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Verfahren und Reagenz zur Bestimmung von menschlichem chorionischem Gonadotrophin
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur serologischen in Vitro-Bestimmung von menschlichem chorionischem Gonadotrophin (in der folgenden Beschreibung als MCG bezeichnet) bzw. ein Reagenz zur serologischen Bestimmung der Schwangerschaft durch Bestimmung des MCG im Urin ; die Herstellung dieses Reagenzes fällt ferner in den Rahmen der Erfindung.
MCG wird während der Schwangerschaft durch die Plazenta gebildet und wird kurz nach einer gewissen Ansammlung in Serum und Urin gefunden. MCG wird nur im Urin schwangerer Frauen ausgeschieden, liegt jedoch nicht im Urin nicht schwangerer Frauen vor, abgesehen von Fällen mit bestimmten pathologischen Zuständen, wie z. B. bei chorionischem Gewebetumor. Es ist allgemein anerkannt, dass-abgesehen von den vorstehend genannten pathologischen Zuständen - die Gegenwart von MCG in Urin und Serum ein verlässlicher Nachweis der Schwangerschaft ist. Verschiedene bisher angewandte Schwangerschaftstests basieren auf biologischen in vivo-Methoden zur Bestimmung der Gegenwart von MCG. Der Aschheim-Zondek-Test beruht auf der Fähigkeit von MCG, bei subkutaner Injektion bei Mäusen Corpora lutea zu bilden.
Trotz der erheblichen Genauigkeit dieses Tests ist seine Anwendung beschränkt, weil relativ viel Zeit benötigt wird, bis die Testergebnisse erhalten werden ; weil ferner zahlreiche Tiere des entsprechenden Alters vorhanden sein und mehrere Injektionen gemacht werden müssen. Ein weiterer Nachteil besteht darin, dass viele Tiere durch die Toxizität des Testurins getötet werden. Ein weiterer biologischer Schwangerschaftstest, der vielfach angewendet wird, ist der sogenannte Friedman-Test. Bei diesem Test wird ein weibliches Kaninchen, das drei oder vier Wochen lang isoliert worden war, als Versuchstier verwendet. Eine Probe des zu testenden Urins wird in die Ohrvene des Kaninchens injiziert und 48 h nach der Injektion werden die Ovarien auf gerissene haemorrhagische Follikel untersucht, die eine positive Reaktion anzeigen.
Ein Vorteil dieses Tests besteht darin, dass das Tier nicht getötet, sondern innerhalb vier bis sechs Wochen wieder verwendet werden kann. Der Friedman-Test vermeidet zahlreiche Nachteile des Aschheim-Zondek-Mäusetests und ist fast genauso exakt. Ein Nachteil des Friedman-Tests liegt darin, dass die Kosten für die Tiere hoch sind, falls ein Tier zugrunde geht, und dass längere Aufzucht der Tiere erforderlich ist.
In andern viologischen Schwangerschaftstests werden nicht ausgereifte weibliche Ratten verwendet.
Der zu testende Urin wird den Ratten subkutan injiziert, worauf die Tiere am nächsten Tag getötet werden. Die Ovarien werden auspräpariert und ihre Vergrösserung sowie die Gegenwart von Rötungen oder roten Flecken wird bestimmt. Ein Hauptnachteil dieses Verfahrens besteht in der Schwierigkeit, schwach rosa gefärbte negative Ovarien von rötlichen positiven Ovarien zu unterscheiden ; eine hinreichende Exaktheit des Tests kann daher nur von sehr geübten Personen garantiert werden.
Auch Frösche und Kröten wurden bereits für Schwangerschaftstests verwendet, jedoch sind diese Tiere relativ unempfindlich im Vergleich mit Mäusen, Ratten und Kaninchen, so dass es häufig notwendig ist, den zu testenden Urin zu konzentrieren, um die Konzentration an MCG zu erhöhen.
