ES2299686T3 - Procedimientos y composiciones para el transporte de oxigeno con alta afinidad por el oxigeno. - Google Patents
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Abstract
Producto substituto de la sangre que consiste en hemoglobina oxigenada modificada en la superficie, en donde la hemoglobina oxigenada modificada en la superficie es hemoglobina a la que se le ha unido covalentemente un óxido de polialquileno a través de un grupo tiol superficial de una cadena lateral aminoacídica expuesta en la molécula de hemoglobina, mientras que la hemoglobina se halla en el estado oxigenado; y en donde la hemoglobina oxigenada modificada en la superficie tiene una P50 menor que la hemoglobina nativa libre de estroma procedente de la misma fuente animal, siempre y cuando se cuantifiquen en las mismas condiciones.
Description
Procedimientos y composiciones para el
transporte de oxígeno con alta afinidad por el oxígeno.
La presente invención hace referencia a
productos de la sangre, y en particular a composiciones que
comprenden una hemoglobina modificada con alta afinidad por el
oxígeno.
La sangre es el medio de transporte de los
nutrientes a los tejidos, y de eliminación de los productos de
desecho excretados por los mismos. La sangre se compone de plasma en
el cual los glóbulos rojos (RBCs por sus siglas en inglés, "Red
Blood Cells", o eritrocitos), los glóbulos blancos (WBCs por sus
siglas en inglés "white blood cells") y las plaquetas se
hallan en suspensión. Los glóbulos rojos comprenden aproximadamente
el 99% de las células en la sangre, y su principal función es el
transporte de oxígeno a los tejidos y la eliminación de dióxido de
carbono de los mismos.
El ventrículo izquierdo del corazón bombea la
sangre a través de las arterias y las arteriolas más pequeñas del
sistema circulatorio. La sangre entra entonces por los capilares,
donde se produce el intercambio de la mayoría de los nutrientes y
productos de desecho. (véase por ejemplo, A. C. Guyton, "Human
Physiology And Mechanisms Of Disease" (3ra. ed.; W. B. Saunders
Co., Philadelphia, Pa.), pp. 228-229 (1982)). A
partir de entonces, la sangre viaja a través de las vénulas y venas
en su retorno a la aurícula derecha del corazón. Aunque la sangre
que retorna al corazón es pobre en oxígeno, comparada con la que se
bombea desde el corazón, en reposo, la sangre que retorna todavía
contiene sobre el 75% del contenido original de oxígeno.
La función de oxigenación reversible (es decir,
el reparto de oxígeno) de los RBCs (por sus siglas en inglés,
"Red Blood Cells") se lleva a cabo mediante la proteína
hemoglobina. En mamíferos, la hemoglobina tiene un peso molecular
de aproximadamente 64.000 daltons y se compone de aproximadamente de
un 6% de grupo hemo y de un 94% de globina. En su forma nativa,
contiene dos pares de subunidades (es decir, es un tetrámero), cada
una de las cuales contiene un grupo hemo y una cadena polipeptídica
globina. En disolución acuosa, la hemoglobina se presenta en
equilibrio entre las formas tetramérica (PM 64.000) y dimérica (PM
32.000). Aparte de los RBCs, los dímeros son excretados
prematuramente por el riñón (vida media en plasma de aproximadamente
2-4 horas). Junto con la hemoglobina, los RBCs
contienen el estroma (la membrana de los RBCs), que contiene
proteínas, colesterol y fosfolípidos.
Debido a la demanda de productos sanguíneos en
los hospitales y otros establecimientos, una gran parte de la
investigación se ha dirigido hacia el desarrollo de substitutos de
la sangre y expansores del volumen plasmático. Un substituto de la
sangre es un producto sanguíneo capaz de transportar y proporcionar
oxígeno a los tejidos. Los substitutos de la sangre tienen
determinados usos, incluyendo la reposición de la pérdida de sangre
durante los procesos quirúrgicos y la consecuente hemorragia aguda,
y los procesos de reanimación tras una lesión traumática. Los
expansores del volumen del plasma o expansores plasmáticos son
substitutos de la sangre que se administran al sistema vascular
pero que normalmente no son capaces de transportar oxígeno. Los
expansores plasmáticos pueden usarse, por ejemplo, para reemplazar
las pérdidas de plasma a causa de quemaduras, para tratar el choque
que se produce por la pérdida de volumen y para efectuar la
hemodilución (por ejemplo, para mantener la normovolemia y reducir
la viscosidad sanguínea). Esencialmente, los substitutos de la
sangre pueden ser utilizados para estos propósitos o cualquier otro
propósito en el que se administre sangre almacenada a los
pacientes. (Véase por ejemplo la patente americana U.S. 4.001.401 de
Bonson y col., y 4.061.736 de Morris y col.)
La fuente actual de sangre humana es limitada, y
ello puede ser paliado gracias al uso de substitutos exógenos de
la sangre. Por ejemplo, una disponibilidad generalizada de
substitutos sanguíneos inocuos y efectivos, reduciría la necesidad
de sangre almacenada (alogénica). Además, tales substitutos
sanguíneos permitirían la inyección inmediata de una solución de
reanimación tras una lesión traumática, sin considerar la
compatibilidad sanguínea (requisito obligado para la sangre),
ahorrando de este modo un tiempo valioso para resuministrar oxígeno
al tejido isquémico. Además, los substitutos de la sangre pueden ser
administrados a los pacientes antes de la cirugía, permitiendo
retirar sangre autóloga de los pacientes que podría ser devuelta
posteriormente durante el proceso, si es necesario, o después de la
cirugía. Así, el uso de productos sanguíneos exógenos no sólo
protege a los pacientes de la exposición a sangre no autóloga
(alogénica), sino también, conserva la sangre autóloga o bien
alogénica (almacenada y testada) para su uso óptimo.
Los intentos para producir substitutos de la
sangre (a veces referidos como "expansores plasmáticos
transportadores de oxígeno") han producido hasta ahora productos
con una eficacia marginal, o cuya producción es tediosa, cara, o
ambas. Frecuentemente, el coste de producción de tales productos es
tan elevado que excluye el uso generalizado de estos productos,
particularmente en aquellos mercados donde existe mayor necesidad
(por ejemplo, economías emergentes del tercer mundo).
Los substitutos de la sangre pueden agruparse en
las siguientes tres categorías: i) emulsiones basadas en
perfluorocarbonos, ii) hemoglobina encapsulada en liposomas, y iii)
hemoglobinas modificadas libres de células. Como se describe más
abajo, ninguna de ellas ha sido completamente satisfactoria, aunque
se piensa que los productos que consisten en hemoglobina modificada
libre de células son los más prometedores. Los compuestos basados
en perfluoroquímicos disuelven oxígeno en lugar de unirlo como
ligando. Para utilizarlos en sistemas biológicos, los
perfluoroquímicos deben emulsionarse con un lípido, generalmente un
fosfolípido de la yema de huevo. Pese a que las emulsiones de
perfluorocarbono son baratas de producir, éstas no transportan
suficiente oxígeno a dosis clínicamente toleradas para ser
efectivas. Por el contrario, mientras la hemoglobina encapsulada en
liposomas ha demostrado ser efectiva, es demasiado costosa para su
uso generalizado. (Véase, Winslow, Robert M.,
"Hemoglobin-based Red Cell Substitutes", Johns
Hopkins University Press, Baltimore (1992)).
La mayoría de los productos substitutos de la
sangre utilizados en ensayos clínicos hoy en día, están basados en
hemoglobina modificada. Estos productos, frecuentemente referidos
como transportadores de oxígeno basados en hemoglobina (HBOCs),
consisten generalmente en una solución acuosa homogénea de
hemoglobina químicamente modificada, esencialmente libre de otros
residuos de los glóbulos rojos (estroma). Aunque la hemoglobina
libre de estroma (SFH) procedente de humanos es la materia prima
más común para preparar un HBOC, se han usado otras fuentes de
hemoglobina. Por ejemplo, la hemoglobina puede ser obtenida o
derivada de sangre animal (por ejemplo, hemoglobina bovina o
porcina) o de bacterias o levadura o animales transgénicos o plantas
molecularmente alterados para producir el producto deseado de
hemoglobina.
La modificación química consiste en
entrecruzamiento intramolecular, oligomerización y/o conjugación
de polímeros, para modificar la hemoglobina de modo que su
persistencia en la circulación se prolongue en relación a la
hemoglobina sin modificar, y sus propiedades de unión al oxígeno
sean similares a las de la sangre. El entrecruzamiento
intramolecular une químicamente subunidades de la unidad de
hemoglobina tetramérica para prevenir la formación de dímeros que,
como se ha indicado previamente, se excretan prematuramente. (Véase,
por ejemplo, patente americana U.S. 5.296.465 de Rausch y col.).
Los costes elevados de la producción de
productos HBOC han limitado mucho su viabilidad comercial. Además,
los presentes inventores han encontrado que los HBOCs conocidos
tienen tendencia a liberar excesivas cantidades de oxígeno a los
tejidos de las paredes de las arteriolas, en lugar de a los
capilares. Esto puede resultar en una disponibilidad insuficiente
de oxígeno para la distribución mediante HBOC a los tejidos
circundantes a los capilares. Esto ocurre a pesar de que la carga
inicial de oxígeno de HBOC pueda ser relativamente alta, comparada
con la que normalmente se alcanza por los glóbulos rojos naturales,
excepto en el caso de mutantes de muy baja afinidad.
En la mayoría de los casos, los HBOCs han sido
diseñados para tener una afinidad por el oxígeno igual o inferior a
la de la hemoglobina nativa. Sin embargo, tal como se describió más
arriba, esto puede resultar en una distribución insuficiente de
oxígeno a los tejidos. Por consiguiente, la presente invención hace
referencia a un substituto de la sangre que consiste en un HBOC con
alta afinidad por el oxígeno en un diluyente acuoso.
Ajisaka y col., Biochem. Biophys. Res. Comm.,
1980, Vol. 97, No. 3, pp. 1076- describen los primeros estudios con
derivados de polietilénglicol (PEG) de hemoglobina humana, como
posibles candidatos para un substituto de la sangre. Los derivados
fueron aparentemente preparados uniendo PEG a los grupos amino de la
hemoglobina usando
2,4,6-tricloro-s-triazina
como agente de unión.
La patente americana U.S. 4.061.736 describe el
primer trabajo sobre hemoglobina entrecruzada intramolecularmente,
para su uso como substituto de la sangre en el transporte de
oxígeno. Las sub-unidades de los respectivos
tetrámeros de la hemoglobina son entrecruzadas covalentemente
(véase, por ejemplo, columna 3, líneas 4-6). El
entrecruzamiento es llevado a cabo en presencia de al menos un
agente entrecruzador covalente bi- o polifuncional, que normalmente
une los grupos amino primarios de residuos de lisina para dar
productos solubles en agua (véase, por ejemplo, columna 5, líneas
20-25). Entre los muchos agentes entrecruzadores que
se mencionan, se encuentra el etilénglicol diglicidil éter y
propilénglicol diglicidil éter (véase columna 8, líneas
16-21). Los ejemplos empleaban los siguientes
agentes entrecruzadores: diisocianato de hexametileno, diepóxido de
butadieno, y divinil sulfona.
La patente americana 6.054.427 describe el
primer trabajo realizado por uno de los inventores de la presente
solicitud. Ésta describe productos substitutos de la sangre que
consisten en un componente transportador de oxígeno y un componente
no transportador de oxígeno (véase, por ejemplo columna 3, líneas
28-31). Preferentemente, el componente
transportador de oxígeno es un transportador de oxígeno basado en la
hemoglobina (véase, por ejemplo columna 3, líneas
39-41). El transportador de oxígeno basado en la
hemoglobina puede ser hemoglobina que ha sido subsecuentemente
modificada por la adición de grupos químicos, incluyendo óxido de
polialquileno (PAO), tal como el polietilénglicol (PEG) (véase, por
ejemplo columna 3, líneas 41-46; columna 4, líneas
23-25). De acuerdo con este documento, la
hemoglobina es modificada con PAO (por ejemplo PEG) con el propósito
de aumentar la viscosidad y el tamaño molecular. Las modificaciones
de la hemoglobina se discuten comenzando en la columna 22. La tabla
3 (en las columnas 23-26) incluye un número de
modificaciones de la hemoglobina que han sido propuestas
previamente. Esta tabla incluye una sección final titulada
"Surface Conjugates" que menciona las modificaciones con
polietilénglicol. Los conjugados de hemoglobina (por ejemplo,
hemoglobina modificada por conjugación con polietilénglicol) se
describen, por ejemplo comenzando en la columna 69, línea 28. En el
primer experimento ("1. Hemoglobin Conjugated to
Polyoxyethylene", columna 69, línea 33), se utilizó
AT-hidroxilsuccinimidilato de ácido
metoxilpoli(etilen glicol) propionico
(M-SPA).
