MX2007002187A - Metodos para mejorar la estabilidad hemodinamica utilizando composiciones que contienen oxigeno. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos para mejorar la estabilidad hemodinamica de un individuo que experimenta cirugia mediante la administracion de una composicion que comprende un vehiculo de oxigeno a base de hemoglobina. En una modalidad, la presente invencion se refiere al uso de hemoglobinas modificadas con oxido de polialquileno con cooperatividad reducida y una alta afinidad al oxigeno para mejorar la descarga de oxigeno como una medida preventiva para evitar las complicaciones relacionadas a la estabilidad hemodinamica durante la cirugia.

Description

MÉTODOS PARA MEJORAR LA ESTABILIDAD HEMODINAMICA UTILIZANDO COMPOSICIONES QUE CONTIENEN OXÍGENO CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a métodos para mejorar la estabilidad hemodinámica de un individuo que experimenta cirugía mediante la administración de una composición que comprende un vehículo de oxígeno a base de hemoglobina. En una modalidad, la presente invención se refiere al uso de hemoglobinas modificadas con óxido de polialquileno con cooperatividad reducida y una alta afinidad al oxígeno para mejorar la descarga de oxígeno como una medida preventiva para evitar las complicaciones relacionadas a la estabilidad hemodinámica durante la cirugía. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La sangre es el medio para administrar oxígeno y nutrientes y retirar los productos de desecho de los tejidos. La sangre se compone de plasma en el que están suspendidos los glóbulos rojos (RBCs o eritrocitos) , los glóbulos blancos (WBCs) y las plaquetas. Los glóbulos rojos comprenden aproximadamente el 99% de las células en la sangre y su principal función es el transporte de oxígeno a los tejidos y la eliminación del bióxido de carbono de éstos. El ventrículo izquierdo del corazón bombea la sangre a través de las arterias y las arteriolas más pequeñas del sistema circulatorio. Después, la sangre entra a los capilares, en donde ocurre la mayoría del suministro de oxígeno, el intercambio de nutrientes y la extracción de los productos celulares de desecho. (Ver, e.g., A. C. Guyton, "Human Physiology And Mechanisms Of Disease" (Fisiología Humana y Mecanismos de Enfermedad) (3a. Ed. ; W.B. Saunders Co., Filadelfia, Pa) , pp. 228-229 (1982)). Después de esto, la sangre pasa a través de las vénulas y venas en su retorno a la aurícula derecha del corazón. Aunque la sangre que retorna al corazón es pobre en oxígeno comparada con la que es bombeada desde el corazón, cuando se está en reposo, la sangre de retorno aún contiene aproximadamente el 75% del contenido original de oxígeno. La función reversible de oxigenación (i.e., el suministro de oxígeno) de los RBCs se efectúa por la hemoglobina de proteína. En los mamíferos, la hemoglobina tiene un peso molecular (MW) de aproximadamente 64,000 Daltones y está compuesta de aproximadamente 6% de hemo y 94% de globina. En su forma natural, contiene dos pares de sub-unidades (i.e., es un tetrámero), cada una de las cuales contiene un grupo hemo y una cadena polipeptídica de globina. En solución acuosa, la hemoglobina está presente en equilibrio entre las formas tetraméricas (MW 64,000 Daltones) y diméricas (MW 32,000 Daltones). Fuera del RBC, los dímeros se excretan prematuramente por el riñon. (vida media plasmática de aproximadamente 2-4 horas). Junto con la hemoglobina, los RBCs contienen estroma (la membrana del RBC), la cual comprende proteínas, colesterol y fosfolípidos. Debido a la demanda de productos de sangre en hospitales y otros ambientes, se ha dirigido una amplia investigación al desarrollo de sustitutos de sangre. Un "sustituto de sangre" es un producto de sangre que es capaz de llevar y proveer oxígeno a los tejidos. Los portadores de oxígeno basados en hemoglobina (HBOCs) son sustitutos de sangre que contienen hemoglobinas. Los HBOCs tienen varios usos, incluyendo el reemplazo de la sangre perdida durante procedimientos quirúrgicos y después de una hemorragia aguda y por procedimientos de resucitación después de un daño traumático. Esencialmente, los HBOCs se pueden utilizar para cualquier propósito en el que la sangre de banco se administra habitualmente a los pacientes. (Ver, e.g., Patente de E.U. Nos. 4,001,401 de Bonson et al . , y 4,061,736 de Morris et al . ) El desarrollo de HBOCs es especialmente importante, dado el hecho de que el aprovisionamiento actual de sangre humana es limitado. Por esta razón, la sangre humana sólo se utiliza normalmente en circunstancias en las que es médicamente necesaria. Esto usualmente significa que la sangre humana no es apropiada para uso profiláctico, tal como "dopaje con sangre" (i.e. administración de sangre completa para el propósito de mejorar el desempeño al incrementar la capacidad de la sangre para transportar oxígeno) . Consecuentemente, ni el uso de sangre completa ni el uso de los HBOCs para indicaciones profilácticas están difundidos y en la mayoría de los casos se considera que es una práctica un tanto cuestionable. Anteriormente se ha sugerido la administración de HBOCs a pacientes antes de la cirugía, en combinación con la eliminación de sangre autóloga de los pacientes (i.e., hemodilución normovolémica o "ANH") la cual se podría regresar más tarde durante el procedimiento, en caso necesario, o después de la cirugía. Ver, por ejemplo, PCT WO 98/37909. En la presente se considera que tales pacientes no son "normovolémicos" al momento de la cirugía. Sin embargo, este procedimiento no maneja la necesidad de medidas profilácticas para evitar los efectos primarios de deterioro de procedimientos quirúrgicos tales como la estabilidad hemodinámica y sólo maneja los efectos secundarios de la pérdida de sangre asociada con la cirugía. Mejorar la estabilidad hemodinámica durante la cirugía que requiera anestesia general es importante por dos razones fundamentales. Primero, la inestabilidad hemodinámica causada por la pérdida de sangre u otros factores puede ocasionar daño tisular o hasta la muerte. Por ejemplo, la hipotensión hemorrágica y el choque anafiláctico son condiciones ocasionadas por la pérdida significante de sangre que lleva a la reducción en la oxigenación tisular. Para los pacientes con tales condiciones médicas, es deseable y con frecuencia crítico para su sobreviviencia estabilizar su presión sanguínea e incrementar la cantidad de oxígeno que se proporciona a los tejidos corporales por sus sistemas circulatorios . Segundo y más importantemente, la inestabilidad hemodinámica, aún cuando sea menor y transitoria, puede afectar la recuperación post-quirúrgica de un paciente. Esta inestabilidad se puede presentar en cualquier parte del cuerpo y con frecuencia se manifiesta como un "evento hipotensivo", el cual se registra usualmente como una disminución en la presión sanguínea. Tales eventos se pueden presentar como resultado de fluctuaciones de propiedades hemodinámicas localizadas durante la anestesia general, aún cuando no exista pérdida de sangre. Estos eventos pueden causar daño cognitivo y otras complicaciones que exacerban la recuperación posterior a la cirugía. Por ejemplo, los pacientes añosos que experimentan procedimientos quirúrgicos invasivos tales como artroplastía de cadera, se beneficiarían con cualquier tratamiento profiláctico que mejore su estabilidad hemodinámica durante la cirugía. Además, tales pacientes con frecuencia no son candidatos apropiados para ANG y se esperaría que el mejoramiento de su estabilidad hemodinámica redujera su necesidad de transfusiones utilizando sangre de donante. El uso de expansores del plasma y reposición de la volemia para mantener la estabilidad hemodinámica están ampliamente difundidos. Sin embargo, estas soluciones que no proporcionan oxígeno sólo diluyen la capacidad del oxígeno en sangre, aún sin ANH concomitante y, realmente, pueden causar inestabilidad hemodinámica en algunas instancias. Además de los expansores de plasma y reposición de la volemia, las soluciones cristaloides también se han sugerido para su uso en el mantenimiento de la estabilidad hemodinámica. Sin embargo, la administración de estas soluciones puede ocasionar una retensión excesiva de agua y edema, lo cual también puede causar fluctuaciones en las propiedades hemodinámicas. Consecuentemente, existe una necesidad de métodos para mejorar t la estabilidad hemodinámica que puedan provocar eventos hipotensivos transitorios que no disminuyan la capacidad de llevar oxígeno inherente de la sangre. De acuerdo con este objetivo, la presente invención se refiere a un método de mejorar la estabilidad hemodinámica por la administración de composiciones que comprenden portadores de oxígeno basados en hemoglobina tales como hemoglobinas modificadas por óxido de polialquileno especialmente formuladas.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al uso de una composición en el tratamiento de un sujeto normovolémíco que experimenta cirugía para mejorar la estabilidad hemodinámica. En una modalidad, la invención se refiere a un método para mejorar la estabilidad hemodinámica de un sujeto normovolémico que experimenta cirugía, que comprende: a) administración de una composición que contiene un portador de oxígeno basado en hemoglobina (HBOC) con una afinidad al oxígeno mayor que la sangre completa al sujeto en relación con la cirugía; y b) monitorear la estabilidad hemodinámica del paciente. Tal administración puede ocurrir antes, durante o después de la cirugía o cualquier combinación de esto. Además, la estabilidad hemodinámica se puede medir antes, durante o después de la cirugía, o cualquier combinación de esto. Además, monitorear la estabilidad hemodinámica del paciente puede tomar muchas formas, tales como monitorear la presión sanguínea de un paciente. En una modalidad, la estabilidad hemodinámica se caracteriza por presión sistólica que permanece arriba de 90 rom Hg. El HBOC de la presente invención puede tomar muchas formas, tal como hemoglobina modificada por óxido de polialquileno, la cual se puede obtener de fuentes naturales o sintéticas, incluyendo fuentes recombinantes. Además la fuente de hemoglobina puede ser de humanos u otros animales no humanos . En otra modalidad de la presente invención, el HBOC tiene una afinidad al oxígeno mayor del doble del de la sangre completa, la cual puede incluir HBOCs con P50s entre 4 a 15. En otro aspecto, la presente invención incluye el uso de un portador de oxígeno basado en hemoglobina (HBOC) en la elaboración de un medicamento para mejorar la estabilidad hemodinámica de un sujeto normovolemico que experimenta cirugía, en donde el HBOC tiene una afinidad al oxígeno mayor que el de la sangre completa. Tal uso puede comprender además un mejoramiento de la descarga de oxígeno como una medida preventiva para evitar la inestabilidad hemodinámica asociada con la cirugía. Las características de los HBOCs y la administración del medicamento son, por ejemplo, como se describen abajo. Otros aspectos de la invención se describen a lo largo de la especificación. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 describe el cromatograma FPLC de MalPEG-Hb y hemoglobina libre de estroma (SFH) . La Figura 2 describe las curvas de equilibrio del oxígeno de MalPEG-Hb, SFH y sangre completa. La Figura 3 describe la tasa de sobrevivencia de ratas después de la administración de varias soluciones de prueba. La Figura 4 describe la emisión de orina de pacientes a los que se les administró MalPEG-Hb o Lactato de Ringer. La Figura 5 describe los signos vitales de pacientes a quienes se les administró MalPEG-Hb antes de la anestesia . La Figura 6 describe el porcentaje de pacientes a quienes se les administró MalPEG-Hb o un placebo que muestran eventos hipotensivos durante la cirugía. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos para mejorar la estabilidad hemodinámica de un individuo que experimenta cirugía por la administración de una composición que comprende un portador de oxígeno basado en hemoglobina.