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Gegenstand der Erfindung ist die Bereitstellung einer serodiagnostischen Methode zur Bestimmung der Schwangerschaft durch in Vitro-Bestimmung des MCG im Urin. Insbesondere ist Gegenstand der Erfindung ein serologisches Testreagenz zur Bestimmung der Schwangerschaft in Form einer MCG-Kunstharz-Kombination, das eine Suspension von Kunstharzteilchen aufweist, die Protein an der Oberfläche adsorbieren können, wobei die Oberfläche der suspendierten Teilchen MCG, dessen physikalische Eigenschaften ohne Veränderung der immunologischen Eigenschaften abgewandelt sind, an der Oberfläche adsorbiert enthalten (in der folgenden Beschreibung als" Latex-Reagenz" bezeichnet).
Die Erfindung stellt ein serodiagnostisches Verfahren zur Bestimmung der Schwangerschaft bereit, das zur Durchführung keine speziellen Vorrichtungen benötigt und in wenigen Minuten vorgenommen werden kann.
Es wurde festgestellt, dass die bei biologischen in vivo-Methoden bestehenden Schwierigkeiten beseitigt werden können bei Verwendung eines Latex-Reagenzes in einem serologischen in Vitro-Test unter Bestimmung des MCG im Urin schwangerer Frauen. Das Verfahren ist äusserst zuverlässig, in wenigen Minuten durchführbar und ohne besondere Vorrichtungen oder besondere Übung anwendbar.
Als Testreagenzien dienen das genannte Latex-Reagenz und ein MCG-Antiserum. Beim Test wird das Antiserum mit einer geringen Menge des zu testenden Urins gemischt, worauf man das Latex-Reagenz dem Antiserum-Uringemisch zumischt. Enthält der zu testende Urin MCG, so erfolgt eine Reaktion zwischen MCG und dem Antikörper des Antiserums, so dass der Antikörper nicht mehr mit dem MCG auf den Teilchen des Latex-Reagenzes reagieren kann. Liegt kein MCG im Urin vor, so reagiert das MCG auf den Kunststoffteilchen mit dem Antikörper des Antiserums, was sich durch Agglutination der Teilchen im Latex-Reagenz anzeigt.
Das Antiserum wird hergestellt, indem man partiell gereinigtes MCG aus dem Urin schwangerer Frauen Kaninchen injiziert. Nach etwa 5 Wochen werden die Kaninchen entblutet und die Seren werden gewonnen. Das Serum von jedem Kaninchen wird gegen MCG bekannter Konzentration getestet, und die Antiseren, die eine positive Reaktion bei einer niedrigen MCG-Konzentration ergeben, werden vereinigt. Die Konzentration der Antikörper in den vereinigten Antiseren wird durch Verwendung von MCG bekannter Konzentration bestimmt, so dass die Menge an MCG, die benötigt wird, um vollständige Reaktion mit den Antikörpern in den vereinigten Antiseren herbeizuführen, genau bekannt ist (E. A. Kabat und M. M. Mayer, Experimental Immunochemistry, 2. Auflage [1961], S. 22-90).
Das Latex-Reagenz wird hergestellt, indem man eine wässerige Lösung von MCG langsam und unter konstantem Rühren einer Suspension aus Teilchen eines Kunstharzes, das Protein an der Oberfläche adsorbieren kann, zusetzt, wobei man eine MCG-Harz-Kombination erhält, bei welcher das MCG an den einzelnen Teilchen adsorbiert ist.