En el Segundo experimento ("2. Hemoglobin
Conjugated to Polyoxyethylene", columna 69, línea 49), se
utilizó monometoxipolioxietilensuccinimidil ester (MPSE). En el
tercer experimento, ("3. Hemoglobin-_Polyethylene
Glycol Conjugate", columna 70, línea 1), se usó metoxipoli
(etilen glicol)-AT-succinimidil
carbonato (SC-PEG). En el cuarto experimento ("4.
Hemoglobin-_Polyethylene Glycol Conjugate",
columna 70, línea 21), fue utilizado polietilénglicol bis
(succinimidil succinato). En los experimentos subsecuentes, se
describen otros conjugados de la hemoglobina sin PEG.
La patente internacional WO 2003/059286
(publicada después de la fecha de registro de la presente solicitud)
describe el uso de una hemoglobina modificada en la superficie en
plasma como substituto de la sangre (véase el párrafo [0013]). La
hemoglobina modificada en la superficie puede ser hemoglobina a la
cual se ha unido un óxido de polialquileno (véase el párrafo
[0018]). En una realización, la modificación de la superficie es
una unión covalente a las cadenas laterales expuestas de aminoácidos
en la molécula de hemoglobina (véase el párrafo [0041]).
La patente internacional WO 2003/059287
(publicada después de la fecha de registro de la presente
solicitud) describe el uso de hemoglobina modificada y de un
cristaloide en una solución acuosa como substituto de la sangre
(véase el párrafo [0013]). La hemoglobina modificada puede ser una
hemoglobina a la que se ha unido un óxido de polialquileno (por
ejemplo, PEG) (véase en los párrafos [0021] y [0022]). En una
realización, la modificación de la superficie es una unión
covalente a las cadenas laterales de aminoácidos expuestas en la
molécula de hemoglobina (véase en los párrafo [0044]. En el Ejemplo
1 se describe una hemoglobina modificada con PEG que fue preparada
primero por tiolación de la hemoglobina y luego reaccionando con PEG
5000 activado con maleimida (véase en el párrafo [0051]).
La patente internacional WO 2004/058291
(publicada después de la fecha de registro de la presente
solicitud) describe una hemoglobina modificada que tienen una serie
de cadenas PEG unidas por medio de grupos tiol (tanto nativos como
introducidos químicamente) por reacción con PEG que ha sido
funcionalizado con un grupo maleimida (véase en los párrafos [0009]
y [0010]).
Un aspecto de la presente invención es un
producto substituto de la sangre que contiene hemoglobina oxigenada
modificada en la superficie, donde la hemoglobina oxigenada
modificada en la superficie es una hemoglobina a la cual se ha
unido covalentemente un óxido de polialquileno vía un grupo tiol de
una cadena lateral de aminoácidos expuesta en la hemoglobina,
encontrándose la hemoglobina en estado oxigenado; y donde la
hemoglobina oxigenada modificada en la superficie tiene una P50
menos que la hemoglobina libre de estroma procedente de la misma
fuente animal, medida en las mismas condiciones.
En un realización, el óxido de polialquileno es
óxido de polietileno, óxido de polipropileno, o un copolímero de de
óxido de polietileno/polipropileno.
En una realización, el óxido de polialquileno es
polietilénglicol.
En una realización, el óxido de polialquileno es
polietilénglicol de acuerdo con la fórmula
H(OCH_{2}CH_{2})_{n}OH, donde n es mayor o igual
a 4.
En una realización, el producto substituto de la
sangre contiene hemoglobina oxigenada modificada en la
superficie,
en donde la hemoglobina oxigenada modificada en
la superficie es una hemoglobina a la cual se ha unido
covalentemente polietilénglicol activado con maleimida vía un grupo
tiol de la superficie de una cadena lateral de aminoácidos expuesta
de la molécula de hemoglobina, hallándose la hemoglobina en estado
oxigenado;
y donde la hemoglobina oxigenada modificada en
la superficie tiene una P50 inferior al de la hemoglobina libre de
estroma de la misma fuente animal, cuantificados en las mismas
condiciones.
En una realización, el polietilénglicol es
polietilénglicol de acuerdo con la fórmula
H(OCH_{2}CH_{2})_{n}OH, donde n es igual o
superior a 4.
En una realización, el producto substituto de la
sangre es un producto substituto de la sangre que contiene una
hemoglobina oxigenada modificada en la superficie, en donde la
hemoglobina oxigenada modificada en la superficie tiene la
fórmula:
Hb-(S-Y-R-CH_{2}-CH_{2}-(O-CH_{2}-CH_{2}]n-O-CH_{3})_{m}
En donde:
Hb es una hemoglobina tetramérica;
S es un grupo tiol de la superficie;
Y es un conector covalente de succinimida;
R es un grupo alquilo, amida, carbamato, o
fenilo;
n define la longitud del polímero y es igual o
superior a 4; y
m es el número de polímeros de PEG unidos a la
superficie de la hemoglobina; y
en donde la hemoglobina oxigenada modificada en
la superficie tiene una P50 inferior al de la hemoglobina libre de
estroma nativa procedente de la misma fuente animal cuando se
cuantifica en las mismas condiciones.
\vskip1.000000\baselineskip
En una realización, m es
4-5.
En una realización, antes de la modificación de
la superficie, la hemoglobina ha sido tiolada.
En una realización, el producto substituto de la
sangre tiene un cociente metemoglobina/hemoglobina total inferior a
0,10.
En una realización, la hemoglobina oxigenada
modificada en la superficie tiene una P50 inferior a 10 torr (1333
Pa).
En una realización, la hemoglobina oxigenada
modificada en la superficie tiene una P50 inferior a 7 torr (933
Pa).
En una realización, el producto substituto de la
sangre es estable a la autooxidación a 24ºC , dicho producto
contiene un conjugado PEG-hemoglobina, donde el
cociente metemoglobina/hemoglobina total es inferior a 0,10 y el
conjugado PEG-hemoglobina tiene una P50 inferior 10
torr (1333 Pa).
En una realización, la hemoglobina es
hemoglobina de caballo.
Otro aspecto de la presente invención es una
composición útil como substituto de la sangre, que comprende tal un
producto substituto de la sangre como se describió mas arriba en un
diluyente acuoso.
En una realización, la concentración de
hemoglobina está entre 0,1 y 4,0 g/dl.
Otro aspecto de la presente invención es un
producto substituto de la sangre tal como se describió más arriba
para su uso en un procedimiento para el tratamiento o terapia del
hombre o de un animal.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de un producto substituto de la sangre tal como se describió más
arriba para su uso en la producción de medicamentos para el
tratamiento de traumatismos, isquemias, hemodilución, choque
séptico, cáncer, anemia crónica, anemia falciforme, cardioplegia, o
hipoxia.
Otro aspecto de la presente invención es el uso
de un producto substituto de la sangre tal como se describió más
arriba para su uso en la producción de un medicamento para el
tratamiento veterinario de la pérdida de sangre debida a heridas,
anemia hemolítica, anemia infecciosa equina, anemia infecciosa
felina, infección bacteriana, fragmentación del Factor IV,
hiperesplenismo y esplenomegalia, síndrome hemorrágico en aves de
corral, anemia hipoplásica, anemia aplásica, anemia hemolítica
autoinmune idiopática, deficiencia de hierro, anemia hemolítica
isoinmune, anemia hemolítica microangiopática, o parasitismo.
Los procedimientos y composiciones descritos
aquí son útiles en una diversidad de instalaciones incluyendo salas
de emergencia, salas de operaciones, salas de emergencias militares,
hospitales de cáncer, y clínicas veterinarias. La baja toxicidad y
la alta estabilidad de las composiciones permiten su almacenamiento
a temperatura ambiente sin poner en peligro la eficacia del
substituto sanguíneo. Además, las composiciones evitan la necesidad
de pruebas de compatibilidad sanguínea de la sangre y los ensayos de
laboratorio asociados, permitiendo una intervención más rápida y
segura en el tratamiento de los pacientes. La combinación de baja
toxicidad, estabilidad a largo plazo y aplicabilidad universal de
las composiciones presentan por tanto un substituto de la sangre
particularmente útil.
Lo que aquí se describe es un producto compuesto
por hemoglobina oxigenada modificada en la superficie, donde la
hemoglobina oxigenada modificada en la superficie tiene una P50
menor que la hemoglobina nativa libre de estroma de la misma fuente
animal (es decir, de la misma especie animal) cuando se mide bajo
las mismas condiciones. Las fuentes animales adecuadas incluyen, por
ejemplo humanos, vacas, cerdos, caballos.
En una realización preferida, el producto
substituto de la sangre toma la forma de una composición que
contiene la hemoglobina oxigenada modificada en la superficie y un
diluyente acuoso.
En una realización específica, la hemoglobina
oxigenada modificada en la superficie tiene una P50 inferior a 10
torr (1333 Pa), preferentemente inferior a 7 torr (933 Pa).
También se describe aquí un producto substituto
de la sangre producido por acoplamiento covalente de uno o más
óxidos de polialquileno con la hemoglobina oxigenada.
En una realización específica, el producto
substituto de la sangre se produce por acoplamiento covalente de un
polímero de óxido de polialquileno tal como el polietilénglicol
(PEG) de fórmula H(OCH_{2}CH_{2})_{n}OH, donde
n es mayor o igual a 4. Preferiblemente, el producto tiene un
cociente metemoglobina/hemoglobina total inferior a 0,10.
También se describe aquí un producto substituto
de la sangre estable a la autooxidación a 24ºC, que consiste en un
conjugado PEG-hemoglobina, donde el cociente
metemoglogina/hemoglobina total es inferior a 0,10 y el conjugado
PEG-hemoglobina tiene una P50 inferior a 10 torr
(1333 Pa).
También se describe aquí un procedimiento para
hacer una composición substituta de la sangre que comprende los
pasos: a) preparación de la hemoglobina con un cociente
metemoglobina/hemoglobina total inferior a 0,1; b) unión covalente
del óxido de polialqileno con la hemoglobina para formar hemoglobina
oxigenada modificada en la superficie, con una P50 inferior a 10
torr (1333 Pa); y c) resuspensión de la hemoglobina oxigenada
modificada en la superficie en un diluyente adecuado.
Preferentemente, la preparación de hemoglobina conlleva además,
aislar la hemoglobina de los glóbulos rojos.
Además, el paso para preparar hemoglobina puede
conllevar el aislamiento de la hemoglobina de los glóbulos rojos,
en donde la hemoglobina tiene un cociente metemoglobina/hemoglobina
total de 0,1 o superior, y la exposición de la hemoglobina a
condiciones aeróbicas (es decir, a la atmósfera) durante un tiempo
suficiente para disminuir el cociente metemoglobina/hemoglobina
total a menos de 0,10. Este paso podría llevarse a cabo en ausencia
de un agente reductor que contenga un grupo tiol.
También se describe aquí un procedimiento de
utilización de un producto substituto de la sangre para distribuir
oxígeno a los tejidos, que consiste en administrar el producto en un
diluyente acuoso a un mamífero que lo necesite.
La Figura 1 describe EL cromatograma de la
MalPEG-Hb y SFH.
La Figura 2 describe las curvas de equilibrio
deL oxígeno para MalPEG-Hb y SFH.
La figura 3 describe patrones de FPLC de la
elución para las dos hemoglobinas modificadas (PHP y POE) y la
hemoglobina (SFH). Advertir que los patrones para PHP y POE son
cualitativamente, pero no cuantitativamente, similares. También
advertir el pico pequeño de hemoglobina aparentemente no modificada
en la curva POE.
La figura 4 describe la curva de equilibrio para
las dos hemoglobinas modificadas con PEG (PHP y POE). Advertir que
ninguna tiene cooperatividad significativa.
La Figura 5 describe el cociente de oxidación
frente al tiempo, cuando MalPEG-hemoglobina está a
temperatura ambiente. Las muestras fueron medidas por duplicado, de
dos botellas separadas almacenadas de la misma manera. La tasa de
oxidación es del 1 por ciento por hora de la hemoglobina total,
yendo de 5,0 a 5,5 por ciento en 10 horas.
La Figura 6 describe el análisis de
supervivencia de Kaplan-Meier de los dos grupos de
animales que recibieron bien PHP o POE.
