DE2205897A1 - Verfahren zur Herstellung von antigenen Extrakten tierischer Thymocythen und tierartspezifischen antithymocytären Seren und Gamma-Globulinen sowie entsprechende Extrakte, Seren und Gamma-Globuline und diese enthaltende Pharmazeutika - Google Patents

Description

Patentanwälte

96-18.3Ο9Ρ 8. 2. 1972

Albert ROLLAND S. A.. Paris (Frankr.)

Verfahren zur Herstellung von antigenen Extrakten tierischer Thymocythen und tierartspezifischen antithymocytären Seren und Gamraa-Globulinen sowie entsprechende Extrakte, Seren und Ganuna-Globuline und diese enthaltende.

Pharmazeutika

Die Erfindung bezieht sich zum einen auf die Herstellung von Thymusantigenen, die über längere Zeitdauer hinweg gelagert werden können und zum anderen auf die Gewinnung von tierartspezifischen antithymocytären Seren und Gamma-Globulinen durch Injektion der bei einer Tierart gewonnenen Thymuaantigene bei Tieren irgendeiner fremden Art,

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Die Erfindung umfaßt mithin auch die so hergestellten Thynmsantigene und antithymocytären Seren und Gamma-Globuline sowie diese enthaltende pharmazeutische Präparate, die in Humanmedizin und Veterinärmedizin hochinteressante Anwendungen finden (in der Antigenotherapie und der Serooder Gl obulinotherapie).

Die Herstellung und Gehaltsbestimmung bzw. -einstellung von antilymphocytären Seren und Gamma-Globulinen erfordert sehr lange Zeiten und stößt auf große"technische Schwierigkeiten« «Der Herstellungspreis ist mithin sehr hoch. Ihre Bedeutung im experimentellen Bereich ist indessen sehr erheblich, und das Studium ihrer Eigenschaften sollte die Entwicklung ihrer Anwendungen in der Veterinärmedizin ermöglichen, wie für inmunodepressive Therapie bei gewiesen Autoimmunisierungskrankheiten und in der Humanmedizin.

Für eine bestimmte Art spezifische antilymphocytäre Gamma-Globuline können durch Injektion der Lymphocyten eben dieser Art bei irgendeiner anderen unterschiedlichen ("heterologischen") Art erhalten werden. Es wurde nun gefunden, daß mit einer antilymphocytären Wirksamkeit begabte antithymocytäre Gamma-Globuline viel rascher und

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mit weniger Kostenaufwand erhalten werden können, indem als antigenes Ausgangsmaterial nicht wie üblich Lymphocyten, sondern vom Thymus stammende Thymocyten oder im Falle von Vögeln Zellen vom Fabriciusbeutel (bourse de Fabricius) verwendet werden.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von wesentlich von Thymocyten gebildeten Thymusantigenen, die über längere Zeiten hinweg durch Gefrieren gelagert werden können, bevor sie aufgetaut und für Injektionen verwendet werden«.

Die Erfindung umfaßt weiter ein Verfahren zur Herstellung von für eine Tierart spezifischen antithymocytären Seren durch Injektion der gemäß der Erfindung erhaltenen Thymusantigene dieser Art bei irgendeinem artfremden Tier und Aussammeln von Serum bei den so immunisierten Tieren und Reinigung desselben.

Herstellung von Thymusantigenen

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Thymusantigenen besteht zunächst darin, daß man die Thymo-

