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Verfahren zur Stabilisierung eines adrenocorticotropen Präparates
Die Erfindung betrifft die Herstellung eines adrenocüwticotropen Präparates, das
sich für intramuskula,re oder subkutane Injektionen eignet und eine gesteigerte
Wirkung zeigt. Das adrenocorticotrope Hormon ist eine Substanz, die von dem Hypo,-physenvorderlappen
abgesondert wird und wahT-scheinlich durch die Blutbahn zur Nebenniere gebracht
wird, wo sie einen Einfluß auf die Entwiddung, das Wachstum und die Wirksamkeit
der Nebennievenrinde ausubt In den letzten Jahr-en haben Gich Extrakte aus adrenocorticotropen
Hormon, die aus, den Hypophysen von Tieren, wie Schweinen, Schafen und Rindern,
gewonnen wurden, als außerst w- irksain für die Besserung bestimmter pathologischer
Zustände beim Menschen bei pairenteraJer Injektion er-wiesen.
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Da die tierischen Hypophysen, aus denen das ad-renocc,r.ticotrope
Hormon gewonnen wird, jedoch
nur in begrenzter Anzahl für eine Verarbeitung
zur Verfugung stehen und dabei nur verhältnismäßig geringe Mengen an Wirkstoff besitzen,
wurde erfindungsgemäß ein Verfahren entwickelt, das nicht nur die äußerste Ausbeute
an aktiver Substanz aus den verfügbaren Drüsen gewährleistet, sondern auch die Wirksamkeit
der aktiven Substanz bis zum größtmöglichen Ausmaß steigert.
Erfindungsgemäß
wird das Ad#renocorticotropin mit einer besonderen Art von Gelatineträger, nänilich
mit Oxypolygelatine, unter Bildung einer Komplexverbindung kombiniert Das adirenoc-o#r-ticotrope
Hormon ist bei Anwen.-dun,g in der KoinplexverUndung mit Oxypolygelatine. wirksamer
als das gleiche AdrenocoTticn,-tropin-Hermon bei Anwendung in irgendeinpr anderen
bekannten Gelatineart und selbstverstäftdlich wesentlich wirksamer als das gleiche
Hormon in einer üblichen wäßTigen Lösung. Die gesteigerte Wirksamkeit zeigte sich
in einer Verdoppelung und Verdreifachung der ACTH-Wi.rkung gegenüber der mit anderen
Gelatinearten erzielten.
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Die 61xm beschriebene Wirkungssteigerung ist eine tatsächliche Potenzierung
zum Unterschied von einer nur verzögernden Wirkung, die manchmal durch die Viskosität
des Trägers hervorgerufen werden kann. Dies wird vielleicht durch die Tatsache klar,
daß das Oxyp#olygelatine-Adrenocorticotropin-Präparat unmittelbar naich der Injektion
eine plötzliche starke Reaktion verursacht, die weit über ,die Reaktion, die durch
eine gleiche Dosis derselben Substanz in einer wäßrigen Lösung, der keine Oxypolygelatine
zugegeben wurde, hinausgeht. Es zeigte sich, daß während der ersiten 24 Stunden
nach der Injektion die Reaktionserschein-ung bei einer bestimmten Dosis Oxypolygelatine-Adrenocorticotropin
ähnlich der des Adrenocorticotrop#in waren. Im weiteren Verlauf konnte jedoch beobachtet
werden, daß die Reaktion des Oxypolygel,atine-A,d,renoooirticiotropins stärker wird,
so als sei eine viel größere Dosis gegeben worden. Diese Erscheinung kann nicht
einfach auf Grund von Resorptionsverzögerung erklärt werden, sondern man
darf annehmen, daß sie auf der Eigenschaft der Komplexverbindiing mit, der Oxypolygelatine
beruht.
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Oxypolygelaitine, der erfindungsgemäß ange wandte Träger, ist bekannt,
in der Literatur ausführlich beschrieben und leicht zu erhalten. (Campbell u.,a.,
»ThePreparationandProperties of a Modified Gelatin, [Oxypo-lygelatin] As an Oncotie
Substitute for Serum Albumin« Texas Reports on Biology and Medicine, Bd.