La figura 7 describe la presión arterial media
en animales que recibieron las dos hemoglobinas modificadas con PEG
(PBP y POE). La respuesta es inmediata y mayor en los animales que
recibieron PHP. Sin embargo, la presión se mantiene mejor en los
animales con POE durante el periodo de hemorragia.
La figura 8 describe un resumen de varios
cocientes de oxidación sobre el tiempo cuando la
MalPEG-Hb es almacenada durante seis días a -20ºC,
cinco días a +4ºC, y diez horas a temperatura ambiente (24ºC).
La Figura 9 describe la tasa de oxidación sobre
el tiempo cuando MalPEG-Hb es almacenada durante
cinco días a +4ºC.
La Figura 10 describe el cociente de oxidación
sobre el tiempo cuando MalPEG-Hb es almacenado
durante diez horas a temperatura ambiente.
La presente invención está dirigida a
substitutos de la sangre que consisten en HBOCs que tienen alta
afinidad por el oxígeno. Para ciertas aplicaciones, estas
composiciones son capaces de distribuir el oxígeno a los tejidos de
forma más eficiente que los substitutos de la sangre con afinidades
por el oxígeno próximas a las de la hemoglobina nativa.
Para facilitar la comprensión de la invención
que se presenta en la descripción que prosigue, se definen una serie
de términos a continuación.
El término "hemoglobina" se refiere
generalmente a la proteína que transporta oxígeno contenida en los
glóbulos rojos. Cada molécula de hemoglobina tiene 4 subunidades,
dos cadenas \alpha y 2 cadenas \beta, dispuestas en una
estructura tetramérica. Cada subunidad contiene también un grupo
hemo, que es el centro que contiene el hierro que une oxígeno. Así,
cada molécula de hemoglobina puede unir cuatro moléculas de
oxígeno.
El término "hemoglobina modificada"
incluye, aunque no está limitado, la hemoglobina alterada mediante
una reacción química tal como entrecruzamiento intra- e
inter-molecular, manipulación genética,
polimerización, y/o conjugación con otro grupo químico (por
ejemplo, óxidos de polialquileno, como por ejemplo polietilénglicol,
u otros aductos tales como proteínas, péptidos, carbohidratos,
polímeros sintéticos y similares). En esencia, la hemoglobina está
"modificada" si se han alterado alguna de sus propiedades
estructurales o funcionales respecto a su estado nativo. Tal como
se usa aquí, el término "hemoglobina" por sí mismo se refiere
tanto a la hemoglobina nativa sin modificar, como a la hemoglobina
modificada.
El término "hemoglobina modificada en la
superficie" se utiliza para referirse a la hemoglobina descrita
más arriba a la cual se han unido grupos químicos, tales como
dextrano u óxido de polialquileno, la mayoría covalentemente. El
término "hemoglobina oxigenada modificada en la superficie" se
refiere a la hemoglobina que se encuentra en el estado "R"
cuando cuando se ha modificado su superficie.
El término "hemoglobina libre de estroma"
se refiere a la hemoglobina a la que se han eliminado todas de las
membranas de los glóbulos rojos.
El término "metemoglobina" se refiere a una
forma oxidada de la hemoglobina que contiene hierro en el estado
férrico y no puede funcionar como trasportadora de oxígeno.
El término "MalPEG-Hb" se
refiere a hemoglobina a la cual se ha conjugado PEG activado por
maleimida. Tal MalPEG puede ser referido más adelante mediante la
siguiente fórmula:
Formula
IHb-(S-Y-R-CH_{2}-CH_{2}-[O-CH_{2}-CH_{2}]_{n}-O-CH_{3})_{m}
donde Hb se refiere a hemoglobina
tetramérica, S es un grupo tiol de superficie, Y es el enlace
succinimido covalente entre Hb y MalPEG, R es un alquilo, amida,
carbamato o grupo fenil (dependiendo de la fuente de la materia
prima y del método de síntesis química),
[O-CH_{2}-CH_{2}]_{n}
son las unidades de oxietileno que constituyen la cadena del
polímero de PEG, donde n define la longitud del polímero(por
ejemplo, PM = 5000), y O-CH_{3} es el grupo metoxi
terminal. PHP y POE son dos hemoglobinas diferentes modificadas por
PEG.
El término "perfluorocarbonos" se refiere a
moléculas sintéticas, inertes, que contienen átomos de flúor, y que
consisten totalmente en átomos de halógeno (Br, F, Cl) y átomos de
carbono. En la forma de emulsiones, éstos se encuentran en
desarrollo como substancias sanguíneas, porque tienen la habilidad
de disolver mucho más oxígeno que la cantidad equivalente de plasma
o agua.
El término "expansor plasmático" se refiere
a cualquier solución que pueda ser dada a un sujeto para tratar la
pérdida de sangre.
El término "capacidad transportadora de
oxígeno", o simplemente "capacidad de oxígeno" se refiere a
la capacidad de un substituto de la sangre para transportar oxígeno,
pero no necesariamente se correlaciona con la eficiencia con la que
lo distribuye. La capacidad transportadora de oxígeno generalmente
se calcula a partir de la concentración de hemoglobina, ya que se
conoce que un gramo de hemoglobina une 1,34 ml de oxígeno. Así, la
concentración de hemoglobina en g/dl multiplicada por el factor 1,34
resulta en la capacidad de oxígeno en ml/dl. La concentración de
hemoglobina puede ser medida por cualquier método conocido, tal como
el Fotómetro de \beta-Hemoglobina (HemoCue, Inc.,
Angelholm, Suecia). Asimismo, la capacidad de oxígeno puede medirse
por la cantidad de oxígeno liberada de una muestra de hemoglobina o
sangre usando, por ejemplo, una célula de combustible (por ejemplo,
Lex-O_{2}-Con; Lexington
Instruments).
El término "afinidad por el oxígeno" se
refiere a la avidez con la que un trasportador de oxígeno, como la
hemoglobina une oxígeno molecular. Esta característica se define por
la curva de equilibrio del oxígeno que relaciona el grado de
saturación de la molécula de hemoglobina con el oxígeno (eje Y) con
la presión parcial de oxígeno (eje X). La posición de esta curva se
indica por el valor de P50, la presión parcial de oxígeno a la cual
el transportador de oxígeno está saturado a la mitad con oxígeno, y
es inversamente proporcional a la afinidad por el oxígeno. De ahí
que a menor P50, mayor afinidad por el oxígeno. La afinidad por
oxígeno de la sangre (y componentes de la sangre como los glóbulos
rojos y la hemoglobina) puede ser medida por varios métodos
conocidos en la materia. (Véase, por ejemplo, Winslow y col.,
J.Biol. Chem. 252(7):2331-37 (1997)). La
afinidad por oxígeno también puede ser determinada utilizando un
analizador comercial HEMOX^{TM} TM Analyzer (TCS Scientific
Corporation, New Hope, Pennsylvania). (Véase, por ejemplo,
Vandegriff y Shrager en "Methods in Enzymology" (Everse y col.,
eds) 232:460 (1994)).
El término "hipertónico" significa una
disolución coloidal con una presión osmótica coloidal (oncótica)
respecto a la sangre (>aproximadamente a 25-27
mmHg (3333-3600 Pa)). La presión coloide osmótica
puede medirse por cualquier técnica apropiada, como en un
instrumento Wescor.
El término "componente transportador de
oxígeno" se refiere en general a una sustancia capaz de
trasportar oxígeno en el sistema circulatorio y distribuir al menos
una porción de ese oxígeno a los tejidos. En las realizaciones
preferidas, el componente transportador de oxígeno es una
hemoglobina nativa o modificada, y también es referida aquí como un
"transportador de oxígeno basado en hemoglobina" o
"HBOC".
El término "parámetros hemodinámicos" se
refiere en general a medidas indicativas de la presión sanguínea,
estado de flujo y volumen, incluyendo medidas como la presión
sanguínea, gasto cardiaco, la presión de la aurícula derecha, y la
presión diastólica final del ventrículo izquierdo.
El término "cristaloide" se refiere a
pequeñas moléculas (normalmente menores de 10 \ring{A} (1 nm))
como sales, azúcares, y tampones. A diferencia de los coloides, los
cristaloides no contienen ningún componente activo oncóticamente y
se equilibran en la circulación y en los espacios intersticiales muy
rápidamente.
El término "coloide", en contraste con el
de "cristaloide" se refiere a moléculas más grandes
(normalmente mayores que 10 \ring{A} (1 nm)) que se equilibran a
través de las membranas biológicas dependiendo de su tamaño y carga
e incluyen proteínas como la albúmina y la gelatina, y almidones
como el pentalmidón y el hetalmidón.
El término "presión osmótica coloidal" se
refiere a la presión ejercida por un coloide para equilibrar el
balance de fluidos a través de una membrana.
El término "estable a la autooxidación" se
refiere a la habilidad de un HBOC para mantener un bajo cociente de
oxidación. Un HBOC se considera estable a 24ºC si el cociente
metemoglobina/hemoglobina total no aumenta más que un 2% tras 10
horas a 24ºC. Por ejemplo, si el cociente de autooxidación es 0,2
h^{-1}, entonces si el porcentaje inicial de metemoglobina es 5%,
el HBOC sería considerado estable a temperatura ambiente durante 10
horas si el porcentaje no aumenta por encima del 7%.
El término "cociente metemoglobina/hemoglobina
total" se refiere al cociente de hemoglobina desoxigenada sobre
la hemoglobina total.
El término "mezcla" hace referencia a la
agregación de dos o más substancias sin que reaccionen por la cual
éstas perderían sus propiedades individuales; el término
"disolución" se refiere a una mezcla de líquidos; el término
"disolución acuosa" se refiere a una disolución que contiene
agua y puede también contener una o más substancias líquidas con
agua para formar una disolución multi-componente; el
término "aproximadamente" se refiere a un valor concreto
dentro de un intervalo, por ejemplo, 10% del valor indicado.
El término "polietilénglicol" hace
referencia a polímeros sólidos o líquidos de la fórmula general
H(OCH_{2}CH_{2})_{n}
OH, donde n es mayor o igual a 4. Puede utilizarse cualquier formulación de PEG, substituida o sin substituir.
OH, donde n es mayor o igual a 4. Puede utilizarse cualquier formulación de PEG, substituida o sin substituir.
El significado de otra terminología empleada
aquí debería ser fácilmente entendida por cualquier persona con
experiencia razonable en el campo.
Aunque la utilización satisfactoria de las
composiciones y procedimientos aquí descritos no requiere la
compresión del mecanismo de distribución y consumo del oxígeno, un
conocimiento básico de los mismos, puede ayudar a la comprensión de
la discusión que prosigue. Generalmente se asume que los capilares
son los principales transportadores de oxígeno a los tejidos. Sin
embargo, respecto a los tejidos en reposo, los descubrimientos
actuales indican que hay aproximadamente una igualdad entre la
liberación de oxígeno arteriolar y capilar. Es decir, se cree que
la hemoglobina en el sistema arterial distribuye aproximadamente un
tercio de su contenido en oxígeno dentro de la red arteriolar, y un
tercio en los capilares, mientras que el oxígeno restante sale de la
microcirculación a través del sistema venoso.
Las arterias por sí mismas utilizan oxígeno. Por
ejemplo, la pared arterial requiere energía para regular el flujo
sanguíneo a través de la contracción en contra de la resistencia
vascular. Así, la pared arterial es un sitio significativo para la
difusión de oxígeno. Sin embargo, los compuestos actuales de
distribución de oxígeno (por ejemplo, los HBOCs) pueden liberar
demasiado oxígeno al sistema arterial, y por tanto, inducir una
repuesta reductora de la perfusión capilar. Por consiguiente, la
eficacia de la distribución de oxígeno de un substituto de la
sangre puede verse dificultada por tener demasiado oxígeno o una
demasiada baja afinidad por el oxígeno.
La tasa de consumo de oxígeno por la pared
vascular, es decir, la combinación del oxígeno requerido para un
trabajo mecánico y el oxígeno requerido para la síntesis bioquímica,
puede determinarse cuantificando el gradiente en la pared vascular.
Véase por ejemplo, Winslow, y col., en "Advances in Blood
substitutes" (1997), Bikhauser, ed., Boston, MA, páginas
167-188. La tecnología actual permite la medida
exacta de la presión parcial de oxígeno en diferentes vasos. El
gradiente medido es directamente proporcional a la tasa de
utilización de oxígeno por el tejido en la región medida. Tales
medidas indican que la pared vascular tiene una línea base de
utilización de oxígeno que aumenta con el aumento de la inflamación
y la constricción, y que disminuye con la relajación.
