DE2205897C3 - Verfahren zur Herstellung von Antithymozytenserum - Google Patents

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Antithymozytenseruin, insbesondere die Gewinnung von tierartspezifischem Antithymozytenseruin durch Injektion bei einer Tierart gewonnener Thymusantigene bei Tieren einer fremden Art.

Die Erfindung umfaßt ferner die Herstellung der Thymusantigene sowie pharmazeutische Präparate, die in der Human- und Veterinärmedizin etwa in der -to Antigentherapie, Serologie, Globulinothcrapie sowie in der Diagnostik verwendbar sind.

Die Herstellung und Gehaltsbestimmung bzw. -einstellung von Antilymphozytcnscren ist sehr zeitaufwendig und verlangt großen technischen Aufwand; der Herstellungspreis ist mithin sehr hoch. Derartige Seren sind jedoch von großer medizinischer Bedeutung, insbesondere im Hinblick auf die immundepressive bzw. iinmunsuppressive Therapie von Autoimmunerkrankungen, besonders in der Humanmedi- v> zin.

Für eine bestimmte Art spezifische Antilymphozytengammaglobuline können durch Injektion von Lymphozyten dieser Art bei einer anderen, heterologen Art erhalten werden. Es wurde nun gefunden, daß Antithymozyten-Globuline viel rascher und mit geringerem Kostenaufwand erhalten werden können, wenn als antigenes Ausgangsmaterial nicht wie üblich Lymphozyten, sondern aus Thymusdrüsen stammende Thymozyten verwendet werden. t>o

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Antithymozytenseruin beruht darauf, daß man

a) eine aus Thymusdrüsen von Tieren erhaltene Zellsuspsension durch eine Reihe von Sieben zunehmender Feinheit oder durch mehrere Gaze- b^ri schichten hindurchpassiert, wobei das letzte Sieb eine Maschenweite von 63 μΐη aufweist,

b) die gewonnenen Thymozyten-Antigene einer

vom Thymus-Snendertier verschiedenen Tierart zur Serumgewinnung injiziert,

c) das Serum der immunisierten Tiere gewinnt,

d) das Serum mit einem Adsorbens versetzt, das aus Glutaraldehyd und Proteinen hergestellt worden ist,

e) rührt und das Adsorbens durch Zentrifugieren vom Serum abtrennt,

und ist dadurch gekennzeichnet, daß in der Verfahrensstufe d) Proteine eingesetzt werden, die aus der Leber des Thymus-Spendertiers und dessen Serum oder der Leber von Thymus-Spendertieren und einem Serumpool von Tieren der gleichen Art stammen.

Herstellung der Thymusantigene

Das erfindungsgemäß verwendete Verfahren zur Herstellung von Thymusantigenen besteht zunächst darin, daß man die Thymozyten nach Entnahme, Entfernen von Fett, Ausblutenlassen und Waschen bei Tieren einer bestimmten Art entnommener Thymusdrüsen freisetzt und die Thymozyten durch Auseinanderreißen des Gewebes in auf pH 7,2 gepufferter physiologischer Flüssigkeit entweder mit Hilfe kleiner gebogener Klammern oder Zangen oder durch direkte Zerteilung des Organs durch Reiben über bzw. Durchschlagen durch ein Sieb und Filtrieren der erhaltenen Suspension von anderen Zellen der Thymusdrüse trennt, wobei im ersten Fall Gazeschichten, im zweiten Fall eine Reihe zunehmend feinerer Siebe verwendet wird. Man verwendet beispielsweise nacheinander zwei Siebe aus nichtrostendem Stahl, deren Maschenweite beim ersten Sieb 0,80 mm und beim zweiten Sieb 0,063 mm beträgt. Je nach Größe der Thymusdrüse kann eine der angegebenen Verfahrensweisen angewendet werden. So verwendet man beispielsweise für Thymusdrüsen von Füllen, Kalb und Schwein bzw. Ferkel bevorzugt Siebe und zusätzlich kleine Zangen, für Thymusdrüsen vom Hund bevorzugt kleine Zangen.

