DE1498937A1

DE1498937A1 - Reagenz zum Schwangerschaftsnachweis

Info

Publication number: DE1498937A1
Application number: DE19641498937
Authority: DE
Inventors: Margaret Treacy
Original assignee: Ortho Pharmaceutical Corp
Current assignee: Ortho Pharmaceutical Corp
Priority date: 1963-08-23
Filing date: 1964-09-19
Publication date: 1969-09-25
Also published as: DE1498937B2; DK129253B; NL6811749A; FI44720B; DK129253C; FI44720C; US3309275A; NL6409790A; SE328669B; IL21908A; BE652184A; GB1083633A; CH469267A; BR6461960D0; ES303379A1; NL132816C

Description

Ortho Pharmaceutical Corporation, Raritan (New Jersey,

U.S.A.)

Reagenz zum Schwangerschaftsnachweis.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur serologischen in Vitro-Bestimmung von menschlichem chorionischem Gonadotrophin (in der folgenden Beschreibung als MCG bezeichnet) bzw. ein Reagenz zur serologischen Bestimmung der Schwangerschaft durch Bestimmung des MCG im Urin; die Herstellung dieses Reagenzes fällt ferner in den Rahmen vorliegender Erfindung,

MCG wird .während der Schwangerschaft durch die Plazenta gebildet und wird kurz nach einer gewissen Ansammlung in Serum und Urin gefunden. MCG wird nur im Urin schwangerer Frauen ausgeschieden, liegt jedoch

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GW.-OB.

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nicht im Urin nicht schwangerer Frauen vor, abgesehen von Fällen mit bestimmten pathologischen Zuständen,wie z.B. bei chorionischem Gewebetumor. Es ist allgemein anerkannt, dass - ab esehen von den vorstehend genannten pathologischen Zuständen - die Gegenwart von MCG in Urin und Serum ein verlässlicher Nachweis der Schwangerschaft isti Verschiedene bisher angewandte Schwangerschaftstest basieren auf biologischen in vivo-Methoden zur Bestimmung der Gegenwart von MCG. Der Aschheim-Zondek-Test beruht auf der Fähigkeit von MCG, bei subkutaner Injektion bei Mäusen Corpora lutea zu bilden. Trotz der erheblichen Genauigkeit dieses Tests ist . seine Anwendung beschränkt, weil relativ viel Zeit benötigt wird bis die Testergebnisse erhalten werden; weil ferner zahlreiche Tiere des entsprechenden Alters vorhanden sein und mehrere Injektionen gemacht werden müssen. Ein weiterer Nachteil besteht darin,dass viele Tiere durch die Toxizität des Testurins getötet werden. Ein weiterer biologischer Schwangerschaftstest, der vielfach angewandtjwird, ist der sogenannte Friedman-Test. Bei diesem Test wird ein weibliches Kaninen, das drei oder vier Wochen lang isoliert worden war, als Versuchstier verwendet. Eine Probe des zu testenden Urins

wird 909839/0470

in die Chrvene des Kaninchens injiziert und 48 Stunden nach der Injektion werden die Ovarien auf gerissene haemorrhagisehe Follikel untersucht, die eine positive Reaktion anzeigen. Ein Vorteil dieses Tests besteht darin, dass das Tier nicht getötet, sondern innerhalb vier bis sechs Wochen wieder verwendet werden kann. Der Friedman-Test vermeidet zahlreiche Nachteile des Aschheim-Zondek-Mäusetests und ist fast genau so exakt. Ein Nachteil des Friedman-Tests liegt darin, dass die Kosten für die Tiere hoch sind, falls ein Tier zugrunde geht, und dass längere Aufzucht der Tiere erforderlich ist.

In anderen biologiechen Schwangerschaftstests werden nicht ausgereifte weibliche Ratten verwendet. Der zu testende Urin wird .den Ratten subkutan injiziert, worauf die Tiere am nächsten Tag getötet ewerden. Die Ovarien werden auspräpariert und ihre Vergrösserung sowie die Gegenwart von Rötungen oder roten Flecken wird bestimmt. Ein Hauptnachteil dieses Verfahrens besteht in der Schwierigkeit, schwach rosa gefärbte negative Ovarien von rötlichen positiven Ovarien zu unterscheiden,· eine hinreichende Exaktheit des Tests kann daher nur von sehr geübten Personen garantiert werden.