El gradiente en la pared vascular es
inversamente proporcional a la oxigenación del tejido. La
vasoconstricción aumenta el gradiente de oxígeno (metabolismo
tisular), mientras que la vasodilatación disminuye el gradiente.
Gradientes grandes indican que la pared vascular está utilizando más
oxígeno, mientras que queda menos oxígeno disponible para el
tejido. Se cree que el mismo fenómeno ocurre en la
microcirculación.
El fundamento del desarrollo de un HBOC con una
alta afinidad por el oxígeno se basa, en parte, en estudios
anteriores que utilizaron hemoglobinas libres de células como
alternativa a las transfusiones de glóbulos rojos. Algunos de los
efectos fisiológicos de estas disoluciones no se comprenden
completamente. De éstos, el más controvertido es quizá la
propensión a causar vasoconstricción, que puede manifestarse como
hipertensión en animales y en el hombre (Amberson, W., "Clinical
experience with hemoglobine-saline solutions",
Science 106:117-117 (1947)) (Keipert, P., A.
Gonzales, C. Gomez, V. Macdonald, J. Hess, and R. Winslow, "Acute
changes in systemic blood pressure and urine output of concious rats
following exchange transfusion with
diaspirin-crosslinked hemoglobin solution",
Transfusion 33: 701-708, (1993)). La hemoglobina
humana con las cadenas \alpha entrecruzadas con
bis-dibromosalicil-fumarato
(\alpha\alphaHb) fue desarrollada por el ejército de EEUU como
modelo de un substituto de los glóbulos rojos, pero fue abandonado
por éste tras demostrar graves aumentos en la resistencia vascular
pulmonar y sistémica (J. Hess, V. Macdonald, A. Mumay, V. Coppes, y
C. Gomez, "Pulmonary and systemic hypertension after hemoglobin
administration", Blood 78:356ª (1991). Una versión comercial de
este producto fue abandonada tras resultados decepcionantes del
ensayo clínico de Fase III (Winslow, R.M.
"\alpha\alpha-Crosslinked hemoglobin: Was
failure predicted by preclinical testing?" Vox sang 79:
1-20 (2000)).
La explicación más común para la
vasoconstricción producida por la hemoglobina libre de células, es
que ésta une fácilmente el factor relajante derivado del endotelio,
el óxido nítrico (NO). De hecho, se han producido hemoglobinas
recombinantes con afinidad reducida por el NO que parecen ser menos
hipertensivas en experimentos de carga máxima con ratas (Doherty,
D. H., M. P. Doyle, S. R. crry, R. J. Vali, T. J. Fattor, J. S.
Olson, y D. D. Lemon, "Rate of reaction with nitric oxide
determines the hypertensive effect of cell-free
hemoglobin", Nature Biotechnology 16: 672-676
(1998)) (Lemon, D. D., D. H. Doherty, S. R. Curry, A. J. Mathews,
M. P. Doyle, T. J. Fattor, y J. S. Olson, "Control of the nitric
oxide-scavenging activity of hemoglobin", Art
Cells, blood Subs., and Immob. Biotech 24:378 (1996)). Sin embargo,
los estudios sugieren que la unión de NO puede no ser la única
explicación para la actividad vascular de la hemoglobina. Se ha
hallado que ciertas moléculas grandes de hemoglobina, como aquellas
modificadas con polietilénglocol (PEG), virtualmente estaban libres
del efecto hipertensivo, incluso aunque sus tasas de unión a NO eran
idénticas a las de la \alpha\alphaHb severamente hipertensiva
(Rohlfs, R. J., E. Bruner, A. Chiu, A. Gonzales, D. Magde, K. D.
Vandegriff, y R. M. Winslow, "Arterial blood pressure responses
to cell-free hemoglobim solutions and the reactions
with nitric oxide", J. Biol. Chem. 273:
12128-12134 (1998)). Además, se halló que la
PEG-hemoglobina era extraordinariamente efectiva en
la prevención de las consecuencias de la hemorragia cuando se
administraba en una transfusión antes de la hemorragia. (Winslow,
R. M., A. Gonzales, M. Gonzales, M. Magde, M. McCarthy, R. J.
Rohlfs, y K. D. Vandegriff, "Vascular resistance and the efficacy
of res cell substitutes", J Appl Physiol 85:
993-1003 (1998)).
Este efecto protector relacionado con la falta
de hipertensión, sugiere que la vasoconstricción es responsable de
la actuación indeseada de muchos de los productos basados en
hemoglobina estudiados hasta la fecha. Basándose en estas
observaciones, se desarrolló una hipótesis para explicar la
vasocostricción, como alternativa, o posiblemente en adición al
efecto de la unión a NO. Sin desear ser partidarios de ninguna
teoría, se cree que un componente substancial del efecto vasoactivo
de la hemoglobina es su respuesta a la difusión de la misma en el
espacio libre de células. Esta hipótesis fue probada en un sistema
capilar in vitro, y se demostró que la
PEG-hemoglobina, que tiene una constante de difusión
reducida, transfería O_{2} de manera similar a la de los glóbulos
rojos nativos (McCarthy, M. R., K. D. Vandegriff, y R. M. Winslow,
"The role of facilitated diffusion in oxygen transport by
cell-free hemoglobin: Implications for the design of
hemoglobin-based oxygen carriers", Biophysical
Chemistry 92: 103-117 (2001)). Se espera que la
afinidad por el oxígeno de la hemoglobina juegue un papel
importante en la difusión del mismo, ya que el cambio en la
saturación desde la hemoglobina a la pared vascular es un
determinante del gradiente de difusión de la propia hemoglobina.
La afinidad por el oxígeno de la hemoglobina
libre de células puede jugar un papel adicional en la regulación
del tono vascular, ya que la liberación de O_{2} a la pared
vascular en las arteriolas desencadena la vasoconstricción (L.
Lindbom, R. Tuma, K. Arfors, "Influence of oxigen on perfusion
capillary density and capillary red cell velocityin rabbit
skeletal muscle", Microvasc Res 19:197-208
(1980)). En los vasos de los pliegues de la piel de los hámsters,
la PO_{2} se encuentra entre 20-40 Torr
(2666-5333 Pa), donde la curva de equilibrio del
oxígeno para un glóbulo rojo normal es la más pendiente
(Intaglietta, M., P. Johnson, y R. Winslow, "Microvascular and
tissue oxygen distribution", Cardiovasc Res 32:
632-643 (1996)). Así, desde un punto de vista
teórico, podría ser importante que la P50 de la hemoglobina libre de
células sea inferior a la de los glóbulos rojos (es decir, mayor
afinidad por el O_{2}), con el fin de prevenir la liberación de
O_{2} en los vasos arteriolares.
El transportador de oxígeno (es decir, el
componente transportador de oxígeno) es un transportador de oxígeno
basado en hemoglobina, o HBOC. La hemoglobina puede ser tanto nativa
(sin modificar); modificada posteriormente por una reacción
química, como entrecruzamiento intra- o
inter-molecularmente, polimerización o la adición
de grupos químicos (por ejemplo, óxidos de polialquilenos u otros
aductos); o puede ser diseñada recombinantemente. Los genes de las
globinas alfa y beta humanas han sido clonadas y secuenciadas.
Libhaber y col., P.N.A.S. 77: 7054-7058 (1980);
Marotta y col., J. Biol. Chem. 353: 5040-5053 (1977)
(cDNA de la beta-globina). Además, muchas
hemoglobinas modificadas producidas recombinantemente, se han
producido utilizando mutagénesis dirigida, aunque se ha notificado
que estas hemoglobinas "mutantes" tienen una afinidad por el
oxígeno demasiado elevada. Véase, por ejemplo, Nagai, y col.,
P.N.A.S., 82:7252-7255 (1985).
La presente invención no está limitada por la
fuente de hemoglobina. Por ejemplo, ésta puede derivarse de humanos
y animales. Para ciertas aplicaciones, las fuentes preferidas de
hemoglobina son el hombre, vacas y cerdos. Además, la hemoglobina
puede producirse por otros procedimientos, incluyendo la síntesis
química y las técnicas recombinantes. La hemoglobina se puede
añadir a la composición del producto sanguíneo en forma libre, o
puede estar encapsulada en una vesícula, como una partícula
sintética, un microglobo o un liposoma. Los componentes
transportadores de oxígeno deben ser libres de estroma y
endotoxinas. Algunos ejemplos representativos de componentes
transportadores de oxígeno se describen en una serie de Patentes
Americanas, entre las que se encuentran la Patente americana U.S.
4.857.636 de Hsia; patente americana U.S. 4.600.531 de Walder,
patente americana U.S. 4.061.736 de Morris y col.; patente
americana U.S. 3.925.344 de Mazur; patente americana U.S. 4.529.719
de Tye; patente americana U.S. 4.473.496 de Scannon; 4.584.130 de
Bocci y col.; patente americana U.S. 5.250.665 de Kluger y col.;
patente americana U.S. 5.028.588 a Hoffman y col.; y patente
americana U.S. 4.826.811 y patente americana U.S. 5.194.590 de
Sehgal y col.
Además de las fuentes de hemoglobina
mencionadas, se ha encontrado recientemente que la hemoglobina de
caballo posee ciertas ventajas como componente transportador de
oxígeno para la composición de la presente invención. Una ventaja
es que existen cantidades comerciales de sangre de caballo
fácilmente disponibles, de las cuales se puede purificar la
hemoglobina de caballo. Otra ventaja es que la hemoglobina de
caballo muestra propiedades químicas que pueden incrementar su
utilidad en los substitutos de la sangre de la presente
invención.
En informes previos, se indica que la
hemoglobina de caballo se auto-oxida a metemoglobina
más rápidamente que la humana, lo que la haría menos indicada como
componente substituto de la sangre. Véase, por ejemplo, J. G.
McLean e I. M. Lewis, Research in Vet Sci, 19:
259-262 (1975). Para minimizar la oxidación, McLean
y Lewis utilizaron un agente reductor, glutatión, tras la lisis de
los glóbulos rojos. Sin embargo, la hemoglobina que se utiliza para
preparar las composiciones de la presente invención,
independientemente de si la hemoglobina procede del hombre o del
caballo, no requiere el empleo de agentes reductores para prevenir
la auto-oxidación, tras la lisis de los glóbulos
rojos.
Más recientemente, se ha notificado que la
hemoglobina de caballo tiene una afinidad por el oxígeno diferente
a la hemoglobina humana. Véase, por ejemplo, M. Mellegrini, y col.,
Eur. J. Biochem., 268: 3313-3320 (2001). Esta
diferencia, disuadiría de la selección de la hemoglobina de caballo
para preparar substitutos de la sangre que mimeticen la hemoglobina
humana. Sin embargo, cuando se incorpora en la composición de la
presente invención, no se observa una diferencia significativa
(inferior al 10%) en la afinidad por el oxígeno de los conjugados
que contienen hemoglobina humana y de caballo.
Por consiguiente, a pesar de estas propiedades
aparentemente indeseables, en las composiciones de la presente
invención, la hemoglobina de caballo es equivalente, si no superior,
a la hemoglobina humana.
Para utilizar en la presente invención, los HBOC
tienen una afinidad por el oxígeno superior a la sangre completa, y
preferentemente el doble de ésta, o alternativamente, mayor que la
hemoglobina libre de estroma (SFH), cuando se miden en las mismas
condiciones. En la mayoría de casos, esto significa que el HBOC en
el substituto de la sangre tendrá una P50 inferior a 10 Torr (1333
Pa), y preferentemente inferior a 7 Torr (933 Pa). En el estado
libre, la SFH tiene una P50 de 15 torr (2000 Pa) aproximadamente,
mientras que la P50 de la sangre entera es aproximadamente de 28
Torr. Previamente se ha sugerido que aumentando la afinidad por el
oxígeno, y por tanto bajando la P50), se puede aumentar la
distribución de oxígeno a los tejidos, aunque se aseguraba que una
P50 inferior a la de la SFH no sería aceptable. Véase Winslow, y
col. en "Advances in Blood Substitutes" (1997), Birkhauser,
ed, Boston, MA, en la página 167, y la patente americana 6.054.427.
Esta sugerencia se contradice con la creencia general de que las
hemoglobinas modificadas que se utilizan como substitutos de la
sangre, deberían tener una afinidad por el oxígeno más baja, y
deberían tener la P50 similar a las de la sangre completa. Así,
muchos investigadores han utilizado piridoxilfosfato para aumentar
la P50 de la SFH de 10 Torr (1333 Pa) a 20-22 Torr
(2666-2933 Pa), ya que la hemoglobina
piridoxilfosfatada libera el oxígeno más fácilmente que la SFH.