En una modalidad, la presente invención se refiere al uso de hemoglobinas modificadas por óxido de polialquileno con cooperatividad reducida y una alta afinidad al oxígeno para mejorar la descarga de oxígeno como una medida preventiva para evitar las complicaciones relacionadas con la estabilidad hemodinámica durante la cirugía. Para facilitar la comprensión de la invención que se muestra en la exhibición siguiente, se definen varios términos a continuación. Definiciones El término "hemoglobina" se refiere generalmente a la proteína contenida dentro de los glóbulos rojos que transporta oxígeno. Cada molécula de hemoglobina tiene 4 sub-unidades, 2 cadenas a y 2 cadenas ß, las cuales se ordenan en una estructura tetramérica. Cada sub-unidad también contiene un grupo hemo, el cual es el centro que contiene hierro que une el oxígeno. Por tanto, cada molécula de hemoglobina puede unir 4 moléculas de oxígeno. El término "hemoglobina modificada" incluye, pero no está limitado a, hemoglobina alterada por una reacción química tal como ligaduras cruzadas intra- e inter-molecular, manipulación genética, polimerización y/o conjugación a otros grupos químicos (e.g., óxidos de polialquileno, por ejemplo polietilenglicol, u otros aductos tales como proteínas, péptidos, carbohidratos, polímeros sintéticos y los semejantes) . En esencia, la hemoglobina es "modificada" si cualquiera de sus propiedades estructurales o funcionales han sido alteradas a partir de su estado natural. Como se utiliza en la presente, el término "hemoglobina" por si mismo se refiere tanto a la hemoglobina natural, no modificada, así como a la hemoglobina modificada. El término "hemoglobina de superficie modificada" se utiliza para referirse a la hemoglobina descrita arriba a la que los grupos químicos tales como dextrano u óxido de polialquileno se han unido, más usualmente covalentemente.

El término "hemoglobina oxigenada de superficie modificada" se refiere a la hemoglobina que está en el estado "R" cuando es de superficie modificada. El término "hemoglobina libre de estroma" se refiere a la hemoglobina de la que se han removido todas las membranas de los glóbulos rojos. El término "metahemoglobina" se refiere a una forma oxidada de hemoglobina que contiene hierro en el estado férrico y que no puede funcionar como portadora de oxígeno. El término "MalPEG-Hb" se refiere a la hemoglobina a la que se ha conjugado PEG activado por malemidilo. Tal MalPEG se puede referir además por la siguiente fórmula: Hb-(S-Y-R-CH2-[0-CH2-CH2]n-0-CH3)m Fórmula I en donde Hb se refiere a hemoglobina tetramérica, S es un grupo tiol superficial, Y es el vínculo covalente succinimida entre Hb y Mal-PEG, R está ausente o es un grupo alquilo, amida, carbamato o fenilo (dependiendo de la fuente de materia prima y el método de síntesis química) , [0-CH2-CH2]n son las unidades oxietileno que forman la estructura del polímero PEG, en donde n define la longitud del polímero (e.g., MW = 5000) y 0-CH3 es el grupo metoxi terminal. El término "sustituto del plasma" se refiere a cualquier solución que se le pueda administrar a un sujeto para incrementar el volumen plasmático. El término "capacidad para portar oxígeno" o simplemente "capacidad de oxígeno", de un sustituto de sangre se refiere a su capacidad para portar oxígeno, pero no necesariamente se correlaciona con la eficiencia en la que administra el oxígeno. La capacidad para portar oxígeno de un sustituto de sangre que contenga hemoglobina generalmente se calcula a partir de la concentración de hemoglobina, ya que se conoce que cada gramo de hemoglobina une 1.34 ml de oxígeno. Por tanto, la concentración de hemoglobina en g/dl multiplicada por el factor 1.34 produce la capacidad de oxígeno en ml/dl. La concentración de hemoglobina se puede medir por cualquier método conocido, tal como por el uso del Fotómetro de ß-Hemoglobina (HemoCue, Inc., Angelholm, Suecia) . De forma similar, la capacidad de oxígeno se puede medir por la cantidad de oxígeno liberada de una muestra de hemoglobina o sangre utilizando, por ejemplo, un instrumento • con pila eléctrica primaria (de hidróxido de potasio, hidrógeno y oxígeno) (e.g., Lex-02-Con, Lexington Instruments, Waltham, Massachussets . ) El término "afinidad al oxígeno" se refiere a la avidez con la que un portador de oxígeno tal como la hemoglobina se une al oxígeno molecular. Esta característica se define por la curva de equilibrio de oxígeno que se refiere al grado de saturación de las moléculas de hemoglobina con oxígeno (eje Y) con la presión parcial del oxígeno (eje X) . La posición de esta curva es señalada por el valor, el P50, la presión parcial del oxígeno en la que el portador de oxígeno es medio-saturado con oxígeno y está inversamente relacionada con la afinidad al oxígeno. Por tanto, mientras más bajo sea el P50, más alta es la afinidad al oxígeno. La afinidad al oxígeno de la sangre completa ( y componentes de sangre completa tal como glóbulos rojos y hemoglobina) , así como cualquier portador de oxígeno, se pueden medir por una variedad de métodos conocidos en el campo. (Ver, e.g., Winslow et al . , J. Biol . . Chem. 252 (7) : 233-37 (1977) ) . La afinidad al oxígeno también se puede determinar utilizando un Analizador HEMOX™ disponible comercialmente (TCS Scientific Corporation, New Hope, Pensilvania) . (Ver, e.g., Vandegriff y Shrager en "Methods in Enzymology" (Everse et al . , Eds.) 232:460(1994)). El término "componente portador de oxígeno" se refiere ampliamente a una sustancia capaz de portar oxígeno en el sistema circulatorio del cuerpo y administrar al menos una porción de ese oxígeno a los tejidos. En modalidades preferidas, el componente portador de oxígeno es hemoglobina natural o modificada, y también se denomina en la presente como "portador de oxígeno basado en hemoglobina", o "HBOC." El término "parámetros hemodinámicos" se refiere ampliamente a medidas indicativas de presión sanguínea, flujo y estado del volumen, incluyendo mediciones directas tales como presión sanguínea, gasto cardiaco, presión de la auricular derecha, presión diastólica final ventricular izquierda, así como mediciones indirectas de taquicardia, isquemia, bradicardia, problemas de conducción, balance hídrico, peso, tiempo UCI y funcionamiento renales. El término "cristaloide" se refiere a moléculas pequeñas (usualmente de menos de 10 Á) tales como sales, azúcares y amortiguadores. A diferencia de los coloides, los cristaloides no contienen ningún componente oncóticamente activo y se equilibran muy rápidamente entre la circulación y los espacios intersticiales. El término "coloide" (en contraste con "cristaloide") se refiere a moléculas más grandes (usualmente mayores de 10 Á) que se equilibran a través de las membranas biológicas dependiendo de su tamaño y carga e incluyen proteínas tales como albúmina y gelatina, así como almidones tales como pentaalmidón y hetaalmidón. El término "presión osmótica coloide" se refiere a la presión ejercida por un coloide para equilibrar el balance hídrico a través de una membrana. El término "estable a la antioxidación" se refiere a la habilidad de un HBOC para mantener una tasa baja de autooxidación. Un HBOC es considerado estable a 24° C si la proporción metahemoglobina/hemoglobina total no se incrementa más del 2% después de 10 horas a temperatura ambiente (aproximadamente 24° C) . Por ejemplo, si la tasa de autooxidación es 0.2 hr"1, entonces si el porcentaje inicial de metahemoglobina es de 5%, y si este porcentaje no se incrementara por arriba del 7% el HBOC se consideraría estable a temperatura ambiente durante 10 horas. El término "proporción de metahemoglobina/hemoglobina total" se refiere a la proporción de hemoglobina oxidada a la hemoglobina total. El término "mezcla" se refiere a una mezcla junto con dos o más sustancias sin la presencia de una reacción por la cual perdería sus propiedades individuales; el término "solución" se refiere a una mezcla de líquidos; el término "solución acuosa" se refiere a una solución que contiene algo de agua y que también podría contener una o más sustancias líquidas distintas con agua para formar una solución ulti-componente; el término "aproximadamente" se refiere al valor actual que está dentro de un rango, e.g. 10%, del valor indicado. El término "polietilenglicol" o "PEG" se refiere a polímeros líquidos o sólidos de la fórmula química general H (OCH2CH2) nOH, en donde n es mayor que o igual a 4, y variantes de esto, tal como el PEG que es activado, sustituido y/o no sustituido. El término "perfusión" se refiere al flujo de un fluido a los tejidos y órganos a través de las arterias y capilares.

