DE2449885C3

DE2449885C3 - Verfahren zur Herstellung von chemisch modifizierten haltbaren Hämoglobinpräparaten sowie das nach diesem Verfahren hergestellte modifizierte Hämoglobinpräparat

Info

Publication number: DE2449885C3
Application number: DE2449885A
Authority: DE
Inventors: Klaus Dipl.-Chem. Dr. 6450 Hanau Bonhard; Uwe 6000 Frankfurt Boysen
Original assignee: Biotest Serum Institut GmbH
Current assignee: Biotest AG
Priority date: 1974-10-21
Filing date: 1974-10-21
Publication date: 1980-04-30
Also published as: JPS6216932B2; JPS5163920A; GB1529578A; FR2288528A1; FR2288528B1; US4336248A; DE2449885B2; DE2449885A1; CH615195A5

Description

Es ist bekannt, daß stoma-freie Lösungen von menschlichem Hämoglobin mit physiologischem Elektrolytgehalt zur Erzielung eines verstärkten Sauerstofftransportes intravenös appliziert werden können (vergleiche zum Beispiel S. F. Rabiner et coll.; J. Ex. Med. 126, 1127—1142 [1967]). In der Prtxis soll jedoch eine höhere Verweildauer der saderstofftransportierenden Moleküle für eine langer anhal. :nde intravasale Wirkung, als bisher erreicht wurde, erwünscht. Teilchenvergrößerungen der Sauerstoffträger durch chemische Aneinanderkopplung, beziehungsweise Ankoppelung an andere Moleküle, hatten bisher immer Einbußen der physiologischen Sauerstoff-Bindungseigenschaften zur Folge (H. Fasold et al; Angewandte Chemie 83, 875-882[197I]).

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß eine Verlängerung der intravasalen Verweildauer bei weitgehender Erhaltung des Sauerstofftransportvermögens durch chemische Modifizierung von Hämoglobinmolekülen nach den besonderen Reaktionsbedingungen möglich ist.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Herstellung von chemisch modifizierten, haltbaren Hämoglobinpräparaten für den akuten Blutersatz und für Organperfusionen, bestehend aus einer Mischung von aneinander oder an andere Proteine gekoppelten Hämoglobinmolekülen, wobei die aneinandergekoppelten Moleküle eine etwa freiem Hämoglobin entsprechend! Sauerstofftransportfähigkeit aufweisen und eine mindestens doppelt so lange Verweilzeit in der Blutbahn haben wie natives, frei gelöstes Hämoglobin, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man (A) Hämoglobinlösungen oder deren Mischungen mit anderen Proteinen mit Dialdehyden mit Kohlenstoffketten mit 3 bis 8 C-Atomen behandelt, oder daß man (B) in bekannter Weise Hämoglobinlösungen oder deren Mischungen mit anderen Proteinen in die sauerstoff-freie Desoxyform überführt und dann unter Sauiirstoffausschluß Dialdehyde mit, insbesondere geraden Kohlenstoffkettcn mit 3 bis 8 C-Atomen zugibt, gegebenenfalls in den Fällen (Λ) und (B) zur Anreicherung und zur Abtrennung des modifizierten Hämoglobins vom nichtmodifizierten oder allzu stark modifizierten Hämoglobin anschließend mit Ammoniumsulfat fraktioniert aussalzt und danach eine Kurzdialyse und Ionenaustausch mit Mischbettionenaustauschern durchführt und gegebenenfalls im Falle (B) anschließend mit Pyridoxalphosphat versetzt, sowie das nach diesem Verfahren hergestellte modifizierte Hämoglobinpräparat.

Zur Herstellung der sauerstoff-freien Desoxyform

j) werden die Hämoglobinlösungen vorteilhaft unter Vakuum und Stickstoffbegasung gerührt. Die Zugabe der Dialdehyde, die das Hämoglobinmolekül chemisch so verändern, daß es eine erhöhte int. jvasale Verweildauer unter Wahrung einer niedrigen Sauerstoffaffinität (das bedeutet eine leichte O2-Abgabe an das Gewebe) gewinnt, erfolgt unter Konzentrations-, Temperatur- und pH-Wert-Verhältnissen, die jeweils einem optimalen Kompromiß zwischen Verweilzeiteffekt einerseits und Erhaltung von Sauerstoffbindungskapazität und

•r> -affinität sowie quantitativer Abreaktion des angewendeten Behandlungsmittels zu nicht-toxischen Derivaten andererseits entsprechend ausgewählt werden. Es hat sich gezeigt, daß auf diesem Wege sowohl eine Verknüpfung des Hämoglobinmoleküls

V)

a) mit einem oder mehreren weiteren Hämoglobinmolekülen,

b) mit Serumproteinmolekülen und

c) mit Molekülen von Gelatinederivaten

v> zum gewünschten Erfolg führen.