Auch Frösche und Kröten wurden bereits für Schwangerschaftsteste verwendet, jedoch sind diese Tiere re-

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lativ unempfindlich i^m Vergleich mit Mäusen, Ratten und Kaninchen, sodasses. häuf ig notwendig ist, den zutestenden Urin, zu konzentrier um die ^Konzentration an MCG .

zu erhöhen,. . \ .;.-.-,-■ ■ ■ - *■ - .-. Gegenstand vorliegender Erfindung ist die Bereit-

stellung einer aerodiagnostischen Methode zur Bestimmung der Schwangerschaft durch in Vitro-Bestimmung des MCG im Urin. Insbesondere ist Gegenstand vorliegender Erfindung ein serologisches Testreagenz zur Bestimmung der Schwangerschaft in Form einer MCG-Kunstharz-Kombination, das eine Suspension von Kunstharzteilchen aufweist, die Protein an der Oberfläche adsorbieren können, wobei die Oberfläche der suspendierten Teilchen MCG, dessen physikalische Eigenschaften ohne Veränderung der immunologischen Eigenschaften abgewandelt sind, an der Oberfläche adsorbiert enthalten (in der folgenden Beschreibung als "Latex-Reagenz" bezeichnet).

Die vorliegende Erfindung stellt ein serodiagnostiT sches Verfahren zur Bestimmung der Schwangerschaft bereit, das zur Durchführung keine speziellen Vorrichtungen benötigt und in wenigen Minuten vorgenommen werden kann.

Es wurde festgestellt*, dass die bei biologischen in Vivo-Methoden bestehenden Schwierigkeiten beseitigt werden können bei Verwendung eines Latex-Reagenzes in

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einem serologischen in Vitro-Test unter Bestimmung des MCG im Urin schwangerer Frauen. Das Verfahren ist äusserst zuverlässig, in wenigen Minuten durchführbar und ohne besondere Vorrichtungen oder besondere Uebung anwendbar.

Als Testreagenzien dienen das genannte Latex-Reagenz und ein MCG-Antiserum. Beim Test wird das Antiserum mit einer geringen Menge des zu testenden Urins gemischt, worauf man das Latex-Reagenzdem Antiserum-Uringemisch zumischt. Enthält der zu testende Urin MCG, so erfolgt* eine Reaktion zwischen MCG und dem Antikörper des Antiserums, sodass der Antikörper nicht mehr mit dem MCG auf den Teilchen des Latex-Reagenzes reagieren kann. Liegt kein MCG im Urin vor, so reagiert das MCG auf den Kunsts offteilchen mit dem Antikörper des Antiserums, was sich durch Agglutination der Teilchen im Latex-Reagens anzeigt.

Das Antiserum wird hergestellt, indem man partiell gereinigtes MCG aus dem Urin schwangerer Frauen Kaninchen injiziert.Nach etwa 5 Wochen werden die Kaninchen entblutet und die Seren werden gewonnen. Das Serum von jedem Kaninchen wird gegen MCG bekannter Konzentration getestet, und die Antiseren,die eine positive Reaktion bei einer niedrigen MCG-Konzentration ergeben, werden vereinigt. Die Konzentration der Antikörper in den vereinigten Antiseren wird durch Verwendung von MCG bekannter Konzentration

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bestimmt, aodass die Menge an MCG, die benötigt wird, um vollständige Reaktion mit den Antikörpern in den vereinigten Antiseren herbeizuführen, genau bekannt ist (E.A.Kabat und M.M.Mayer, Experimental Immunochemistry, 2.Aufl., 1961, S.22-90).

Das Latex-Reagenz wird hergestellt, indem man

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eine wässrige Lösung von MCG langsam und unter konstantem Rühren einer Suspension aus Teilchen eines Kunstharzes, das Protein an der Oberfläche adsorbieren kann, zusetzt, wobei man eine MCG-Harz-Kombination erhält, bei welcher das MCG an den einzelnen Teilchen adsorbiert ist.

Die Teilchen sind etwa sphärisch und besitzen einen mittleren Durchmesser zwischen etwa 0,07 und etwa 0,90 Mikron; der bevorzugte mittlere Durchmesser liegt bei etwa 0,81 Mikron. Die Konzentration der Teilchen im Latex kann zwischen etwa 0,5 und 1,5 Gew.% schwanken; es empfiehlt sich jedoch, eine Suspension zu verwenden, in welcher die Konzentration zwischen etwa 0,8 und etwa 1,2 Gew.% liegt. Ist die Teilchenkonzentration in der Suspension geringer als etwa 0,5 Gew.%, so kann eine Agglutinierung bzw. Zusammenballung der Teilchen nicht leicht erfolgen, und wenn sie erfolgt, ist sie nur schwer erkennbar. Bei mehr als etwa 1,5 Gew.% ist die

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Menge wiederum zu gross, um.genaue Bestimmung der Agglutination zu erlauben«

Das bei der Herstellung der MCG-Lösung verwendete MCG sollte relativ rein sein. Es hat sich gezeigt, dass MCG mit etwa 1700 und vorzugsweise zwischen etwa 1700 und etwa 3000 internationalen Einheiten pro Milligramm befriedigende Ergebnisse liefert.