El término "estabilidad hemodinámica" se refiere al funcionamiento estable en la mecánica de la circulación, i.e. la estabilidad de cualquier parámetro hemodinámico durante un período dado de tiempo. El término "eventos hipotensivos" se caracteriza por o se debe a la hipotensión localizada o generalizada, i.e., una disminución de la presión sanguínea, la cual se puede definir posteriormente cuantitativamente como una presión sistólica menor de 90 miriHg o una disminución de la presión sanguínea debajo del 75% del valor inicial. El significado de otra terminología utilizada en la presente deberá ser fácilmente entendida por alguien que cuente con habilidades razonables en el campo. La Naturaleza de la Administración y Consumo de Oxígeno Aunque el uso exitoso de las composiciones y métodos de la presente invención no requieren la comprensión de la mecánica subyacente de la administración y el consumo de oxígeno, el conocimiento básico que se refiere a algunos de estos mecanismos putativos puede ayudar para entender la siguiente discusión. Generalmente se ha supuesto que los capilares son los conductores principales de oxígeno a los tejidos. Sin embargo, en lo que respecta al tejido en reposo, los hallazgos actuales indican que existe aproximadamente una equipartición entre la liberación de oxígeno auricular y capilar. Esto es, se cree que la hemoglobina en el sistema arterial administra aproximadamente un tercio de su contenido de oxígeno en la red de trabajo auricular y un tercio en los capilares, mientras que el resto sale de la microcirculación via el sistema venoso. Las arterias y arteriolas mismas son sitios de utilización de oxígeno. Por ejemplo, la pared arterial requiere energía para efectuar la regulación del flujo sanguíneo a través de la contracción contra la resistencia vascular. Por tanto, la pared arterial es normalmente un sitio importante para la difusión de oxígeno fuera de la sangre. Sin embargo, las composiciones actuales que administran oxígeno (e.g., HBOCs) pueden liberar demasiado de su contenido de oxígeno en el sistema arterial e inducir así una reducción autorreguladora en la perfusión capilar. Consecuentemente, la eficiencia de el suministro de oxígeno de un sustituto de sangre realmente puede ser estorbada por tener demasiado oxígeno o una afinidad al oxígeno demasiado baja. La tasa de consumo de oxígeno por la pared vascular, i.e., la combinación de oxígeno requerida para el trabajo mecánico y el oxígeno requerido para la síntesis bioquímica, se pueden determinar por la medición del gradiente en la pared del vaso. (Ver, e.g., Winslow, et al . , en "Advances in Blood substitutes" (1977), Birkhauser, Ed., Boston, Massachusetts, páginas 167-188. La tecnología actual permite efectuar mediciones precisas de la presión parcial de oxígeno en una variedad de vasos. El gradiente medido es directamente proporcional a la tasa de utilización de oxígeno por el tejido en la región de la medición. Tales mediciones muestran que la pared del vaso tiene una utilización inicial de oxígeno que se incrementa con los incrementos en la inflamación y constricción, y se reduce por la relajación. El gradiente de la pared del vaso es inversamente proporcional a la oxigenación tisular. La vasoconstricción incrementa el gradiente de oxígeno (metabolismo tisular) , mientras que la vasodilatación reduce el gradiente. Los gradientes más altos son indicativos del hecho de que la pared del vaso utiliza más oxígeno, mientras que hay menos oxígeno disponible para el tejido. Se cree que el mismo fenómeno está presente a través de toda la microcirculación. La Relación entre Vasoconstricción y Afinidad al oxígeno La justificación para desarrollar un HBOC con alta afinidad al oxígeno se basa, en parte, en estudios anteriores que utilizaron hemoglobinas libres de células como alternativas de las transfusiones de glóbulos rojos. Algunos de los efectos fisiológicos de estas soluciones aún no se han comprendido completamente. De estos, quizá el más controversial es la propensión a causar vasoconstricción, la cual se puede manifestar como hipertensión en animales y en el hombre (Amberson, W., "Clinical experience with hemoglobin-saline solutions,". Science 106:117-117(1947)) (Keipert, P., A. Gonzáles, C. Gómez, V. Macdonald, J. Hess y R. Winslow, "Acute changes in systemic blood pressure and uri e output of conscious rats following exchange transfusión with diaspirin-crosslinked hemoglobin solution, " Transfusión 33:701-708, (1993)). La hemoglobina humana reticulada entre cadenas a con bis-dibromosalicil-fumarato (aaHb) fue desarrollada por la Armada de E.U.A. como un sustituto modelo de glóbulos rojos, pero fue abandonada por la Armada después de que se demostraron severos incrementos en la resistencia vascular pulmonar y sistémica (Hess, J., V. Macdonald, A.

Murria, V. Coppes y C. Gómez, "Pulmonary and systemic hipertensión after hemoglobin administration," Blood 78:356A (1991)) . Una versión comercial de este producto también se abandonó después de un desalentador estudio clínico Fase III (Winslow, R. M. "aa-crosslinked hemoglobin: Was failure predicted by preclinical testing?" Vox sang 79: 1-20 (2000). La explicación que se propone más frecuentemente de la vasoconstricción producida por hemoglobina libre de células es que une fácilmente el factor de relajación derivado del endotelio, óxido nítrico (NO) . De hecho, se han producido hemoglobinas recombinantes con afinidad reducida para NO, las cuales parecen ser menos hipertensas en experimentos con ratas con carga máxima (Doherty, D.H., M.P. Doyle, S.R. Curry, R.J. Vali, T. J. Fattor, J. S. Olson y D.D. Lemon, "Rate of reaction with nitric oxide determines the hypertensive effect of cell-free hemoglobin", Nature Biotechnology 16: 672-676 (1998)) (Lemon, D.D., D.H. Doherty, S.R. Curry, A.J. Mathews, M.P. Doyle, T.J. Fattor y J.S. Olson, "Control of • the nitric oxide-scavening activity of hemoglobin," Art Cells, Blood Subs . , and Immob . Biotech 24:378 (1996)). Sin embargo, los estudios sugieren que es probable que la unión de NO no fuera la única explicación de la vasoactividad de la hemoglobina. Se ha encontrado que ciertas moléculas grandes de hemoglobina, tales como aquellas modificadas con polietilenglicol (PEG) , estaban virtualmente libres del efecto hipertensivo, aunque sus tasas de unión de NO fueron idénticas a las de la aaHb severamente hipertensiva (Rohlfs, R. J., E. Bruner, A. Chiu, A. Gonzáles, M.L. Gonzáles, D. Magde, M.D. Magde, K. D. Vandegriff y R.M. Winslow, "Arterial blood pressure responses to cell-free hemoglobin solutions and the reaction with nitric oxide," J Biol . Chem 273:12128-12134 (1998)). Además, se encontró que la hemoglobina PEG fue extraordinariamente efectiva para prevenir las consecuencias de la hemorragia cuando se administró como una transfusión de intercambio antes de la hemorragia (Winslow, R. M., A. Gonzáles, M. Gonzáles, M. Magde, M. McCarthy, R.J. Rohlfs y K.D. Vandegriff "Vascular resístanse and the efficacy of red cell substitutes," J Appl Physiol 85:993-1003 (1998)). Este efecto protector se correlacionó con la carencia de hipertensión, lo que sugiere que la vasoconstricción es responsable del desalentador desempeño de muchos de los productos basados en hemoglobina estudiados hasta la fecha. Basándose en estas observaciones, se desarrolló una hipótesis para explicar la vasoconstricción, como una alternativa del, o posiblemente en adición al, efecto de la unión NO. Aunque no se desee atarse a ninguna teoría en particular, se cree que un componente sustancial del efecto vasoactivo de la hemoglobina es una respuesta refleja a la difusión de la hemoglobina en el espacio libre de células. Esta hipótesis se probó en un sistema capilar in vitro, y se demostró que la PEG-hemoglobina, la cual tiene una constante de difusión reducida, transfirió el 02 en una manera muy similar a la de los glóbulos rojos naturales (McCarthy, M.R., K.D. Vandegriff y R.M. Winslow, "The role of facilitated diffusion in oxygen transport by cell-free hemoglobin: Implications for the design of hemoglobin-based oxygen carriers," Biophysical Chemistry 92: 103-117 (2001)). Sería de esperar que la afinidad al oxígeno desempeñara un papel en esta difusión facilitada por la hemoglobina en el espacio plasmático, ya que el cambio en la saturación de la hemoglobina a la pared del vaso es un determinante del gradiente de difusión de la hemoglobina misma.