Durch Trennung mit kleinen Klemmen oder Pinzelten werden fast ausschließlich die Zellen der Markschicht freigelegt; durch Siebe werden mehr Zellen der Rindenschicht sowie freie Epithelzellen und an diesen anhaftende Zellen freigesetzt. Die Anwendung von Sieben ermöglicht mithin die Erzielung einer größeren Ausbeute an Thymozyten.

Bei alleiniger Trennung mit Hilfe kleiner Klemmen, beispielsweise büm Hund, filtriert man die erhaltene Zellsuspcnsion anschließend durch sieben Schichten hydrophiler Gaze. Durch das Passieren durch Siebe oder Filter wird eine durch Agglutination von Zellen während des Waschens hervorgerufene schleimige Substanz abgetrennt.

Nach dem Zentrifugieren des so erhaltenen Filtrats wird der die Thymozyten enthaltende Bodensatz erneut in gepufferter physiologischer Flüssigkeit suspendiert, woraus die roten Blutkörperchen durch Ammoniumchlorid (bei Erythrozyten von Füllen oder Kalb) und durch destilliertes Wasser (bei Erythrozyten von Hund oder Schwein) lysiert werden. Es folgen dann zwei hintereinandergeschaltete Waschvorgänge mit etwa der 9fachen Menge gepufferter physiologischer Flüssigkeit, bezogen auf das Volumen des ursprünglichen Bodensatzes, mit zweifachem Zentrifugieren, wodurch ggf. gebildete Agglutinate von Thyniuszellen eliminiert werden können.

Darauf folgt eine Zählung der Thymozyten in der erhaltenen Suspension in einer Zählkammer. Ein

Ausstrichpräparat ermöglicht ebenfalls den Nachweis der Abwesenheit von größeren Mengen an Zeilverunreinigungen, insbesondere der Abwesenheit eosinophiler Zellen bei der Thymusdrüse vom Kalb. Die Suspension wird dann auf 1,5 · 10⁸ Zel!en/ml eingestellt und auf Fläschchen oder Ampullen von 1 bis 5 ml in Mengen von 1 bis 3 · 10⁹ Zellen pro Fläschchen verteilt.

Die erhaltenen Thymusantigene können durch Einfrieren über längere Zeit konserviert werden, be- ίο vor sie aufgetaut und für Injektionen verwendet werden. Die Konservierung der Thymozyten in derartigen Präparaten hängt im wesentlichen von zwei entscheidenden Faktoren ab:

- Die eingefrorenen Thymusantigenpräparate müssen bei einer Temperatur von —20 bis — 40° C, vorzugsweise bei —30°C, aufbewahrt werden;

- Das Auftauen muß rasch erfolgen (0,5 bis 1 h bei 30 bis 32° C) und von Bewegung mit Kugeln, beispielsweise aus Glas oder Kunststoff mit einem mittleren Durchmesser von 5 bis 8 mm begleitet sein. Wenn anstelle von Kugeln mechanische Blatt- oder Flügelrührer verwendet werden, ist die Anzahl der Thymozyten im Präparat nach dem Auftauen nur halb so groß wie bei Verwendung von Kugeln zur Bewegung des Präparats.

Herstellung des Antithymozytenserums

Zur Herstellung des erfindungsgemäßen Antithymozytenserums werden die vor der Verwendung aufgetauten Thymusantigene Erzeugertieren injiziert, deren Art von der des Thymus-Spendertiers verschieden ist.

Vor jeder Immunisierung werden die Seren der vorgesehenen Erzeugertiere auf Abwesenheit einer eventuellen Zytotoxizität gegenüber zu den drei Blutgruppen A, AB und 0 gehörenden menschlichen Lymphozyten sowie gegenüber den Thymozyten der Antigen-Spenderart geprüft. Diese Untersuchungen werden nach dem bekannten Verfahren von Terasaki oder nach dem modifizierten Engelfriet-Verfahren (vgl. Cytotoxic antibodies against leucocytes in histocompatibility testing [1965], S. 245, 250, Munksgaard, Kopenhagen) vorgenommen.