Das verwendete MCG sollte nicht weniger als etwa 1700 internationale Einheiten pro Milligramm aufweisen, ida andernfalls das Fremdprotein, das zusammen

mit dem MCG vorhanden ist, in merklicher Menge ebenfalls Harz " ..,-■--■-■-.-■ -...■-

auf den teilchen adsorbiert wird, sodass eine Störung des Tests durch Verhinderung der Agglutination eintritt.

Die bei der Herstellung des Latex_rEeagenz verwendete MCG-Lösung enthält das MCG in einer Menge von etwa 720 bis etwa 900 internationalen Einheiten pro Milliliter. Die bevorzugte Menge liegt bei ca. 840 internationalen Einheiten pro Milliliter. Enthält die MCG-Lösung weniger als etwa 720 internationale Einheiten pro Milliliter, so werden die Kunstharzteilchen nicht vollständig immunologisch iiberschichtet, sodass offen liegende Teilchenoberfläche vorhanden ist, die Fremdprotein aus dem zu testenden Urin adsorbiert, wodurch die Bestimmung gestört wird. Enthält die MCG-Lösung

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mehr als etwa 900 internationale Einheiten MCG pro Milliliter, so bleibt überschüssiges MCG im Latex-Reagenz in nicht adsorbierter Form zurück, das vorzugsweise mit dem MCG-Antikörper im Antiserum reagiert, sodass dieser Antikörper nicht mit dem MCG des Latex-Reagenzes sich umsetzen kann und dadurch die Agglutination, die andernfalls stattfinden sollte, verhindert wird. Die zu behandelnde Latex-Suspension enthält zwischen etwa 1,8 und 2,2 Gew.$ Harzteilchen.

Damit der Latex beim Test eine befriedigende Wirkung entfaltet, muss das darin vorhandene MCG die Fähigkeit besitzen, rasch und vollständig mit den Antikörpern des Antiserums zu reagieren, unter Hervorrufung einer leicht beobachtbaren Zusammenballung der Teilchen im Latex. Um dies zu ermöglichen, muss das MCG abgewandelt werden. Die Abwandlung verursacht eine Veränderung der physikalischen Eigenschaften des MCG unter Aufrechterhaltung der immunologischen Eigenschaften. Die Abwandlung erfolgt durch Altern des Latex-Reagenses bzw. beschleunigtes Altern durch verschiedene Behandlungen wie Erhitzen oder Anwendung einer digestiven enzymatisehen Behandlung zusammen mit Wärme; diese Behandlung wird mit der MCG-Lösung vor der Adsorption auf den Latex-Teilchen oder mit dem fertigen Latex-Reagenz vorgenommen.

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Die Abwandlung des Latex-Reagenzes kann erfolgen durch langsames Erhitzen auf eine Temperatur von ca. 96 C, Abkühlen auf etwa 50 C und längeres Stehenlassen bei dieser Temperatur während etwa 4 bis etwa 6 Wochen; auch kann man das Material langsam auf etwa 50⁰C erwärmen und ca. 2 bis 3 Monate bei dieser Temperatur belassen.

Die Abwandlung unter gleichzeitiger Anwendung von Enzymen und Wärme kann erfolgen, indem man das Latex-Reagena, das einen pH-Wert zwischen etwa 8,0 und 9,0, vorzugsweise 8,2 aufweist, mit einer wässrigen Trypsin-Lösung versetzt, deren Konzentration l/lO der Konzen-

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tration an Latex-TeilchenYIriTLatex-Reagenz beträgt (bezogen auf das Gewicht), dann das Latex-Reagenz langsam auf etwa 50 C erwärmt und bei dieser Temperatur ca. 2 bis 4 Woehen belässt*

Auch kann man die Enzymbehandlung vor der Adsorption des MCG auf den Latex-Teilchen und die Wärmebehandlung nach der Adsorption vornehmen. Man kann beispielsweise so vorgehen, dass eine wässrige Trypsin-Lösung, deren pH-Wert auf etwa 6,8 bis etwa 7,2, und vorzugsweise auf etwa 7,1 eingestellt wurde, einer wässrigen MCG-LÖsung vom selben pH-Wert zugesetzt wird, worauf die resultierende Lösung auf eine Temperatur von beispielsweise etwa 37 C erwärmt und eine Stunde dabei belassen wird; dann wird die MCG-Lösung auf einen pH-

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Wert von etwa 8,0 bis etwa 9,0, vorzugsweise 8,7 gepuffert, worauf man sie langsam unter Rühren der Latex-Suspension, die auf den selben pH-Wert gepuffert ist, zusetzt und das resultierende Gemisch langsam auf etwa 50 C erwärmt und ca. 2 bis 4 Wochen bei dieser Temperatur belässt.