La afinidad al oxígeno de la hemoglobina libre de células puede desempeñar un papel adicional en la regulación del tono vascular, ya que la liberación de 02 a las paredes de los vasos en las arteriolas detonarán la vasoconstricción (Lindbom, L., R. Turna y K. Arfors, "Influence of oxygen on perfusión capillary density and capillary red cell velocity in rabbit skeletal muscle," Microvasc Res 19:197-208 (1980)). En el pliegue de piel de hámster, el P02 en tales vasos está en el rango de 20-40 Torr, en donde la curva de equilibrio del oxígeno de glóbulos rojos normales es más empinada (Intaglietta, M., P. Jonson y R. Winslow, "Microvascular and tissue oxygen distribution," Cardiovasc res 32: 632-643 (1996) ) . Por lo tanto, desde un punto de vista teórico, sería importante que el P50 de la hemoglobina libre de células fueran más bajo que el de los glóbulos rojos (i.e., mayor afinidad al 02) en los vasos arteriolares reguladores. Descarga de Oxígeno Además de la afinidad al oxígeno, las propiedades de unión del oxígeno en si mismas, i.e., los efectos de cooperatividad y alostéricos, pueden desempeñar un papel crucial en las capacidades de descarga del oxígeno de los HBOCs. Se ha observado que la unión de polialquileno a la hemoglobina produce un "ajuste" general de la estructura de globina. Esto se atribuye a los efectos osmóticos de tener una cubierta hidrofílica que rodea a la hemoglobina y también puede depender de la naturaleza y localización de los grupos de unión utilizados para unirse al óxido de polialquileno. El conocimiento más convencional es que el diseño de los HBOCs deberían imitar las características de la hemoglobina natural. Sin embargo, se ha encontrado inesperadamente que la perturbación de la conformación cuaternaria de la hemoglobina puede tener ventajas, particularmente en el contexto de la descarga de oxígeno. Se considera que una proteína es "alostérica" si sus características cambian como resultado de la unión a una molécula efectora, i.e. un ligando, en su sitio alostérico. En el caso de la hemoglobina, el ligando es oxígeno. Cada sub-unidad del tetrámero de hemoglobina es capaz de unir una molécula de oxígeno. Cada sub-unidad del tetrámero de hemoglobina es capaz de unir una molécula de oxígeno. Cada sub-unidad también existe en una de dos conformaciones- tensa (T) o relajada (R ) . En el estado R, éste puede unir el oxígeno más fácilmente que en el estado T. La hemoglobina muestra un efecto concertado, o cooperatividad, entre las sub-unidades individuales que se unen al oxígeno. La unión del oxígeno a una sub-unidad induce un cambio de conformación en esa sub-unidad que causa que los sitios activos restantes muestren una afinidad mejorada al oxigeno. Consecuentemente, cada molécula secuencial de oxígeno que se une a la molécula de hemoglobina se une más fácilmente que la anterior, hasta que la molécula de hemoglobina ha logrado el estado R o "de ligando", con cuatro moléculas de oxígeno unidas. Por el contrario, la hemoglobina natural muestra un efecto concertado en términos de su eficiencia para liberar oxígeno. La primera molécula se une más ajustadamente y toma más energía para ser "descargada" después la siguiente y así, sucesivamente. Por lo tanto, las enseñanzas convencionales hacia el diseño de sustitutos de sangre que imitan la cooperatividad de la hemoglobina natural pueden afectar de forma adversa su capacidad para liberar oxígeno una vez unido. La presente invención se refiere al hallazgo de que los HBOCs con menos, no más, cooperatividad que la hemoglobina natural son inesperadamente más útiles en las aplicaciones que involucran la descarga de oxígeno. Por ende, una composición para uso en el mejoramiento de la estabilidad hemodinámica deberá ser capaz de liberar fácilmente su oxígeno una vez que llega a su lugar objetivo, pero no deberá contener demasiada capacidad de liberación de oxígeno para evitar los efectos de vasoconstricción. En resumen, la composición ideal del tratamiento profiláctico en conexión con un procedimiento quirúrgico para mejorar la estabilidad hemodinámica contiene necesariamente una hemoglobina modificada con menos cooperatividad que la hemoglobina natural, sino que se formula en una composición con una afinidad al oxígeno mucho mayor (e.g. menos de la mitad de P50) cuando se compara con sangre completa. Componente Portador de Oxígeno En las modalidades preferidas, el portador de oxígeno (i.e., componente portador de oxígeno) es un portador de oxígeno basado en hemoglobina o HBOC. La hemoglobina puede ser natural (no modificada) ; modificada subsecuentemente por una reacción química tal como la unión cruzada intra- o inter .-molecular, polimerización, o la adición de grupos químicos (e.g., óxidos de polialquileno u otros aductos); o se puede geno anipular recombinantemente. Los genes humanos alfa- y beta-globina han sido tanto clonados como secuenciados. Liebhaber, et al, P.N.A.S. 77:7054-7058 (1980); Marotta, et al . , J. Biol . Chem. 353:5040-5053 (1997) (cDNA beta-globina). Además muchas hemoglobinas modificadas producidas recombinantemente han se han estado produciendo actualmente con el uso de mutagénesis dirigida al sitio, aunque estas variedades "mutantes" de hemoglobina se reportaron con altas afinidades al oxígeno. Ver, e.g., Nagai, et al . , P.N.A.S., 82:7252-7255 (1985). Los HBOCs que se utilizan en la práctica de la presente invención tienen afinidades al oxígeno más altas que las de la sangre completa normal (de la misma fuente animal que el sujeto, el cual no necesariamente es humano) , lo cual también se expresa como un P50 más bajo que el de la sangre completa. Generalmente, se considera que la sangre completa tiene un P50 que se aproxima a 28 torr. En una modalidad, los HBOCs de la presente invención tienen un P50 de menos de la mitad que el de la sangre completa, lo que se considera como "afinidad alta al oxígeno". Tales HBOCs de alta afinidad al oxígeno tienen un P50 de 4-15, tal como 10, 7, etc. La presente invención no está limitada por la fuente de hemoglobina. Por ejemplo, la hemoglobina se puede derivar de animales y humanos . Las fuentes preferidas de hemoglobina para ciertas aplicaciones son humanas, de vacas y cerdos, así como fuentes de no-mamíferos, tales como anélidos, reptiles, etc. Además, la hemoglobina se puede producir por otros métodos, que incluyen síntesis químicas y técnicas recombinantes . La hemoglobina se puede añadir a la composición de producto de sangre en forma libre o se puede encapsular en una vesícula, tal como una partícula sintética, microesfera o liposoma. Los componentes portadores de oxígeno preferidos de la presente invención deberán ser libres de estroma y libres de endotoxina. Ejemplos representativos de componentes libres de oxígeno se exhiben en varias de las Patentes de Estados Unidos expedidas, que incluyen Pat. E.U. No. 4,857,636 a Hsia; Pat. E.U. No. 4,600,531 a Walder, Pat. E.U. No. 4,061,736 a Morris et al . ; Pat. E.U. No. 3,925,344 a Mazur; Pat. E.U. No. 4,529,719 a Tye; Pat. E.U. No. 4,473,496 a Scannon; 4,584,130 a Bocci et al; Pat. E.U. No. 5,250,665 a Kluger, et al . ; Pat. E.U. No. 5,028,588 a Hoffman et al y Pat. E.U. No. 4,826,811 y Pat. E.U. No. 5,194,590 a Sehgal et al . Además de las fuentes antes mencionadas de hemoglobina, recientemente se ha encontrado que la hemoglobina de caballo puede tener ciertas ventajas como el componente portador de oxígeno en las composiciones de la presente invención. Una ventaja es que las cantidades comerciales de sangre de caballo se encuentran fácilmente disponibles, de las que se puede purificar la hemoglobina de caballo. Otra ventaja inesperada es que la hemoglobina de caballo muestra las propiedades químicas que pueden mejorar su utilidad en los sustitutos de sangre de la presente invención. Reportes previos han indicado que la hemoglobina de caballo se auto-oxida a metahemoglobina más rápidamente que la hemoglobina humana, lo cual la haría menos deseable como un componente sustituto de sangre. Ver, e.g., J.G. McLean e I.M. Lewis, Research in Vet . Sci., 19:259-262 (1975). A fin de reducir la auto-oxidación, McLean y Lewis utilizaron un agente reductor, glutatión, después de la lisis de glóbulos rojos. Sin embargo, la hemoglobina que se utiliza para preparar las composiciones de la presente invención, sin importar si la fuente de hemoglobina es humana o equina, no requieren el uso de agentes reductores para prevenir la auto-oxidación después de la lisis de glóbulos rojos. Más recientemente, se ha reportado que la hemoglobina de caballo tiene una afinidad al oxígeno que es diferente a la de la hemoglobina humana. Ver, e.g., M. Mellegrini, et al . Eur. J. Biochem. , 268: 3313-3320 (2001). Tal diferencia desalentará la selección de hemoglobina equina para preparar sustitutos de sangre que imiten la hemoglobina humana. Sin embargo, cuando se incorporan en las composiciones de la presente invención, no se observa una diferencia significante (menor del 10%) en la afinidad al oxígeno entre los conjugados que contienen hemoglobina humana y equina. Por tanto, al contrario de estas propiedades aparentemente indeseables, en las composiciones de la presente invención, la hemoglobina equina puede ser equivalente a la hemoglobina humana. Para el uso en la presente invención, el HBOC tiene una afinidad al oxígeno que es mayor que la de la sangre completa y preferiblemente el doble que la de la sangre completa, o alternativamente, mayor que la de la hemoglobina libre de estroma (SFH) , cuando se mide bajo las mismas condiciones. En la mayoría de las instancias, esto significa que el HBOC en el sustituto de sangre tendrá un P50 menor de 10, y más preferiblemente menor de 7. En el estado libre, la SFH tiene un P50 de aproximadamente 15 torr, mientras que el P50 de la sangre completa es de aproximadamente 28 torr. Previamente se ha sugerido que el incremento en la afinidad al oxígeno y de ahí la reducción del P50, puede mejorar el suministro de oxígeno a los tejidos, aunque se implicó que un P50 menor que el de la SFH sería inaceptable. Ver Winslow, et al . , en "Advances in Blood substitutes" (1997), Birkhauser, ed., Boston, MA, en la página 167, y Pat. E.U. No. 6,054,427. esta sugerencia contradice la creencia ampliamente sostenida de que las hemoglobinas modificadas para uso como sustitutos de sangre tienen afinidades al oxígeno más bajas y deberían tener P50s que se aproximen al de la sangre completa. Por tanto, muchos investigadores han utilizado el piridoxil fosfato para aumentar el P50 de la SFH de 10 a aproximadamente 20-22, ya que la hemoglobina piridoxilada libera oxígeno más fácilmente cuando se compara con la SFH. Existen muchos procedimientos científicos diferentes para la elaboración de HBOCs con alta afinidad al oxígeno (i.e., aquellos con P50s menores que el de la SFH). Por ejemplo, los estudios han identificado los residuos de aminoácido que desempeñan un papel en la afinidad al oxígeno, tal como ß-93 cisteína y por tanto la mutagénesis dirigida al sitio ahora se puede efectuar fácilmente para manipular la afinidad al oxígeno al nivel deseado. Ver, e.g., Pat. E.U.

