WO1994006010A1 - Verfahren und vorrichtung zur in-vitro-prüfung von einwirkungen auf biologische strukturen - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur in-vitro-prüfung von einwirkungen auf biologische strukturen Download PDF

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WO1994006010A1
WO1994006010A1 PCT/EP1993/002371 EP9302371W WO9406010A1 WO 1994006010 A1 WO1994006010 A1 WO 1994006010A1 EP 9302371 W EP9302371 W EP 9302371W WO 9406010 A1 WO9406010 A1 WO 9406010A1
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active
biological structure
fluid
biological
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PCT/EP1993/002371
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Inventor
Reinhard Teichmann
Hans-Georg Liebich
Udo Heidrich
Original Assignee
Reinhard Teichmann
Liebich Hans Georg
Udo Heidrich
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Application filed by Reinhard Teichmann, Liebich Hans Georg, Udo Heidrich filed Critical Reinhard Teichmann
Publication of WO1994006010A1 publication Critical patent/WO1994006010A1/de

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for in vitro testing of effects on biological structures according to claims 1 and 41, respectively.
  • antibacterial agents e.g. Antibiotics or
  • Sulfonamides trigger reactions on the skin that are usually not predictable in their course.
  • ingredients are examined from tissues or organs using conventional methods, this is preferably done by mechanical crushing or extraction on mostly dead tissues or organs, after the substance to be tested has been added to the organ exclusively before organ recovery.
  • the invention is based first of all on the knowledge that the known tests mentioned provide scientific results only on individual cells or their components, that is, overarching biological relationships within the organ must be disregarded.
  • the metabolically active performance of the organs is subject to the constant control of higher-level control loops, which have in common the ability to release chemical signaling substances and to induce a specific reaction chain at receptors of organ-specific cells. This is only possible in tissue associations such as organs.
  • tissue cells e.g. Epithelial cells or sessile or solid cells of the connective tissue, mediators acting locally, cf. in detail also below, which, through the mediation of the body's basic fluid at the site of its formation, have a positive or negative influence on the intermediate metabolism of adjacent target cells.
  • the invention is, in particular, to create an impact test that is reliable, yet quick and inexpensive
  • the invention is also based on
  • This release of the mediators from the tissue or organ sample is action-specific and can subsequently be detected by biochemical, enzymatic or immunological analysis.
  • the food / feed components supplied to the lining of the stomach are largely
  • Trigger immune response which in turn triggers the entire gastric digestive cascade.
  • the latter includes in particular an increase in the local secretion of the tissue hormone gastrin, which was isolated in 1964,
  • the gastrin in turn controls the secretion of the gastric juice.
  • the immune response includes immunocellular reaction chains that originate from the T nica mucosa of the antrum pylori, on which intra- and extra-epithelial immune-associated (IA-positive) T cell populations and mast cells in sensitized animals and humans after oral antigen uptake,
  • Rats (Fig. 6), e) soy concentrate, fish meal, ovalbumin and potato as proteins and food and feed ingredients
  • Pigs (Fig. 7), f) soy isolate as a food and feed component in pigs with and without animal immunization (Fig. 8), g) tetanus toxoid
  • the invention is particularly advantageous for diagnostics, e.g. Early detection of diseases of the
  • Lengths caused by active substances e.g. Bronchitis, silicosis, dust lung,
  • Somatostatin and VIP vasoactive intestinal (poly) peptide
  • This release occurs after a surprisingly long exposure time of some 10 minutes.
  • the rinsing fluid can be simply physiological saline (0.9% aqueous NaCl solution).
  • the samples used in the experiments described below were from healthy pig lung tissue to obtain basal values for damaged lung tissue.
  • somatostatin is released from the lung tissue of the pig (here a 2 mm x 2 mm sample) after exposure to physiological saline as a rinsing fluid.
  • the purging process of the lung tissue of the pig (here a 2 mm x 2 mm sample) is examined for released VIP (vasoactive intestinal (poly) peptide) after exposure to physiological saline as a rinsing fluid, it is shown for the first time that this mediator is also occurs in the lungs, whereby an equilibrated system is established for " vTP after only 20 minutes of exposure (in contrast to 40 minutes for somatostatin).