Als besonders vorteilhaft erwies sich das Arbeiten mit

der 6- bis 18-fachen molaren Menge Dialdehyd, bezogen auf das eingesetzte Hämoglobin, sowie die Verwendung von wäßrigen oder alkoholischen, vorzugsweise

(Ii iÖⁿ/oigen wäßrigen Dialdehydiösungen.

Die im Kaninchenkreislauf nachgewiesene 'ntravasa-Ie Verweildauer stieg in allen diesen Fällen auf 5 bis 10 Stunden (Halbwerrszeit) an, gegenüber einet Verweildauer beim freien nativen Hämoglobin von r ur 2 bis 3 <·'< Stunden.

Zur Erläuterung werden nachstehend di« entsprechenden Werte von Aiisscheidungs-Kurvcn aus dem Kaninchenkreislauf angeführt.

Tabelle 1

Halbwertszeit der intravasalen Verweildauer nach Blutaustausch von 15 ml pro kg Körpergewicht bei Kaninchen. Die Hämoglobinkonzentration der untersuchten Präparate betrug einheitlich 6 g pro 100 ml (nähere Einzelheiten der Methode vergleiche K. Bonhard; Anaesthesist 23, 78-82 [1974]).

Präparat	Zeil in Stunden	2
	Roh- hochmolekulare
	produkte 1. Fraktion
	GelchromaL/	4,3 9
	Sephadex G 150
Nicht modifiziertes
Hämoglobin	8,3
(Vergleichssubstanz)
Dialdehydvernetztes
Hämoglobin (wie in den	4
Beispielen 1-5, 13 u. 14)
An Albumin gekoppeltes
Hämoglobin (wie in Bei
spiel 6, 7, 11 u. 12)
An Gelatine gekoppeltes
Hämoglobin (wie in Bei
spiel 8-10)

Als Verknüpfungsreagenz dienten höhere Homologe des Glyoxals, nämlich die Glieder der homologen Reihe Propandial, Butandial, Pentandial, Hexandial und Octandial, die der allgemeinen Formel OCH — (CH₂J_n-CHO entsprechen, in der η einen Wert von 1 bis 6 bedeutet.

(Das für die Gelfiltration verwendete Produkt Sephadex der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Schweden, ist ein modifiziertes Dextran mit dreidimensionaler Netzstruktur.)

Den Erfolg einer Ankoppelung des sauerstofftransportierenden Hämoglobins an das Albumin zeigt das Elutionsdiagramm einer gelchromatographischen Auftrennung (siehe nachfolgend Beispiel 6) und die mehr als verdoppelte intravasale Verweilzeit des Chromoproteids im Kaninchenversuch.

Zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Produkte wurde als Ausgangsmaterial neben menschlichen auch Hämoglobin verschiedener Säugetierarten wie Maus, Ratte, Kaninchen, Hund und Schwein zur Durchführung homologer Tierversuche und zur Gewinnung entspre-

ifl chender Tierprodukte verwendet. Es wurden jeweils 3-bis 20%ige Hämoglobinlösungen eingesetzt, die vorzugsweise nach einem bekannten Verfahren aus den Erythrozyten gewonnen waren. Höhere Hämoglobinkonzentrationen erreicht man, indem man entweder mit einer entsprechend verringerten Menge an bidestilliertem Wasser die Erythrozyten hämolysiert und dann in bekannter Weise aufarbeitet oder indem man die beschriebene 6°/oige (Standard)Lösung durch ein bekanntes schonendes Ankonzentrierurvwverfahzen einengt

Zur Anreicherung und zur Abtrennung des erfindungsgemäß modifizierten Hämoglobins vom nicht-modifizierten oder allzu stark modifizierten (schwerlöslichen) kanr eine fraktionierte Aussalzung mit Ammoniumsulfat mit anschließender Kurzdialyse und Ionenaustausch durch Mischbett-Austauscherbehandlung angewendet werden. Dabei werden Ammonium- und Sulfationen gegen Natrium- beziehungsweise Chloridionen ausgetauscht.