Die Teilchen sind etwa sphärisch und besitzen einen mittleren Durchmesser zwischen etwa 0, 07 und etwa 0, 90/l ; der bevorzugte mittlere Durchmesser liegt bei etwa 0, 81 li. Die Konzentration der Teilchen im Latex kann zwischen etwa 0, 5 und 1, 5 Gew. -0/0 schwanken ; es empfiehlt sich jedoch, eine Suspension zu verwenden, in welcher die Konzentration zwischen etwa 0, 8 und etwa 1, 2 Gew.- o liegt. Ist die Teilchenkonzentration in der Suspension geringer als etwa 0, 5 Gew.-%, so kann eine Agglutinierung bzw. Zusammenballung der Teilchen nicht leicht erfolgen, und wenn sie erfolgt, ist sie nur schwer erkennbar. Bei mehr als etwa 1, 5 Gew.- ist die Menge wieder zu gross, um eine genaue Bestimmung der Agglutination zu erlauben.
Das bei der Herstellung der MCG-Lösung verwendete MCG sollte relativ rein sein. Es hat sich gezeigt, dass MCG mit etwa 1700 und vorzugsweise zwischen etwa 1700 und etwa 3000 internationalen Einheiten pro mg befriedigende Ergebnisse liefert.
Das verwendete MCG sollte nicht weniger als etwa 1700 internationale Einheiten pro mg aufweisen, da andernfalls das Fremdprotein, das zusammen mit dem MCG vorhanden ist, in merklicher Menge ebenfalls auf den Harzteilchen adsorbiert wird, so dass eine Störung des Tests durch Verhinderung der Agglutination eintritt.
Die bei der Herstellung des Latex-Reagenz verwendete MCG-Lösung enthält das MCG in einer Menge von etwa 720 bis etwa 900 internationalen Einheiten pro ml. Die bevorzugte Menge liegt bei zirka 840 internationalen Einheiten pro ml. Enthält die MCG-Lösung weniger als etwa 720 internationale Einheiten pro ml, so werden die Kunstharzteilchen nicht vollständig immunologisch überschichtet, so dass offen liegende Teilchenoberfläche vorhanden ist, die Fremdprotein aus dem zu testenden Urin adsorbiert, wodurch die Bestimmung gestört wird.
Enthält die MCG-Lösung mehr als etwa 900 internationale Einheiten MCG pro ml, so bleibt überschüssiges MCG im Latex-Reagenz in nicht adsorbierter Form zurück, das vorzugsweise mit dem MCG-Antikörper im Antiserum reagiert, so dass dieser Antikörper nicht
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mit dem MCG des Latex-Reagenzes sich umsetzen kann und dadurch die Agglutination, die andernfalls stattfinden sollte, verhindert wird. Die zu behandelnde Latex-Suspension enthält zwischen etwa 1, 8 und 2, 2 Gew.- ) Harzteilchen.
Damit der Latex beim Test eine befriedigende Wirkung entfaltet, muss das darin vorhandene MCG die Fähigkeit besitzen, rasch und vollständig mit den Antikörpern des Antiserums zu reagieren, unter Hervorrufung einer leicht beobachtbaren Zusammenballung der Teilchen im Latex. Um dies zu ermöglichen, muss das MCG abgewandelt werden. Die Abwandlung verursacht eine Veränderung der physikalischen Eigenschaften des MCG unter Aufrechterhaltung der immunologischen Eigenschaften. Die Abwandlung erfolgt durch Altern des Latex-Reagenzes bzw. beschleunigtes Altern durch verschiedene Behandlungen wie Erhitzen oder Anwendung einer digestiven enzymatischen Behandlung zusammen mit Wärme ; diese Behandlung wird mit der MCG-Lösung vor der Adsorption auf den Latex-Teilchen oder mit dem fertigen Latex-Reagenz vorgenommen.
Die Abwandlung des Latex-Reagenzes kann erfolgen durch langsames Erhitzen auf eine Temperatur von zirka 96 C, Abkühlen auf etwa 500C und längeres Stehenlassen bei dieser Temperatur während etwa 4 bis etwa 6 Wochen ; auch kann man das Material langsam auf etwa 500C erwärmen und zirka 2-3 Monate bei dieser Temperatur belassen.