Hay muchas propuestas científicas para producir
HBOCs con alta afinidad por el oxígeno (es decir, aquellos con una
P50 inferir a la de SFH). Por ejemplo, hay estudios que han
identificado los aminoácidos que juegan un papel en la afinidad por
el oxígeno, como la cisteína \beta-93, y por tanto
hoy se puede llevar a cabo la mutagénesis dirigida para manipular
la afinidad por el oxígeno al nivel deseado. Véase por ejemplo, la
patente americana U.S. 5.661.124. En la patente americana U.S.
6.054.427 se discuten muchas otras propuestas.
La hemoglobina se auto-oxida
cuando cambia reversiblemente del estado ferroso (Fe^{2+}) al
estado férrico (Fe^{3+}) o metemoglobina. Cuando esto ocurre, el
oxígeno molecular se disocia de la oxihemoglobina en forma de ión
superóxido (O_{2}^{-}). Esto también resulta en la
desestabilización del complejo hemo-globina y
eventualmente en la desnaturalización de las cadenas de globina.
Tanto la formación del radical oxígeno como la desnaturalización de
la proteína, se cree que juegan un papel importante en la toxicidad
in vivo de los HBOCs (Vandegriff, K. D., Blood Substitutes,
Physiological Basis of Efficacy, páginas 105-130,
Winslow y col., ed., Birkhauser, Boston, MA (1995).)
Con la mayoría de los HBOCs, hay una correlación
negativa entre la afinidad por el oxígeno y la oxidación de la
hemoglobina, es decir, a mayor afinidad por el oxígeno, menor es el
cociente de auto-oxidación. Sin embargo, el efecto
de las diferentes modificaciones de la hemoglobina en la afinidad
por el oxígeno y la tasa de auto-oxidación, no es
siempre predecible. Además, el equilibrio óptimo entre la afinidad
por el oxígeno y la auto-oxidación no se entiende
completamente.
La presente invención, se relaciona, en parte,
con el descubrimiento inesperado de que los conjugados
PEG-Hb descritos aquí, muestran tasas de
auto-oxidación muy bajos. Cuando se mide la tasa de
auto-oxidación, ésta ha de ser lo más baja posible
(es decir, un 0,2% por hora de la hemoglobina total, preferiblemente
un 0,1% de la misma, a temperatura ambiente durante al menos 3
horas, y más preferiblemente durante al menos 10 horas). Así, los
HBOCs de la presente invención se mantienen estables durante la
administración y/o almacenamiento a temperatura ambiente.
El componente transportador de oxígeno es la
hemoglobina modificada cuya modificación consiste en modificar la
superficie, es decir, unir covalentemente grupos químicos a las
cadenas laterales de aminoácidos expuestas de la molécula de
hemoglobina.
La modificación se lleva a cabo principalmente
para aumentar el tamaño molecular de la hemoglobina, generalmente
por unión covalente de grupos poliméricos, como polímeros
sintéticos, carbohidratos, proteínas y similares. Generalmente, se
prefieren los polímeros sintéticos.
Los polímeros sintéticos hidrofílicos apropiados
incluyen, entre otros, el óxido de polialquileno, como el óxido de
polietileno ((CH_{2}CH_{2}O)_{n}), el óxido de
polipropileno ((CH(CH_{3})CH_{2}O)_{n})
o un copolímero de los óxidos polietileno/polipropileno
((CH_{2}CH_{2}O)_{n}-CH(CH_{3})CH_{2}O)_{n}).
En el campo médico, se conocen otros polímeros sintéticos de cadena
simple, cadena ramificada, y substituidos, que también podrían ser
adecuados.
Comúnmente, el grupo químico unido a la
hemoglobina es el polietilénglicol (PEG), debido a su aceptación
farmacológica, y disponibilidad comercial. Los PEGs son polímeros de
fórmula química general H(OCH_{2}CH_{2})_{n}OH,
donde n es, en general, mayor o igual a 4. Las formulaciones de PEG
normalmente están seguidas de un número que corresponde a su peso
molecular medio. Por ejemplo, el PEG-200 tiene un
peso molecular medio de 200 y su peso molecular puede estar dentro
del intervalo de 190-210. Los PEGs normalmente se
encuentran disponibles en diferentes formas comerciales, y en
muchos casos vienen preactivados, y listos para ser conjugados a
proteínas.
Un aspecto importante de las realizaciones
preferidas de la presente invención, es que la modificación de la
superficie tiene lugar cuando la hemoglobina se encuentra en el
estado oxigenado o estado "R". Esto se consigue fácilmente,
dejando a la hemoglobina equilibrarse con la atmósfera (o,
alternativamente, se puede llevar a cabo una oxigenación activa)
antes de la conjugación. Realizando la conjugación con hemoglobina
oxigenada, se aumenta la afinidad por oxígeno de la hemoglobina
resultante. Este paso generalmente se considera contraindicado, ya
que muchos investigadores describen que la desoxigenación antes de
la conjugación disminuye la afinidad por el oxígeno. Véase, por
ejemplo, patente americana U.S. 5.234.903.
Aunque en muchos aspectos, la actuación de las
hemoglobinas modificadas en la superficie es independiente de la
unión entre la hemoglobina y el modificador (por ejemplo, PEG), se
cree que cuanto más rígido sea la unión, como sustituyentes
alifáticos o aromáticos C_{1} a C_{6}, es posible aumentar la
producción y/o las características de los conjugados comparado con
los que tienen un modo de unión más flexible y por tanto
deformable.
El número de PEGs que se unen a la molécula de
hemoglobina puede variar, dependiendo del tamaño del PEG. Sin
embargo, el tamaño molecular de la hemoglobina modificada resultante
debe ser lo suficientemente grande para evitar que sea eliminada
por los riñones, y que pueda llegar a alcanzar la vida media
deseada. Blumenstein y col., determinaron que este tamaño se
alcanza por encima del peso molecular de 84.000. (Blumenstein, y
col., en Blood Substitutes ad Plasma Expanders'', Alan R. Liss,
editors, New York, New York, páginas 205-212
(1978)). Los autores conjugaron hemoglobina con dextrano de peso
molecular variable. Reportaron que un conjugado de hemoglobina (con
un peso molecular de 64.000) y dextrano (con peso molecular de
20.000) "era retirado lenta e insignificantemente de la
circulación por los riñones", y que un aumento en el peso
molecular por encima de 84.000 no alteraba las curvas de
aclaramiento. Por consiguiente, como determinó Blumenstein y col. es
preferible que el HBOC tenga un peso molecular de al menos
84.000.
En una realización de la presente invención, el
HBOC es "MalPEG" que es hemoglobina a la que se ha conjugado
PEG activado con maleimida. Este MalPEG podría ser referido
posteriormente mediante la fórmula siguiente:
Fórmula
1Hb-(S-Y-R-CH_{2}-CH_{2}-[O-CH_{2}-CH_{2}]_{n}-O-CH_{3})_{m}
donde Hb se refiere a la
hemoglobina tetramérica, S es un grupo tiol superficial, Y es el
conector succinimida covalente entre la Hb y el
Mal-PEG, R es un grupo alquilo, amida, carbamato, o
grupo fenilo (dependiendo de la fuente de la materia prima y del
procedimiento de síntesis química),
[O-CH_{2}-CH_{2}]_{n}
son las unidades de oxietileno que constituyen la cadena del
polímero de PEG, donde n define la longitud del polímero (por
ejemplo, PM = 5000), y O-CH_{3} es el grupo
metoxilo
terminal.
En una realización de la presente invención, el
substituto de la sangre puede, también consistir en un cristaloide.
El componente cristaloide puede ser cualquier cristaloide que, en la
composición del substituto de la sangre, sea preferentemente capaz
de alcanzar una osmolaridad superior a 800 mOsm/l, es decir,
convertir al substituto sanguíneo en "hipertónico". Ejemplos
de cristaloides apropiados y de sus concentraciones incluyen, por
ejemplo, 3% NaCl, 7% NaCl, 7,5% NaCl, y 7,5% NaCl en 6% dextrano.
Preferiblemente, el substituto de la sangre tiene una osmolaridad
entre 800 y 2400 mOsm/l. Previamente se ha reportado el uso de
hemoglobinas recombinantes en disoluciones con osmolaridad entre
300-800 mOsm/l, que constituyen más bien un coloide
(es decir, una molécula menos difundible que la dextrosa). Véase
por ejemplo, la patente americana No. 5.661.124. Sin embargo, esta
patente recomienda producir substitutos de la sangre con
osmolaridades superiores a 800, y sugiere que la concentración de
hemoglobina debe estar entre 6-12 g/dl. Sin embargo,
la eficiencia transportadora de oxígeno de las composiciones de la
presente invención, permiten utilizar hemoglobinas a menor
concentración, como a 6 g/dl e incluso 4 g/dl. Cuando el substituto
de la sangre consiste en un cristaloide y es hipertónico, la
composición de la presente invención puede conseguir una
recuperación rápida de los parámetros hemodinámicos respecto a
otras composiciones substitutas de la sangre, que incluyen los
componentes coloidales. La inyección de un pequeño volumen de un
cristaloide altamente hipertónico (por ejemplo, 1-10
ml/kg) proporciona beneficios significativos en la recuperación
rápida y sostenida de los parámetros hemodinámicos aceptables en una
hemorragia controlada. (Véase, por ejemplo, Przybelsky, R. J., E.
K. Daily, y M. L. Birnbaum, "The pressor effect of hemoglobin -
good or bad?" en Winslow, RM., K. D. Vandegriff, M. Intaglietta,
eds. Advances in Blood Substitutes. Industrial Opportunities and
Medical Challenges. Boston, Birkhluser (1997),
71-85). Sin embargo, las disoluciones de
cristaloide solas, no reestablecen adecuadamente el transporte de
oxígeno cerebral. Véase D. Prough, y col., "Effects of hypertonic
saline versus Ringer's solution on cerebral oxygen transport during
resucitation from hemorrhagic shck", J. Neurosurg. 64:
627-32 (1986).
El substituto de la sangre de la presente
invención se formula mezclando el transportador de oxígeno y otros
excipientes opcionales, con un diluyente adecuado. Aunque la
concentración del transportador de oxígeno en el diluyente puede
variar dependiendo de la preparación, y en particular, basándose en
la dilución esperada tras la administración, en las realizaciones
preferidas, debido a las características de otras composiciones de
la presente invención, que proporcionan una buena distribución del
oxígeno y efectos terapéuticos, normalmente es innecesaria una
concentración superior a 6 g/dl, y preferentemente entre 0,1 y 0,4
g/dl.
Los diluyentes adecuados (es decir, aquellos
farmaceúticamente aceptables para la inyección intravenosa)
incluyen, entre otros: proteínas, glicoproteínas, polisacáridos, y
otros coloides. No se pretende que estas realizaciones se limiten a
un diluyente en particular. Así, se pretende que el diluyente
abarque disoluciones acuosas de albúmina libres de células, otros
coloides, u otros componentes no transportadores de oxígeno, y que
la disolución acuosa tenga una viscosidad de al menos 2,5 cP. En
algunas realizaciones preferidas, la viscosidad de la disolución
acuosa está entre 2,5 y 4 cP. Se contempla que la presente invención
también abarque disoluciones con viscosidad de 6cP o superior.
Se contempla que la presente invención y sus
realizaciones sean útiles en aplicaciones clínicamente indicadas en
las que sea necesaria una reposición rápida de los niveles de
O_{2}, un aumento de los niveles de O_{2}, o un reemplazamiento
de los niveles de O_{2}. Véase por ejemplo, la patente americana
U.S. Patent No. 6.054.427. Entre las diferentes situaciones en las
que las composiciones de la presente invención encuentran uso se
hallan las siguientes:
Trauma. La pérdida aguda de sangre puede
resultar en un desplazamiento de fluidos de los espacios
intersticiales e intracelulares para reponer dicha pérdida,
desviando sangre de los órganos de menor prioridad incluyendo piel
e intestinos. La desviación de la sangre de los órganos, reduce, y a
veces elimina, los niveles de O_{2} en los mismos, provocando
muerte tisular progresiva. Se contempla la reposición rápida de los
niveles de O_{2} como modo de salvar estos tejidos en pacientes
que sufren pérdidas de sangre agudas.
Isquemia. En la isquemia, un órgano particular
(u órganos) son privados de oxígeno. Como consecuencia de la falta
de O_{2}, pequeñas secciones del órgano, denominadas infartos,
comienzan a morir. La reposición rápida de los niveles de O_{2}
es crítica en la prevención de la formación de infartos en tejidos
críticos. Las condiciones que resultan en isquemia, incluyen ataque
cardiaco, ictus, o trauma cerebrovascular.