Die nach dem Auftauen erhaltene Thymozytensuspension wird den Erzeugertieren (deren Serum bei den oben angegebenen Prüfungen durch negative Resultate als geeignet erwies) injiziert, wobei das injizierte Volumen von der Zahl der zuvor in der Suspension bestimmten Thymozyten abhängt.

Im allgemeinen werden zwei Intradermalinjektionen vorgenommen, wobei ein Suspensionsvolumen mit 1 bis 3 K)'' Thymozyten im gleichen Volumen eines Immunitätsadjuvans wie des Freundschen Adjuvans injiziert wird; die beiden Injektionen werden in einem Abstand von 15 Tagen vorgenommen. Die anschließenden Injektionen erfolgen jede Woche intramuskulär mit der gleichen Zellmenge, jedoch ohne Zugabe von Freundschen Adjuvans.

Diese wöchentlichen Injektionen werden fortgesetzt, bis das Serum der immunisierten Tiere einen geeigneten cytotoxischen Titer aufweist, d. h. über oder gleich V_800ü (bestimmt nach der Methode von Engelfriet mit nicht-adsorbiertem, reinem Kaninchen-Komplement). Wenn das Serum unmittelbar verwendet, d. h. nicht zur Konservierung eingefroren wird, wird es durch Erwärmen dekomplementiert.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Antithymozytenserum ist es von Bedeutung, daß das den Erzeugertieren entnommene Blut während der Immunisierung kontrolliert wird, um insbesondere die mögliche Anwesenheit löslicher zirkulierender Antigen-Antikörper-Komplexe zu erkennen.

Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ferner, daß das am Ende der Immunisierung gesammelte Serum durch Adsorption an einem Protein-Immunoadsorbens so gereinigt wird, daß es keine cytotoxische Begleitstoffe wie nichtspezifische Antikörper wie Antiserum-Antikörper, Anti-Histokompatibilitäts-Antikörper sowie Hämagglutinine mehr enthält.

Kontrolle des Serums während der Immunisierung

Nach jeder wöchentlichen Injektion werden drei Kontrollen am Serum des Erzeugertiers vorgenommen.

Dabei wird einerseits auf evtl. Anwesenheit zirkulierender löslicher Antigen-Antikörper-Komplexe durch Immunodiffusion an Gelose in Boratpuffer in folgender Weise geprüft:

In eine Petrischale wird eine erste Schicht von 2%iger Gelose in Boratpuffer (pH 8,6) gegeben und nach dem Abkühlen eine zweite Schicht von l%iger Gelose im gleichen Boratpuffer aufgebracht. Nach etwa 2 h Erstarrenlassen erzeugt man in der Gelose mit einem Locher Löcher von 0,6 cm Durchmeser in einem Abstand von 1 cm, wobei man sorgfältig darauf achtet, daß nur die erste Geloseschicht durchstochen wird und die zweite intakt bleibt. Man erhält so eine Anzahl kleiner Vertiefungen, in die jeweils gleiche Volumina (50 μΐ) der verschiedenen Serumproben des gleichen Tiers gegeben werden, die in regelmäßigen Zeitabständen, beispielsweise alle 7 Tage, entnommen werden.

Die so präparierte Platte wird bei Raumtemperatur in feuchter Atmosphäre etwa 5 Tage lang aufbewahrt, während die Diffusion einer Serumprobe zur anderen hin erfolgt.

Nach dem Waschen zur Entfernung überschüssiger nichlreagierter Proteine durch 3 Tage langes Eintauchen in eine physiologische Lösung, die zweimal täglich gewechselt wird, wird die Platte mit einem auf die Gelose gepreßten Filterpapier vollständig getrocknet. Wenn der Gelosefilm gut getrocknet ist, wird er mit fließendem Wasser bis zur Transparenz gewaschen und einige Augenblicke vor der Untersuchung der Platte getrocknet.