  • VIP vasoactive intestinal (poly) peptide
  • VIP vasoactive intestinal (poly) peptide
  • Burns that are secreted or released from components of the blood plasma e.g. plasma kinins from globulins under the influence of kallikrein
  • components of the blood plasma e.g. plasma kinins from globulins under the influence of kallikrein
  • Lymphokines (mediators of cellular immunity);
  • LEM leukocytic endogenous mediators, leukocytes
  • Tissue hormones especially oligo- and polypeptides such as
  • Glycosaminoglycans such as heparin
  • Oxygen radicals such as oxygen derivative H2O2; biogenic amines such as histamine, serotonin;
  • angiotensins cleavage products of the activated complement with kinin-like, anaphylatoxic and chemotactic activity (eg anaphylatoxin); slow reacting substances; ly sosomal enzymes.
  • the vitality and functionality of the tissue bandages are ensured up to, for example, 12 hours after sampling, so that several different parameters can be recorded under reproducible conditions within one and the same test arrangement within these 12 hours.
  • the invention can be used in particular in numerous fields of pharmacology in the context of clarifying pharmacodynamic mechanisms of action or the toxicological testing of substances or food-induced allergy.
  • the aim of conventional organ cultures is to cultivate different cell types in a natural anatomical relationship to one another, but the organ samples should be max. Do not exceed 2 mm 2 , otherwise necrosis zones will develop inside
  • a method for determining (alone) the metabolism (metabolism conversion) of certain chemicals and active substances, in particular potential carcinogens and mutagens in which a) a culture of an Hwnan liver-cell line is kept in nutrient medium, b) the cell line of the chemical to be tested or exposed to the drug, c) the culture is (somehow) analyzed for the presence of metabolites of the chemical or drug, and d) the metabolites are introduced into
  • liver cell lines which are useful for drug-substance exchange studies and particularly for the selection of potential carcinogens and mutagens; ...
  • Pieces from the stomach wall of rats are incubated with the toxin of a scorpion and their ACh (acetylcholine) release is determined;
  • Prostaglandin PGE2 reduces ⁇ 2 consumption and the 14 CO 2 emissions of 1- 14 C and 6- 14 C-labeled glucose in tissue - samples of the gastric mucosa of rats.
  • Perfusion bath made, which is wholly or partly made of glass or similar transparent material; during such studies it is necessary for the tissue to be immersed in a physiologically balanced solution or other liquid which is exposed to controlled flow through the bath in order to remove waste and other undesirable matter from the bath; it is also necessary that the surface of the liquid be shielded from the ambient air so that the gas content of the liquid can be kept within predetermined values.
  • the aim (s) of the invention is to provide an improved (perfusion) bath in which the fluid level in the bath can be kept substantially constant, even with significant changes in the fluid flow rate into the bath; which has a higher fluid flow rate through the bath than in previously known forms of perfusion baths; which is less susceptible to vibration of the suspended tissue preparation than previously known types of perfusion baths.
  • Testing in active fields according to claim 3 is particularly useful for proteins as a biological structure.
  • proteins regularly have more complex secondary, tertiary and quaternary "structure", which are caused by heating, UV or X-ray radiation or the like radiation (including strong pH changes and detergents) can be destroyed ("denatured").
  • claim 12 bypasses in particular the source of error of conventional diagnostics (cf. above), since the released exposure products can be collected in physiological solution and can be supplied to the analysis immediately after being released. This object is also achieved by the device according to claim 41.
  • the teaching according to claim 53 allows an electric or a magnetic field to be applied to the samples, or to be irradiated with ionizing radiation and I or light, especially since it is known from clinical studies that ointments under light - exposure depending on the duration of exposure and storage period partly are subject to considerable renovations.
  • the device consists of two chambers, a prechamber 1 and a main chamber 2, surrounded by a temperature space 3.
  • a drain - hose 7 is flushing fluid via a hose pump 8
  • the method enables analysis and diagnosis of local functional control loops in biological structures.
  • Samples 4 of the biological structure such as tissue or tissue associations, can be obtained by:
  • biopsy endoscopy, gastroscopy, bronchoscopy, arthroscopy
  • arthroscopy surgical intervention from tissues and organs of the inner or outer surface of the body and / or organs, e.g. the skin, the gastrointestinal tract, the respiratory tract, the urogenital tract, endocrine organs, from nerve tissue, the bone marrow, from lymphatic organs, the pericardium, the placenta or from tumors.