in Die Hämoglobinverbindungen, die Gegenstand der Erfindung sind, sowie das Verfahren zu ihrer Herstellung werden durch die nachstehenden Beispiele erläutert. Wirksamkeit und Verträglichkeit im Organismus, das heißt, die Eigenschaften, langer in der Blutbahn zu bleiben und dabei vergleichbar mit freigelöstem Hämoglobin Sauerstoff dem Gewebe zuzuführen, wurden in vivo (Verweildauerbestimmungen, vergleiche Tabelle 1) und in vitro (Messung der Sauerstoffbindungskurve und -kapazität, vergleiche die nachstehende TabeHe 2) bewiesen. Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Präparate erwiesen sich im Tierversuch als pyrogenfrei.

Tabelle 2

a) Saucrstoffbindungskapazität (Prozentsalz der theoretischen O.-Bindung von völlig nalivem Hämoglobin),

b) 1%,-Wcrte (Sauerstoffpartialdruck in Torr, der zur Sauerstoffhalbsättigung des Präparates erforderlich ist). Temperatur 37 C, pH-Wert 7,45.

Präparat	a) CS-Kapazität (% d.	Th.)	80	b) Pjo (Torr)
Nicht modifiziertes Hämoglobin (Verglcichspräparat)			75 65	21-23
Dialdehydvernetztes \| lüniQglobin (Beispiele I 5, 13 und 14)	Rohprodukt: Fraktion*) gem.	Beispiel 1:	70 70	18 15
An Albumin gekoppeltes Hämoglobin (Beispiele 6, 7. I I und 12)	Rohprodukt: Fraktion*) gem.	Beispiel 6:	75 70	13
An Gelatine gekoppeltes lliinioglohiii (Bcisnicle K- in)	Rohprodukt: Fraktion*) ecm.	Beispiel K):	15 13

*) Durch Ammoniunisulfatlniktioiicrung angereichertes »Doppclrrolekiil«.

Beispiel 1

Aneinanderkopplung von Hämoglobinmolekülen
mit Hilfe von Propandial (Malondialdehyd)

Vorarbeiten: Propandial wurde aus handelsüblichem acetalisiertem Derivat Malondialdehyd-bis(diätihylacetal) mit Hilfe von I η-Salzsäure freigesetzt. Dazu wurden 1 ml des Acetals mit 2 ml der Säure bis zur Klärung der Emulsion gerührt und mit Wasser auf das Zwölffache zur »Reagenzlösung I« verdünnt.

100 ml einer 3%igen Hämoglobinlösung wurden mit I η-Natronlauge auf einen pH-Wert von 9,0 eingestellt, auf 10 bis 15°C gekühlt, bei Magnetrührung unter ein Vakuum von 20 bis 25 Torr gesetzt und mit Stickstoffgas sauerstoff-frei gespült. Unter dauernder Stickstoffspülung des Gasraumes über der Lösung wurden 2 ml der f^;_rni, u.,»..,,;« „*„„ η ~ i" .- t :___n_L~iL. ...... * "MkM l/t.lt.llviVII IVl-Clgl.lt£.llS3Uttg I 11 Il H-1 11 α IL/ VKJIl I Minute dazugetropft. Gleichzeitig wurde 1 n-Natronlauge zur Aufrechterhaltung des pH-Wertes 9.0 eingerührt. Während 1 stündigem Rühren stieg die Temperatur der Reaktionsmischung auf 15 bis 20°C. Nach Einstellung einer isotonischen Elektrolyt- beziehungsweise Glucosekonzentration (Zusatz von 3 g Glucose und 0,21 g Natriumbicarbonat) wurde mit Kationenaustauscher in der H * -Form der pH-Wert auf 7,5 abgestumpft, das Präparat sterilfiltriert und im Kühlschrank (5⁰C) aufbewahrt. Nach 3wöchiger Lagerung ließ sich das Präparat gelchromatographisch durch das Säulen-Elutions-Diagramm nach Fig. 1 charakterisieren.