No. 5,661,124. En la Pat. E.U. No. 6,054,427 se discuten muchos otros procedimientos. Toxicidad Asociada con la Hemoglobina Se sabe que la hemoglobina muestra autooxidación cuando cambia reversiblemente de la forma ferrosa (Fe2+) a la férrica (Fe3+) . Cuando esto ocurre, el oxígeno molecular se disocia de la oxihemoglobina en la forma de un anión de superóxido (02_) . Esto también produce desestabilización en el complejo hemo-globina y la desnaturalización eventual de las cadenas de globina. Se cree que tanto la formación radical de oxígeno como la desnaturalización de proteínas desempeñan un papel en la toxicidad in vivo de los HBOCs (Vandegriff, K. D., Blood substitutes, Physiological Basis of Efficacy, páginas 105-130, Winslow et ai., ed., Birkhauser, Boston, Massachussets (1995) . Con la mayoría de los HBOCs, existe una correlación negativa entre la afinidad al oxígeno y la oxidación de la hemoglobina, i.e., mientras más alta sea la afinidad al oxígeno, más baja es la tasa de autooxidación. Sin embargo, los efectos de diferentes modificaciones de la hemoglobina sobre la afinidad al oxígeno y la tasa de autooxidación no siempre son predecibles. Además, el balance óptimo entre la afinidad al oxígeno y la tasa de autooxidación no es bien comprendida. En una modalidad, las composiciones de la presente invención contienen conjugados de óxido de polialquileno-Hb, tales como los conjugados de polietilenglicol-Hb que muestran tasas muy bajas de autooxidación a temperatura ambiente. Cuando se mide como una tasa de oxidación este valor deberá ser tan bajo como sea posible (i.e., 0.2% por hora de hemoglobina total, más preferiblemente 0.1% por hora de hemoglobina total, a temperatura ambiente por al menos 3 horas y más preferiblemente al menos 10 horas.) . Por tanto, los HBOCs de la presente invención que se ejemplifican permanecen estables durante su administración y/o almacenaje a temperatura ambiente. Modificaciones del Componente Portador de Oxígeno En una modalidad que se ejemplifica, el componente portador de oxígeno es hemoglobina modificada por óxido de polialquileno (PAO), inter. alia, óxido de polietileno ( (CH2CH20)n) , óxido de polipropileno ( (CH (CH3) CH20) n) o un copolímero de óxido de polietileno/polipropileno ( (CH2CH20) n- (CH (CH3) CH20) n) . Otros polímeros sintéticos de cadena recta, ramificada y opcionalmente sustituidos que serían apropiados en la práctica de la presente invención son bien conocidos en el campo médico. Más frecuentemente, el grupo químico unido a la hemoglobina es el polietilenglicol (PEG) , debido a su aceptabilidad farmacéutica y disponibilidad comercial. Los PEGs son polímeros de fórmula química general H (0CH2CH2) n0H, en donde n es generalmente mayor que o igual a . Las formulaciones PEG son seguidas usualmente por un número que corresponde a su peso molecular promedio. Por ejemplo, PEG-200 tiene un peso molecular promedio de 200 y puede tener un rango de peso molecular de 190-210. Los PEGs están disponibles comercialmente en un número de formas diferentes y en muchas instancias vienen pre-activados y listos para conjugarlos con proteínas. Un aspecto importante de las modalidades que se ejemplifican de la presente invención es que la modificación superficial tiene lugar cuando la hemoglobina está en el estado oxigenado o "R". Esto se logra fácilmente al permitir que la hemoglobina se equilibre con la atmósfera (o, alternativamente, se puede efectuar la oxigenación activa) antes de la conjugación. Al efectuar la conjugación a hemoglobina oxigenada, se mejora la afinidad al oxígeno de la hemoglobina resultante. Generalmente, tal etapa se considera contraindicada, debido a que muchos investigadores describen que la desoxigenación previa a la conjugación disminuye la afinidad del oxígeno. Ver, e.g., Pat. E.U. No. 5,234.903. Aunque en muchos respectos el desempeño de las hemoglobinas modificadas por PAO es independiente del vínculo entre la hemoglobina y el modificador (e.g., PEG), se cree que el tipo de ligadores tales como los sustituyentes del ligador Cl a C6 alifáticos o aromáticos insaturados más rígidos pueden cambiar las características de elaboración y/o las características de los conjugados cuando se comparan con los que tienen diferentes ligaduras, tales como modos más deformables de unión cuando se comparan con los ligadores rígidos que acaban de describirse. El número de PEGs que deben ser añadidos a la molécula de hemoglobina puede variar, dependiendo del tamaño del PEG. Sin embargo, el tamaño molecular de la hemoglobina modificada resultante deberá ser suficientemente grande para evitar que sea depurada por los ríñones, para lograr la vida media deseada. Blumenstein, et al . , determinaron que este tamaño se logra arriba de un peso molecular de 84,000 Daltones. (Blumenstein, et al . , en "Blood substitutes and Plasma Expanders," Alan R. Liss, editors, New York, New York, páginas 205-212 (1978).) Ahí, los autores conjugaron hemoglobina a dextrano de peso molecular variable. Reportaron que un conjugado de hemoglobina (con un peso molecular de 64,000 Daltones) y dextrano (que tiene un peso molecular de 20,000 Daltones) "se depuró lentamente de la circulación e insignificantemente a través de los ríñones," pero el incremento del peso molecular arriba de 84,000 Dalto?es no alteró las curvas de depuración. Consecuentemente, como lo determinaron Blumenstein, et al . , es preferible que el HBOC tenga un peso molecular de al menos 84,000 Daltones.

En una modalidad de la presente invención, el HBOC es una "MalPEG-Hb, " que representa hemoglobina a la que se ha conjugado PEG. Tal MalPEG-Hb se puede referir por la siguiente fórmula: Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[0-CH2-CH2]n-0-CH3)m Fórmula I en donde Hb se refiere a la hemoglobina tetramérica, S es un grupo tilo superficial, Y es la unión covalente succinimida entre Hb y Mal-PEG, R es ausente o es un grupo alquilo, amida, carbamato o fenilo (dependiendo de la fuente de materia prima y el método de síntesis química) , [0-CH2-CH2]n son las unidades de oxietileno que conforman la estructura del polímero PEG, en donde n define la longitud del polímero (e.g., MW = 5000), y 0-CH3 es el grupo terminal metoxi. Formulación Los HBOCs de la presente invención son formulados por la mezcla de HBOC y otros excipientes opcionales con una solución acuosa apropiada, o "diluyente" (i.e., una que sea farmacéuticamente aceptable para inyección intravenosa.) Aunque la concentración del portador de oxígeno en el diluyente puede variar de acuerdo con la aplicación y, en particular, basándose en la dilución esperada postadministración, en las modalidades preferidas, debido a que las otras características de las composiciones de la presente invención que proporcionan la administración mejorada de oxígeno y efectos terapéuticos, habitualmente es innecesario que la concentración de hemoglobina en un HBOC sea mayor de 6 g/dl, y puede ser entre 0.1 a 4 g/dl. Los diluyentes apropiados también pueden incluir, inter. alia, proteínas, glicoproteínas, polisacáridos y otros coloides. No se propone que estas modalidades estén limitadas a algún diluyente en particular. Por tanto, se propone que el diluyente incluya soluciones acuosas libres de células de albúmina, otros coloides, u otros componentes no portadores de oxígeno. En algunas modalidades, la solución acuosa puede tener una viscosidad de al menos 2.5 cP. En otras modalidades, la viscosidad de la solución acuosa es de entre 2.5 y 4 cP. La administración de las composiciones descritas en la presente se puede llevar a cabo en cualquier momento "en relación con la cirugía", incluyendo hasta todo un día antes, durante o un día después de la cirugía. Aplicaciones Clínicas La presente invención se relaciona con HBOCs tales como conjugados de hemoglobina modificada por PAO que podrían mostrar menos cooperatividad que la hemoglobina natural, que se formulan en composiciones con P50s más bajos que el de la sangre completa, los cuales en algunas modalidades son menos de la mitad del P50 de la sangre completa. Tales composiciones son útiles para mejorar la estabilidad hemodinámica en pacientes normovolémicos que experimentan cirugía. Se pueden administrar utilizando los mismos parámetros de administración que son bien conocidos en el campo de los sustitutos del plasma, mejoradores de la volemia y tales. La estabilidad hemodinámica puede ser monitoreada antes, durante o después de cirugía, o cualquier