Nach der Abwandlung des Latex-Reagenses wird letzteres auf einen pH-Wert zwischen etwa 7,8 und etwa 8,8 gepuffert. Bei pH-Werten unter etwa 7,8 und oberhalb etwa 8,8 lässt die Stabilität des Reagens derart nach, dass die Zuverlässigkeit des Tests unbefriedigend wird»

Ein Latex-Reagens der obigen Art .weist etwa 36 bis etwa 45 internationale Einheiten MCG pro Milligramm Latex-Teilchen auf. Die bevorzugte Menge liegt bei etwa 40 bis 42 internationalen Einheiten pro Milligramm Latex-Teilchen. Bei weniger als etwa 36 internationalen Einheiten pro Milligramm bleibt viel freie , immunologisch unbeschichtete Oberfläche zurück, auf der Fremdprotein aus dem zu testenden Urin adsorbiert werden kann, wodurch Störung der Reaktion erfolgt. Bei mehr als etwa 45 internationalen Einheiten pro Milligramm Latex-Teilchen ist überschüssiges, nicht adsorbiertes MCG vorhanden, das bevorzugt mit dem MCG-Anti-

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körper des Antise^ums reagiert, sodass dieser Antikörper nicht zur Reaktion mit dem MCG auf den Latex-Teilchen zur Verfügung steht und daher die andernfalls fällige Agglutination unterbleibt.

Die zur Adsorption des MCG und Herstellung des Latex-Reagenzes geeigneten Kunstharze müssen Protein adsorbieren können und ferner in sphärischer oder nahezu sphärischer Form mit einem mittleren Durchmesser von etwa 0,07 bis etwa 0,90 Mikron herstellbar sein. Geeignete Harze sind z.B. Polystyrol und Polymethacrylsäureharze.

Beispiel 1

3,6 ml einer Suspension von Polystyrolteilchen, die einen mittleren Durchmesser von 0,81 Mikron aufwiesen und in einer Konzentration von 28,32 Gew.% vorlagen,wurden zu 46,4 ml einer wässrigen Pufferlösung mit einem pH-Wert von 8,2 zugesetzt. Die Pufferlösung war hergestellt aus 6,675 g Natriumborat, 8,04 g Borsäure und 9,0 g Natriumchlorid unter Auffüllen mit destilliertem Wasser auf 1 Liter. 50 ml einer wässrigen MCG-Lösung mit 40000 internationalen Einheiten, die auf einen pH-Wert von 8,2 mit Hilfe der gleichen Pufferlösung gepuffert war, wurden langsam der gepufferten

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Suspension unter ständigem Rühren zugesetzt. Das resultierende Material wurde langsam auf 50 C erwärmt und 3 Monate lang bei dieser Temperatur gehalten.

Beispiel. 2

Es wurde ein Latex-Reagenz nach der Methode , von Beispiel 1 hergestellt, mit der Abweichung, dass direkt nach Zugabe der gepufferten MCG-Lösung zu der gepufferten Polystyrolsuspension das Gemisch langsam auf 96⁰C unter heftigem Rühren erwärmt wurde, worauf auf 50⁰C abgekühlt und das Gemisch 6 Wochen lang bei dieser Temperatur stehen gelassen wurde.

Beispiel 3

3,6 ml einer Suspension von Polystyrolteilchen mit einem mittleren Durchmesser von 0,81 Mikron wurden langsam zu 36,4 ml der in Beispiel 1 verwendeten Pufferlösung zugesetzt. Dann wurden 50 ml einer wässrigen MCG-Lösung, die ebenfalls mit der Pufferlösung gemäss Beispiel 1 auf .pH 8,2 gepuffert war, und die 40000 internationale Einheiten MCG enthielt, langsam der gepufferten Suspension unter ständigem Rühren zugesetzt.

Das resultierende Material wurde dann 16 Stunden lang

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bei 5 C gehalten, worauf unter Rühren 10 ml einer l$igen wässrigen Trypsinlösung zugesetzt wurden. Das

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so erhaltene Gemisch wurde auf 50⁰C erwärmt und 4 Wochen lang bei dieser Temperatur belassen.