Hemodilución: en esta aplicación clínica, se
requiere un substituto de la sangre para reemplazar la sangre que
es eliminada en el pro-operatorio. Se contempla que
se retire sangre del paciente para prevenir la necesidad de
transfusión alogénica post-operatoria. En esta
aplicación, el substituto de la sangre se administra para
reemplazar los niveles de O_{2} de la sangre autóloga retirada.
Esto permite la utilización de la sangre autóloga reemplazada para
transfusiones posiblemente necesarias durante y tras la cirugía. Una
de las operaciones que requieren retirar sangre
pre-operatoria sería el proceso de bypass
cardio-pulmonar.
Choque séptico. En sepsis agudas, muchos
pacientes pueden volverse hipertensos a pesar de la intensiva
terapia de fluidos y debido al tratamiento con vasoconstrictores. En
estos casos, la sobreproducción de óxido nítrico (NO) resulta en la
disminución de la presión sanguínea. Por lo tanto, la hemoglobina es
un tratamiento ideal para estos pacientes ya que ésta une NO con
una avidez paralela a la del O_{2}.
Cáncer. El aporte de O_{2} al centro interno
hipóxico de una masa tumoral aumenta su sensibilidad a radioterapia
y quimioterapia. Debido a que la microvasculatura de un tumor es
diferente a la de otros tejidos, la sensibilización a través de un
aumento de los niveles de O_{2} requiere descargar el oxígeno al
centro hipóxico del tumor. En otras palabras, la P50 debería ser
muy baja para prevenir la descarga del oxígeno antes de tiempo,
aumentando los niveles de O_{2} para asegurar la sensibilización
óptima del tumor para los tratamientos de radioterapia o
quimioterapia subsecuentes.
Anemia crónica. En estos pacientes, la
reposición de la hemoglobina perdida o metabolizada está
comprometida o es completamente ausente. Se contempla que los
substitutos sanguíneos deben reemplazar efectivamente, o aumentar
los niveles de O_{2} en los pacientes.
Anemia falciforme. En la anemia falciforme, los
pacientes se debilitan por pérdidas en los niveles de O_{2} que
ocurren durante la deformación del glóbulo rojo, además de por una
alta tasa de recambio de glóbulos rojos. La deformación de los
glóbulos rojos es función de la PO_{2}, donde a menor PO_{2},
mayor es la deformación. Se contempla que el substituto de la
sangre ideal reestablezca los niveles de O_{2} dentro del rango
normal durante la crisis.
Cardioplegia. En ciertos procedimientos
quirúrgicos cardiacos, se para el corazón mediante las disoluciones
de electrolitos adecuadas y reduciendo la temperatura del paciente.
La reducción de la temperatura reducirá significantemente la P50,
posiblemente previniendo la descarga de oxígeno bajo cualquier
condición fisiológica ordinaria. El reemplazamiento de los niveles
de O_{2} se contempla para reducir el daño potencial de los
tejidos y muerte durante tales procesos.
Hipoxia. Los soldados, los moradores en altitud
y los deportistas de calidad internacional en condiciones extremas,
pueden verse sometidos a niveles de O_{2} reducidos debido que la
extracción de O_{2} del aire en los pulmones es reducida. Esto
limita el transporte de O_{2}. Se contempla que los substitutos de
la sangre puedan reemplazar o aumentar los niveles de O_{2} en
tales individuos.
Perfusión del Órgano. Durante el tiempo que un
órgano se mantiene ex vivo, mantener el contenido de O_{2}
es esencial para preservar la integridad estructural y celular y
para minimizar la formación de infartos. Se contempla que un
substituto de la sangre podría suministrar los requerimientos de
O_{2} de dicho órgano.
Cultivo Celular. Este requerimiento es
virtualmente idéntico al de la perfusión del órgano, excepto que la
tasa de consumo de O_{2} sería mayor.
Hematopoyesis. Se contempla que el substituto
sanguíneo sirve como fuente de grupo hemo y hierro para su uso en la
síntesis de nueva hemoglobina durante la hematopoyesis.
La presente invención no sólo se puede utilizar
en humanos. Las composiciones de la presente invención pueden
utilizarse en animales domésticos, como ganado y animales de
compañía (por ejemplo, perros, gatos, caballos, pájaros, reptiles),
como también otros animales en aquarios, zoos, parques acuáticos, y
otras instalaciones que alberguen animales. Se contempla que la
presente invención encuentra utilidad en el tratamiento de
emergencia de los animales domésticos y salvajes que sufran una
pérdida sanguínea a causa de heridas, anemias hemolíticas,
etcétera. Por ejemplo, se contempla que las realizaciones de la
presente invención son útiles en casos como anemia infecciosa
equina, anemia infecciosa felina, anemia hemolítica debido a agentes
químicos o físicos, infección bacteriana, fragmentación del Factor
IV, hiperesplenismo y esplenomegalia, síndrome hemorrágico en aves
de corral, anemia hipoplásica, anemia aplásica, anemia hemolítica
autoinmune idiopática, deficiencia de hierro, anemia hemolítica
isoinmune, anemia hemolítica microangiopática, o parasitismo, etc.
En particular, la presente invención encuentra uso en áreas donde
los donantes de sangre para animales de especies raras y/o exóticas
son difíciles de encontrar.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso 1
Los glóbulos rojos empaquetados y fecha de uso
expirada se obtienen de una fuente comercial, tal como San Diego
Blood Bank o la Cruz Roja Americana. Preferentemente, el material
expirado no se recibe si tiene más de 45 días tras su recolección.
Los glóbulos rojos empaquetados (pRBCs) se almacenan a 4 \pm 2ºC
hasta el siguiente procesamiento (1-7 días). Todas
las unidades son analizadas par infecciones víricas y sometidas a
test de ácidos nucleicos antes de su utilización.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso 2
Los glóbulos rojos empaquetados se agrupan en
recipientes esterilizados en una instalación limpia. El volumen de
glóbulos rojos empaquetados es anotado y la concentración de
hemoglobina se determina utilizando un co-oxímetro
comercial u otro método reconocido en el área.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso 3
La leucodepleción (es decir, la eliminación de
los glóbulos blancos) se lleva a cabo utilizando membranas de
filtración. Se realizan contages iniciales y finales de leucocitos
para seguir la eficiencia de este proceso.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso 4
Los glóbulos rojos se lavan con seis volúmenes
de 0,9% de cloruro de sodio. El proceso se lleva a cabo a 4 \pm
2ºC. El lavado de las células se analiza para verificar la
eliminación de componentes del plasma mediante un ensayo
espectrofotométrico para albúmina.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso 5
Los glóbulos rojos lavados se lisan al menos
durante 4 horas o durante una noche a 4 \pm 2ºC con agitación
empleando 6 volúmenes de agua. El lisado se procesa en frío para
purificar la hemoglobina. Esto se consigue filtrando el lisado por
una membrana se 0,16 \mum. La hemoglobina purificada se recolecta
en un recipiente estéril despirogenado. Todos los pasos de este
proceso se llevan a cabo a 4 \pm 2ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso 6
La eliminación de virus se lleva a cabo por
ultrafiltración a 4 \pm 2ºC.
\newpage
Paso 7
La hemoglobina purificada del lisado y la
ultrafiltración se intercambia en la solución Lactato de Ringer
(RL) o un tampón fosfato salino (PBS, pH 7,4) utilizando una
membrana de 10 kD. La hemoglobina se concentra entonces utilizando
la misma membrana a una concentración final de
1,1-1,5 mM (tetrámero). Se utilizan de 10 a 12
volúmenes de RL o PBS para el cambio de disolvente. Este proceso se
lleva a cabo a 4 \pm 2ºC. El pH de la disolución preparada en RL
se ajusta a 7,0-7,6.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso 8
La hemoglobina en PBS o en lactato de Ringer
(RL) es filtrada de manera estéril a través de filtros desechables
de 0,45 ó 0,2 \mum y almacenados a 4 \pm 2ºC antes de llevar a
cabo la modificación química.
Se conocen otros procedimientos para purificar
hemoglobina. Además, normalmente es innecesario el empleo de un
agente reductor (por ejemplo, glutatión u otro agente reductor que
contenga el grupo tiol) para prevenir la
auto-oxidación tras la lisis celular.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso 1
La tiolación se lleva a cabo usando un exceso
molar de 10 veces de iminotiolano respecto a la hemoglobina durante
4 horas a 4 \pm 2ºC con agitación continua.
Condiciones de la reacción:
- \bullet
- Hemoglobina (tetrámero) 1 mM en RL (pH 7,0-7,5) o PBS (pH 7,4)
- \bullet
- Iminotiolano 10 mM en RL (pH 7,0-7,5) o PBS (pH 7,4)
El cociente 1:10 SFH:iminotiolano y el tiempo de
reacción se optimizaron para maximizar el número de grupos
PEG-tiol y minimizar la heterogeneidad del
producto.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso 2
La hemoglobina tiolada reacciona con PEG
utilizando 20 veces de exceso molar de Mal-PEG (con
un grupo de unión alquilo o fenilo) basado en la concentración
inicial de hemoglobina tetramérica. La hemoglobina primero se
equilibra con la atmósfera para oxigenarla. La reacción se lleva a
cabo durante 2 horas a 4 \pm 2ºC con agitación continua.
Condiciones de la reacción:
- \bullet
- hemoglobina tiolada 1 mM en RL o PBS (pH 7,4)
- \bullet
- Mal-PEG 20 mM en RL o PBS (pH 7,4)
\vskip1.000000\baselineskip
Paso 3
La hemoglobina-PEGlicolada se
procesa a través de una membrana de 70 kD para quitar el exceso de
reactivos o de hemoglobina sin reaccionar. Para asegurarla la
eliminación de los reactivos se lleva a cabo una filtración de 20
volúmenes, que es seguida mediante cromatografía de exclusión por
tamaño a 540 nm y 280 nm. La concentración de proteína se diluye a
4 g/dl. El pH se ajusta a 7,3 \pm 0,3 utilizando NaOH 1N.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso 4
El producto final MalPEG-Hb se
filtra de modo estéril utilizando una cápsula estéril de 0,2 \mum
desechable y se recoge en un recipiente estéril despirogenado a 4
\pm 2ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso 5
La Hb-PEG se diluye a 4 g/dl en
RL, ajustando el pH a 7,4 \pm 0,2.
\vskip1.000000\baselineskip
Paso 6
La composición substituta de la sangre final se
filtra de manera estéril (0,2 \mum) y se alicuota por peso en
viales estériles de vidrio, cerrados con tapones estériles de goma y
sellados en una campana de flujo laminar y se almacenan a -80ºC
hasta su uso.
\vskip1.000000\baselineskip
La homogeneidad y el tamaño molecular del
substituto de la sangre MalPEG-Hb se caracterizan
mediante Cromatografía Líquida (LC). La LC analítica se emplea para
evaluar la homogeneidad de la hemoglobina-PEG y
seguir con la eliminación del Mal-PEG no unido. Se
utiliza la absorbancia a 540 nm para evaluar la hemoglobina y
separarla de la que no ha reaccionado con el PEG según la posición
del pico. La absorbancia a 280 nm se utiliza para separar la
Hb-PEG del Mal-PEG libre, que
absorbe en el ultravioleta (UV) debido a los anillos que
contiene.
Los espectros ópticos son recogidos utilizando
un espectrofotómetro de dispositivos de fotodiodos de barrido
rápido (Milton Roy 2000 o Hewlett Packard Model 8453) en las
regiones de Soret y visible, que analiza la concentración de
hemoglobina y el porcentaje de metemoglobina por análisis
multicomponente (K. D. Vandegriff, R. E. Shrager. Evaluation of
oxygen equilibrium binding to hemoglobin by
rapid-scanning spectrophotometry and singular value
decomposition. Meth. Enzymol. 232: 460-485
(1994).
La concentración de MalPEG-Hb y
el porcentaje de metemoglobina se determinan utilizando un
cooxímetro. La viscosidad se determina utilizando un Rheometro. La
Presión Osmótica Coloide se determina empleando un osmómetro
coloidal. Los parámetros de unión de oxígeno se determinan a partir
de las curvas de equilibrio del oxígeno.
Las especificaciones preferidas para las
composiciones substitutas de la sangre se presentan en la Tabla 1
abajo:
\vskip1.000000\baselineskip
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
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Para la modificación de la superficie, el número
"m" en la Fórmula I es el parámetro que define el número de
polímeros de PEG unidos a la superficie de la hemoglobina.