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cyten nach Enthülsen bzw. Herausschälen (decapsulation), Entfernen von Fetten, Ausblutenlassen und Waschen einer bei einem Tier einer bestimmten Art entnommenen Thymusdrüse freisetzt und die Thymocyten von anderen Zellen der Thymusdrüse durch Auseinanderziehen bzw. Voneinandertrennen (dilaceration) der Gewebe in auf pH 7,2 gepufferter physiologischer Flüssigkeit entweder mit Hilfe kleiner gebogener Klemmen oder Zangen oder durch direkte Aufteilung des Organs durch Abreiben über bzw. Durchschlagen durch (frottement sur) ein erstes Sieb und durch Filtrieren der erhaltenen Suspension trennt, und zwar im ersten Fall durch Gazeschichten, im zweiten Fall durch eine Reihe von zunehmend feineren Sieben. Man verwendet beispielsweise nacheinander zwei Siebe aus nichtrostendem Stahl, deren Maschenöffnungsdurchmesser beim ersten Sieb O,80 mm und beim zweiten Sieb 0/063 mm beträgt. Je nach Größe der Thymusdrüse kann man die eine oder andere dieser Verfahrensweisen (Voneinandertrennen mit Hilfe kleiner Klemmen oder durch Sieben) anwenden. So verwendet man beispielsweise für die Thymusdrüsen von Füllen, Kalb und Schwein bzw. Ferkel bevorzugt Siebe und zusätzlich kleine Klemmen) für die Thymusdrüsen vom Hund verwendet man bevorzugt kleine Klemmen.

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Das Voneinandertrennen mit kleinen Klemmen oder Pinzetten setzt nahezu ausschließlich die Zellen der Markschicht in Freiheit} die Siebe setzen die Zellen der Rindenschicht in größerer Zahl in Freiheit und ebensogut die freien Zellen im Epithel, wie die an diesen anhaftenden Zellen. Die Anwendung von Sieben ermöglicht mithin die Erzielung einer größeren Ausbeute an Thymocyten.

Bei alleiniger Anwendung der Trennung mit Hilfe kleiner Klemmen (beispielsweise beim Hund) filtriert man nachfolgend die erhaltene Zellsuspension durch sieben Schichten hydrophyler Gaze. Der Durchgang durch Siebe oder Filter eliminiert eine durch spätere Agglutination von Zellen während des Väschens verursachte schleimige Substanz.

Nach dem Zentrifugieren des so erhaltenen Filtrate bringt man den die Thymocyten enthaltenden Bodensatz erneut in gepufferter physiologischer Flüssigkeit (eau) in Suspension und führt die Lysis der roten Blutkörperchen durch Ammoi^Lumchlorid (bei Erythrocyten von Füllen oder Kalb) und <|urch destilliertes Wasser (bei Erythrocyten von Hund oder Schwein) durch. Es folgen dann zwei hintereinanderg·schaltete Vaachvorgänge mit gepufferter physiologischer Flüssigkeit (wobei das Volumen der Lösung neun-

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mal größer ist als dasjenige des ursprünglichen Bodensatzes) mit zweifachem Zentrifugieren, wodurch gegebenenfalls gebildete Agglutinate von Thymuszellen eliminiert werden können.

Es folgt dann eine Auszählung der Thymocyten in der erhaltenen Suspension unter Verwendung einer Malassez-Zelle oder Thoma-Zählkammer. Ein Ausstrichpräparat ermöglicht
ebenfalls den Kachweis der Abwesenheit von erheblicheren Zellkontaminanten (insbesondere bei der Thymusdrüse vom

Kalb ι Abwesenheit von eosinophilen Zellen). Die Suspension

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wird dann auf 1,5 x 10 Zellen pro ml eingestellt und in Fläschchen bzw. Ampullen von 1 bis 5 ml in Mengen von 1

ο
bis 3 x 10^ Zellen pro Fläschchen verteilt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht, wie oben angegeben, die Konservierung der erhaltenen Thymusantigene durch Einfrieren über längere Zeiten hinweg, bevor sie
aufgetaut und für Injektionen verwendet werden. Die Konservierung der Thymocyten in diesen Präparaten hängt wesentlich von zwei kritischen Faktoren ab:

- Die Thymusantigenpräparate müssen eingefroren und bei einer Temperatur von -20 bis -40 ⁰C erhalten werden;

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sie werden bevorzugt im Gefrierraum bei -30 ⁰C aufbewahrt.

- Das Auftauen muß rasch erfolgen (O,f5 bis 1 h auf 30 bis 32 °C) und von einer Aufteilung durch Bewegung bzw„ Rührwirkung über gedrungene bzw. Kugelkörper (billes speriques) aus irgendeinem Material wie beispielsweise Glas oder Kunststoff und mit einem mittleren Durchmesser von 5 bis 8 mm begleitet sein. Wenn man anstelle der Kugelkörper mechanische Rührer mit Klauen oder Flügeln verwendet, ist die Zahl der Thymoeyten im Präparat nach dem Auftauen gleich der Hälfte von denen, die man bei "Verwendung von Kugeln für die Bewegung des Präparates erhält.