Beispiel 4

42000 internationale MCG-Einheiten wurden in 4,5 ml einer wässrigen Pufferlösung vom pH-Wert 7,1 gelöst. Die Pufferlösung war aus 1,907 g Natriumborat, 11,133 g Borsäure, 9,0 g Natriumchlorid und 5,54 g Calciumchlorid unter Auffüllen mit destilliertem Wasser auf 1 Liter erhalten worden. Eine wässrige Trypsinlösung, hergestellt durch Auflösen von kristallinem Trypsin in destilliertem Wasser in einer Menge, die l/lOfies Gewicht3MCG &e«f entsprach, wurde langsam unter Rühren der gepufferten MCG-Lösung zugesetzt. Die resultierende Lösung wurde auf 37 C erwärmt und 1 Stunde lang bei dieser Temperatur belassen, worauf eine ausreichende Menge an Pufferlösung der Zusammensetzung gemäss Beispiel 1 zugesetzt wurde, um auf 50 ml aufzufüllen. Die so verdünnte MCG-Lösung besaas einen pH-Wert von 8,2. Die gepufferte Lösung wurde langsam unter ständigem Rühren 50 ml einer 2-gewiehtsprozentigen Suspension von Polystyrolteilchen mit einem mittleren Durchmesser von 0,81 Mikron zugesetzt. Die Suspension besass einen

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pH-Wert von 8,2, der durch Anwendung eines wässrigen Puffers der Zusammensetzung laut Beispiel 1 erhalten worden war. Das resultierende Material wurde langsam auf 50⁰C erwärmt und 3 Wochen lang bei dieser Temperatur gehalten.

Beispiel 5

42000 internationale MCG-Einheiten wurden in 4,5 ml destilliertem Wasser, das auf pH 7,1 eingestellt war, gelöst. Kristallines Trypsin entsprechend 1/10 der Gewichtsmenge ao/MCG- wurde in 20 ml destilliertem Wasser, auf einen pH 7,1 eingestellt, gelöst. Die Enzymlösung wurde dann der MCG-Lösung zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde 1 Stunde lang bei 37 C gehalten und dann mit 50 ml destilliertem Wasser verdünnt, das mit wässriger Natronlauge auf einen pH-Wert von 9 eingestellt worden war. Die verdünnte Lösung wurde 50 ml einer 2-gewichtsprozentigen Suspension von Polystyrolteilchen vom mittleren Durchmesser 0,81 Mikron zugesetzt, die über Nacht gegen 100 Vol.Teile destilliertes Wasser dialysiert worden war, das mit. wässriger Natronlauge auf einen pH-Wert von 9j,0 eingestellt worden war. Das resultierende Material wurde auf 50⁰C erwärmt und

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10 Tage lang bei dieser Temperatur gehalten.

Beispiel 6

25110 internationale MCG-Einheiten wurden in 4,5 ml destilliertem Wasser, das auf einen pH-Wert von

7.4 eingestellt worden war, gelöst. Kristallines Trypsin

in einer Menge entsprechend ·ΐ/ΐθ des Gewichts C\e$ eaen/ MCG| wurde in 0,5 ml destilliertem Wasser, das auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt war, gelöst. Die Enzymlösung wurde der MGG-Lösung zugesetzt und das resultierende Gemisch wurde Ϊ Stunde lang bei 37⁰C gehalten und dann mit 50 ml eines 0,1-molaren Boratpuffers vom pH 8,68, der 10$ Sucrose enthielt, verdünnt.

Die verdünnte Lösung wurde zu 50 ml einer 2-Volumenprozentigen Dispersion von Polymethacrylharzteilchen vom mittleren Durchmesser 0,5 Mikron zugegeben; die Dispersion" war über Nacht gegen 3 Liter destilliertes Wasser diaiysiert worden.

"""■■"'■ ' -■■■■■■"-■ Beispiel 7 -¹'·' - ■ " 5000'internationale MCG-Einheiteri wurden in

4.5 ml destilliertem Wasser, das auf einen pH von 7',4 eingestellt-worden'war, gelöst. Kristallines Trypsin* in einer Menge entspreChönd l/lO des Gewichts f des,

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MCG f mtrde in 0,5 ml destilliertem Wasser "■ gelöst, das auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt war. Die Enzymlösung wurde sodann der MCG-Lösung zugesetzt und das resultierende Gemisch "wurde 1 Stunde lang bei 37 C gehalten und dann mit 50 ml eines .0,1-molaren Boratpuffers verdünnt, der einen pH-Wert von 8,68 aufwies und 10$ Sucrose enthielt. Die verdünnte Lösung wurde zu 50 ml einer 2-volumenprozentigen Suspension von Polystyrol-Latex·* Teilchen vom mittleren Durchmesser.0,15 Mikron zugesetzt, .die. über Nacht gegen 38 1 destilliertes Wasser dialysiert worden war. - ■ , -.. ^:--■ ' .· - Beispiel-8