combinación de esto. Por lo tanto, el mejoramiento de la estabilidad hemodinámica no necesariamente está limitado a la medición de las propiedades hemodinámicas del sujeto sólo durante el procedimiento quirúrgico mismo, y puede observarse en cualquier momento después de la administración. La población de pacientes que pueden recibir el máximo beneficio de la práctica del presente método de la invención es de "pacientes normovolémicos que experimentan cirugía." Por lo tanto, en una modalidad, el presente método de la invención se refiere a la administración de las composiciones a pacientes que no han experimentado la extracción de sangre durante un tratamiento de hemodilución normovolémica aguda (ANH) . Esto se basa en el hallazgo de que los individuos a quienes se les administran estas composiciones en conexión con un procedimiento quirúrgico tienen menos probabilidades de requerir una transfusión sanguínea durante o después de cirugía. Por ende, los métodos de la presente invención son, en un aspecto, una alternativa a la ANH. En otro aspecto, el presente método de la invención también puede ser la causa del beneficio indirecto de un paciente normovolétnico que vaya a ser sometido a cirugía que requiera menos administración de vasopresores durante la cirugía para elevar su presión sanguínea, debido a que su presión sanguínea se estabiliza efectivamente durante la cirugía debido a la administración profiláctica de HBOC en relación con la cirugía. EJEMPLOS Una versión similar de los siguientes tres ejemplos se exhibe en la Solicitud de Patente E.U. No. 2003/0162693, la cual se publicó el 28 de agosto de 2003. En cuanto a todos los ejemplos, se utilizó MalPEG_Hb como un HBOC modelo. La producción y disponibilidad de otros HBOCs son bien conocidas en la literatura científica, además la habilidad para conducir estudios clínicos en sujetos humanos está cuidadosamente reglamentada y es imposible de llevar a cabo utilizando múltiples formas de HBOCs. Por tanto, basándose en las enseñanzas presentadas en la presente, es necesario que un experto en la materia entienda bien que el ámbito de la presente invención no está limitado al uso de MalPEG-Hb, y HBOCs con características similares (e.g., una afinidad más alta al oxígeno que la de la hemoglobina natural, y en particular la hemoglobina modificada por PAO) también sería apropiada para su uso. Ejemplo I Producción de Hemoglobina Libre de Estroma Etapa 1: Obtención de glóbulos rojos caducos Los eritrocitos empacados caducos se obtienen de una fuente comercial, tal como el Banco de Sangre de San Diego o la Cruz Roja Americana. Preferiblemente, el material caduco se recibe no más de 45 días del tiempo de recolección. Los RBCs empacados (pRBCs) se almacenan a 4 + 2° C hasta que su procesamiento posterior (1-7 días). La detección de infección viral se lleva a cabo en todas las unidades y se someten a pruebas de ácido nucleico antes de su uso. Etapa 2 : Mezclado de la sangre caduca Los paquetes de eritrocitos se mezclan en un vaso estéril en instalaciones limpias. Se registra el volumen del paquete de eritrocitos y la concentración de hemoglobina se determina utilizando un co-oxímetro disponible comercialmente u otro método reconocido en el campo. Etapa 3 : Leucocitopenia La leucocitopenia (i. e. , eliminación de glóbulos blancos) se efectúa utilizando la filtración por membrana. Las cuentas iniciales y finales de leucocitos se hacen para monitorear la eficiencia de este proceso. Etapa 4 : Separación celular y lavado celular Los glóbulos rojos se lavan con seis volúmenes de 0.9% de cloruro de sodio. El proceso se efectúa a 4 + 2°C. El lavado celular se analiza para verificar la eliminación de componentes plasmáticos por un ensayo espectrofotométrico de albúmina . Etapa 5 : Lisis de glóbulos rojos y eliminación de residuos celulares Los glóbulos rojos lavados se lisan al menos 4 horas o durante la noche a 4 + 2° C con agitación utilizando 6 volúmenes de agua. El lisado se procesa en frío para purificar la hemoglobina. Esto se logra al procesar- el lisado a través de una membrana de 0.16-µm. La hemoglobina purificada se colecta en un vaso estéril despirogenado. En este proceso, todas las etapas se efectúan a 4 + 2° c. Etapa 6 : Eliminación viral La eliminación viral se efectúa por ultrafiltración a 4 + 2° C. Etapa 7 : Concentración e intercambio de solvente La hemoglobina purificada del lisado y de la ultrafiltración se intercambia en lactato de Ringer (RL) o salina amortiguada con fosfato (PBS, pH 7.4) utilizando una membrana de 10 ID. Después la hemoglobina se concentra utilizando la misma membrana a una concentración final de l.l-1.5mM (en tetrámero). Se utilizan diez a 12 volúmenes de RL o PBS para el intercambio de solvente. Este proceso se efectúa a 4 + 2° C. El pH de la solución preparada en Rl se ajusta a 7.0-7.6. Etapa 8 : Filtración estéril La hemoglobina en PBS o lactato de Ringer (RL) se filtra estéril a través de una cápsula de filtro de 0.45- o 0-2µm desechable y se almacena a 4 + 2° C antes de que se efectúe la reacción de modificación química. Otros métodos para purificar la hemoglobina son bien conocidos en el campo. Además, usualmente es innecesario el uso de un agente reductor (e.g., glutatión u otro agente reductor que contenta tiol) para prevenir la auto-oxidación después de la lisis celular. Ejemplo 2 Modificación de la Hemoglobina Libre de Estroma Etapa 1 : Tiolación La tiolación se efectúa utilizando iminotiolano con un exceso molar de 10 veces sobre la hemoglobina por 4 horas a 4 + 2° C con agitación continua. Condiciones de la reacción: • 1 mM de hemoglobina (tetrámero) en RL (pH 7.0-7.5) o PBS (pH 7.4) • 10 raM de iminotiolano en RL (pH 7.07.5) o PBS (pH 7.4) La proporción de 1:10 de SFH-iminotiolano y el tiempo de reacción se redujeron para mejorar el número de grupos tiol PEGilados y para reducir la heterogeneidad del producto. Etapa 2 : PEGilación de la hemoglobina tiolada La hemoglobina tiolada es PEGilada utilizando un exceso molar de 20 veces de Mal PEG (con un ligador alquilo o fenilo) basado en la concentración de hemoglobina tetramérica de inicio. Primero se deja que la hemoglobina se equilibre con la atmósfera para oxigenar la hemoglobina. La reacción tiene lugar por 2 horas a 4 + 2° C con agitación continua. Condiciones de la reacción: • 1 m de hemoglobina tiolada en RL o PBS (pH 7.4) • 20 mM de Mal-PEG en RL o PBS (pH 7.4) Etapa 3 : Eliminación de reactivos sin reactivar La Hb-PEGilada se procesa a través de una membrana de 70-kD para eliminar el exceso de reactivos sin reactivar o hemoglobina. Se lleva a cabo una filtración de 20 volúmenes para asegurar la eliminación de los reactivos sin reaccionar, la cual se monitorea por cromatografía de exclusión de tamaño a 540 nm y 280 nm. La concentración de proteína se diluye a 4 g/dl. El pH se ajusta a 7.3 + 0.3 utilizando 1 N NaOH. Etapa 4 : Filtración estéril El producto final de MalPEG-Hb se filtra estéril utilizando una cápsula desechable estéril de 0.2 µm y se colecta en un vaso despirogenado estéril a 4 + 2° C. Etapa 5 : Formulación de MalPEG-Hb La Hb PEGilada se diluye a 4 g/dl Rl, se ajusta el pH a 7.4 + 0.2. Etapa 6 : Llenado estéril La composición final de sustituto de sangre se filtra estéril (0.2 µm) y separa en alícuotas por peso en viales de vidrio estériles y se cierra con tapones de goma estériles con sellos doblados en una campana de flujo laminar y se almacena a -80° C hasta que se utiliza. Ejemplo 3 Análisis Fisioquímico de MalPEG-Hb Metodología del análisis fisioquímico La homogeneidad y el tamaño molecular del sustituto de sangre MalPEG-Hb se clasifican por Cromatografía Líquida (LC) . La LC analítica se utiliza para evaluar la homogeneidad de la hemoglobina PEGilada y el grado de la eliminación de Mal-PEG sin reaccionar. La absorbancia a 540 nm se utiliza para evaluar la hemoglobina y resuelve la hemoglobina PEGilada de la hemoglobina sin reaccionar por la posición de la cresta.. La absorbancia a 280 nm se utiliza para resolver la hemoglobina PEGilada de Mal-PEG libre, que se absorbe en el espectro ultravioleta (UV) debido a las estructuras anulares en MalPEG. Los espectros ópticos se colectan utilizando un espectrofotómetro con aparato a diodo de detección rápida (Milton Roy 2000 o Modelo Hewlett Packard 8453) en las regiones Soret y visible para el análisis de la concentración de hemoglobina y el porcentaje de metahemoglobina por análisis multicomponente (Vandegriff K.D. y R.E., Shrager.