In dieser Figur kennzeichnet der Verlauf des Höhenprofils (Ultraviolett-Absorption) von links nach rechts den Austritt von Hämoglobinmolekülen sinkender Teilchengrößen. Der Gipfel bei C entspricht Hämoglobin, das an keine anderen Kolloidmoleküle angekoppelt ist. Letzteres ist jedoch der Fall bei den höhermolekularen Substanzen, denen die »Bergschulter« (S) links entspricht. Diese höhermolekularen Substanzen sind leichter ammoniumsulfatausfällbar, das heißt, sie lassen sich durch ein Fällungsfraktionien'erfahren, das in Beispiel 2 näher beschrieben v»ird, anreichern. Mit Hilfe dieser Fällungsfraktionierung gewinnt man ein Präparat, das einen höheren Gehalt an »Doppelmolekülen« (Nachweis durch Molekulargewichtsbestimmung mit dem Membran-Osmometer) enthält. Diesem angereicherten Präparat entsprach ein P₅O- Wert von 15 Torr (vergleiche Text zu Tabelle 2).

Beispiel 2

Aneinanderkoppliing von Hämoglobinmolekülen
mit Hilfe von Butandial (Succindialdehyd)

Vorarbeiten: Butandial wurde aus dem handelsüblichen cyclischen Acetal 2,5-Diäthoxy-tetrahydrofuran analog dem Propandial von Beispiel 1 freigesetzt. Die 1 : 2-Mischung Acetal/Salzsäure wurde jedoch anschließend auf das 18fache mit Wasser zur Reagenzlösung 2« verdünnt.

100 ml einer 6 g Hämoglobin enthaltenden wäßrigen Lösung mit pH 6,0 (Ansäuern mit H+-Form eines Kationenaustauschers) wurden wie in Beispiel 1 gekühlt, sauerstofffrei gespült und entsprechend mit 4 ml der Reagenzlösung 2 innerhalb von 2 Minuten versetzt. Das gleichzeitige Zutropfen von Natronlauge erfoigte jedoch nur in dem Maße, daß ein pH-Wert von 6,0 aufrechterhalten wurde. Nach 1 stündigem Rühren bei Raumtemperatur unter Stickstoffatmosphäre wurde der pH-Wert auf 7,3—7,5 korrigiert und der Ansatz gemäß Beispiel I weitergeführt. Nach 3 Wochen Kühlschranklagerung ergab sich ein gelchromatographisch über Sepharose 6 B (Produkt der Firma Pharmacia Fine Chemicals AB, bestehend aus perlförmigcr Agarose speziell für die Gelfiltration) eine MolekülgröOenverteilting (vergleiche Beispiel I) gemäß F i g. 2.

Zur Anreicherung des »Doppclmole'cülanteils« (je 2 Kolloideinheiten sind aneinandergekoppelt) wurde generell nach folgendem Schema verfahren:

In die Reaktionslösiiii wurde unter Rühren bei Kaumtemperatur soviel 4molare Ammoniumsulfatesung eingetropft, bis sich eine bleibende Trübung ergab. Es wurde 10 Minuten wcitergerührt, dann der gebildete Niederschlag abzcntrifugicrt. Seine Auflösung ergab ein betont hochmolekulares Profil I (vergleiche Beispiel 1) gemäß Fig. 3.

im nt ν. yj L/v. ι Λ ta ι

f(1!!lll-i t MtIt

4molarer Ammoniumsulfatlösung 'is /um glcichvolu migen Verhältnis von ursprünglicher Reaktionslösiing

> zur Ammoniumsulfatlösung versetzt. Der dabei gebildete Niederschlag entsprach Profil II. aus dem man das gewünschte Übergewicht von Doppelmolekülen bei .S' ersieht. Im Überstund dieser zweiten Fällung (Profil III) dominiert dagegen das nicht an Kolloide gekoppelte

ji einfache Hämoglobin (C).

De^r Pin-Wert der Profil Il entsprechenden Fraktion aus butandial-vernetztem Hämoglobin wurde mit 1 5.5 Torr bestimmt.

in Beispie' 3

Aneinanderkopplung von Hämoglobinmolekülen
mit Hilfe von Pentandial(Glutardialdehyd)

100 ml einer 10 g Hämoglobin enthaltenden Lösung

ι. vom pH 7,5 wurden mit 1,2ml 10%iger Pentandiallösung (verdünnt aus wäßriger 25°/oiger Lösung von Glutardialdehyd) wie in Beispiel 1 zur Reaktion gebracht. Das Präparat wurde 3 Wochen bei 5°C gelagert. Danach ergab sich das gelchromatographische

■in »Profil« (vergleiche Beispiel 1) dieses Rohproduktes (siehe F i g. 4). P_5n-Wert: 16,5Torr.