Die Abwandlung unter gleichzeitiger Anwendung von Enzymen und Wärme kann erfolgen, indem man das Latex-Reagenz, das einen PH- Wert zwischen etwa 8, 0 und 9, 0, vorzugsweise 8, 2, aufweist, mit einer wässerigen Trypsin-Lösung versetzt, deren Konzentration 1/10 der Konzentration des an den Latex-Teilchen im Latex-Reagenz adsorbierten MCG beträgt (bezogen auf das Gewicht), dann das Latex-Reagenz langsam auf etwa 500C erwärmt und bei dieser Temperatur zirka 2-4 Wochen belässt.
Auch kann man die Enzymbehandlung vor der Adsorption des MCG auf den Latex-Teilchen und die Wärmebehandlung nach der Adsorption vornehmen. Man kann beispielsweise so vorgehen, dass eine wässerige Trypsin-Lösung, deren PH- Wert auf etwa 6, 8 bis etwa 7, 2 und vorzugsweise auf etwa 7, 1 eingestellt wurde, einer wässerigen MCG-Lösung vom selben PH- Wert zugesetzt wird, worauf die resultieren-
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Temperatur belässt.
Nach der Abwandlung des Latex-Reagenzes wird letzteres auf einen PH- Wert zwischen etwa 7, 8 und etwa 8, 8 gepuffert. Bei PH- Werten unter etwa 7, 8 und oberhalb etwa 8, 8 lässt die Stabilität des Reagenz derart nach, dass die Zuverlässigkeit des Tests unbefriedigend wird.
Ein Latex-Reagenz der obigen Art weist etwa 36 bis etwa 45 internationale Einheiten MCG pro mg Latex-Teilchen auf. Die bevorzugte Menge liegt bei etwa 40 - 42 internationalen Einheiten pro mg Latex-Teilchen. Bei weniger als etwa 36 internationalen Einheiten pro mg bleibt viel freie, immunologisch unbeschichtete Oberfläche zurück, auf der Fremdprotein aus dem zu testenden Urin adsorbiert werden kann, wodurch Störung der Reaktion erfolgt. Bei mehr als etwa 45 internationalen Einheiten pro mg Latex-Teilchen ist überschüssiges, nicht adsorbiertes MCG vorhanden, das bevorzugt mit dem MCGAntikörper des Antiserums reagiert, so dass dieser Antikörper nicht zur Reaktion mit dem MCG auf den Latex-Teilchen zur Verfügung steht und daher die andernfalls fällige Agglutination unterbleibt.
Die zur Adsorption des MCG und Herstellung des Latex-Reagenzes geeigneten Kunstharze müssen Protein adsorbieren können und ferner in sphärischer oder nahezu sphärischer Form mit einem mittleren Durchmesser von etwa 0, 07 bis etwa 0, 90/l herstellbar sein. Geeignete Harze sind z. B. Polystyrol und Polymethacrylsäureharze.
Beispiel 1: 3,6 ml einer Suspension von Polystyrolteilchen, die einen mittleren Durchmesser von 0, 81 J. l aufwiesen und in einer Konzentration von 28, 32 Gew.-% vorlagen, wurden zu 46, 4 ml einer wässerigen Pufferlösung mit einem PH- Wert von 8, 2 zugesetzt. Die Pufferlösung war hergestellt aus 6, 675 g Natriumborat, 8, 04 g Borsäure und 9, 0 g Natriumchlorid unter Auffüllen mit destilliertem Wasser auf l l. 50 ml einer wässerigen MCG-Lösung mit 40000 internationalen Einheiten, die auf einen pH-Wert von 8, 2 mit Hilfe der gleichen Pufferlösung gepuffert war, wurden langsam der gepufferten Suspension unter ständigem Rühren zugesetzt.
Das resultierende Material wurde langsam auf 500C erwärmt und 3 Monate lang bei dieser Temperatur gehalten.