  • the samples After removing any deposits (e.g. food residues, food porridge, dirt, blood, etc.) by rinsing or preparation (organ capsule, connective and supporting tissue, bone fragments), the samples are carefully broken down into small sections and, if necessary, for transport or until transfer to the main chamber 2 stored in a chilled, physiological solution.
  • deposits e.g. food residues, food porridge, dirt, blood, etc.
  • preparation organ capsule, connective and supporting tissue, bone fragments
  • the samples can be stored for up to 12 hours, for example. b) procedural ⁇ en
  • the device Before the start of the test, e.g. 30 min the device with a reference - flushing fluid 5, e.g. a physiological solution, at a constant flow rate (z. B. 0.5 - 0.7 ml I min), controlled by the peristaltic pump 8, rinsed and equilibrated at 37 ° C (pre-run phase A).
  • a reference - flushing fluid e.g. a physiological solution
  • gassing the antechamber 1 causes the oxygen partial pressure
  • pre-chamber 1 through the gasifier 10 other gases
  • Flushing fluid can be supplied (preliminary flow phase A).
  • sample 4 is heated by flushing and gassed
  • Reference - rinsing fluid 5 e.g. physiological solution
  • Reference - rinsing fluid 5 e.g. physiological solution
  • control device 11 replaces the reference rinsing fluid 5 with the test rinsing fluid 6 (time "0").
  • test - rinsing fluid 6 can act on the sample 4 in the main chamber 2.
  • action products are released in sample 4 and can run in the rinsing process within regular time intervals
  • an active field can be created in the main chamber 2 before the sample 4 is rinsed with a rinsing fluid (FIGS. 1 a - c).
  • the device After collecting the test values, the device is rinsed again with reference rinsing fluid 5 (for example physiological solution) and these are collected for a further 10 minutes in order to be able to analyze possible follow-up reactions without test rinsing fluid 6 (follow-up value E. After this rinsing, the device is cleaned with a physiological solution for, for example, 15 minutes (cleaning phase F), a renewed test with another test rinsing fluid 6 can be connected to the identical or a new sample 4.
  • reference rinsing fluid 5 for example physiological solution
  • test values D obtained fractionally during the active substance test, like the rinsing processes of the basic value (C) and the rinsing processes - value for the wake ( ⁇ ) of all biochemical, biophysical, serological, enzymatic , enzyme chemical, immunological or immunobiological or other methods of detection of ingredients from body fluids or from organs are made accessible and exposure products are recorded.
  • histological, histochemical or immunohistochemical examinations can be carried out on the biological structures before and after the action of an active substance and / or an active field and before and after flushing.
  • the method was validated by stimulating isolated organ samples from the gastric mucosa with different animal and vegetable active substances (proteins, antigens and toxins, neurotransmitters) as a test - rinsing fluid.
  • the hormones gastrin and somatostatin were selected in the rinsing process to demonstrate functional reaction processes of gastric digestive processes.
  • basal gastrin release (basal value) gives a constant low value over the entire course of the experiment, which is significantly lower than the hormonal readings induced after stimulation with a test rinsing fluid.
  • NIP nitrophenylacetic acid
  • HOG human gamma globulin
  • somatostatin released on rat gastric mucosa NIP 6 nitrophenylacetic acid (NIP), bound to human gamma globulin (HGG, somatostatin released on rat gastric mucosa;
  • Fig. 11 Actin released gastrin on gastric mucosa of the pig.
  • the invention recognizes for the first time that specific active products are released when vegetable or animal proteins act on a stomach sample and that these can be analyzed qualitatively and quantitatively depending on the duration of the action.
  • a comparable release of gastrin can also be achieved by the action of 10% soy extract solution as a vegetable protein; Fig. 4.
  • FIGS. 4 and 5 show that the method according to the invention makes a distinction between the biological activity for the first time
  • Soy extract and soy flour is possible.
  • This finding is particularly important for the nutrition of animals and humans, especially to avoid disorders and diseases of the gastrointestinal tract, but also with regard to the development of allergies.
  • NIP nitrophenylacetic acid
  • HOG human gamma globulin
  • somatostatin can also be found significantly on gastric mucosa in addition to gastrin, depending on the duration of exposure become ; Fig. 6.