Nach Anreicherung des Doppelmolekülanleils (vergleiche Beispiel 2: »Profil II«) wurde durch Dialyse (Cellophantchläuche. dampfsterilisiert) bei Raumtempe-

r, ratur gegen 2°/oige Kochsalzlösung (Magnetriihrung. 4facher Wechsel des jeweils lOfachen Volumens der Dialysierflüssigkeit im Vergleich zum Präparat innerhalb von 3 Stunden) und durch Passage eines sterilen Ionenaustauschermischbettes(je 100 g Na^-, rev^ktive

.(ι Cl-Form)das Fraktioniersalz (Ammoniumsulfat) vollständig entfernt. Nach Wiedereinstellung der Isotonie und des physiologischen pH-Wertes wurde nochmals sterilfiltriert. Das Präparat erwies sich als pyrogenfrei. Es verweilte 5.5 Stunden im Kaninchenkreislauf

ü (Halbwertszeit) bei einem Pso-Wert von 15 Torr. In F i g. 5 wird das gelchromatographische Profil des Präparates aus pentandial-vernetztem Hämoglobin nach Anreicherung des Doppelmolekülanteils gezeigt.

bo B e i s ρ i e I 4

Aneinanderkopplung von Hämoglobinmolekülen
mit Hilfe von Hexandial (Adipindialdehyd)

Vorarbeiten: Hexandial wurde frisch hergestellt

r5 analog K. W. Rosenmund und F. Zetzsche; Chem. Ber.

54. 2888 [1921] aus Adipinsäure-dichlorid (vergleiche Beispiel 5). Der vom festen Katalysator abgetrennte, noch salzsaure Abdampfrückstand wurde im öfachen

Volumen Äthanol aufgenommen zur »Reaktionsmischung 4« mil einem pH-Wert von 2 — 3.

4 ml der Reagenzmischung 4 wurden unmittelbar nach der Herstellung analog Beispiel I auf 100 ml einer — allerdings — I4%igen Hämoglobinlösung vom pK-Wert 9 einwirken gelassen. Nach der üblichen Aufarbeitung und Ammoniumsulfaifraktionierung gemäß Beispiel 2 ergab sich das gelchromatographische Profil gemäß F i g. 6. Der Pv,-Wert betrug 16 Torr.

Beispiel 5

Aneinanderkopplung von Hämoglobinmolekülen
mit Hilfe von Octandial (Suberaldehyd)

Vorarbeiten: Octandial wurde nach K. W. Rosenmund und F. Zetzsche. Chem. Ber. 54, 2888 [1921], aus Korksäuredichlorid hergestellt. Dazu wurden 40g Korksäure in 50 ml Thionylchlorid 2 Stunden unter Rückfluß gekocht. Nach nochmaligem Zusatz von 25 ml Thionylchlorid und weiteren 3 Stunden Sieden unter Rückfluß wurde das Korksäuredichlorid im Vakuum von 10 Torr bei 143— 145°C abdestilliert. Es folgte eine hydrogenolytische Umsetzung gemäß der vorstehend genannten Vorschrift zum Octandial, das im Verhältnis I g : 10 ml Äthanol zur »Reagenzmischung 5« angesetzt _,nd unmittelbar mit Hämoglobin zur Reaktion gebracht wurde.

100 ml einer 14%igen Hämoglobinlösung vom pH 6 (wie in Beispiel 2) wurden mit 43 ml »Reagenzmischung 5« zur Reaktion gebracht. Nach entsprechender Aufarbeitung und Anreicherung des Doppelmolekülanteils durch Ammoniumsulfatfällung ergab sich ein Präparat mit einem gelchromatographischen Profil gemäß F i g. 7.

Diesem Präparat entsprach ein Pw-Wert von 14,5 Torr.