Herstellung von antithymocytärem Serum

Für die Herstellung von antithymocytärem Serum gemäß der Erfindung werden die so im Zeitpunkt ihrer Anwendung aufgetauten Thymosantigene Erzeuger-Tieren injiziert, die einer Art angehören, die von derjenigen unterschiedlich ist, von der die Thymusantigene stammen.

Vor jeder Immunisierung werden die Seren der ins Auge gefaßten Erzeuger-Tiere überprüft zur Sicheretellung der

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Abwesenheit einer gegebenenfalls gegenüber den zu den drei Blutgruppen (A, AB, θ) gehörenden menschlichen Lymphocyten und gegenüber den Thymocyten der Spenderart für das Antigen gegebenenfalls möglichen eigenen Cytotoxicität. Diese Nachweise werden nach der klassischen Methode von Terasaki erbracht oder nach der modifizierten Methode von Engelfriet (Cytotoxic antibodies against leucocytes in histocompatibility testing, I965, S. 245, 250, Munksgaard, Kopenhagen).

Die nach dem Auftauen erhaltene Thymocytensuspension wird den Erzeuger-Tieren (deren Serum bei den oben angegebenen Prüfungen negative Resultate gezeigt hat) in einem Volumen injiziert, das mit der Zahl der vorangehend in der Suspension bestimmten Thymocyten veränderlich ist.

Gemäß allgemeiner Verfahrensweise werden zwei In-

tradermallnjektionen vorgenommen, und zwar wird ein Sus-

pensionsvolumen mit 1 bis 3 χ 10 Thymocyten in einem gleichen Volumen eines Immun!tatsadjuvanβ, wie des Freund*sehen Adjuvans injiziert, wobei die beiden Injektionen durch ein Intervall von 15 Tagen voneinander getrennt sind. Die anschließenden Injektionen erfolgen jede Woche intramuskulär mit der gleichen Zellmenge, aber ohne Zugabe von Freund'- «ehern Adjuvans.

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Diese wöchentlichen Injektionen werden fortgesetzt, bis das Serum der immunisierten Tiere einen passenden
cytotoxischen Gehalt zeigt, d. h. mehr als oder gleich
1/8000 (bestimmt nach der Methode von Engelfriet mit nichtabsorbiertem reinem Kaninchen-Komplement). Wenn das Serum unmittelbar verwendet wird, d. h. wenn es nicht zur Konservierung eingefroren wird, dekomplementiert man es (on Ie decomplemente) durch Aufheizen.

Ein wesentliches Merkmal des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von antilymphocytärem bzw. antithymocytärem Serum besteht zum einen darin, daß man bei
den Erzeuger-Tieren entnommenes Blut während der Immunisierung kontrolliert, um insbesondere die mögliche Anwesenheit von löslichen zirkulierenden Antigen-Antikörperkomplexen zu erkennen und zum anderen darin, daß man das am Ende der Immunisierung gesammelte Serum reinigt, um
gleichzeitig die Antiserum-Antikörper, die Hystokompatibilitätsantisystem-Antikörper und die Hämagglutinine zu
unterdrücken.

Kontrolle dee Serums während der Immunisierung
Nach jeder wöchentlichen Injektion werden drei Kon-

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trollen an dem beim Erzeuger-Tier entnommenen Serum vorgenommen·

Zum einen wird die evtl. Anwesenheit von löslichen zirkulierenden Antigen-Axitikörperkomplexen nach der Immunodiffus ions technik an Gelose in einem Boratpuffer in folgender Veise vorgenommen:

In eine Petrischale wird eine erste Schicht von 2prozentlg in einem Boratpuffer (pH 8,6) gelöster Gelose geschüttet und nach dem Abkühlen eine zweite Schicht von in Mengen von 1 $ im gleichen Boratpuffer gelöster Gelose darüber gebracht. Nach dem Erstarrenlassen über etwa 2 Stunden erzeugt man in der Gelose mit einem Locher Löcher von 0,6 cm Durchmesser in einem Abstand von 1 cm, wobei man sorgfältig darauf achtet, daß nur die erste Geloseschicht durchstochen wird und die zweite intakt bleibt. Man erhält so eine gewisse Anzahl von kleinen Aufnahmen, in deren jede ein gleiches Volumen (50 /ul) der verschiedenen Proben des Serums von ein und demselben Tier gegeben werden, die in regulären Zeitabständen - beispielsweise alle 7 Tage entnommen werden.