Die Untersuchung erfolgt in Abständen von 24 h, um eventuell auftretende Ausfällungen zu erkennen, die durch Anfärbung beispielsweise mit Amidoschwarz als Proteinausfällung identifiziert werden können. Das Auftreten einer derartigen Ausfällung ist ein Hinweis auf die Anwesenheit von Antigen-Antikörper-Komplexen. Wenn in einer der nach einer Injektion entnommenen Serumproben die Anwesenheit zirkulierender löslicher Antigen-Antikörper-Komplexe nachgewiesen wird, werden die anschließenden Immunisierungsinjektionen für zwei Wochen ausgesetzt.

Bei Abwesenheit von Antigen-Antikörper-Komplexen umfaßt die Kontrolle des Serums während der Immunisierung andererseits noch die Bestimmung des Gehalts an cytotoxischen Substanzen, die nach der Mikromethode von Terasaki oder der Makromethode von Engelfriet gegenüber Thymozyten der

Antigen-Spendertierart (oder peripheren Lymphozyten) vorgenommen wird.

Schließlich wird der Gehalt an Thymozyten-Antimembran-Antikörpern nach Konfrastfärbung mit Evansblau durch Immunofluoreszenzmessing bestimmt. Dabei werden entweder dünne und wenig ausgedehnte Proben eines Thymusläppchens (2 Proben pro Platte oder eine fixierte Thymozytensuspension (4000 bis 5000 Thymozyten/μΐ; aufgebrachte Menge 2 bis 20 μΐ je nach Fall, 3 Auftragungen pro Platte).

Die Platten werden sorgfältig bei Raumtemperatur oder bei +4° C mit einem Ventilator getrocknet und anschließend bei -20° C aufbewahrt. Nach Entnahme aus der Kühltruhe werden die Platten erneut is nach 1 h bei Raumtemperatur getrocknet, dann 15 min in einer speziell für Immunfluoreszenz bestimmten, auf pH 7,2 bis 7,4 gepufferten physiologischen Flüssigkeit gewaschen (erhältlich beim Institut Pasteur). Man drückt die Kontur der Proben mit saugfähigem Papier ab und bringt dann mit Hilfe einer Mikropipette einen Tropfen (50 μΐ) reines oder verdünntes Antithymozytenserum auf.

Anschließend wird 30 min einwirken gelassen, und zwar bei Organproben bei Raumtemperatur und im Fall einer Thymozytensuspension bei 37° C in feuchter Atmosphäre.

Nach dem Waschen mit physiologischer Pufferlösung und Trocknen wird auf die Platten ein Tropfen (5 μ!) im allgemeinen mit physiologischer Pufferlösung auf '/,„ verdünntes fluoreszierendes Konjugat aufgebracht. Nach 30minütigem Einwirken taucht man die Platten in eine 0,1 %ige Lösung von Evansblau in destilliertem Wasser (5 min), wäscht sie dann in Phosphatpuffer, drückt bzw. trocknet und bringt sie zwischen Objektträger für Ultramikroskopie.

Die so erhaltenen Präparate werden im Fluoreszenzmikroskop mit Fluorszenzphasenkontrastkondensor bei starker Vergrößerung oder im Dunkelfeld mit einem starken Objektiv mit Irisblende untersucht.

Wenn es sich bei den Präparaten um Organproben handelt, haben diese bei geringer Vergrößerung ein netzartiges Aussehen, das sich bei starker Vergrößerung als membranartig und cytoplasmatisch erweist; die Dichte dieses Netzes hängt vom Gehalt an Thymo- « zyten-Antimembran-Antikörpern ab.

Wenn es sich bei den Präparaten um eine Thymozytensuspensinn handelt, zeigt eine gewisse Anzahl der Zellen einen fluoreszierenden Ring. Die prozentuale Anzahl dieser Zellen wird unter Bezug auf ein Eich- so serum bestimmt.