Beispiel 6

Ankopplung von Hämoglobin an Serumalbumin

In 100 ml einer 6 g Hämoglobin enthaltenden Lösung wurden 6,5 g Serumalbumin aufgelöst. Diese Bereitung wurde gemäß Beispiel 2 weiterbehandelt mit der Ausnahme, daß 5,1 ml wäßrige Butandiallösung (»Reagenzlösung 2«) innerhalb 2 Minuten bei einem zuvor eingestellten pH-Wert von 84. der im Verlaufe von 2 Stunden Rühren bei Raum-Temperatur aufrechterhalten wurde, hinzugesetzt wurden. Danach erfolgte eine pH-Korrektur (H⁺-Form eines Kationenaustauschers) auf 73, Sterilfiltration und Kühlschranklagerung. Nach 3 Wochen ergab die gelchromatographische Charakterisierung an Hand einer Säule von Sephadex G 150 ein Profil gemäß F i g. 8.

Die Charakterisierung durch Folienelektrophorese (pH 8,6) ergab eine starke Bande des Kopplungsproduktes Hämoglobin-Albumin zwischen den schwächeren Banden des langsamer wandernden Hämoglobins und des rascher wandernden Albumins.

Durch Ammoniumsulfatfraktionierung konnte das Kopplungsprodukt weiter angereichert werden. Nach Gelchromatographie über Sephadex G 150 ergab sich ein Profil gemäß Fig.9. Das derart angereicherte Produkt hatte einen P?o-Wert von 13 Torr.

Beispiel 7

Ankopplung von Hämoglobin an Serumalbumin

In 100 ml einer 6 g Hämoglobin enthaltenden Lösung wurden 6,5 g Serumalbumin aufgelöst. Diese Bereitung wurde gemäß Beispiel 6 weiterbehandelt mit der Ausnahme, daß 1,5 ml 10%ige Pentandiallösung innerhalb einer Minute bei einem zuvor eingestellten pH-Wert von 9, der im Verlaufe von 2 Stunden Rühren bei Raumtemperatur aufrecht erhalten wurde, hinziipesetzt wurden. Nach 3 Wochen ergab die gelchromato graphische Charakterisierung anhand einer Säule von Sephadex G 150 ein Profil gemäß Fig. 10. Pw-Wert: 13,5 Torr.

Beispiel 8

Ankopplung von Hämoglobin an Oxypolygelatine

100 ml einer 12°/oigen Hämoglobinlösung wurde ein 10%iges Konzentrat von Oxypolygelatine zugemischt.

:> Diese Mischung wurde gemäß Beispiel 3 bei einem pH-Wert von 7,5, jedoch mit 1,5 ml 10%iger Pentandiallösung unter sonst analogen Bedingungen umgesetzt und gelagert. Gelchromatographii: über Sephadex G 150 ergab davon ein Profil gemäß Fig. 11.

in Dieses Präparat wies einen P₅₀- Wert von 15 Torr auf.

Beispiel 9

Ankopplung von Hämoglobin an hydrolytisch
abgebaute Gelatine

7ii 60 m! pinpr fiO/nippn Hämnplnhinlöiiinp wurden 50 ml einer 6%igen Gelatinebereitung (Rinderknochengelatine) zugemischt, die zuvor durch Erhitzen bei pH 10 auf ein mittleres Molekulargewicht (M_n) von 25 000 hydrolytisch abgebaut worden war. Dieses Gemisch wurde gemäß Beispiel 3 mit Pentandial umgesetzt, allerdings bei einem pH-Wert von 7 und mit einer Menge von 0,75 ml der 10%igen Pentandiallösung. Das analog Beispiel 3 aufgearbeitete unfraktionierte Endprodukt zeigte nach 3 Wochen Lagerung das gelchromatographische Profil gemäß Fig. 12 und einen P₅₀- Wert von 14 Torr.

Beispiel 10

Ankopplung von Hämoglobin an hydrolytisch
abgebaute Gelatine

Zu 50 ml einer 6%igen Hämoglobinlösung wurden 50 ml einer abgebauten Gelatinebereitung wie in Beispiel 9 zugemischt Dieses Gemisch wurde gemäß Beispiel 4 mit Hexandial umgesetzt, allerdings bei einem pH-Wert von 7 und mit einer Menge von 0,6 ml der 16%igen Dialdehydzubereitung (»Reagenzmischung 4«). Das analog Beispiel 4 aufgearbeitete Endprodukt zeigte nach Ammonsulfatfraktionierung einen Pso-Wert von 13 Torr.