Beispiel 2 : Es wurde ein Latex-Reagenz nach der Methode von Beispiel l hergestellt, mit der Abweichung, dass direkt nach Zugabe der gepufferten MCG-Lösung zu der gepufferten Polystyrolsuspension das Gemisch langsam auf 960C unter heftigem Rühren erwärmt wurde, worauf auf 500C abgekühlt und das Gemisch 6 Wochen lang bei dieser Temperatur stehen gelassen wurde.
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Beispiel 3 : 3, 6 ml einer Suspension von Polystyrolteilchen mit einem mittleren Durchmesser von 0, 81 ! l wurden langsam zu 36, 4 ml der im Beispiel 1 verwendeten Pufferlösung zugesetzt. Dann wurden 50 ml einer wässerigen MCG-Lösung, die ebenfalls mit der Pufferlösung gemäss Beispiel 1 auf PH 8, 2 gepuffert war, und die 40000 internationale Einheiten MCG enthielt, langsam der gepufferten Suspension unter ständigem Rühren zugesetzt. Das resultierende Material wurde dann 16 h lang bei 5 C
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4:Natriumchlorid und 5, 54 g Calciumchlorid unter Auffüllen mit destilliertem Wasser auf 1 l erhalten worden.
Eine wässerige Trypsinlösung, hergestellt durch Auflösen von kristallinem Trypsin in destilliertem Wasser in einer Menge, die 1/10 des Gewichts des MCG entsprach, wurde langsam unter Rühren der gepufferten MCG-Lösung zugesetzt. Die resultierende Lösung wurde auf 370C erwärmt und 1 h lang bei dieser Temperatur belassen, worauf eine ausreichende Menge an Pufferlösung der Zusammensetzung gemäss Beispiel 1 zugesetzt wurde, um auf 50 ml aufzufüllen. Die so verdünnte MCG-Lösung besass einen PH-Wert von 8, 2. Die gepufferte Lösung wurde langsam unter ständigem Rühren 50 ml einer 2 gew. gen Suspension von Polystyrolteilchen mit einem mittleren Durchmesser von 0, 81 j zugesetzt. Die Suspension besass einen PH- Wert von 8, 2, der durch Anwendung eines wässerigen Puffers der Zusammensetzung laut Beispiel 1 erhalten worden war.
Das resultierende Material wurde langsam auf 500C erwärmt und 3 Wochen lang bei dieser Temperatur gehalten.
Beispiel 5 : 42000 internationale MCG-Einheiten wurden in 4, 5 ml destilliertem Wasser, das auf PH 7, 1 eingestellt war, gelöst. Kristallines Trypsin, entsprechend 1/10 der Gewichtsmenge des MCG, wurde in 20 ml destilliertem Wasser, auf einen PH 7, 1 eingestellt, gelöst. Die Enzymlösung wurde dann der MCG-Lösung zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde 1 h lang bei 370C gehalten und dann mit 50 ml destilliertem Wasser verdünnt, das mit wässeriger Natronlauge auf einen PHWert von 9 eingestellt worden war. Die verdünnte Lösung wurde 50 ml einer 2 gew. -%igen Suspension
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81 bol9, 0 eingestellt worden war. Das resultierende Material wurde auf 500C erwärmt und 10 Tage lang bei dieser Temperatur gehalten.
Beispiel 6 : 25110 internationale MCG-Einheiten wurden in 4, 5 ml destilliertem Wasser, das auf einen PH- Wert von 7, 4 eingestellt worden war, gelöst. Kristallines Trypsin in einer Menge entsprechend 1/10 des Gewichts des MCG wurde in 0, 5 ml destilliertem Wasser, das auf einen PH-Wert von 7, 4 eingestellt war, gelöst. Die Enzymlösung wurde der MCG-Lösung zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde 1 h lang bei 370C gehalten und dann mit 50 ml eines 0, lmolaren Boratpuffers vom PH 8, 68, der 10% Sucrose enthielt, verdünnt.