Die so präparierte Platte wird bei Zimmertemperatur

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in feuchter Atmosphäre etwa 5 Tage lang aufbewahrt, während welcher Zeit die Diffusion einer Serumprobe zur anderen hin erfolgt.

Nach dem Waschen zur Eliminierung des Überschusses der nicht reagierten Proteine durch 3 Tage langes Eintauchen in eine physiologische Flüssigkeit, die morgens und abends gewechselt wird, wird die Platte mit Hilfe eines auf die Gelose gepreßten Filterpapiers vollständig getrocknet. Wenn der Gelosefilm gut getrocknet ist, wäscht man ihn mit fließendem Wasser, bis er transparent wird und trocknet ihn einige Augenblicke vor der Untersuchung der Platte.

Diese Untersuchung erfolgt in Intervallen von 2k Stunden, um das eventuelle Auftreten einer Ausfällung zu erkennen, die man als Proteinausfällung durch Anfärbung beispielsweise mit Amidoschwärζ identifizieren kann. Das Austreten dieser Ausfällung ist ein Hinweis für die Anwesenheit von Antigen-Antikörperkomplexen. Wenn in einer der nach einer Injektion entnommenen Serumproben die Anwesenheit von zirkulierenden löslichen Antigen-Antikörperkomplexen nachgewiesen wird, werden die anschließenden Immunisierungsinjektionen zwei Wochen ausgesetzt.

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Bei Abwesenheit von Antigen-Antikörperkomplexen umfaßt die Kontrolle des Serums während der Immunisierung zum zweiten die Bestimmung des cytotoxischen Gehaltso Diese erfolgt nach der Mikromethode von Terasaki oder nach der Makromethode von Engelfriet gegenüber Thymocyten der das Antigen spendenden Tierart (oder peripheren Lymphocyten)₀ ·

Zum dritten bestimmt man den Gehalt bzw. "Reichtum" an Thymocytenantimembran-Antikörpern nach der Immunofluoreszenzmethode nach Kontrastfärbung mit Evansblau» Diese Methode wird folgendermaßen durchgeführts

- entweder an dünnen und wenig ausgedehnten Proben bzw. Kopien (caiques) eines Thymusläppchens (2 Kopien pro Platte (lame)),

- oder an fixierter Thymocytensuspension (4000 bis 5000 Thymocyten pro /ul) in Mengen von einer Ablagerung von 2 /Ul bis 20 /ul je nach Fall (3 Ablagerungen pro Platte).

Die Platten bzw. Objektträger werden sorgfältig mit dem Ventilator bei Zimmertemperatur oder bei + k ⁰C ge-

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trocknet und dann im Gefrierraum bei -20 C aufbewahrt. Bei Verlassen des Gefrierraums werden die Platten erneut nach einer Stunde bei Zimmertemperatur getrocknet, dann 15 Minuten lang in einer speziell für Immunofluoreszenz bestimmten auf pH 7»2 bis Ί,h gepufferten physiologischen Flüssigkeit gewaschen (erhältlich beim Institut Pasteur)_o Man drückt bzw. trocknet die Kontur der Kopien (bzw. dün- nen Scheibchen) mit saugfähigem Papier bzw. Löschpapier ab und bringt dann mit Hilfe einer Mikropipette nach Eppendorf auf die Platten einen Tropfen (50 /ul) reines oder verdünntes antithymocytares Serum.

Man läßt 30 Minuten lang einwirken!

- bei Zimmertemperatur, wenn es sich um Organproben bzw. -kopien handelt;

- bei 37 C in feuchter Atmosphäre, wenn es sich um Thymocytensuspensionen handelt.

