediciones por duplicado en cada punto de tiempo según el protocolo.

Se controlaron las temperaturas con termómetro o registradores de gráfico de temperatura. El estudio de almacenamiento congelado se realizó en un intervalo de temperaturas entre -21,0 ± 3,0ºC. El estudio refrigerado se realizó en un intervalo de temperaturas de +4,0 ± 0,2ºC. El estudio a temperatura ambiente se realizó en un intervalo de temperaturas de +21, 0 ± 1,0ºC.

La temperatura, la hemoglobina total y el porcentaje de metahemoglobina se registraron en cada uno de los puntos de tiempo indicados. En los estudios congelado y refrigerado, se tomaron mediciones en el tiempo cero (completamente descongelado), una hora después y a continuación cada 24 horas durante cinco días. En el estudio a temperatura ambiente se tomaron mediciones en el tiempo cero (completamente descongelado) y posteriormente cada hora durante diez horas.

Resultados

MalPEG-Hb no presentó ningún cambio significativo en el porcentaje de metahemoglobina durante los 6 días de almacenamiento a -20ºC. Asimismo, MalPEG-Hb no presentó ningún cambio apreciable en el porcentaje de metahemoglobina durante cinco días de almacenamiento a +4ºC. Durante el almacenamiento a temperatura ambiente, MalPEG-Hb presentaba menos del 1% de aumento en la metahemoglobina durante un período de diez horas.

Ejemplo 5 Utilización de MalPEG-Hb para favorecer la estabilidad hemodinámica

Se preparó MalPEG-Hb como se describió anteriormente. Una dosis de 0 (Ringer lacteado solo), 200 (“A”), 400 (“B”) o 600 ml (“C”) de MalPEG-Hb, balanceado hasta un volumen total de 100 ml de solución de Ringer lacteada, se administró a pacientes que estaban sometidos a intervención quirúrgica ortopédica programada antes de la inducción con anestesia intradural. Los resultados se representan en la Figura 4. La Figura 5 representa los signos vitales de pacientes que recibieron 600 ml de MalPEG-Hb. Como se muestra, no se observaron elevaciones de la presión sanguínea en comparación con las mediciones de referencia. Por contraste, se observaron aumentos de presión sanguínea detectables pero ligeros en los pacientes que recibieron 200 o 400 ml de MalPEG-Hb.

Se controlaron también episodios hipotensores en pacientes y los resultados se presentan a continuación en la Tabla 3:

Tabla 3

200 ml

400 ml 600 ml Lactato de Ringer

nº de pacientes con hipertensión

0 2 0 2

nº de episodios por paciente

0 2 0 3

nº de intervenciones

0 0 0 2

Como se muestra, los pacientes que reciben MalPEG-Hb presentaban menos episodios hipotensores que los pacientes que recibieron el placebo.

Ejemplo 6 Estudio clínico ampliado de la utilización de MalPEG-Hb para mejorar la estabilidad hemodinámica durante la intervención quirúrgica

Se ha ensayado anteriormente MalPEG-Hb en la prueba en Fase I en voluntarios sanos y no produjo ningún episodio adverso significativo, y fue también coherente con los estudios no clínicos que presentan vasoactividad reducida en comparación con Hb sin estroma. La inestabilidad hemodinámica (p. ej., episodios cardiovasculares) medida como episodios hipotensores, particularmente en pacientes mayores con enfermedad cardiovascular, son una preocupación para dichos pacientes que están siendo sometidos a intervención quirúrgica. Considerable bibliografía apoya la hipótesis de que la hipotensión arterial produce isquemia en el cerebro, corazón y riñones lo que podría conducir a morbidez posoperatoria significativa. El desarrollo de transportadores de oxígeno basados en Hb (HBOC) para proteger dichos pacientes quirúrgicos de los efectos de estos episodios adversos es el centro de este experimento.

Un estudio al azar, doble a ciegas de MalPEG-Hb (250 o 500 ml) y un grupo de referencia que recibió acetato de Ringer solo, se realizó en 6 hospitales diferentes en grupos de 30 pacientes cada uno. Los pacientes que dieron su consentimiento se sometieron a intervención quirúrgica agresiva grave, principalmente sustitución de la cadera. La administración se produjo antes de la inducción anestésica intradural. La evaluación de la seguridad incluyó signos vitales y control de Holter (desde la infusión hasta 24 horas), así como análisis clínicos, coagulación, hematología y balance de fluidos. La frecuencia de la hipotensión arterial, definida cuantitativamente como la presión sistólica inferior a 90 mm Hg o 75% del valor de referencia, fue el punto final de la eficacia primaria. Otra medida de eficacia fue la necesidad de la intervención farmacológica para estabilizar la presión sanguínea y el balance de fluidos como se describe con más detalle a continuación.