Es .wurde -Q in .0,l$iger Polystyrol-Latex mit Teilchen vom mittleren Durchmesser 0,81 Mikron in einem 0,2-molaren Boratpuffer vom pH 8,2 hergestellt. 100 ml einer MCG-Lösung, die 4000 internationale MCG-Einheiten enthielt, in einem Boratpuffer vom pH 8,2 wurden langsam unter Rühren 100 ml des obigen Polystyrol-Latex . zugesetzt.. Die MCG-Polystyrol-Latex-Kombination wurde unbewegt -6 Monate lang bei 5°G gehalten, um ein Absetzen zu erzielen. 180 ml der überstehenden Pufferlösung wurden sodann entfernt und die Teilchen wurden

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in den zurückbleibenden - 20 ml überstehender Lösung wieder suspendiert, wobei man ein Gemisch mit l$iger Teilchenkonzentration erhielt.

Das gemäss den obigen Beispielen erhältliche Latex-Reagens wird auf die Verwendbarkeit zur Bestimmung von MCG durch serologische Tests nach folgendem Verfahren getestet: Zunächst werden m hrere Verdünnungen eines MCG-Antiserums bekannter Wirksamkeit in Imidazol hergestellt* Das Imidazol-Verdünnungsmittel wird erhalten durch Zugabe von 6 ml 0,1-normaler Salzsäure zu 25 ml einer 0,2-molaren wässrigen Imidazollösung, Auffüllen auf ein Volumen von 100 ml mit destilliertem Wasser, Zusatz von 0,7 g Natriumchlorid, 0,032 g Natriumsalicylat, 20 ml 30$iger wässriger Ochsenalbuminlösung, und soviel Natrium-Aethylquecksilberthiosalicylat, dass die Konzentration der Lösung inbezug auf letzteres Salz 1:10000 Vol/Vol beträgt. Das Imidazolverdünnungsmittel kann man much herstellen durch Zusatz von 1,36 ml 0,1-normaler Salzsäure zu 0,3407 g Imidazol und 7,5 g Glycin und Verdünnen mit destilliertem Wasser auf 1 Liter. Je 1 Tropfen der verschiedenen Antiserum-Verdünnungen wird auf einer dunklen Glasplatte mit 1 Tropfen des Imidazol-Verdünnungs-

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mittels gemischt. Dann werden 2 Tropfen des Latex-'*"""' Reagenses neben das Gemisch auf die Glasplatte gegeben, worauf alles vermischt wird. Nach beendigtem Mischen wird die Glasplatte langsam und vorsichtig hin- und hergeschwenkt und visuell nach Zusammenballungen untersucht. In einer zweiten Stufe wird eine Verdünnung entsprechend der Hälfte der höchsten Verdünnung an Antiserum, die bei der obigen Bestimmung als die Agglutinierung bewirkend gefunden wurde, wobei die Agglutinierung nach 15 Sekunden einsetzte und nach 2-minÜtigem Schwenken der Glasplatte beendet war,mit dem Latex-Reagens und einer MCG-Lösung verwendet. Bei diesem Test wird nun 1 Tropfen der Antiserum-Verdünnung auf eine dunkel gefärbte Glasplatte gegeben und 30 Sekunden lang mit 1 Tropfen Urin einer nicht schwangeren Frau, der 10 internationale MCG-Einheiten pro ml enthält, gemischt. Dann werden 2 Tropfen des zu testenden Latex-Reagemes mit dem Gemisch aus Antiserum und MCG-Lösung gemischt. Sofort nach beendete« Vermischen wird die Glasplatte langsam und vorsichtig geschwenkt und die Agglutination wird verfolgt. Das Latex-Reagens eignet sich zur Verwendung gemäss vor liegender Erfindung, wenn T3ei der zweiten Stufe keine

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beobachtbare Zusammenballung der Teilchen innerhalb 2 Minuten nach beendetem Vermischen unter Schwenken der Glasplatte erfolgt ist.