Nach Waechen in gepufferter physiologischer Flüssigkeit und Trocknen bringt man auf die Platten einen Tropfen (5 /ul) von generell auf 1/30 in gepufferter physiologischer Flüssigkeit verdünntem fluoreszierenden Kopplungs-

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mittel (conjugue fluorescent). Nach 3Oniinütigem Einwirkenlassen taucht man die Platten in eine Lösung von O,1 $ Evansblau in destilliertem Wasser (5 Minuten lang); man wäscht sie dann in einem Phosphatpuffer, drückt bzw. trocknet· sie ab und bringt sie zwischen dünne Plättchen bzw. Objektträger für Ultramikroskopie.

Man beobachtet dann die so erhaltenen Präparate im Fluoreszenzmikroskop mit zugeordnetem Fluoreszenzphasen-Kontrastkondensator bei starker Vergrößerung oder im Dunkelfeld mit einem starken Objektiv mit Irisblende.

- Wenn es sich um Proben bzw» Kopien handelt, haben diese bei geringer Vergrößerung ein netzartiges Aussehen, das sich bei starker Vergrößerung als membranartig und cytoplasraisch erweist; die Dichte dieses Netzes ist eine Funktion des Reichtums an Thymocytenantimembran-Antikörpern.

- Wenn es sich um eine Thymocytensuspension handelt, zeigt eine gewisse Anzahl von Zellen einen Fluoreszenzring. Man bestimmt den Prozentsatz der Anzahl dieser Zellen durch Bezugnahme auf ein Eichserum.

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Reinigung des antithymocytären Serums

Das Verfahren zur Herstellung von antithymocytärem Serum umfaßt nach dem Aufsammeln des Serums der immunisierten Tiere (wenn dieses einen cytotoxischen Gehalt über 1/8000 erreicht) einen Reinigungsabschnitt für dieses Serum, wodurch gleichzeitig die Antiserum-Antikörper, die gewebsartigen Histokompatibilitätsantisystem-Antikörper und die homologen und heterologen Hämagglutinine eliminiert werden können.

Diese Reinigung erfolgt insbesondere gemäß der Erfindung durch Absorption des antithymocytären Serums an einem Polymeren, das mit Glutaraldehyd durch die Proteine des Serums und der Leber des (oder der) Antigenspender(s) gebildet wird. Man erzeugt dieses Polymere entweder vorzugsweise mit der Leber und dem Serum des Thymusspendertieres oder mit der Leber eines Tieres der Spenderart und einem Serumpool von Tieren der gleichen Art, das die löslichen Substanzen enthält, die die Bildung von Hämagglutininantikörpern hätten hervorrufen können bzw. hervorrufen können würden.

Die Injektion der durch Serum mit einem Gehalt an J-

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und O-Substanzen verunreinigten Antigene einer Thymusdrüse vom Kalb· bei einem r-Schaf kann beispielsweise die Bildung von Anti-A- und Anti-H-Antikörpern vom Menschen hervorgerufen haben. In diesem Falle verwendet man einen Serumpool mit einem Gehalt an J- und O-Substanzen.

Nachfolgend wird als Beispiel eine Präparationsart für dieses Polymere ausgehend von Leber und Schweineserum beschrieben (das Polymere kann auch in gleicher Weise wie unten beschrieben ausgehend von Leber und Serum vom Kalb hergestellt werden).

Die vorzugsweise beim Thymusspender-Schwein entnommene Leber, wird enthülst bzw. herausgeschält, von Nerven und Blutgefäßen befreit, in kleine Würfel zerschnitten und mehrere Male in gepufferter physiologischer Flüssigkeit (Phosphatpuffer mit pH 7»*0 gewaschen. Man wägt das erhaltene Gewebe und gibt auf 1 Volumen Gewebe zwei Volumina gepufferte physiologische Flüssigkeit hinzu. Man zerkleinert bzw. rührt die erhaltene Mischung 2 Minuten lang mit einer Vorrichtung vom Turax-Typ in schmelzendem Eis (+k °C) und zentrifugiert 10 Minuten lang mit einer Beschleunigung von 4000 g. Die erhaltene überstehende Flüssigkeit wird

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eine Nacht lang bei + h °C gegen gepufferte physiologische Flüssigkeit (wäßrig) dialysiert.