Reinigung des Antithymozytenserums

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Antithymozytenserum umfaßt nach dei Gewinnungdes Serums der immunisierten Tiere (wenn dieses einen cytotoxischen Gehalt über V₈₀₀₀ erreicht) die Reinigung des Serums, bei der gleichzeitig Antiserum-Antikörper, Gewebe-Antihistokompatibilitäts-Antikörper sowie homologe und heterologe Hämagglutinine elimini'.i werden.

Diese Reinigung ertolgt insbesondere durch Absorption des Antithymozytenserums an einem Polymeren, das in an sich bekannter Weise durch Glutaraldehydvernetzung von Proteinen hergestellt wird, wobei die Proteine erfindungsgemäß aus dem Serum und der Leber des bzw. der Antigenspender stammen. Das Polymere wird vorzugsweise entweder mit Proteinen aus der Leber und dem Serum des Thymusspendertieres oder Proteinen aus der Leber eines Tieres der Spenderart und aus Poolserum von Tieren der gleichen Art hergestellt, das die löslichen Substanzen enthält, die die Bildung hämagglutinierender Antikörper hätten hervorrufen können.

Die Injektion von durch Serum mit einem Gehalt an J- und O-Substanzen verunreinigten Thymus-Antigenen vom Kalb bei einem r-Schaf kann beispielsweise die Bildung von menschlichen Anti-A- und Anti-H-Antikörpern hervorgerufen haben. In diesem Falle verwendet man Serum aus einem Serumpool mit einem Gehalt an J- und O-Substanzen.

Nachfolgend wird als Beispiel eine Präparationsart für dieses Polymer ausgehend von Leber und Schweineserum beschrieben (das Polymer kann in gleicher Weise wie unten beschrieben auch ausgehend von Leber und Serum vom Kalb hergestellt werden).

Die vorzugsweise dem Thymusspender-Schwein entnommene Leber wird herausgeschält, von Nerven und Blutgefäßen befreit, in kleine Würfel zerschnitten und mehrere Male in physiologischer Pufferlösung (Phosphatpuffer pH 7,4) gewaschen. Man wiegt das erhaltene Gewebe und gibt auf 1 Volumen Gewebe zwei Volumina physiologische Pufferlösung hinzu. Die erhaltene Mischung wird anschließend 2 min mit einer Vorrichtung vom Turax-Typ in schmelzendem Eis ( + 4° C) zerkleinert und 10 min mit einer Beschleunigung von 4000 g zentrifugiert. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wird eine Nacht lang bei + 4"C gegen wäßrige phyisologische Pufferlösung dialysiert.

Das Serum om Thymusspender-Schwein oder einem die Substanz A enthaltenden Schweineserumpool (oder einem die Substanzen J und O enthaltendne Pool im Falle von Kälberserum) wird eine Nacht lang bei +4⁰C gegen physiologische Pufferlösung dialysiert.

Die Menge der in den nach der Dialyse erhaltenen Lösungen von Leber und Serum enthaltenen Proteine wird anschließend nach der Biuretmethode bestimmt. Dann werden die Lösungen der Proteine von Leber und Serum gemischt und Glutaraldehyd in einer Menge von 1 Gewichtsteil einer durch Verdünnen 1:5 aus 25 %iger Glutaraldehydlösung erhaltenen 5 %igen Glutaraldehydlösung auf 10 Gewichtsteile der Gesamtproteine von Serum und Leber zugegeben. Der Glutaraldehyd muß dabei tropfenweise unter Rühren zu der Proteinlösung zugesetzt werden, worauf diese dann bei Raumtemperatur 3 h stehengelassen wird, wobei sich in 10 bis 30 min ein Gel bildet. Das Verhältnis von Leber- zu Serumproteinen ist hierbei nicht von ausschlaggebender Bedeutung. Das erhaltene Gel wird in 100 ml Phosphatpuffer pH 7,4 dispergiert und durch eine mit einer Nadel von 1,2 bis 1,5 mm Durchmesser versehene Spritze hindurchgeschickt; darauf wird dreimal 10 min mit einer Beschleunigung von 1500 g zentrifugiert, wobei das Gel zwischen dem ersten und zweiten Zentrifugieren in 50 ml Phosphatpuffer und zwischen dem zweiten und dritten Zentrifugieren in 50 ml HCl-Glycin-Puffer (pH 2,2 bis 2,8) dispergiert wird. Nach dem Neutralisieren des Gels durch Dispergieren in 10 ml K₂HPO₄ (1 M) und Zugabe von destilliertem Wasser wird erneut dreimal zentrifugiert, wobei das zentrifugierte Gel jedesmal in 50 ml physiologischer Pufferlösung aufgenommen wird.