Beispiel 11

Ankopplung von Hämoglobin an Serumproteine

50 ml einer 10%igen Hämoglobinlösung wurden mit 50 ml Humanserum mit 5% Proteingehalt gemischt und gemäß Beispiel 3 mit Pentandial zur Reaktion gebracht. Dazu wurden jedoch 1,4 ml der 10%igen Dialdehydlösung bei einem vorher eingestellten pH-Wert von 8,0 verwendet. Das nach üblicher Aufarbeitung anfallende Rohprodukt wurde durch das Gelfiltrations-Diagramm von Fi g. 13 charakterisiert. Pw-Wert: 13 Torr.

Beispiel 12
Ankopplung von Hämoglobin an Serumproteine

50 ml einer 10%igen Hämoglobinlösung wurden mit 50 ml Humanserum mit 5% Proteingehalt gemischt und analog Beispiel 5 mit Octandial, jedoch bei einem vorher eingestellten pH-Wert von 8,0 zur Reaktion gebracht. Dazu wurden 1,9 ml der Reagenzmischung 5 verwendet. Das nach üblicher Aufarbeitung anfallende Rohprodukt wurde durch das Gelfiltrations-Diagramm von Fig. 14 charakterisiert. P₅₀-Wert: 13 Torr.

Beispiel 13

Bindung von Pyridoxalphosphat an
aneinandergekoppelte Hämoglobinmoleküle

Zu einem gemäß Beispiel I hergestellten fertigen Präparat wurden nach 3 Wochen Lagerung im Kühlschrank 0,1 g Pyridoxalphosphat pro 100 ml zugesetzt mit dem Ziel, die Sauerstoffaffinität zu erniedrigen. Nach weiterer 3monatiger Kühlschranklagerung wurde bei dem Präparat ein p5o-Wert von 17 Torr gemessen. Das Rohprodukt zeigte nach Gelchromatographie über SephadexG 150 das Profil gemäö Fi g. 15.

Beispiel 14

Bindung an Pyridoxalphosphat an
aneinandergekoppelte Hämoglobinmoleküle

Zu einem gemäß Beispiel J hergestellten Rohprodukt wurden nach 3 Wochen Lagerung im Kühlschrank 0,1 g Pyridoxalphosphat pro 100 ml zugesetzt. Bei dem Präparat wurde ein Ps₀-Wert von 16,5 Torr gemessen. Es zeigte nach Gelchromatographie über Sephadex G 150ein Profil gemäß Fig. 16.

Hierzu (i Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von chemisch modifizierten, haltbaren Hämoglobinpräparaten für den akuten Blutersatz und für Organperfusionen, bestehend aus einer Mischung von aneinander oder an andere Proteine gekoppelten Hämoglobinmolekülen, wobei die aneinandergekoppelten Moleküle eine etwa freiem Hämoglobin entsprechende Sauerstofftransportfähigkeit aufweisen und eine mindestens doppelt so lange Verweilzeit in der Blutbahn haben wie natives, frei gelöstes Hämoglobin, dadurch gekennzeichnet, daß man (A) Hämoglobinlösungen oder deren Mischungen mit anderen Proteinen mit Dialdehyden mit Kohlenstoffketten mit 3 bis 8 C-Atomen behandelt, oder daß man (B) in bekannter Weise Hämoglobinlösungen oder deren Mischungen mit anderen Proteinen in die saueiVxiff-freie Desoxyform überführt und dann unter Sauerstoffausschluß Dialdehyde mit, insbesondere geraden, Kohlenstoffketten mit 3 bis 8 C-Atomen zugibt, gegebenenfalls in den Fällen (A)

und (B) zur Anreicherung und zur Abtrennung des modifizierten Hämoglobins vom nichtmodifizierten oder allzu stark modifizierten Hämoglobin anschließend mit Ammoniumsulfat fraktioniert aussalzt und danach eine Kurzdialyse und Ionenaustausch mit Mischbettionenaustauschern durchführt und gegebenenfalls im Falle (B) anschließend mit Pyridoxalphosphat versetzt.

Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die 6- bis lSfache molare Menge Dialdehyd, bezogen auf das eingesetzte Hämoglobin, zugibt

3. Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man wäßrige oder alkoholische, vorzugsweise lO°/oige wäßrige Dialdehydlöaungen verwendet.

4. Modifiziertes Hämoglobinpräparat, erhalten durch das Verfahren gemäß einem dsr vorstehenden Ansprüche.