Im Folgenden wird die Herstellung und_ Standardisierung des im erfindungsgemässen Reagens verwendeten Antiserums beschrieben:

Zunächst wird Kaninchen eine Emulsion von 1 ml einer 0,9-^igen wässrigen Natriumehloridlösung mit. 50000 internationalen MCG-Einheiten und einem gleichen Volumen von Freund's Hilfsstoff (J.Freund, Ann.Rey. Microbiol., 1947, 1:291) intramuskulär injiziert. Nach 6 Wochen werden in Abständen von je 2 Tagen drei intravenöse Injektionen mit MCG-Lösung verabreicht. Jede , Injektion enthält 1000 internationale MCG-Einheiten ,. in Lösung in 1 ml 0,9-#iger wässriger .Natriumchlorid- . lösung. 14 Tage nach der letzten Injektion werden die Kaninchen entblutet. 14 Tage nach dem Entbluten werden ihnen intravenös an drei aufeinanderfolgenden Tagen 1 ml einer Q,9-%igen wässrigen Natriumchloridlösung mit 3300 internationalen MCG-Einheiten injiziert, worauf 1 Monat nach dem ersten Entbluten nochmals entblutet wird.

Um sicherzustellen, dass das Antiserum eine

für die vorliegenden Zwecke geeignete Konzentration

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an Antikörper aufweist, bestimmt man die Antikörper-Konzentration im Antiserum in einem zweistufigen Verfahren; in erster Stufe wird die Konzentration im Serum näherungsweise bestimmt _r während in zweiter Stufe die genaue Bestimmung erfolgt.

In der ersten Stufe wird das Serum jeder Entblutung mit dem Imidazol-Verdünnungsmittel verdünnt, wobei man Lösungen mit einem Teil Serum pro 100, 200, 300, 400, 500 und 1000 Teile Imidazol-Verdünnungsmittel herstellt. 1 Tropfen jeder Serumverdünnung wird jeweils auf eine schwarze Glasplatte gebracht und mit 1 Tropfen Imidazol-Verdünnungsmittel vermischt. Dann werden 2 Tropfen des als wirksam befundenen Latex-Reagenzes der Serum-Verdünnung zugemischt. Sofort nach beendeter Vermischung werden die Platten langsam und vorsichtig geschwenkt, und die' Agglutination wird beobachtet, Seren, die die Teilchen des Latex-Reagenzes innerhalb 2 Minuten bei einer Verdünnung von 1:300 oder höhere Verdünnung vollständig agglutinieren, werden vereinigt.

In der zweiten Stufe werden zunehmend höhere Verdünnungen des vereinigten Antiserums im Imidazol-Verdünnungsmittel hergestellt und wie oben beschrieben getestet, um die höchste Verdünnung, die innerhalb

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2 Minuten noch zur Agglutination führt, zu bestimmen. Dis vereinigte Serum wird dann mit dem Imidazol-Verdünnungsmittel auf einen Verdünnungsgrad verdünnt, der der Hälfte der höchsten Verdünnung, die vollständige Agglutination innerhalb 2 Minuten lieferte, entspricht, und diese Verdünnung wird dann wie folgt weitergetestet:

Man stellt eine Verdünnung von MCG im Urin einer nicht schwangeren Frau, wobei die Verdünnung 10 internationale MCG-Einheiten pro ml enthält, her. Jeweils

1 Tropfen Antiserumverdunnung wird auf eine dunkle Glasplatte gebracht, wozu dann 1 Tropfen der MGG-Lö« sung beigemischt wird. Die einzelnen Gemische werden 30 Sekunden lang gerührt. 2 Tropfen Latex-Reagenz, für die erfindungsgemässen Zwecke als gut befunden, werden jedem Gemisch aus Antiserum und MCG-Lösung zugesetzt bzw, beigemischt. Direkt nach vollständigem Vermischen wird jede Platte langsam und vorsichtig geschwenkt und die Agglutination wird verfolgt. Die Anti serum"-Verdünnung, die zu keiner beobachtbaren Agglutination innerhalb 2 Minuten nach beendetem Vermischen führt, wird als Standard-Antiserum im Schwangerschaftstest gemäss vorliegender Erfindung verwendet.Falls eine vollständige; Inhibierung, die durch fehlende Agglutination innerhalb _

2 Minuten angezeigt wird, mit der 10 internationale MCG-Einheiten pro 9 Q 9 8 3 9 / 0 4 7 0

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Milliliter enthaltenden MCG-Lösung nicht.erreicht wird, wird die Antiserum-Verdünnung durch Zusatz von konzentriertem Antiserum oder weiterer Verdünnung so eingestellt, dass vollständig Inhibierung bei einer 10 internationale MCG-Einheiten pro Milliliter aufweisenden Lösung im obigen Test'erfolgt. Der eigentliche Test zur serologischen in Vitro-BeStimmung von MCG im "Urin wird unter Verwendung des erfindungsgemässen Latex-Reagenses wie folgt vorgenommen:

1 Tropfen des standardisierten MCG-Antiserums wird auf eine dunkle Platte gebracht. Damit wird 1 Tropfen des zu testenden Urins vermischt und das Ge-. misch wird 30 Sekunden lang gerührt. 2 Tropfen des Latex-Reagenses werden danach imit dem Gemisch aus' Antiserum und Urin vermischt* Sofort'nach beendetem Vermischen wird die Platte langsam und vorsichtig ge-'" '-schwenkt, und]die Agglutination wird verfoigt~, Elf-"*-·"· ^: -"'-" treten =einer beobachtbaren Agglutination innerhalb ge- " '^; nau 2 Minuten nach Beendigung des Mischvorgangs '^eigt"" '"^w

die Abwesenheit von MCG im zu " "testenden Urin an. Fehlende Agglutination'nach der gleichen Zeit bedeutet Anwesenheit von MCG" Im Vu testenden" Urin. Neben jedem Test wird elW Vergleichsversuch" mit 1 Tropfen physiologischer Natriumchloridlösung Vn "Stelle des Urins durch-

^gefUhrt· 909839/0470

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Claims

Patentanspruch I Reagenz zur Bestimmung von menschlichem chorionischem Gonadotrophin im Urin durch serologischen Test unter Verwendung eines MCG-Antiserums, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Suspension von mit MCG beschichteten Teilchen aufweist, wobei das MCG auf Teilchen aus einem Kunstharz, welches Protein adsorbieren kann, adsorbiert ist, und dass die physikalischen Eigenschaften des MCG bei gleichbleibenden immunologischen Eigenschaften abgewandelt sind. Unteransprüche

1. Reagenz nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension eine wässrige Suspension von Polystyrolteilchen mit einem mittleren Durchmesser von etwa 0,07 bis 0,90 Mikron, vorzugsweise 0,81 Mikron darstellt.

2. Reagenz nach Patentanspruch I oder Unteranspruch

1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration der Teilchen in der Suspension etwa 0,5 bis 1,5, vor- - .- . zugsweise 0,8 bis 1,2 Gew.% beträgt, der pH-Wert des _;

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Reagenzes bei etwa 7 bis 9, vorzugsweise 7,8 bis 8,8 liegt, und die Menge an adsorbiertem MCG auf den Teilchen etwa 36 bis 45, vorzugsweise 40 bis 42 internationale Einheiten pro Milligramm Teilchengewicht beträgt,

Patentanspruch II

Verfahren zur Herstellung des Reagenzes gemäss Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass man eine wässrige Suspension aus Teilchen eines Kunstharzes, das Protein zu adsorbieren in der Lage ist, bildet, wobei die Teilchen mit MCG beschichtet sind, und dass man das MCG einer thermischen und/oder enzymatischen Behandlung unterwirft vor oder nach der Adsorption auf den Kunstharzteilchen, wobei die physikalischen Eigenschaften des MCG ohne Veränderung der immunologischen Eigenschaften abgewandelt werden.

TJnteransprüche

3. Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension auf etwa 96⁰C erwärmt, dann auf etwa 50° C abgekühlt und bei dieser

Temperatur etwa 2 bis 3 Monate belassen wird.

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H98937

4. Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man die Suspension mit einer Lösung in Berührung bringt, die etwa 10$ Trypsin, bezogen auf das Gewicht der Teilchen in der Suspension, enthält, die resultierende Suspension langsam auf etwa 50 C erwärmt und bei dieser Temperatur etwa 2 bis 4 Wochen lang belässt.

5. Verfahren IECh Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man die Lösung von Trypsin und MCG mit einem pH-Wert von etwa 6,8 bis 7,2 auf etwa 37 C erwärmt und etwa 1 Stunde lang bei dieser Temperatur belässt, den pH-Wert auf etwa 8,0 bis 9,0 einstellt, die resultierende Lösung zu einer Suspension von Kunstharzteilchen, die zur Adsorption von Protein befähigt sind, zugibt, das so erhaltene Gemisch auf etwa 50 C erwärmt und bei dieser Temperatur etwa 2 bis 4 Wochen lang belässt.

6. Verfahren nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass man die Suspension auf etwa 5 C abkühlt und bei dieser Temperatur etwa 6 Monate lang belässt.

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U98937 4,6

Patentanspruch III

Verwendung des Reagenzes gemäss Patentanspruch I zur Bestimmung von MCG im Urin, dadurch gekennzeichnet, dass man MCG-Antiserum mit dem zu testenden Urin mischt, das resultierende Gemisch aus Antiserum und Urin mit dem Reagenz gemäss Patentanspruch I mischt, das Gemisch anschliessend 2 Minuten lang bewegt und das Auftreten einer Agglutination beobachtet, wobei die fehlende Agglutination nach 2 Minuten nach Beendigung des Mischvorganges die Gegenwart von MCG im Urin anzeigt.

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