Das Serum vom Thymusspender-Schwein oder ein die Substanz A enthaltender Schweineserumpoöl (oder die Substanzen J und 0 enthaltender Pool im Falle von Kälberserum) wird eine Nacht lang bei + 4 °C gegen physiologische Flüssigkeit dialysiert.

Man bestimmt dann nach der Biuretmethode die Menge der in den nach Dialyse erhaltenen Lösungen von Leber und Serum enthaltenen Proteine. Dann werden diese Lösungen von Proteinen von Leber und Serum gemischt und dazu 25prozentiger Glutaraldehyd (erhältlich unter der Bezeichnung Glutaraldehyde Practical bei Eastman Kodak) fünffach verdünnt hinzugegeben, und zwar in Mengen von einem Gewichtsteil dieser Lösung mit 5 % Glutaraldehyd pro 10 Gewichtsteile der Gesamtproteine von Serum und Leber. Man muß dabei den Glutaraldehyd tropfenweise unter Rühren zu der Proteinlösung geben und diese dann bei Zimmertemperatur drei Stunden lang ruhen lassen} es bildet sich dann in 10 bis 30 Minuten ein Gel. (Das Verhältnis von Leber- zu Serumproteinen ist nicht kritisch).

Man dispergiert das erhaltene Gel In 100 ml Phosphat-

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puffer (pH 7,*O und schickt es durch eine mit einer Nadel von 1,2 bis 1,5 mm Durchmesser versehene Spritze und zentrifugiert dann dreimal 10 Minuten lang mit einer Beschleunigung von 15OO g, wobei man das Gel zwischen dem ersten und zweiten Zentrifugieren in 50 ml Phosphatpuffer und zwischen dem zweiten und dritten Zentrifugieren in 50 ml HCl-Glycin-Puffer (pH 2,2 bis 2,8) dispergiert. Nach Neutralisieren des Gels durch Dispersion in 10 ml K„HP0k (1 Μ) und Zugabe von destilliertem Wasser wird erneut dreimal zentrifugiert, wobei das zentrifugierte Gel jedesmal in 50 ml gepufferter physiologischer Flüssigkeit aufgenommen wird.

In diesem Stadium kann das Polymere in gepufferter physiologischer Flüssigkeit bei + k C konserviert werden.

Das Verfahren zur Reinigung des antithymocytären Serums gemäß der Erfindung umfaßt mithin die Absorption des

immunisierten ^

bei den^(er-ieren gesammelten Serums an dem durch Glutaraldehyd und die Proteine von Serum und Leber gebildeten Polymeren, das, wie oben angegeben, hergestellt wird.

Nach dem Zentrifugieren des Polymeren zur Eliminierung der physiologischen Flüssigkeit, in der es konserviert wurde, nimmt man den Bodensatz vom Zentrifugieren mit dem

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zu reinigenden Serum auf. Man rührt eine Stunde lang bei Zimmertemperatur und zentrifugiert 10 Minuten lang mit einer Beschleunigung von 1500 g zur Abtrennung des Polymeren und Gewinnung des gereinigten Serums.

Das so gereinigte Serum wird einer Reihe von Kontrollen unterzogen zur Sicherstellung;

a) der Abwesenheit von Hämagglutininens

- durch Hamagglutination nach der Technik von Dr₀ Eyquem für die roten Blutkörperchen von Mensch, Pferd (equius) und Hund;

- nach der Methode von Dudok, de Wit u. a. (j. Small animal practice, 19^7, J., Nr. 5» S. 287) für die roten Blutkörperchen vom Hund (canius);

- nach der Technik der Hämolyse für die roten Blutkörperchen vom Rind;

b) der Abwesenheit von Antiserum-Antikörpern der das Antigen spendenden Art durch Immunodiffusion gegen normales Serum dieser Art;

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c) der antithrombocytären Wirksamkeit;

d) dem Gehalt an Thymocytenantimembran-Antikörpern nach dem oben beschriebenen Verfahren der Immunofluoreszenz:

- an Thymusproben (caiques)s Man sieht dabei nach Reinigung des Serums einen Teil der antimembrangebundenen Fluoreszenz verschwinden;

- an Thyinocytensuspensions Man bestimmt den Prozentsatz der Zellen mit einem Fluoreszenzring;

- an Leber- und Nierenschnitten oder an Zellsuspensionen dieser Organes Man muß die Abwesenheit einer epithelialen Immunofluoreszenz feststellen (Abwesenheit von Antileber- und Antinieren-Antikörpern).

e) Prüfung durch Elektrophorese des rohen Serums und des gereinigten Serums an Celluloseacetat: Dabei soll der Peak der Immunoglobuline G (und der Immunoglobuline A beim Pferd) verbleiben bzw. zurückbleiben.

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Herstellung der antithymocytären Globuline

Die Herstellung der Gamma-Globuline ausgehend vom gereinigten und kontrollierten antithymocytären Serum erfolgt nach einer Reihe von üblichen Operationen!

Man fällt zunächst die Globuline mit Ammoniumsulfat; man verwendet dazu bevorzugt eine Lösung mit kO $ Sulfat für die beiden Erzeugerarten Pferd und Schaf (equine et ovine) und eine Lösung mit 33 Ί° für die Erzeugerart Pferd (chevaline). (Beim Schaf können die Immunoglobuline G mit Athacridinlactat getrennt werden).

Man filtriert den erhaltenen Niederschlag durch Papier und dialysiert bei + h C zunächst gegen gewöhnliches Wasser 3 Tage lang und dann gegen salzhaltiges Wasser (3 0/00) drei weitere Tage lang zur Eliminierung des Niederschlages.

Nach Zentrifugieren kontrolliert man das erhaltene Produkt durch Elektrophorese und Immunoelektrophorese und bestimmt den Gehalt der Proteine durch Biuretreaktion zur Festlegung des Verhältnisses zwischen dem cytotoxischen

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Gehalt und der Proteinmenge. Man stellt den endgültigen Gehalt in der Weise ein, daß die Proteinmenge kleiner oder gleich 8 # ist (im Mittel 5,22 #). Schließlich wird eine zweifache sterilisierende Filtration durch Seitz-C-10- und SeItZ-EK-S₁-Filter unter komprimierter Luft und ultravioletter Strahlung vorgenommen.

Die Konservierung des gereinigten Serums kann entweder in Glykokoll (glycocolle) bei +4 C oder durch Gefriertrocknen oder auch durch Gefrieren auf -30 C erfolgen,= Die beiden letzteren Verfahren sind allein für die Konservierung der Gamma-Globuline angemessen.

Die Tier-Thymocytenantigenpräparate sowie auch die für eine Tierart spezifischen antithymocytären Seren und Gamma-Globullne finden Anwendungen in der Humanmedizin und Veterinärmedizin.

Es wurde festgestellt, daß die für eine Tierart spezifischen antithymocytären Seren und Globuline einen cytotoxischen Effekt auf die weißen Blutkörperchen (Lymphocyten, Lymphoblasten, Myelocyten, Myeloblasten) von Kranken mit diversen Formen von Leukämietypen ausüben. Dieser cytotoxische Effekt bildet einen Beweis für die Existenz von den

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tierischen Thymocyten und den leukämischen Zellen gemeinsamen Antigenen.

Auf der anderen Seite wurde gefunden, daß diese Antigene je nach Merkmal (bzw, Art) der Leukämien bezüglich ihrer Spezifizität gegenüber der Tierart variieren können. Gewisse leukämische Zellen zeigen beispielsweise Empfindlichkeiten, die sie mit den Thymocyten vom Schwein verbinden, andere leukämische Zellen scheinen den Thymocyten vom Kalb verwandt, noch andere den Zeil- und Gewebsextrakten des Fabriciusbeutels und noch andere schließlich den Thymocyten mehrerer Arten gleichzeitig.