Die verdünnte Lösung wurde zu 50 ml einer 2 vol. -%i n Dispersion von Polymethacrylharzteilchen vom mittleren Durchmesser 0, 5 p zugegeben ; die Dispersion war über Nacht gegen 3 l destilliertes Wasser dialysiert worden.
Beispiel 7 : 5000 internationale MCG-Einheiten wurden in 4, 5 ml destilliertem Wasser, das auf einen PH von 7, 4 eingestellt worden war, gelöst. Kristallines Trypsin in einer Menge, entsprechend 1/10 des Gewichts von MCG, wurde in 0, 5 ml destilliertem Wasser gelöst, das auf einen pH-Wert von 7, 4 eingestellt war. Die Enzymlösung wurde sodann der MCG-Lösung zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde 1 h lang bei 370C gehalten und dann mit 50 ml eines 0, molaren Boratpuffers verdünnt, der einen PH- Wert von 8, 68 aufwies und 10% Sucrose enthielt.
Die verdünnte Lösung wurde zu 50 ml einer 2 vol. -%i n Suspension von Polystyrol-Latex-Teilchen vom mittleren Durchmesser 0, 15 li zugesetzt, die über Nacht gegen ze 1 destilliertes Wasser dialysiert worden war.
Beispiel 8 : Es wurde ein 0,1%iger Polystyrol-Latex mit Teilchen vom mittleren Durchmesser 0, 81 ! l in einem 0, 2molaren Boratpuffer vom PH 8, 2 hergestellt. 100 ml einer MCG-Lösung, die 4000 internationale MCG-Einheiten enthielt, in einem Boratpuffer vom PH 8, 2 wurden langsam unter Rühren 100 ml des obigen Polystyrol-Latex zugesetzt. Die MCG-Polystyrol-Latex-Kombination wurde unbewegt 6 Monate lang bei 50C gehalten, um ein Absetzen zu erzielen. 180 ml der überstehenden Pufferlösung wurden sodann entfernt und die Teilchen wurden in den zurückbleibenden 20 ml überstehender Lösung wieder suspendiert, wobei man ein Gemisch mit loiger Teilchenkonzentration erhielt.
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Das gemäss den obigen Beispielen erhältliche Latex-Reagens wird auf die Verwendbarkeit zur Bestimmung vonMCG durch serologische Tests nach folgendem Verfahren getestet : Zunächst werden mehrere Verdünnungen eines MCG-Antiserums bekannter Wirksamkeit in Imidazol hergestellt. Das Imidazol-Verdünnungsmittel wird erhalten durch Zugabe von 6 ml 0, lnormaler Salzsäure zu 25 ml einer 0, 2molaren wässerigen Imidazollösung, Auffüllen auf ein Volumen von 100 ml mit destilliertem Wasser, Zusatz von 0, 7 g Natriumchlorid, 0, 032 g Natriumsalicylat, 20 ml piger wässeriger Ochsenalbuminlösung, und so viel Natrium-Äthylquecksilberthiosalicylat, dass die Konzentration der Lösung in bezug auf letzteres Salz 1 : 10000 Vol/Vol beträgt.
Das Imidazolverdünnungsmittel kann man auch herstellen durch Zusatz von 1, 35 ml 0, lnormaler Salzsäure zu 0, 3407 g Imidazol und 7, 5 g Glycin und Verdünnen mit destilliertem Wasser auf 1 l. Je 1 Tropfen der verschiedenen Antiserum-Verdünnungen wird auf einer dunklen Glasplatte mit 1 Tropfen des Imidazol-Verdünnungsmittels gemischt. Dann werden 2 Tropfen des Latex-Reagenzes neben das Gemisch auf die Glasplatte gegeben, worauf alles vermischt wird. Nach beendigtem Mischen wird die Glasplatte langsam und vorsichtig hin-und hergeschwenkt und visuell nach Zusammenballungen untersucht.