9, Nr.:2, S. 235
bis :28o, Sommer 195 1). Im allgeineinen wird
Oxypolygelatine wie folgt hergestellt: DieGelatine wird mit einem Kondensationsmittel,
wie z. B. Glyoxal oder einem Kupplungsagens zu größeren Komplexen gebunden. und
diese-, Gelgti#nK>-Polymere mit hohem Ni ,lojektilaagewicht der Oxydation mit Wasserstoffsuperoxyd
bis zu einem bestimmten Grad unteTworfen, wobei dais Molekül bis zur gewünschten
Größe und Konfiguration abgebaut wird.
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Oxypolygelatine wurde bereits zur Vergrößerung des PJasmavolumens
verwendeL Die Verwendung aJs Trager für adTenoooreicotropes Hormon wax bis jetzt
noch nicht bekannt. Es. ist bekannt, daß sie nicht toxisch wirkt und weder Antigene
erzeugt noch Fieber hervorruf t. Es wird vorzugsweise eine 35- bis 4o%ige wäßrige
Oxypolygelatine bei. der Herstellung des erfmdungsgeni*aßen Produktes angewandt.
Im aälgemeinen ist es zweckmäßig, daß die Konzentration an Oxypolygelatine in einem
Bereich zwischen 5 und 5o Gewichtsprezent der Injektions,lösung liegt, es
können aber auch Oxypolygelatine-Konzentrationen =gewendet werden, die ober- und
unterhalb dieser Grenzen liegen.
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Das adTenocorticotrope Hormon ist zwar bis jetzt noch nicht isoliert
worden, und seine Molekülstruktur ist noch nicht endgültig charakterisiert. Man
nimmt jedoch an, daß es ein EiweißköTper ist und daß bestimmte Herstellungsverfahreii
zu einem Polypep,tid-Molel-,üJ mit adrenocorticotroper Wirksamkeit führen. Bei der
vorliegenden Arbeit wurde eine ziemlich reine Substanz verwendet, aber
jede
der bekannten adrenocorticotropen Substanzen -
ganz gleich, ob
sie in der sogenannten »Ganzp#roteinform«:oder der »P.oilypeptid.form« vorliegt
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kann unabhängig von ihr'eT Herkunft oder ihrem Herstellungsverlauf mit Oxypolygelakine
zur Erzielung der erfindungsgemäß beabsichtigten Wirkung kombiniert werden.
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Die Art, inder die aktive Substanz mit der Oxypolygelatine reagiert,
um die erhöhte- Wirksamkeit zu schaffen, könnte man etwa wie folgt erklären: Durchdie
Oxydationsreaktion, der die Oxypolygelaitine unterzogen wird, wird das Molekül mit
einer größeren Anzahl saurer Carboxylgruppen versehen, die verursachen, daß die
Oxypolygelatine sich mit dem basischcn Adrenocorticotropin unter Bildung eines chemischen
Komplexes mit erhöhter ad#renocortico,tropeT Wirksamkeit verbindet.
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Die Erfindung wird an Hand der nachfolgenden Beispiele näher beschrieben:
Beispiel i . Eine bestimmte Menge Aclrenoconrticotropin wird durch Extra:ktion
mit Eisessig bei 7o' C aus mit Aceton entwässerten Hypophysen.vorderlappen-
von Schweinen erhalten. Durch Zusatz des halben Vo# lumens Aceton und einer kleinen,
Menge NaC1 zu der Lösung werden unerwünschte Bestandteile ausgefällt. Durch Versetzen
der Lösung mit einer gleich großen Menge Äthyläther fällt man. ein rohes Adrenoocyrticww,opin
aus. Der Niederschlag wird durch Adsorption an Oxyzellulose gereinigt und wieder
eluiert. Man versetzt das Eluat mit einem IonenaustauschhaTz, insbesondere einem
Anionenalistauschharz (ein Handelspriodukt der Fa. Röhm und Haas mit dem Namen i
R 4oo), um das Adrenocoirticotropin in dais Aceat zu überführen. Die so gebildete
Lösung wird dann lyophilisiert, mit destilliertem pyrogenfreietn Wasser aufgenommen,
steril filtriert, in Ampullen abgefüllt, abgekühlt und wieder lyophilisiiert.