  • Very important for nutrition is the knowledge of the different effects of soy concentrate and potato as vegetable proteins and of fish meal and ovalbumin as animal proteins in dissolved form as different test fluids; Fig. 7.
  • ovalbumin releases significantly more gastrin than soy protein.
  • Fig. 8 shows for the first time that the
  • Gastric mucosa can be measured quantitatively.
  • Tetanus - toxoid as a test - flushing fluid releases gastrin as an active product in the gastric mucosa depending on the duration of exposure; Fig. 9.
  • Actin releases the delayed reaction only after 7.5 minutes of exposure.

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Abstract

Verfahren und Vorrichtung zur in-vitro-Prüfung von Einwirkungen auf Strukturen, vorzugsweise biologische, insbesondere als Analytik und medizinische Diagnostik, Verträglichkeits-, Toxizitäts-, Nebenwirkungs- und Wirksamkeits-Prüfung, gekennzeichnet durch Gewebe oder Gewebe-Verbände, wie Organe oder Organ-Systeme, von Tieren, Menschen und Pflanzen als biologische Strukturen, chemische und/oder physikalische und/oder biologische und/oder sonstige Einwirkungen, Umspülen einer Probe der Struktur mit Spül-Fluid (Flüssigkeit, Gas oder sonstigen druck-isotropen Medium), und Auswerten des Umspül-Ablaufs auf Einwirk-spezifisch in/an der Probe anfallende Einwirk-Produkte, insbesondere Mediatoren wie Cytokine, Transmitter oder Signalstoffe, z.B. Gewebs-Hormone, Biotransformanten.

Description

VERFAHREN und VORRICHTUNG zur IN-VITRO-PRUFUNG von
EINWIRKUNGEN auf BIOLOGISCHE STRUKTUREN
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur in - vitro - Prüfimg von Einwirkungen auf biologische Strukturen nach Anspruch 1 bzw. 41 .
Probanden belastende in - vivo - Provokationstests sind weit verbreitet als Auslösung von latenten, unter Normalbedingungen nicht (oder selten und / oder untypisch) auftretenden Krankheitssymptomen durch kontrollierte Reize, z.B. als
- Hautprobe oder Suchdiät (zur Ermittlung eines Allergens) ,
- Belastungs-EKG,
- Flimmerlicht oder Hyperventilation (in der EEG-Diagnostik) ,
- Dunkelprobe (bei Glaukom).
Herkömmliche serologische und enzymatische Diagnostik von Erkrankungen tierischer oder menschlicher Gewebe oder Organe ist vielfach mit der Fehlerquelle behaftet, daß die zu prüfenden Stoffe eine kurze Halbwertzeit besitzen und sich während der Zirkulation im Blut verändern. Dies gilt vorzugsweise für membrangebundene Enzyme der Leber (z.B. alkalische Phosphatase) oder für den Nachweis von Hormonrezeptoren an Zeil - Oberflächen - Membranen.
Neben Wirk-Stoffen beeinflussen erheblich auch physikalische Felder innere und äußere Gewebe und Organe von Tieren und Menschen.
So ist seit langem bekannt, daß die Haut von Mensch und Tier durch zahlreiche Wirk - Felder strukturell und funktionell positiv und negativ beeinflußt wird und Ozon als zusätzlicher Wirk-Stoff kumulativ negativ wirken kann.
Zusätzlich verabreichte antibakterielle Wirk-Stoffe , z.B. Antibiotika oder
Sulfonamide, lösen an der Haut Reaktionen aus, die meist in ihrem Verlauf nicht vorhersehbar sind.
Werden aus Geweben oder Organen nach herkömmlichen Verfahren Inhaltsstoffe untersucht, so geschieht dies vorzugsweise durch mechanische Quetschung oder Extraktion an meist toten Geweben oder Organen, nachdem der zu prüfende Stoff ausschließlich schon vor der Organgewinnung dem Organ zugefügt wurde.
Wissenschaftlich begründete Ansätze, Tierversuche durch in - vitro - Prüfung zu ersetzen, benutzen seit langem bis heute fast ausschließlich
- Mono - Zellkulturen tierischer oder menschlicher Zellen , z.B. DE-PS 3923279 (Will W. MINUTH ) ,
- subzelluläre Zellorganellen. Die Erfindung beruht zunächst auf der E r k e n n t n i s , daß mit den genannten bekannten Prüfungen wissenschaftliche Ergebnisse allein an Einzelzellen oder deren Bestandteilen gewonnen werden , also übergreifende biologische Zusammenhänge innerhalb des Organs unberücksichtigt bleiben müssen.