In einer zweiten Stufe wird eine Verdünnung, entsprechend der Hälfte der höchsten Verdünnung an Antiserum, die bei der obigen Bestimmung als die Agglutinierung bewirkend gefunden wurde, wobei die Agglutinierung nach 15 sec einsetzte und nach 2minütigem Schwenken der Glasplatte beendet war, mit dem Latex-Reagenz und einerMCG-Lö- sung verwendet. Bei diesem Test wird nun 1 Tropfen der Antiserum-Verdünnung auf eine dunkel gefärbte Glasplatte gegeben und 30 sec lang mit 1 Tropfen Urin einer nicht schwangeren Frau, der 10 internationale MCG-Einheiten pro ml enthält, gemischt. Dann werden 2 Tropfen des zu testenden LatexReagenzes mit dem Gemisch aus Antiserum und MCG-Lösung gemischt. Sofort nach beendetem Vermischen wird die Glasplatte langsam und vorsichtig geschwenkt und die Agglutination wird verfolgt.
Das Latex-Reagenz eignet sich zur Verwendung gemäss der Erfindung, wenn bei der zweiten Stufe keine beobachtbare Zusammenballung der Teilchen innerhalb 2 min nach beendetem Vermischen unter Schwenken der Glasplatte erfolgt ist.
Im folgenden wird die Herstellung und Standardisierung des im erfindungsgemässen Reagenz verwendeten Antiserums beschrieben :
Zunächst wird Kaninchen eine Emulsion von 1 ml einer 0, 9% igen wässerigen Natriumchloridlösung mit 50000 internationalen MCG-Einheiten und einem gleichen Volumen von Freund's Hilfsstoff (J. Freund, Ann. Rev. Microbiol., 1947, 1 : 291) intramuskulär injiziert. Nach 6 Wochen werden in Abständen von je 2 Tagen drei intravenöse Injektionen mit MCG- Lösung verabreicht. Jede Injektion enthält 1000 internationale MCG-Einheiten in Lösung in l ml O, 90 ; oiger wässeriger Natriumchloridlösung.
14 Tage nach der letzten Injektion werden die Kaninchen entblutet. 14 Tage nach dem Entbluten werden ihnen intravenös an drei aufeinanderfolgenden Tagen l ml einer 0, 91eigen wässerigen Natriumchloridlösung mit 3300 internationalen MCG-Einheiten injiziert, worauf 1 Monat nach dem ersten Entbluten nochmals entblutet wird.
Um sicherzustellen, dass das Antiserum eine für die vorliegenden Zwecke geeignete Konzentration an Antikörpern aufweist, bestimmt man die Antikörper-Konzentration im Antiserum in einem zweistufigen Verfahren ; in erster Stufe wird die Konzentration im Serum näherungsweise bestimmt, während in zweiter Stufe die genaue Bestimmung erfolgt.
In der ersten Stufe wird das Serum jeder Entblutung mit dem Imidazol-Verdünnungsmittel verdünnt, wobei man Lösungen mit 1 Teil Serum pro 100,200, 300,400, 500 und 1000 Teile Imidazol-Verdünnungsmittel herstellt. 1 Tropfen jeder Serumverdünnung wird jeweils auf eine schwarze Glasplatte gebracht und mit 1 Tropfen Imidazol-Verdünnungsmittel vermischt. Dann werden 2 Tropfen des als wirksam befundenen Latex-Reagenzes der Serum-Verdünnung zugemischt. Sofort nach beendeter Vermischung werden die Platten langsam und vorsichtig geschwenkt, und die Agglutination wird beobachtet. Seren, die die Teilchen des Latex-Reagenzes innerhalb 2 min bei einer Verdünnung von 1 : 300 oder höhere Verdünnung vollständig agglutinieren, werden vereinigt.