Evaluation of oxygen equilibrium binding to hemoglobin by rapid-scanning spectrofotometry and singular valué decomposition. Meth. Enzymol. 232:460-485 (1994). La concentración de MalPEG-Hb y el porcentaje de metahemoglobna se determinan utilizando un co-oxímetro. La viscosidad se determina utilizando un Reómetro. La Presión Osmótica Coloide se determina utilizando un osmómetro coloide. Los parámetros de unión del oxígeno se determinan de acuerdo con las curvas de equilibrio del oxígeno. Las especificaciones que se ejemplifican para la composición del sustituto de sangre se presentan en la Tabla 1, abajo: Tabla 1 Prueba Especificación Concentración de hemoglobina (g/dl) 4.2 + 0.2 Metahemoglobina (%) <10 PH 7.4 + 0.4 Conductividad (mS/cm) 12 + 4 Endotoxina (EU/ml) <0.5 Tiempo de retención FPLC (min) 43 + 3 Espesor de la cresta FPLC a la altura 6 + 2 media (min) Viscosidad (cPs) 2.5 + 1.0 COP (mmHg) 50 + 20 P50 (Torr) 6 + 2 Número de cima (en P50) 1.2 + 0.5 Esterilidad Pasa Número de sitios PEGilados en MalPEG-Hb Para la modificación superficial, el número "m" en la Fórmula I es el parámetro que define el número de polímeros PEG unidos a la superficie de la hemoglobina. Hb-(S-Y-R-CH2-CH2-[0-CH2-CH2]n-0-CH3)m Fórmula I Para determinar este número, se utiliza un ensayo colorimétrico ditiopiridina (Ampulski R., V. Ayers y S. Morell. Determination of the reactive sulfhydryl groups in heme proteins with 4, 4' -dipyridinesdisulde . Biochem . Biophys . Acta 163-169, 1969) para medir el número de grupos tiol disponibles en la superficie del tetrámero Hb antes y después de la tiolación y luego de nuevo después de la Hb PEGilación. La hemoglobina humana contiene 2 grupos tiol reactivos intrínsecos en los residuos ß93Cys, lo cual se confirma por la reacción de ditiopiridina. Después de la tiolación de SFH en una proporción de 1:10 SFH: iminotiolano, el número de grupos tiol reactivos se incrementa de 2 a 6 tioles basados en la reacción de ditiopiridina. Después de la reacción de PEGilación, el número de grupos tiol reactivos disminuye a 1.3. Esto indica que hay 4-5 sitios PEGilados en MaLPEG-Hb. Análisis por cromatografía de exclusión de tamaño de MalPEG-Hb contra SFH La FPLC se lleva a cabo para el análisis del producto MaLPEG-Hb final. Los cromatogramas finales se muestran en la Figura 1 de MaLPEG-Hb comparada con SFH no modificada. El tiempo de retención de SFH es de aproximadamente 57 mm. El tiempo de retención de MaLPEG-Hb es de aproximadamente 44 Min. Características físicas y químicas de MalPEG-Hb Las propiedades físicas de MalPEG-Hb comparadas con la sangre y la hemoglobina humana no modificada (SFH) se muestran abajo en la Tabla 2. Tabla 2 Sangre SFH MalPEG-Hb P50 (Torr) 28 15 5 N50 (número Hill/de la 2.9 2.9 1.2 cuesta) Efecto Bohr (Log?) - -0.46 -0.20 P50/?pH) Viscosidad (cPs) 4.0 0.9 2.5 COP (mm Hg)1 27 16 50 MW (kD)2 N/A 65 90 Radio Molecular (nm) 4000 3.22 9 1 Determinado en 15 g/dl para sangre completa y aproximadamente 4 g/dl para soluciones de hemoglobina 2 Determinado por mediciones COP y FPLC Afinidad al oxxgeno Las curvas de unión del equilibrio de hemoglobina-oxígeno se midieron durante el consumo de oxígeno enzimático {Anal Biochem. 256:107-116, 1998. La MalPEG-Hb muestra una alta afinidad al oxígeno (P50 = 5 mm Hg) y baja cooperatividad (n50 = 1.0-1.4) . La Figura 2 muestra curvas representativas que comparan la hemoglobina libre de estroma (SFH), MalPEG-H y sangre. Viscosidad Esta propiedad de solución de la MalPEG-Hb se debe a la fuerte interacción entre las cadenas de polietilenglicol y las moléculas solventes al agua. Se cree que esto es un importante atributo de un sustituto de sangre MalPEG-Hb por dos razones: 1) su mayor viscosidad reduce la constante de difusión tanto de la molécula PEG-Hb como de las moléculas de ligando gaseosas que se difunden a través del solvente y 2) su mayor viscosidad incrementa es esfuerzo cortante de la solución que fluye contra la pared endotelial, con lo que se produce la liberación de vasodilatadores para contrarrestar la vasoconstricción. Como se demuestra en la Tabla 2, la viscosidad de la solución MalPEG-Hb es de 2.5 cPs . Presión Osmótica Coloidal (COP) La COP de las soluciones de hemoglobina que contienen hemoglobina no modificada de ligaduras cruzadas intra- e intermolecularmente o conjugada en la superficie con PEG se han medido para determinar sus propiedades de solución macromolecular (Vandegriff, K.D., R. J. Rohlfs y R.M. Wislow. Colloid osmotic effects of hemoglobin-based oxygen carriers . En Wislow, R.M., K.D. Vandegriff y M. Intaglia, eds., Advances in Blood substitutes Industrial Opportunities and Medical Challenges. Boston, Birkhauser, pp. 207-232 (1997). Las hemoglobinas tetraméricas muestran una conducta de solución casi ideal; mientras que las hemoglobinas conjugadas a PEG tienen una actividad osmótica coloidal significativamente más alta y muestran una no-idealidad de solución (Vandegriff, K.D., M. Mcarthy, R.J. Rohls y R.M. Winslow. Colloid osmotic properties of modified hemoglobins: chemically cross-linked versus polyethyíene glycol surface conjugated.. Biophys . Chem. 69: 23-30 (1997). Como se muestra en la Tabla 2, la COP de la solución MalPEG-Hb es de 50. Estabilidad La estabilidad de las soluciones de hemoglobina que contienen PEG-hemoglobina se ha determinado por la examinación de la tasa de autooxidación. A temperatura ambiente, la autooxidación de MalPEG-Hb se incrementó de aproximadamente 5% MetHb a 5.5% MetHb en 10 horas. La tasa de autooxidación de MalPEG-HB fue por lo tanto de 0.05% por hora . Ejemplo 4 Estabilidad de MalPEG-Hb El propósito de este estudio fue determinar la estabilidad de MalPEG-Hb durante una simulación de condiciones ejemplares de " almacenaje y manejo. La estabilidad se evaluó durante tres etapas de manejo. La etapa I representó la transferencia desde el almacenaje en congelación en las instalaciones de producción a condiciones de temperatura durante el embarque al sitio clínico (estudio de almacenaje en congelación) . La etapa II representó la descongelación de MalPEG-Hb por 24 horas a +4° C y el almacenaje subsecuente a +4° C por cinco días (estudio de refrigeración) . La etapa III representó la descongelación de la MalPEG-Hb por 24 horas a +4° C y el almacenaje subsecuente de MalPEG-Hb a temperatura ambiente por varios días antes de la administración al paciente (estudio de temperatura ambiente) . Métodos Experimentales La estabilidad se definió por la tasa de oxidación del material de prueba MalPEG-Hb. El porcentaje de metahemoglobina en la muestra se midió utilizando co-oximetría (IL Co-Oximetro 682, GMI, Inc., Ramsey, Minnesota.) Las mediciones se efectuaron por duplicado en cada punto de tiempo de acuerdo con el protocolo. Las temperaturas se monitorearon por registradores de gráficas de termómetro o temperatura. El estudio de almacenaje en congelación se condujo en un rango de temperatura de -21.0 + 3.0°C. El estudio de refrigerado se condujo en un rango de temperatura de +4° + 0.2° C. El estudio de temperatura ambiente se condujo en un rango de temperatura de +21.0 + 1.0° C. La temperatura, la hemoglobina total y el porcentaje de metahemoglobina se registraron en cada uno de los puntos de tiempo indicados . En los estudios de congelación y de refrigeración, las mediciones se tomaron en el tiempo cero (completamente descongelado) , una hora más tarde y después cada 24 horas por cinco días. En el estudio de temperatura ambiente, las mediciones se tomaron en el tiempo cero (completamente descongelado) y subsecuentemente cada hora por diez horas . Resultados La MalPEG-Hb no mostró cambio significativo en el porcentaje de metahemoglobina durante 6 días de almacenaje a -20° C. De forma similar, la MalPEG-Hb no mostró cambio apreciable en el porcentaje de metahemoglobina durante cinco días de almacenaje a +4° C. Durante el almacenaje a temperatura ambiente, la MalPEG-Hb mostró un incremento menor del 1 por ciento en la metahemoglobina en un período de diez horas . Ejemplo 5 Uso de MalPEG-Hb para Promover la Estabilidad Hemodinámica Se preparó MalPEG-Hb como se describe arriba. Una dosis de 0 (Lactato de Ringer solo), 200 ("A"), 400 ("B") o 600 ml ( "C'J de MalPEG-Hb, balanceada a un volumen total de 1000 ml de Lactato de Ringer, se administró a pacientes que experimentaron cirugía ortopédica electiva antes de la inducción de anestesia intradural . Los resultados se muestran en a Figura 4. La Figura 5 muestra los signos vitales de pacientes a los que se les administraron 600 ml de MalPEG-Hb. Como se muestra, no se observaron elevaciones en la presión sanguínea comparativamente con las mediciones iniciales. En contraste, se observaron incrementos detectables pero leves en la presión sanguínea en los pacientes a los que se les administraron 300 o 400 ml de MalPEG-Hb. También se monitorearon los eventos hipotensivos en los pacientes y los resultados se muestran abajo en la Tabla 3: Tabla 3 Como se muestra, los pacientes a quienes se les administró MalPEG-Hb mostraron menos eventos hipotensivos que los pacientes a quienes se les administró el placebo. Ejemplo 6 Estudio Clínico Amplio del uso de MalPEG-Hb para Mejorar la Estabilidad Hemodinámica Durante Cirugía Previamente, se ha probado MalPEG-Hb en un estudio Fase I en voluntarios sanos y no produjo eventos adversos significantes y también fue consistente con estudios no clínicos que mostraron vasoactividad reducida en comparación con la Hb libre de estroma. La inestabilidad hemodinámica (e.g., eventos cardiovasculares) medida como eventos hipotensivos, particularmente en pacientes añosos con cardiovasculopatía, es una preocupación para tales pacientes que experimentan cirugía. Hay una cantidad considerable de literatura que apoya la hipótesis de que tal hipotensión produce isquemia en el cerebro, corazón y riñones que pudiera llevar a una morbilidad post-operatoria significativa. El enfoque de este experimento es el desarrollo de portadores de oxígeno basados en Hb (HBOCs) para proteger a tales pacientes quirúrgicos de los efectos de estos eventos adversos. Se efectuó un estudio aleatorizado, doble ciego de MalPEG-Hb (250 o 500 ml) y un grupo de control al que se le administró acetato de Ringer solo, en 6 diferentes hospitales, en grupos de 30 pacientes cada uno. Los pacientes que otorgaron su consentimiento experimentaron cirugía invasiva mayor, predominantemente artropastía de cadera. La administración de la dosis se llevó a cabo antes de la inducción de anestesia intradural. La evaluación de seguridad incluyó signos vitales y monitoreo Holter (desde la infusión hasta las 24 horas) , así como química clínica, coagulación, hematología y balance hídrico. La incidencia de hipotensión, definida cuantitativamente como presión sistólica menor de 90 mmHg o 75% del valor inicial, fue el criterio primario de valoración de eficacia. Otra medida de eficacia fue la necesidad de intervención farmacológica para estabilizar la presión sanguínea y el balance hídrico como se describe más cabalmente abajo. Población de Estudio El grueso de los pacientes estudiados en este experimento experimentó procedimientos quirúrgicos electivos, artroplastías primarias de cadera en pacientes con osteoartritis. Sin embargo, también se estudiaron varias fracturas agudas, así como unas cuantas artroplastías secundarias. Los criterios de inclusión y exclusión se presentan en la Tabla 4.