Schon die präparatorische Isolation der Einzellzellen oder von deren Bestandteilen vor der eigentlichen Prüfung in einem herkömmlichen in - vitro - System beeinträchtigt die physiologischen Funktionen des jeweiligen biologischen Zellsystems.
Die an Einzelzellen oder subzellulären Bestandteilen gewonnenen Erkenntnisse geben in Einzelfällen gezielte Informationen über spezifische Reaktionen wieder, interzellulär übergreifende Informationen, die Rückschlüsse auf das Verhalten des Gesamtorgans zuließen, müssen aber unberücksichtigt bleiben.
Die mit diesen Verfahren gewonnenen Erkenntnisse sind einseitig, unvollständig und daher für die Gesamtbeurteilung untauglich .
Zelluläre oder interstitielle Interaktionen , wie z.B. lokale intramurale Reflexbögen oder neurokrine Sekretionsmechanismen , bleiben für in-vitro-Prüfungen vollständig unberücksichtigt.
Die stoffwechselaktiven Leistungen der Organe unterliegen nämlich der ständigen Kontrolle übergeordneter Regelkreise, denen gemeinsam ist die Fähigkeit, chemische Signalstoffe abzugeben und an Rezeptoren organspezifischer Zellen eine spezifische Reaktionskette zu induzieren. Dies ist allein in Gewebeverbänden wie Organen möglich.
In Organen geben Gewebszellen, z.B. Epithelzellen oder sessile oder feste Zellen des Bindegewebes, lokal wirkende Mediatoren ab, vgl. im einzelnen auch weiter unten, die unter Vermittlung der Körpergrundflüssigkeit am Ort ihrer Entstehung den intermediären Stoffwechsel anliegender Zielzellen positiv oder negativ beeinflussen.
Sie dienen vor allem der funktionellen Reglung lokaler Stoffwechselleistungen der Zellen und steuern diese teilweise gegenseitig.
Werden diese Zellen aus ihrem natürlichen Verband artifiziell gelöst, so können übergreifende Regelkreise nicht mehr wirksam werden, "realitätsferne" Erkenntnisse zur Funktion von Zellverbände werden vermittelt. Da die herkömmlichen in-vitro-Prüfungen diese erforderlichen physiologische Erhaltung biologisch gewachsener Zeil- und Organsysteme in keiner Weise berücksichtigen und keine geeigneten Verfahren zur Lösung dieser Probleme bekannt sind, besteht seit vielen Jahrzehnten ein dringendes Bedürfnis an neuartigen Prüfungen.
uf abe der Erfindung ist daher die Schaffung einer Prüfung von Einwirkungen, die zuverlässig und trotzdem schnell und wenig aufwendig ist, insbesondere
Tierversuche ersetzt , auch Unsicherheiten der Übertragung ihrer Versuchsergebnisse auf den Menschen vermeidet , und direkten menschlichen Biopsie-Organproben ausführbar ist.
Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe erfolgt zunächst durch das Verfahren nach Anspruch 1.
Die Erfindung beruhtauch auf
Erkenntnissen anhand von Untersuchungen der Erfinder an Menschen sowie Labor- und Versuchstieren (Ratten, Schweinen, Hunden).
Zahlreiche physiologische Vorgänge in Geweben bzw. Organen unterliegen der synergistischen Wirkung von : endokrinen Drüsen , insbesondere für Gewebshormone , exokrinen Drüsen , und
I m m u n System (spezifisch / unspezifisch) ,
das in den Organen der inneren und der äußeren Körperoberfläche , wie Magen-Darm-Trakt und Lunge bzw. Haut , aber auch Harnorganen und Knochenmark, durch chemische und / oder physikalische Einwirkungen lokal angeregt wird,
Einwirk - Produkte , wie Mediatoren , freizusetzen.
Diese Freisetzung der Mediatoren aus der Gewebe- bzw. Organ-Probe ist einwirk - spezifisch und kann nachfolgend durch biochemische, enzymatische oder immunologische Analytik nachgewiesen werden.