Fórmula
IHb-(S-Y-R-CH_{2}-CH_{2}-[O-CH_{2}-CH_{2}]_{n}-O-CH_{3})_{m}
Para determinar este número, se utiliza el
ensayo colorimétrico de ditiopiridina (Ampulski R., Ayers V.,
Morell S. Determination of the reactive sulfhydril groups in heme
proteins with 4, 4'- dipyridinedisulfide. Biocheim Biophys. Acta
163-169, 1969). Este método se utiliza para
cuantificar el número de grupos tiol disponibles en la superficie
de la Hb tetramérica antes y después de la tiolación, y luego
también tras la PEG-glicolación. La hemoglobina
humana contiene 2 grupos tiol reactivos intrínsecos en los residuos
\beta93Cys, confirmados por la reacción con ditiopiridina. Tras
la tiolación de SFH en un a tasa de 1:10 SFH:iminotiolano, el número
de grupos tiol reactivos aumenta de 2 a 6 tioles según la reacción
de ditiopiridina. Tras la reacción de
PEG-glicosidación, el número de grupos tiol
reactivos disminuye a 1,3. Esto indica que hay 4-5
sitios de PEG-glicosidación en la
MalPEG-Hb.
\vskip1.000000\baselineskip
La FPLC se lleva a cabo para analizar el
producto final, MalPEG-Hb. Los cromatogramas típicos
se muestran en la Figura 1 para MalPEG-Hb comparada
con la SFH sin modificar. El tiempo de retención para SFH es de
aproximadamente 57 min. El tiempo de retención para
MalPEG-Hb es de aproximadamente 44 min.
\vskip1.000000\baselineskip
Las propiedades físicas de
MalPEG-Hb comparadas con la sangre y la hemoglobina
humana sin modificar (SFH) se muestran en la Tabla 2 abajo.
\vskip1.000000\baselineskip
Las curvas de unión en equilibrio de
hemoglobina-oxígeno fueron medidas tal como se
describió previamente (Vandegriff K. D., Rohlfs R. K., Magde M. D.,
Winslow R. M. Hemoglobinoxigen equilibrium curves measured during
enzymatic oxygen consumption. Anal. Biochem. 256:
107-116, 1998). La MalPEG-Hb muestra
una alta afinidad por el oxígeno (P50 = 5 mm Hg) (666 Pa) y baja
cooperatividad (n50 = 1,0-1,4). La figura 2 muestra
las curvas representativas que comparan la hemoglobina libre de
estroma (SFH) y las soluciones de MalPEG-Hb.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta propiedad de la solución de
MalPEG-Hb es debida a la fuerte interacción entre
las cadenas de polietilénglicol y las moléculas de agua del
disolvente. Se piensa que es un buen atributo para un substituto de
la sangre por dos razones: 1) una mayor viscosidad disminuye la
constante de difusión tanto de la molécula de PEG-Hb
como de los ligandos gaseoso que se difunden por el disolvente, y
2) una mayor viscosidad aumenta la tensión de la solución que fluye
contra la pared endotelial, provocando la liberación de
vasodilatadores que contrarrestan la vasoconstricción. Como se
muestra en la Tabla 2, la viscosidad de la MalPEG-Hb
es de 2,5 cPs.
\vskip1.000000\baselineskip
La COP de las disoluciones de hemoglobina que
contienen hemoglobina sin modificar, entrecruzada intra- e
inter-molecularmente, o conjugada con PEG en la
superficie se han medido para determinar sus propiedades
macromoleculares en disolución (Vandegriff K. D., Rohlfs R. J.,
Winslow R. M. Colloid osmotic effects of
hemoglobin-based oxygen carriers. Winslow R. M.,
Vandegriff K. D., Intaglia M., eds, Advances in Blood Substitutes
Industrial Opportunities and Medical Challenges. Boston,
Birkhauser, pp. 207-232 (1997). Las hemoglobinas
tetraméricas muestran un comportamiento cercano al ideal en
disolución, mientras que las hemoglobinas conjugadas a PEG tienen
una actividad osmótica coloidad significantemente mayor y se
comportan en disolución de forma no ideal (Vandegriff K. D., Rohls
R. J. y Winslow R. M. Colloid osmotic properties of modified
hemoglobins: chemically cross-linked versus
polyethilene glycol surface-conjugated. Biophiys.
Chem. 69:23-30 (1997). Como se muestra en la Tabla
2, la COP de la disolución MalPEG-Hb es DE 50 mm Hg
(6666 Pa).
\vskip1.000000\baselineskip
La estabilidad de las disoluciones de
hemoglobina que contienen hemoglobina conjugada con PEG en la
superficie, se ha determinanado examinando el cociente de
auto-oxidación. A temperatura ambiente, la
auto-oxidación de la MalPEG-Hb
aumentó desde aproximadamente 5% MetHb a 5,5% MetHb en 10 horas como
muestra la figura 5. El cociente de auto-oxidación
para la MalPEG-Hb fue de 0,05% por hora.
El papel de la afinidad por el oxígeno en la
eficacia de la hemoglobina libre de células utilizando hemoglobina
modificada por conjugación con polioxietileno (POE) es de particular
interés en el estudio de la eficacia de tales materiales como
substitutos de la sangre. Esta modificación, descrita primero por
Iwashita y coautores (Ajisaka K. y Iwashita Y. "Modification of
human hemoglobin with polyethylene glycol: A new candidate for
blood substitutes", Biochem Biophys Res Comm
97:1076-1981 (1980)), mantiene un efecto
hipertensivo, y se ha encontrado útil en el tratamiento del choque
séptico. Como parte de la preparación de este producto, la
hemoglobina se hizo reaccionar con
piridoxal-5-fosfato (PLP) para
alcanzar su P50, cercana al valor de la sangre humana. Así, fue
posible preparar dos soluciones de hemoglobina modificada con POE,
una con y otra sin modificación previa con PLP. Estas disoluciones
son idénticas en todos los sentidos excepto por su P50, y su
habilidad para desarrollar funciones fisiológicas en ratas fue
probada durante hemorragia severa (60%).
Las disoluciones de hemoglobina modificada, con
o sin modificación con PLP para formar "PHP" se prepararon tal
como se describió más arriba en el Ejemplo 1.
Para este estudio se utilizaron ratas
Sprague-Dawley. Las presiones sistólicas y
diastólicas se controlaron durante el estudio; las presiones
máximas y mínimas, respectivamente, y la presión arterial media
(MAP) era diastólica + 1/3 presión
(sistólica-diastólica). La dP/dt fue calculada de la
máxima pendiente positiva para cada ciclo de presión. Los valores
medios del ritmo cardiaco, sistólico, diastólico, presiones medias
arteriales, presión de pulso y dP/dt fueron promediados para cada
minuto.
El pH arterial, la PCO_{2} y PO_{2} fueron
medidas en un analizador de gases en sangre utilizando 100 \mul
de muestras de sangre heparinizada. El ácido láctico fue medido en
sangre arterial utilizando un Analizador de Lactato. El CO_{2}
total, el bicarbonato estándar (HCO_{3}^{-}) y el exceso de
bases (BE) se calcularon de la PCO_{2}, el pH y la concentración
de hemoglobina se calcularon usando los algoritmos descritos
previamente (Winslow R., "A model for red cell O_{2} uptake".
Int. J. Clin. Monit. Comput. 2:81-93 (1985)). La
hemoglobina total y la hemoglobina en plasma, fueron medidas
utilizando equipos disponibles comercialmente: el hematocrito fue
medido utilizando aproximadamente 50 \mul de muestra de sangre
arterial mediante microcentrifugación.
La transfusión de intercambio fue llevada a cabo
a una tasa de 0,5 ml/min aproximadamente hasta un volumen total que
igualaba el 50% del volumen de sangre estimado. Se asumió un volumen
de sangre de 65 ml/kg. La bomba peristáltica operaba de modo que la
sangre se retiraba exactamente a la misma velocidad que se infundía
el material de prueba. Las disoluciones de prueba fueron calentadas
a 37ºC en un baño de agua antes de su infusión y mantenidas
calientes durante la misma.
El protocolo de hemorragia que seguimos está
basado en el método de Hannon y Wade (Hannon J., Wade C., Bossone
C., Hunt M. Coppes R., Loveday J., "Blood gas and
acid-base status of concious pigs subjected to
fixed-volume hemorrage and resucitated with
hypertonic Sali dxtran", Circ Shock 32: 19-29
(1990)). La hemorragia se comenzó aproximadamente 3 minutos después
de la finalización de la transfusión de intercambio bombeando fuera
la sangre arterial de la arteria femoral a una velocidad de 0,5
ml/min para eliminar el 60% del volumen sanguíneo al final de 60
minutos. Cada 10 minutos se tomaron muestras de sangre (0,3 ml) para
los análisis hamatológicos y de gas en sangre.
Para los análisis de supervivencia, los animales
fueron observados durante un mínimo de 120 minutos tras el inicio
de la hemorragia. Los datos fueron agrupados en intervalos de 10
minutos, y para cada intervalo se calculó la proporción acumulada de
animales vivos y su error estándar.
Las disoluciones utilizadas se describen abajo
en la Tabla 3. La concentración de hemoglobina total, la viscosidad
y la presión osmótica coloidal (COP)son parecidas. La P50 de
la PHP (19,7 Torr) (2826 Pa)era mayor que la de POE (12,2
Torr) (1626 Pa). El grado de cooperatividad (el parámetro de Hill,
n) fue equivalente para las dos soluciones. Los patrones de FPLC
para las dos soluciones se dan en la Figura 3. Mientras que hay un
pico pequeño en cada uno, que corresponde a la hemoglobina sin
modificar, la mayor parte de la hemoglobina aparece en un conjunto
heterogéneo de picos que se eluyen significativamente antes que la
hemoglobina sin modificar (SFH). Los patrones para las dos
hemoglobinas modificadas con PEG fueron cualitativamente
similares.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La afinidad por oxígeno de la POE era
significativamente mayor que la de PHP (Figura 4). Ningún producto,
sin embargo, muestra cooperatividad significativa.
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los experimentos se resumen en la Tabla 4.
Hubo más animales que recibieron PHP (18) que POE (11), y el peso
medio de los animales PHP fue significativamente superior al del
grupo POE (P<0,001). Sin embargo, esta diferencia en el peso fue
tenida en cuenta para calcular el grado de hemorragia, asumiendo un
volumen total de sangre de 65 ml/kg. Por tanto, los volúmenes
consecuentes para la transfusión de intercambio y la hemorragia
fueron también diferentes. No obstante, el tiempo medio de muerte
era significativamente más corto para los animales con PHP (93
minutos) comparado con los animales POE (116 minutos). Esta
diferencia fue estadísticamente significativa (P<0,02). Si los
animales sobrevivían el periodo de observación, 120 min después de
comenzar la hemorragia, éstos se consideraban "censurados" para
la finalidad del análisis de supervivencia de
Kaplan-Meier (Figura 5).
\vskip1.000000\baselineskip
Las cuantificaciones del nivel basal y de
post-ET y post-hemorragia (60
minutos) se muestran en la tabla 5. El hematocrito medio fue
ligeramente superior en los animales POE comparado con los PHP, pero
tras la transfusión de intercambio los valores fueron idénticos en
los dos grupos. Al final del periodo de hemorragia, el hematocrito
medio en los animales POE fue otra vez ligeramente superior que en
los PHP. Diferencias similares se hallaron en los valores de
hemoglobina total, con los valores de animales POE siendo
ligeramente superiores en todos los puntos muestreados. La
hemoglobina en plasma no fue diferente en los dos grupos, pero
aumentó ligeramente en los animales POE tras el periodo de
intercambio.
La concentración de ácido láctico arterial fue
significativamente mayor en los animales POE comparado con los PHP
en todos los pasos del estudio. Los valores de exceso de bases no
fueron significativamente diferentes entre los dos grupos, aunque
sugieren que los valores son menores en los animales PHP comparados
con el grupo POE. Además, la diferencia entre los valores basales
para los animales PHP (10,24 mEq/l) es mayor que para los animales
POE (7,01 mEq/l).
\vskip1.000000\baselineskip
La presión arterial media durante la transfusión
de intercambio se muestra en la Figura 6. El nivel basal de las
presiones arteriales medias son indistinguibles en los dos grupos.
Sin embargo, la respuesta de la presión sanguínea a la infusión de
PEG-hemoglobina es significantemente diferente entre
los dos grupos. El aumento inicial en la MAP es mayor en los
animales PHP comparada con los POE, y se mantiene durante el periodo
de infusión. En contraste, la MAP en los animales POE retorna al
nivel basal al final de la infusión.