31

Población en estudio

La mayor parte de los pacientes estudiados en este experimento se sometieron a intervenciones quirúrgicas que eran programadas, artroplastias primarias de cadera en pacientes con osteoartritis. Sin embargo, se estudiaron también numerosas fracturas agudas, así como unas pocas artroplastias secundarias. Los criterios de inclusión y exclusión se presentan en la Tabla 4.

Tabla 4

Criterios de inclusión

Criterios de exclusión

Varones o hembras adultos (quirúrgicamente estériles o posmenopáusicos) ASA clase I-III pacientes con edad � 50 años, que reciben anestesia intradural para la intervención quirúrgica de fractura de cadera aguda (fijación interna o artroplastia) o intervención quirúrgica programada de artroplastia de cadera.

Cualquier afección aguda o crónica que limite la capacidad del paciente para completar el estudio o ponga en riesgo la seguridad del paciente a juicio del investigador.

Estables para la intervención quirúrgica y anestesia determinado por examen físico, estado en el laboratorio, signos vitales y ECG a juicio del investigador.

Pacientes con manifestaciones clínicas de trastorno metabólico, cardiovascular o psiquiátrico incontrolado.

Se ha dado información por escrito y verbal y ha tenido

Presión sanguínea > 180 mm Hg (sistólica) o > 105 mm Hg

oportunidad de hacer preguntas acerca del estudio. Los

(diastólica) medida en posición supina en la identificación

pacientes deben firmar una forma de consentimiento

de pacientes con antecedentes recientes de infarto de

informado (véase el Apéndice II) para el estudio, que ha

miocardio o ictus (en 6 meses).

sido estudiado y aprobado por el Comité de Ética

independiente (IEC).

Pacientes con antecedentes recientes de infarto de miocardio o ictus (en 6 meses).

Pacientes con antecedentes recientes de infarto de miocardio o ictus (en 6 meses).

Dependencia conocida al alcohol o a otras drogas.

Pacientes que han recibido algunos otros fármacos para investigación 30 días antes de la administración del fármaco en estudio.

Paciente en tratamiento bucal anticoagulante con la excepción de ácido acetilsalicílico a baja dosis (<200 mg/día).

Antecedentes o antecedentes familiares de hemoglobinopatía.

Antecedentes de coagulopatía.

Personal profesional o auxiliar implicado en este estudio.

Aleatorización y ensayo a ciegas

El tratamiento asignado a cada paciente numerado se determinó según una lista con código de aleatorización sucesivamente numerado, generada por ordenador. Los grupos de tratamiento se designaron: A, 250 ml de MalPEG-Hb; 500 ml de MalPEG-Hb; (representando A y B los “grupos de ensayo”) y C, acetato de Ringer (que representa el “grupo con placebo”), ajustándose todos los volúmenes de administración para cada grupo al mismo volumen de administración total antes de la administración. Como MalPEG-Hb es de color rojo y el placebo es transparente, se emprendieron esfuerzos también para impedir que el paciente y al personal “cegado” vieran la solución que se infunde, es decir, se realizó el estudio del modo clásico “doble a ciegas”.

Materiales

Se preparó MalPEG-Hb esencialmente como se describió anteriormente en los Ejemplos 1 a 3 con algunas variaciones menores. Aproximadamente 24 horas antes de la administración, se sacaron del congelador (-20ºC) botellas de MalPEG-Hb y se colocaron a temperatura ambiente para su descongelación gradual. Se adquirió acetato de Ringer en un proveedor comercial (Fressenius Kabi AB, Uppsala, Suecia).

Administración

Se administró MalPEG-Hb o placebo por una línes intravenosa creada mediante una bomba de infusión volumétrica calibrada. Se infundió un volumen total de 100 ml de MalPEG-Hb y/o de acetato de Ringer para la prueba a ciegas antes de que se indujera la anestesia, lo que tuvo lugar 30 minutos después del fin de la infusión.