Es wurde darüber hinaus beobachtet, daß gewisse für eine Tierart spezifische antithymocytäre Seren oder Globuline je nach ihrer Konzentration an Antikörpern, ihrer Natur und ihrer Spezifizität ebenfalls eine cytotoxische Wirkung auf die normalen menschlichen Lymphocyten ausüben können.

Nach diesen Feststellungen hat die Anmelderin gefunden, daß die vom Tier erhaltenen Thymocytenantigenpräparate und die für eine Tierart spezifischen antithymocytären Seren und Gamma-Globuline diverse Anwendungen finden können«

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Zunächst ermöglicht das Studium der Cytotoxizität von diversen. Tierarten spezifischen antithymocytären Seren gegenüber leukämischen Zellen eine diagnostische Feststellung des "Tier"-heterospezifischen Antigens der leukämischen Zelle.,

Die tierischen antithymocytären Seren können ebenfalls als Immunodepressoren und als die Abweisung verhindernde Faktoren im Bereich der Organtransplantationen angewandt werden.

Schließlich sind die antithymocytären Seren nützlich in der Veterinärmedizin, Insbesondere für die Behandlung von autoimmunitären und entzündlichen Krankheiten in einer injizierbaren Dosis von 1 bis 2 ml Serum pro kg Tierkörpergewicht.

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Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Verfahren zur Bereitstellung von tierischem thymocytären Antigen, insbesondere in Vorratsmengen, die vor Gebrauch längere Zelt konserviert werden können, dadurch gekennzeichnet, daß man die ausgehend vom Thymus oder dem Fabriciusbeutel (im Falle von Vögeln) in bekannter Weise erhaltene zelluläre Suspension durch eine Reihe von Sieben zunehmender Feinheit oder durch mehrere Schichten Gaze filtriert, auf eine Temperatur von -20 bis -kO C einfriert und bei dieser Temperatur konserviert bzw. aufbewahrt und im Zeitpunkt der Verwendung insbesondere rasch unter Aufteilung bzw. Ausbreitung durch Bewegung über gedrungene insbesondere Kugelkörper auftaut.

   2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Kugelkörper mit einem Durchmesser von 5 bis 8 mm verwendet.

   3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das letzte der angewandten Reihe von Sieben eine Maschenöffnung mit einem Durchmesser von 0,063 mm hat.

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   k. Verfahren zur Herstellung von für eine Tierart spezifischen antithymocytären Seren durch Injektion der thymocytären Antigene dieser Art bei einer davon verschiedenen bzw. fremden Tierart, dadurch gekennzeichnet, daß man für die Injektionen die nach Anspruch 1 hergestellten Antigeneverwendet und das bei den immunisierten Tieren gesammelte Serum durch Absorption an einem Polymeren von Glutaraldehyd und Proteinen von Leber und Serum des Antigenspendertieres oder von Lebern und Seren von Tieren der gleichen Art wie der Antigenspender reinigt, wobei die Seren die löslichen Substanzen enthalten, wenn diese die Bildung von hämagglutinanten Antikörpern hätten hervorrufen können.

   5· Verfahren nach Anspruch k, dadurch gekennzeichnet,

   daß das Polymere von Glutaraldehyd und Proteinen von Serum

   Gewichts an 5£iger GlutaraldehydlÖsung

   und Leber unter Verwendung eines Gaa hergestellt ist, das gleich einem Zehntel des nach Dialyse der Proteine von Leber gegen auf pH 7_th gepufferte physiologische Flüssigkeit und der Lösung der Proteine des Serums gegen physiologische Flüssigkeit bestimmten Gesamtgewichts der Proteine von Leber und Serum ist.

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   6. Thymocytäre Antigenextrakte, hergestellt nach einem der Ansprüche 1 bis 3·

   7ο Antlthymocytäre Seren, hergestellt nach einem der Ansprüche h und 5 sowie ausgehend von diesen hergestellte Gamma-Globuline.

   8. Pharmazeutische Mittel für die Veterinärmedizin für die Behandlung autoimmunitärer und entzündlicher Krankkeiten und für die Humanmedizin für die Diagnostik von "Tier"-heterospezifischen Antigenen der leukämischen Zelle, gekennzeichnet durch einen Gehalt an antithymocytären Seren nach Anspruch 7·

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