In diesem Stadium kann das Polymer in physiologi-

scher Pufferlösung bei +4° C aufbewahrt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Reinigung des Antithymozytenserums umfaßt ferner die Adsorption des immunisierten gewonnenen Serums an dem mit Glutaraldehyd aus Proteinen von Serum und Leber erhaltenen Polymeren, das wie oben angegeben hergestellt wird.

Nach dem Zentrifugieren des Polymeren zur Abtrennung der physiologischen Pufferlösung, in der es aufbewahrt wurde, wird der Bodensatz vom Zentrifugieren mit dem zu reinigenden Serum aufgenommen. Man rührt 1 h bei Raumtemperatur und zentrifugiert 10 min mit einer Beschleunigung von 1500 g zur Abtrennung des Polymeren und Gewinnung des gereinigten Serums.

Das erfindungsgemäße Reinigungsverfahren unter Verwendung des beschriebenen Adsorbens führt zu einer weitaus spezifischeren und damit immunchemisch besseren Reinigung des Serums als bei herkömmlichen Verfahren, da beim Adsorbens Proteine verwendet werden, die aus dem Thymus-Spendertier selbst stammen.

Es ist dabei durchaus überraschend, daß unter den genannten Verfahrensbedingungen die unerwünschten Begleitsubstanzen bei einfachem Digerieren des Serums mit dem Adsorbens so gebunden werden, daß sie durch Abzentrifugieren in an das Adsorbens gebundener Form in einfacher Weise abgetrennt werden können, so daß keine aufwendige chromatographische Trennung unter Elution der gewünschten Serum-Antikörper mehr erforderlich ist, die zugleich zu unerwünschter Verdünnung führt.

Das so gereinigte Serum wird einer Reihe von Kontrolluntersuchungen unterzogen:

a) Prüfung der Abwesenheit von Hämagglutininen: durch Hämagglutinationstest nach Eyquem für rote Blutkörperchen von Mensch, Pferd und Hund;

nach dem Verfahren von Dudok, de Wit et al. (J. Small Animal Practice (1967) 1, S. 287) für rote Blutkörperchen vom Hund sowie
durch Hämolyse roter Blutkörperchen vom Rind;

b) Prüfung der Abwesenheit von Antiserum-Antikörpern der Antigenspenderart durch Immunodiffusion gegen normales Serum dieser Art;

c) Prüfung der antithrombozytären Wirksamkeit;

d) Prüfung des Gehalts an Thymozyten-Antimembran-Antikörpern nach dem oben beschriebenen Verfahren der Immunfluoreszent:

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anThymusprubeii, wobei nachuei Reinigung des Serums ein Teil der membrangebundenen Fluoreszenz verschwindet,
an einer Thymozytensuspension, wobei der Prozentsatz an Zellen mit einem Fluoreszenzring bestimmt wird,

an Leber- und Nierenschnitten oder Zellsuspensionen dieser Organe, wobei die Abwesenheit einer epithelialen Immunfluoreszenz (entsprechend die Abwesenheit von Antileber- und Antinieren-Antikörpern) festgestellt wird;
e) Prüfung des rohen Serums durch Elektrophorese und des gereinigten Serums an Celluloseacetat, wobei der Peak der Immunglobuline G (und der Immunoglobuline A beim Pferd) zurückbleiben soll.