In der zweiten Stufe werden zunehmend höhere Verdünnungen des vereinigten Antiserums im Imidazol-Verdünnungsmittel hergestellt und wie oben beschrieben getestet, um die höchste Verdünnung, die innerhalb 2 min noch zur Agglutination führt, zu bestimmen. Das vereinigte Serum wird dann mit dem Imidazol-Verdünnungsmittel auf einen Verdünnungsgrad verdünnt, der der Hälfte der höchsten Verdünnung, die vollständige Agglutination innerhalb 2 min lieferte, entspricht, und diese Verdünnung wird dann wie folgt weitergetestet :
Man stellt eine Verdünnung von MCG im Urin einer nicht schwangeren Frau, wobei die Verdünnung 10 internationale MCG-Einheiten pro ml enthält, her. Jeweils 1 Tropfen Antiserum-Verdünnung
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wird auf eine dunkle Glasplatte gebracht, wozu dann 1 Tropfen der MCG-Lösung beigemischt wird.
Die einzelnen Gemische werden 30 sec lang gerührt. 2 Tropfen Latex-Reagenz, für die erfindungsgemässen Zwecke als gut befunden, werden jedem Gemisch aus Antiserum und MCG-Lösung zugesetzt bzw. beigemischt. Direkt nach vollständigem Vermischen wird jede Platte langsam und vorsichtig geschwenkt und die Agglutination wird verfolgt. Die Antiserum-Verdünnung, die zu keiner beobachtbaren Agglutination innerhalb 2 min nach beendetem Vermischen führt, wird als Standard-Antiserum im Schwangerschaftstest gemäss der Erfindung verwendet.
Falls eine vollständige Inhibierung, die durch fehlende Agglutination innerhalb 2 min angezeigt wird, mit der 10 internationale MGC-Einheiten pro ml enthaltenden MCG-Lösung nicht erreicht wird, wird die Antiserum-Verdünnung durch Zusatz von konzentriertem Antiserum oder weiterer Verdünnung so eingestellt, dass vollständig Inhibierung bei einer 10 internationale MCG-Einheiten pro ml aufweisenden Lösung im obigen Test erfolgt. Der eigentliche Test zur serologischen in Vitro-Bestimmung von MCG im Urin wird unter Verwendung des erfindungsgemässen Latex-Reagenzes wie folgt vorgenommen :
1 Tropfen des standardisierten MCG-Antiserums wird auf eine dunkle Platte gebracht. Damit wird 1 Tropfen des zu testenden Urins vermischt und das Gemisch wird 30 sec lang gerührt. 2 Tropfen des Latex-Reagenzes werden danach mit dem Gemisch aus Antiserum und Urin vermischt.
Sofort nach beendetem Vermischen wird die Platte langsam und vorsichtig geschwenkt, und die Agglutination wird verfolgt. Auftreten einer beobachtbaren Agglutination innerhalb genau 2 min nach Beendigung des Mischvorganges zeigt die Abwesenheit von MCG im zu testenden Urin an. Fehlende Agglutination nach der gleichen Zeit bedeutet Anwesenheit von MCG im zu testenden Urin. Neben jedem Test wird ein Vergleichsversuch mit l Tropfen physiologischer Natriumchloridlösung an Stelle des Urins durchgeführt.
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Bestimmung von menschlichem chorionischem Gonadotrophin im Urin durch serologischen Test unter Verwendung eines MCG-Antiserums, dadurch gekennzeichnet, dass man MCG-Antiserum mit dem zu testenden Urin mischt, das resultierende Gemisch aus Antiserum und Urin mit einem Reagenz mischt, das eine Suspension von mit MCG beschichteten Teilchen aufweist, wobei das MCG auf Teilchen aus einem Kunstharz, das Protein adsorbieren kann, wie Polystyrol oder Methacrylsäureharzen, adsorbiert ist, das Gemisch anschliessend 2 min lang bewegt, vorzugsweise auf einem Trägerglas, und das Auftreten einer Agglutination beobachtet, wobei die fehlende Agglutination nach 2 min nach Beendigung des Mischvorganges die Gegenwart von MCG im Urin anzeigt.