Al inicio de la hemorragia, la caída en la MAP
es inmediata en los animales PHP y se retrasa en el grupo POE.
Además, la MAP se mantiene en o cerca de los valores basales durante
toda la hemorragia y después para el grupo POE, mientras que la
MAP nunca retorna a los valores basales en los animales PHP.
Especialmente en los animales PHP, la dispersión en los datos, como
se indica con el aumento de los errores estándar, aumenta con el
tiempo a medida que los animales quedan fuera del grupo PHP.
En este estudio, estudiamos 2 soluciones de
hemoglobina modificadas (substitutos de la sangre) estrechamente
relacionadas, con respecto a su capacidad para proteger ratas de una
hemorragia severa (60%). Para probar esta capacidad, los animales
recibieron primero un 50% (de volumen de sangre) por transfusión de
intercambio con una de las dos soluciones de prueba. Las soluciones
diferían sólo en su afinidad por el oxígeno, y se parecían en sus
patrones FPLC, presiones oncóticas, viscosidad y concentración.
Otros estudios que intentaron mostrar los efectos de variables
específicas en las respuestas fisiológicas no han sido capaces de
presentar ambas soluciones tan bien correlacionadas. Véase, por
ejemplo, Sakai H., Hara H., Tsai A. G., Tsuchida E., Johnson P. C.,
Intaglietta M., "Changes in resistance vessels during hemorragic
shock and resuscitation in concious hamster model", Am. J.
Physiol 276(45), H563-H571. (1999), Sakai H.,
Hara H.,Yuasa M., Tsai A., Takeoka S., Tsuchida E., Intaglietta
M."Molecular dimensions of Hb-based O_{2}
carriers determine constriction of resistance arteries and
hypertension", Am. J. Physiol 279: H908-H915,
(2000). Estos experimentos representan el primer ejemplo en el que
soluciones tan parecidas pueden ser comparadas con una sola
variable, P50, siendo significativamente diferentes.
El grupo de animales que recibieron POE
presentaron diferencias ligeras pero significativas: mayor
hematocrito y niveles superiores de hemoglobina total y en plasma.
Sin embargo, es poco probable que estas diferencias puedan explicar
los resultados o interpretaciones de los experimentos. Claramente,
las dos soluciones afectan a la presión sanguínea de manera
diferente, como muestra la figura 4. En el momento de la infusión,
el efecto sobre la presión debe ser función de las propiedades de la
solución infundida, no del animal receptor. La respuesta de la
presión sanguínea es mayor y se mantiene en los animales PHP
comparados con los POE.
La supervivencia de los animales no está
claramente relacionada con el efecto vasopresor de la solución de
hemoglobina, como ha sido sugerido por algunos investigadores en el
pasado, porque la supervivencia (y supuestamente un déficit basal
inferior) es mejor en los animales POE comparados con los PHP, en
los que los efectos de la presión sanguínea son menores y sólo
transitorios. Véase Przybelsky R. J., Daily E. K., Birnbaum M. L.,
"The pressor effect of hemoglobin - good or bad?" en Winslow,
R. M., Vandegriff K. D., Intaglietta M., eds. Advances in Blood
Substitutes. Industrial opportunities and Medical Challenges.
Boston, Birkhäuser (1997), 71-85.
En conjunto, estos resultados respaldan la
hipótesis que una menor P50 es beneficiosa para el uso de
hemoglobina libre de células como transportador de oxígeno. La
hipótesis se basa en 2 conceptos. Primero, que el gradiente de
difusión para la hemoglobina libre de células es una función del
gradiente de oxihemoglobina entre la fuente de oxígeno, el glóbulo
rojo, y la pared vascular. Este gradiente, en cambio, es dependiente
de la forma y posición de la curva de equilibrio del oxígeno
(McCarthy M. R., Vandegriff K. D., Winslow, R. M., "The role of
facilitated diffusion in oxygen transport by
cell-free hemoglobin: Implications for the design
of hemoglobin-based oxygen carriers", Biophysical
Chemistry 92: 103-117 (2001)). Segundo, esta
consideración lleva a la segunda base de nuestra hipótesis, que una
afinidad alta por el oxígeno (baja P50) de hecho "esconde" el
O_{2} de la circulación hasta que la molécula de hemoglobina llega
a las regiones de la circulación en la que la PO_{2} es muy baja,
tal como en isquemias y tejidos hipóxicos.
\vskip1.000000\baselineskip
El propósito de este estudio fue determinar la
estabilidad de la MalPEG-Hb durante la simulación de
condiciones de almacenamiento y manipulación de las muestras en
ensayo clínico de Fase I. Se valoró la estabilidad durante tres
etapas de manipulación. La etapa I correspondía a la transición de
la condición de congelación en el lugar de almacenamiento a las
condiciones de temperatura durante el transporte a la instalación
clínica (estudio de almacenamiento bajo congelación). La Etapa II
correspondía con el descongelamiento de la MalPEG-Hb
durante 24 horas a +4ºC y su posterior almacenamiento a +4ºC
durante 5 días (estudio de refrigeración). La etapa III
correspondía con la descongelación de la MalPEG-Hb
durante 24 horas a +4ºC y su posterior almacenamiento a temperatura
ambiente durante varios días antes de la administración al paciente
(estudio a temperatura ambiente).
\vskip1.000000\baselineskip
La estabilidad se definió como el cociente de
oxidación del material test MalPEG-Hb. El porcentaje
de metemoglobina en la muestra fue medido utilizando un cooxímetro
(IL Co-oximetry 682). Las medidas se hicieron por
duplicado en cada punto de acuerdo con el protocolo.
La temperatura se siguió con un termómetro o con
registradores gráficos de la temperatura. El estudio de
almacenamiento bajo congelación se llevó a cabo en un rango de
temperatura de -21,0 \pm 3,0ºC. El estudio de refrigeración se
llevó a cabo en un rango de temperatura de +4,0 \pm 0,2ºC. El
estudio a temperatura ambiente se hizo en un intervalo de
temperatura de +21 \pm 1,0ºC.
La temperatura, la hemoglobina total, y el
porcentaje de metemoglobina fueron registradas a cada uno de los
puntos indicados. En los estudios de congelación y refrigeración,
las medidas se tomaron a tiempo cero (completamente descongelado),
tras una hora, y luego cada 24 horas durante cinco días. En el
estudio a temperatura ambiente, las medidas se tomaron a tiempo
cero (completamente descongelado) y después cada hora durante diez
horas.
\vskip1.000000\baselineskip
La MalPEG-Hb no mostró ningún
cambio en el porcentaje de metemoglobina durante su almacenamiento
de 6 días a -20ºC como muestra la Figura 8. Igualmente, la
MalPEG-Hb no mostró ningún cambio en el porcentaje
de metemoglobina durante su almacenamiento de 5 días a +4ºC, como
muestra la Figura 9. Durante el almacenamiento a temperatura
ambiente, la MalPEG-Hb mostró menos de un 1% de
aumento de metemoglobina en un periodo de 10 horas, como muestra la
Figura 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Esta lista de referencias citadas por el
solicitante es únicamente para la comodidad del lector. Ésta no
forma parte de ningún documento de patente europea. Aunque se ha
tenido mucho cuidado en recopilar las referencias, no se pueden
excluir errores u omisiones y la EPO renuncia a cualquier
responsabilidad al respecto.
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[0180]
Claims (19)
1. Producto substituto de la sangre que consiste
en hemoglobina oxigenada modificada en la superficie, en donde la
hemoglobina oxigenada modificada en la superficie es hemoglobina a
la que se le ha unido covalentemente un óxido de polialquileno a
través de un grupo tiol superficial de una cadena lateral
aminoacídica expuesta en la molécula de hemoglobina, mientras que la
hemoglobina se halla en el estado oxigenado; y
en donde la hemoglobina oxigenada modificada en
la superficie tiene una P50 menor que la hemoglobina nativa libre de
estroma procedente de la misma fuente animal, siempre y cuando se
cuantifiquen en las mismas condiciones.
2. Producto substituto de la sangre según la
reivindicación 1, en donde el óxido de polialquileno es óxido de
polietileno, óxido de polipropileno o un copolímero de óxido de
polietileno/polipropileno.
3. Producto substituto de la sangre según la
reivindicación 1, en donde el óxido de polialquileno es
polietilénglicol.
4. Producto substituto de la sangre según la
reivindicación 1, en donde el óxido de polialquileno es
polietilénglicol según la fórmula
H(OCH_{2}CH_{2})_{n}OH, donde n es mayor o igual
a 4.
5. Producto substituto de la sangre según la
reivindicación 1, que consiste en hemoglobina oxigenada modificada
en la superficie, en donde la hemoglobina oxigenada modificada en la
superficie es hemoglobina a la que se ha unido covalentemente
polietilénglicol activado con maleimidina a través de un grupo tiol
superficial de una cadena lateral aminoacídica expuesta de la
molécula de hemoglobina, mientras la hemoglobina se halla en el
estado oxigenado; y en donde la hemoglobina oxigenada modificada en
la superficie tiene una P50 menor que la hemoglobina nativa libre de
estroma procedente de la misma fuente animal, siempre y cuando se
cuantifiquen en las mismas
condiciones.
condiciones.
6. Producto substituto de la sangre según la
reivindicación 1, en donde el polietilénglicol es polietilénglicol
según la fórmula H(OCH_{2}CH_{2})_{n}OH, donde n
es mayor o igual que 4.
7. Producto substituto de la sangre según la
reivindicación 1 o la reivindicación 5, que consiste en hemoglobina
oxigenada modificada en la superficie, en donde la hemoglobina
oxigenada modificada en la superficie tiene la fórmula:
Hb-(S-Y-R-CH_{2}-CH_{2}-[O-CH_{2}-CH_{2}]_{n}-O-CH_{3})_{m}
En donde:
Hb es hemoglobina tetramérica;
S es un grupo tiol superficial;
Y es un conector covalente succinimidilo;
R es un alquilo, amida, carbamato o grupo
fenilo;
n define la longitud del polímero y es mayor o
igual que 4;
m es el número de polímeros PEG unidos a la
superficie de la hemoglobina; y
en donde la hemoglobina oxigenada modificada en
la superficie tiene una P50 menor que la hemoglobina nativa libre de
estroma procedente de la misma fuente animal, siempre y cuando se
cuantifiquen en las mismas condiciones.
8. Producto substituto de la sangre según la
reivindicación 7, en donde m es 4-5.
9. Producto substituto de la sangre según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde, antes de
modificar la superficie, la hemoglobina ha sido tiolada.
10. Producto substituto de la sangre según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que tiene un cociente
metemoglobina/hemoglobina total inferior a 0,10.
11. Producto substituto de la sangre según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la hemoglobina
oxigenada modificada en la superficie tiene una P50 inferior a 10
torr (1333 Pa).
12. Producto substituto de la sangre según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde la hemoglobina
oxigenada modificada en la superficie tiene una P50 inferior a 7
torr (933 Pa).
\newpage
13. Producto substituto de la sangre según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, estable a la
auto-oxidación a 24ºC que consiste en un conjugado
PEG-hemoglobina, en donde el cociente
metemoglobina/hemoglobina es inferior a 0,10 y el conjugado tiene
una P50 inferior a 10 torr (1333 Pa).
14. Producto substituto de la sangre según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en donde la hemoglobina
es hemoglobina de caballo.
15. Composición útil como substituto de la
sangre según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que consiste
en un producto substituto de la sangre en un diluyente acuoso.
16. Composición según la reivindicación 15, en
donde la concentración de hemoglobina se halla entre 0,1 y 4,0
g/dl.
17. Producto substituto de la sangre según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, para su utilización en
un procedimiento de tratamiento o terapia de humanos o animales.
18. Utilización de un producto substituto de la
sangre según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la
producción de un medicamento para el tratamiento de traumatismos,
isquemia, hemodilución, choque séptico, cáncer, anemia crónica,
anemia falciforme, cardioplegia, o hipoxia.
19. Utilización de un producto substituto de la
sangre según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la
producción de un medicamento para el tratamiento veterinario de la
pérdida de sangre debida a heridas, anemia hemolítica, anemia
infecciosa equina, anemia infecciosa felina, infección bacteriana,
fragmentación del Factor IV, hiperesplenismo y esplenomegalia,
síndrome hemorrágico en aves de corral, anemia hipoplásica, anemia
aplásica, anemia hemolítica autoinmune idiopática, deficiencia de
hierro, anemia hemolítica isoinmune, anemia hemolítica
microangiopática, o parasitismo.
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