Tabla 4 Aleatorización y Cegado El tratamiento asignado a cada paciente numerado se determinó de acuerdo con una lista de códigos de aleatorización numerados secuencialmente, generada por computadora. Los grupos de tratamiento se designaron: A, 250 ml de MalPEG-Hb; B, 500 ml de MalPEG-Hb; (A y B representan los "grupos de prueba") y C, acetato de Ringer (que representa el "grupo de placebo") , con todos los volúmenes de administración de cada grupo ajustado al mismo volumen total de administración antes de la administración. Como la MalPEG-Hb es de color rojo y el placebo es transparente, también se hicieron esfuerzos para evitar que tanto el paciente como el personal "cegado" vieran la solución de la infusión, i.e., el estudio se efectuó de manera clásica "doble ciego". Materiales Esencialmente, se preparó MalPEG-Hb como se describe arriba en los Ejemplos 1 a 3 con algunas variaciones menores. Aproximadamente 24 horas antes de la administración, se sacaron botellas de MalPEG-Hb del congelador (-20° C) y se colocaron a temperatura ambiente para su descongelación gradual. Se obtuvo acetato de Ringer de una fuente comercial (Fressenius Kabi AB, Uppsala, Suecia. ) Administración Se administró MalPEG-Hb o placebo a través de una línea intravenosa establecida por una bomba de infusión volumétrica calibrada. Se infundió un volumen total de 1000 ml de MalPEG-Hb y/o acetato de Ringer para propósitos del ciego antes de que se indujera la anestesia, lo cual se efectuó 30 minutos después de terminar la infusión. La infusión de la composición de prueba o de la solución de placebo no influyó en el cuidado normal del paciente. A los pacientes a quienes se les administró solución de prueba o de placebo también se les administró algún tratamiento adicional según se consideró necesario para el bienestar del paciente. Todos los procedimientos y tratamientos médicos se condujeron de acuerdo con el estándar de atención de la clínica. La administración de todo el medicamento continuo que se estaba administrando al inicio del estudio y el medicamento concomitante administrado durante el estudio se registró y se consideró en la interpretación de los resultados . Mediciones y variables farmacocinéticas La persistencia intravascular de MalPEG-Hb y la estabilidad del producto intravascular se determinaron a partir de los niveles plasmáticos de hemoglobina y metahemoglobina antes de la infusión, al final de la infusión, 6 horas después de la infusión, en los días 1, 2 y 3 y 7-10 días después de la infusión. Los resultados de estos estudios no estuvieron fuera de lo ordinario y no se reportan en la presente. Toma y análisis de muestras Las muestras de sangre se tomaron utilizando los métodos de rutina para reducir la hemolisis durante la toma de muestras y se procesaron para asegurar la completa separación de las muestras de sangre del plasma. Debido a que la porción plasmática de las muestras de sangre que contenían MalPEG-Hb eran rojas, fue necesario que el procesamiento de las muestras lo efectuara un técnico "no cegado". El análisis de las muestras se efectuó antes de la "ruptura del código". Por lo tanto, el laboratorio que efectuó el análisis estuvo adecuadamente cegado. Mediciones y variables de eficacia La efectividad de la MalPEG-Hb como un ejemplo de HBOC para mejorar la estabilidad hemodinámica se estudió de acuerdo con los siguientes criterios de valoración: A. Episodios Hipotensivos. El número de episodios hipotensivos después de la infusión de MalPEG-Hb/Placebo, se definió como presión sanguínea sistólica (SBP) <90 mmHg o un descenso >25% en SBP comparada con la del período previo a la infusión. Cada uno de los registros de una SBP que cumple la definición se contó como un episodio hipotensivo. B. Ingestión y producción totales de líquidos (balance hídrico) La medición se efectuó en el día de la cirugía (a partir del inicio de la infusión hasta 24 horas después de iniciar la infusión) y en los días 1, 2 y 3 posteriores a la operación. La ingestión incluyó: líquidos inf ndidos (MalPEG-Hb/Placebo, coloides y cristaloides), transfusiones de sangre e ingestión oral de líquidos . La producción incluyó: orina y la pérdida estimada de sangre durante la cirugía. El tipo y cantidad de líquidos intravenosos se registraron (no se muestran los datos.) La cantidad total de infusiones cristaloides y coloides no fue estadísticamente diferente entre los tres grupos durante todo el período de hospitalización. Sin embargo, hubo diferencias en el período intraoperatorio. Al grupo A se le administró significativamente menos cristaloide (913 + 06 ml) comparativamente con el Grupo B (1299 + 183 ml) y el Grupo c (1281 + 144 ml) (P<0.05). Además, cuando se incluyó MalPEG-Hb en la cantidad de coloide administrado, al Grupo B se le administró significativamente más coloide total (1389 + 169 ml) comparativamente con el Grupo A (850 + 66 ml) o Grupo C (666 + 69 ml) . Ambas diferencias, B vs C y A vs B fueron estadísticamente significantes (P<0.05). No hubo diferencias estadísticamente significantes en la administración de líquidos cristaloides, coloides o intravenosos totales en el resto del estudio . C . Alteraciones cardiacas El número y el tipo de alteraciones cardiacas como medidas de inestabilidad hemodinámica (taquicardia, isquemia, bradicardia y problemas de conducción) fueron evaluados por el cardiólogo cegado. Las alteraciones del ritmo cardiaco se registraron utilizando monitoreo Holter continuo y ECG. D . Intervenciones Farmacológicas El número y dosis de las intervenciones farmacológicas (e.g., drogas para la presión sanguínea, diuréticos) de apoyo cardiovascular también se registraron desde la inducción a la anestesia hasta 12 horas después de inicio de la infusión. E . Transf siones sanguíneas También se registraron las transfusiones sanguíneas (volumen del paquete de eritrocitos) administradas durante la cirugía (desde la inducción con anestesia hasta el final de la cirugía y posteriormente) . F. Utilización de oxígeno Se registró la duración de el suministro de oxígeno suplementario post-operatorio el día de la cirugía y unos cuantos días después. Resultados La inestabilidad hipotensiva que se manifestó como evento adverso, tal como episodios hipotensivos y la necesidad de administrar presores, se muestran en la Tabla 5, abajo. Los resultados obtenidos del porcentaje de eventos hipotensivos también se muestra en la Figura 6. Tabla 5 Los ejemplos que se muestran arriba se proporcionarles a quienes tienen un conocimiento ordinario/normal en la materia, una exhibición y descripción completas de cómo elaborar y utilizar las modalidades preferidas de las composiciones y no se proponen para limitar el ámbito de lo que los inventores consideran como su invención. Las modificaciones de los modos descritos arriba (para efectuar la invención) que son obvias a las personas expertas en la materia se proponen para que estén dentro del ámbito de las siguientes reivindicaciones. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en esta especificación se incorporan en la presente por referencia como si cada una de tales publicaciones, patentes o solicitudes de patente fueran específicamente e individualmente indicadas para incorporarse en la presente por referencia.

Claims (19)

1. REIVINDICACIONES : 1. Un método para mejorar la estabilidad hemodinámica de un sujeto normovolémico que se somete a cirugía que comprende : a) la administración de una composición que contiene un portador de oxígeno a base de hemoglobina (HBOC) con una afinidad al oxígeno más alta que la sangre completa al sujeto en relación con la cirugía; y b) el monitoreo de la estabilidad hemodinámica del paciente .
2. 2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición se administra antes de la cirugía.
3. 3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición se administra durante la cirugía.
4. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la composición se administra después de la cirugía.
5. 5. El método de acuerdo -con la reivindicación 1, en donde la etapa b) se efectúa antes de la cirugía.
6. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa b) se efectúa durante la cirugía.
7. 7. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa b) se efectúa después de la cirugía.
8. 8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el HBOC comprende además una hemoglobina natural modificada por óxido de polialquileno.
9. 9. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el HBOC comprende además una hemoglobina sintética modificada por óxido de polialquileno.
10. 10. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el HBOC comprende además una hemoglobina recombinante .
11. 11. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el HBOC comprende además hemoglobina humana.
12. 12. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el HBOC comprende además una hemoglobina humana de un animal no humano .
13. 13. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el HBOC tiene una afinidad al oxígeno mayor del doble de la de la sangre completa.
14. 14. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el HBOC tiene un P50 entre 4 y 15.
15. 15. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el HBOC comprende además hemoglobina que ha sido modificada por la unión covalente de polietilenglicol activado por malemidilo.
16. 16. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa b) comprende además el monitoreo de la presión sanguínea del sujeto.
17. 17. El método de la reivindicación 16, en donde la estabilización hemodinámica se caracteriza porque el sujeto mantiene una presión sistólica arriba de 90 mm Hg.
18. 18. El uso de un portador de oxígeno a base de hemoglobina (HBOC) en la elaboración de un medicamento para mejorar la estabilidad hemodinámica de un sujeto normovolémico que experimenta cirugía, en donde el HBOC tiene una afinidad al oxígeno mayor que la de la sangre completa.
19. 19. El uso de acuerdo con la reivindicación 18, que comprende además un mejoramiento de la descarga de oxígeno como una medida preventiva para evitar la inestabilidad hemodinámica asociada con la cirugía.