La infusión de la composición de ensayo o de la solución placebo no influyó en el cuidado normal del paciente. Los pacientes que reciben solución de ensayo o de placebo también recibieron algunos tratamientos adicionales considerados necesarios para el bienestar del paciente. Todos los procedimientos y tratamientos médicos se llevaron a cabo según las atenciones clínicas normales. La administración de toda la medicación continua en curso en el comienzo del estudio y la medicación simultánea administrada durante el estudio se anotaron y se consideraron en la interpretación de los resultados.

Mediciones y variables farmacocinéticas

La persistencia intravascular de MalPEG-Hb y la estabilidad intravascular del producto se determinaron en la hemoglobina del plasma y las concentraciones de metahemoglobina antes de la infusión, al final de la infusión, 6 horas después de la infusión, los días 1, 2 y 3 y 7 a 10 días después de la infusión. Los resultados de estos estudios no fueron extraordinarios y no se publican en la presente memoria.

Extracción de muestras y análisis

Se extrajeron muestras de sangre utilizando los métodos de rutina para minimizar la hemólisis durante en muestreo y se procesaron para asegurar la separación completa de las muestras de sangre del plasma. Como la fracción de plasma de las muestras de sangre que contienen MalPEG-Hb era roja, fue necesario que el tratamiento de las muestras fuera realizado por un técnico “no a ciegas”. El análisis de la muestra se realizó antes del “quebrantamiento del código”. Así, el laboratorio que lleva a cabo el análisis lo hizo a ciegas de manera apropiada.

Mediciones de eficacia y variables

Se estudió la eficacia de MalPEG-Hb como HBOC ilustrativa para aumentar la estabilidad hemodinámica utilizando los siguientes puntos finales:

A. Episodios hipotensores

El número de episodios hipotensores tras la infusión de MalPEG-Hb/Placebo se definió como una presión sanguínea sistólica (SBP) <90 mm Hg o una caída �25% en SPB en comparación con la infusión previa. Cada registro de una SPB que completa la definición se contó como un episodio hipotensor.

B. Aporte y emisión de fluido total (balance de fluidos)

Se hicieron mediciones el día de la intervención quirúrgica (a partir del inicio de la infusión hasta 24 horas después del inicio de la infusión) y los días 1, 2 y 3 después de la operación. El aporte incluía: fluidos infundidos (MalPEG-Hb/Placebo, coloides y cristaloides), transfusiones de sangre y aporte bucal de fluidos. La emisión incluía: orina y la pérdida de sangre estimada durante la intervención quirúrgica.

Se registró el tipo y la cantidad de fluidos intravenosos (datos no mostrados). La cantidad total de infusiones cristaloides y coloides no fueron estadísticamente diferentes entre los tres grupos durante todo el período de hospitalización. Sin embargo, no se produjeron diferencias en el período intraoperativo. El grupo A recibió significativamente menos cristaloides (913 ± 106 ml) en comparación con el grupo B (1299 ± 183 ml) y el grupo C (1281 ± 144 ml) (P<0,05). Además, cuando se incluyó el MalPEG-Hb en la cantidad de coloide administrado, el grupo D recibió significativamente más coloide total (1389 ± 169 ml) en comparación con el grupo A (850 ± 66 ml) o el grupo C (666 ± 69 ml). Tanto las diferencias, B frente a C como A frente a B fueron estadísticamente significativas (P<0,05). No existieron diferencias estadísticamente significativas en la administración de fluido intravenoso cristaloide, coloide o total para el resto del estudio.

C. Trastornos cardíacos

El número y tipo de trastornos cardíacos como medidas de inestabilidad hemodinámica (taquicardia, isquemia, bradicardia y problemas de conducción) fueron evaluados por el cardiólogo a ciegas. Se registraron trastornos del ritmo cardíaco utilizando el control continuo de Holter y ECG.

D. Intervenciones farmacológicas

El número y dosis de intervenciones farmacológicas (p. ej. fármacos para la presión sanguínea, diuréticos) para apoyo cardiovascular se registraron también desde la inducción anestésica hasta 12 horas después del comienzo de la infusión.

E. Transfusiones de sangre

Se registraron también las transfusiones de sangre (volumen de concentrado de glóbulos rojos) administradas durante la intervención quirúrgica (desde la inducción anestésica hasta el final de la intervención quirúrgica y después).