Die Herstellung der Gammaglobuline aus dem gereinigten und kontrollierten Antithymozytenserum kann in bekannter Weise durch Ammonsulfat-Fällung und übliche Reinigung erfolgen.

Die Konservierung des gereinigten Serums kann entweder in Glykokoll bei +4° C, durch Gefriertrocknen oder auch durch Einfrieren auf —30° C erfolgen. Die beiden letzteren Verfahren eignen sich zur Aufbewahrung der Gammaglobuline.

Die für eine Tierart spezifischen erfindungsgemä-Ben Äntithymozytenseren sowie die daraus gewinnbaren Gammaglobuline sind in der Human- und Veterinärmedizin anwendbar.

Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen tierartspezifischen Antithymozytenseren einen cytotoxischen Effekt auf die weißen Blutkörperchen (Lymphozyten, Lymphoblasten, Myelozyten, Myeloblasten) von Kranken mit verschiedenen Formen von Leukämie ausüben. Dieser cytotoxische Effekt ist ein Beweis für die Existenz von tierischen Thymozyten und leukämischen Zellen gemeinsamen Antigenen.

Es wurde ferner festgestellt, daß diese Antigene je nach Art der Leukämie in ihrer Spezifizität hinsichtlich der Tierart variieren können. Gewisse leukämische Zellen zeigen beispielsweise Empfindlichkeiten, die sie mit den Thymozyten des Schweins verbinden, andere Ieukämische Zellen scheinen den Thymozyten vorn Kalb, wieder andere den Zeil- und Gewebsextrakten der bursa fabricii und andere schließlich den Thymozyten mehrerer Arten gleichzeitig verwandt zu sein.

Darüber hinaus wurde beobachtet, daß bestimmte erfindungsgemäße tierartspezifische Antithymozytenseren je nach ihrer Konzentration an Antikörpern, ihrer Art und Spezifizität ebenfalls eine cytotoxische Wirkung auf normale menschliche Lymphozyten ausüben können.

Die erfindungsgemäßen Antithymozytenseren sind in üblicher Weise als Testseren bzw. Diagnostika verwendbar; die Untersuchung der Cytotoxizität verschiedener tierartspezifischer Antithymozytenseren gegenüber leukämischen Zellen ermöglicht eine diagnostische Feststellung der »tier«-heterospezifischen Antigene der leukämischen Zelle und einen Nachweis latenter Viruserkrankungen, da das Gleichgewicht zwischen Virus und Organismus durch T-Lymphozyter. bedingt ist.

Die erfindungsgemäßen Seren können ferner als Immunodepressoren und als die Abweisung verhindernde sowie zur Verhinderung der Abstoßung von Transplantaten bei Organtransplantationen angewandt werden.

Die erfindungsgemäßen Seren sind schließlich zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen verwendbar, die durch Vermehrung der T-Lymphozyten der Thymosin-Hypersekretion hervorgerufen sind; in der Veterinärmedizin werden Tieren beispielsweise 1 bis 2 ml Serum/kg Körpergewicht injiziert.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Verfahren zur Herstellung von Antithymozytenserum, wobei man

   a) eine aus Thymusdrüsen von Tieren erhaltene Zellsuspension durch eine Reihe von Sieben zunehmender Feinheit oder durch mehrere Gazeschichten hindurchpassiert, wobei das letzte Sieb eine Maschenweite von 63 μπι ίο aufweist,

   b) die gewonnenen Thymozyten-Antigene einer vom Thymus-Spendertier verschiedenen Tierart zur Serumgewinnung injiziert,

   c) das Serum der immunisierten Tiere gewinnt,

   d) das Serum mit einem Adsorbens versetzt, das aus Glutaraldehyd und Proteinen hergestellt worden ist,

   e) rührt und das Adsorbens durch Zentrifugieren vom Serum abtrennt,

   dadurch gekennzeichnet, daß in der Verfahrensstufe d) Proteine eingesetzt werden, die aus der Leber des Thymus-Spendertiers und dessen Serum oder der Leber von Thymus-Spendertieren und einem Serumpool von Tieren der gleichen Art stammen.