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Das getrocknete Produkt, das manchmal als »Polypeptidfofrm<,i des
Ad-renocorticotropin-,s bezeichnet wird, wird mit einer Lösung, die 37 0/0
Oxypolygelatine
und 0,5 0/0 Phenol enthält, umgesetzt.
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Die Oxypolygelatinelösung wurde durch Kondensation von Gelatine mit
Glymal und darauffolgender Oxvdati-on mit Wasserstoffsuperoxyd hergestellt unä lag
ais 5%ige Oxypolygelatinelösung in Salzlösung vor. Diese wurde für die Verwendung
in
dem vorliegenden Beispiel so, behandelt, laß der normale Sailzgehalt durch Dialyse
entfernt, die Lösung durch Vakuumdestillation auf 370/0
Oxypolygelatme angereichert"mit
Phenol bis zu ainer Konzentration von 0,5010 versetzt und steril filtriert
wurde.
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Beispiel 2 Lyophi,1,i,siertio,s Adrenooorticot#ropin, das nach Beispiel
i hergestellt worden war, wird -mit i6"/oige,r Gelatine zu einer ACTH-Wirksamkeit
von 16,5 Ei#n#heiten/o,5 nil aufgebaut. Die obige Stammlösung wird-in zwei gleich
große Teile geteilt und zur Herstellung der LösungenA und B wie folgt verwendet-.
LösungA wird durch VeT-dünnen der Stammlösung auf 0,40 Einheit-en/0,5 nil mit i6,1/oiger
Gelatine, die 0,5 "70 Phenol enthält, hergestellt. Lösung B wird durch Verdünnen
dex Stammlösung auf 0,4b Einheiten / 0,5 ml mit 37%iger OxYPO-lYgelatine"d-ie 0,5
0/0 Phenoll enthält, hergestellt.
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Lösungen A und B werden darauf nach dem Adrenalin-Ascorbinsäure-Erschöpfungstest
an hypophysektomierten Ratten untersucht. Den Ratten werden die Hypophysendrüsen
vor dem Test entfernt. Die Versuchstiere bekommen eine Injektion von A C
T H und werden in Abständen getötet und der Gehalt an. AsoDrNn#säu-re in der Adrenalindrüse
bestimmt. Das. ACTH hat die Wirkung, den Gehalt an Ascorbinsäure in der AdrenaEndrüse
zu senken. Die gefundene Konzentration der AscoTbinsäu-re wird als Maßstab der Aktivität
des ACTH-Produktes verwendet. Diese Methode ist eine Standardmethode zur Untersuchung
dex Aktivität von ACTH-Produkten (S ayers u. a. »Indocrinology« 4:2,
379 [1948]). Beispiel 3
Lyophili:siertes AdTenocoTticotropin, das nach
Beispiel i hergeste-fit worden war, wird mit i6,1/oig-eir Gelatine zu einer ACTH-Wirksamkeit
von 16,5 Einheiten / o, 5 ml aufgebaut.
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Die.-obige, Stammlösung wird in zwei gleich große Teile geteilt und
zur Herstellung der L& sung C und D wie folgt verwendet: Lösung
C wird durch Verdünnen der Stamm-« lösung -auf o,i:2o Einheitenjo,5 ml mit
i60/9iger Gelatine, die o,5 11/o Phenol enthält, hergestellt.
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Lösung D wird durch Verdünnen der Stammlösung auf 0,120 Einhei,ten/0,5
ff11 mit 37%iger OxypoJygelatine, die o,5 1/o Phenol enthält, verdünnt.
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Lösungen C und D werden nach der genannten Standardmethode
untersucht, und es zeigte sich, daß Lösung D (mit Oxypolygolatine umgesetzt)
eine Wirksamkeit von etwa i5o bis 2oo%, deir Lösung C (mit nur gewöhnlicher
Gelatine) besaß. Wenn der Ausdruck »Einheit« hier in Verbindung mit ACTH-Wirksamkeit
gebraucht wird, so bedeutet dies immer: »Internationale Einheit«, wie sie von der
Welt-Gesundheits-Organisation angenommen wird.