F. Utilización de oxígeno

La duración de la administración adicional de oxígeno después de la operación se registró el día de la intervención quirúrgica y durante unos pocos días después.

Resultados

La inestabilidad hipotensora registrada como episodios desfavorables, tal como los episodios hipotensores y la necesidad de la administración de vasotensores, se muestran en la Tabla 5 a continuación. Los resultados obtenidos para el porcentaje de episodios hipotensores se representan también en la Figura 6.

Tabla 5

Episodios

Grupo A (n = 29) Grupo B (n = 30) Grupo C (n = 31)

Episodios hipotensores

15 15 27

% de pacientes con episodios hipotensores

52 50 87

nº de pacientes tratados con vasotensores

5 4 10

% de pacientes tratados con vasotensores

17 13 32

**************************

5

Los ejemplos publicados anteriormente se proporcionan para dar a los expertos en la materia una exposición completa y una descripción de cómo preparar y utilizar las realizaciones preferidas de las composiciones, y no se pretende limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Las modificaciones de los modos de

10 llevar a cabo la invención descritos anteriormente que son obvias para los expertos en la materia se pretende que estén dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes, citadas en esta memoria están incorporadas en la misma como referencia como si cada publicación, patente o solicitud de patente estuviese indicada específica e individualmente para ser

15 incorporada en la presente memoria como referencia.

Claims (21)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) con una afinidad por el oxígeno superior a la de la sangre completa para su utilización en un método de aumento de la estabilidad hemodinámica de un paciente normovolémico sometido a intervención quirúrgica.

2. 2.

   Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) con una afinidad por el oxígeno superior a la de la sangre completa según la reivindicación 1, para su utilización en un método para aumentar la estabilidad hemodinámica de un paciente normovolémico que está siendo sometido a intervención quirúrgica que comprende:

   a) administrar una composición que contiene un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) a un paciente en relación con la intervención quirúrgica; y

   b) controlar la estabilidad hemodinámica del paciente.

3. 3.

   Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según la reivindicación 2, en el que la composición se administra antes de la intervención quirúrgica.

4. 4.

   Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según la reivindicación 2, en el que la composición se administra durante la intervención quirúrgica.

5. 5.

   Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según la reivindicación 2, en el que la composición se administra después de la intervención quirúrgica.

6. 6.

   Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según la reivindicación 2, en el que la etapa b) se lleva a cabo antes de la intervención quirúrgica.

7. 7.

   Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según la reivindicación 2, en el que la etapa b) se lleva a cabo durante la intervención quirúrgica.

8. 8.

   Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según la reivindicación 2, en el que la etapa b) se lleva a cabo después de la intervención quirúrgica.

9. 9.

   Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según la reivindicación 2, en el que la etapa b) el control de la presión sanguínea del paciente.

10. 10.

    Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la estabilización hemodinámica se caracteriza porque el paciente mantiene una presión sistólica por encima de 90 mm Hg.

11. 11.

    Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el método comprende además el aumento de la descarga de oxígeno como medida preventiva para impedir la inestabilidad hemodinámica asociada a la intervención quirúrgica.

12. 12.

    Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el HBOC comprende además una hemoglobina natural modificada con óxido de polialquileno.

13. 13.

    Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el HBOC comprende además una hemoglobina sintética modificada con óxido de polialquileno.

14. 14.

    Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el HBOC comprende además hemoglobina recombinante.

15. 15.

    Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el HBOC comprende además hemoglobina humana.

16. 16.

    Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el HBOC comprende además hemoglobina humana de un animal no humano.

17. 17.

    Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el HBOC tiene una afinidad por el oxígeno mayor que el doble que la sangre completa.

18. 18.

    Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el HBOC tiene un P50 entre 4 y 15.

19. 19.

    Un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC) para su utilización en un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que el HBOC comprende además hemoglobina que ha sido modificada por el enlace covalente de polietilenglicol activado con maleimidilo.

20. 20.

    Utilización de un transportador de oxígeno basado en la hemoglobina (HBOC), que tiene una afinidad por el oxígeno mayor que la sangre completa, en la preparación de un medicamento para aumentar la estabilidad hemodinámica de un paciente normovolémico que está siendo sometido a intervención quirúrgica.

21. 21.

    Utilización según la reivindicación 20, en el que el medicamento además aumenta la descarga de oxígeno como medida preventiva para impedir la inestabilidad hemodinámica asociada a la intervención quirúrgica.