Da Vorgänge in unterschiedlichen Organen nach übereinstimmenden Mustern verlaufen, wird nachfolgend als Anwendungsbeispiele repräsentativ nur auf
M a g e n und L u n g e näher eingegangen.
Die der Schleimhaut des Magens zugeführten Nahrungsmittel / Futtermittel - Bestandteile sind weitgehend
Antigene im immunologischen Sinn, so daß sie Mediatoren lokal freisetzen,
die im Antrum des Magens eine
Immunreaktion auslösen, die ihrerseits die gesamte gastrale Verdauungskaskade auslöst.
Letztere umfaßt insbesondere eine Steigerung der lokalen Sekretion des Gewebshormons Gastrin , das bereits 1964 isoliert wurde,
GREGORY et al.,
The constitution and properties oftwo gastrins extractedfrom hog antrat mucosa.
Gut 5, 103 - 117, 1964.
Das Gastrin seinerseits steuert die Sekretion des Magensafts.
Zur Immunreaktion gehören immunzelluläre Reaktionsketten , die von der T nica mucosa des Antrum pylori ausgehen, auf der intra- und extra epitheliale immunassoziierte (IA-positive) T-Zell - Populationen und Mastzellen bei sensibilisierten Tieren und Menschen nach peroraler Antigen-Aufnahme,
Mediatoren freisetzen, insbesondere
Somatostatin , Prostaglandine und andere Mediatoren, wie Histamin, Leukotriene, Interleukine. Die Erfinder haben für die Erfassung der einwirk - spezifischen Freisetzung des Gewebshormons Gastrin und des Mediators Somatostatin aus der Magen - Schleimhaut von Tier und Mensch nach Stimulation durch Wirkstoff (Antigen) - Lösung in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung (vgl. unten) und
Auswertung der fraktioniert gesammelten Umspül- Abläufe mit Radioimmunoassays insbesondere die folgenden zu prüfenden
Wirkstoffe verwendet (vgl. auch weiter unten die jeweils einschlägigen Figuren) :
a) Herzmuskelgewebe und Fischmehl als tierisches Protein bei Hunden (Fig. 3) , b) Soja extrakt ( 10% ) als pflanzliches Protein und Nahmngs- und Futtermittelbestandteil bei Schweinen (Fig. 4) . c) Soja mehl als Nahmngs- und Futtermittelbestandteil bei Schweinen (Fig. 5) , d) Nitrophenylessigsäure (NIP) , gebunden an humanes Gammaglobulin (HGG) , als synthetisches Protein bei
Ratten (Fig. 6) , e) Soja konzentrat, Fischmehl, Ovalbumin und Kartoffel als Proteine und Nahrungs- und Futtermittelbestandteile bei
Schweinen (Fig. 7) , f) Soja isolat als Nahrungs- und Futtermittelbestandteil bei Schweinen mit und ohne Immunisierung der Tiere (Fig. 8) , g) Tetanus - Toxoid bei
Menschen (Fig. 9, 10) , h) Actin als Muskelbestandteil ( = Fleisch) und Protein bei Schweinen (Fig. 11) .
Der Nachweis immunologischer Stimulierung gastraler Verdauungsmechanismen bietet eine völlig neuartige Sicht von Physiologie und Pathophysiologie der Verdauungstätigkeit bei Mensch und Tier.
Mit der Stimulierung der gastralen Immunmechanismen durch z.B.
Nahrungsmittel-Antigene ergibt sich somit eine völlig neuartige , in größter Breite anzuwendende Möglichkeit zur Prüfung von Wirk-Stoffen, die prophylaktisch oder therapeutisch bei Störungen und Krankheiten im Magen-Darm-Trakt von Mensch und Tier wirken. Zu den Ansprüchen 17 , 19 insbesondere :
Die Erfindung ist besonders vorteilhaft für die Diagnostik, z.B. Früherkennung, von Krankheiten der
L u n g e , bedingt durch Einwirk-Stoffe ( vgl. Anspruch 24 ), z.B. Bronchitis, Silikose, Staublunge,
aufgrund der erfindungsgemäßen Erkenntnis der Freisetzung von
Mediatoren , z.B. der Gewebshormone
Somatostatin und VIP ( vasoaktives intestinales (Poly-) Peptid )
Diese Freisetzung erfolgt nach überraschend langer Einwirk-Dauer von einigen 10 min .
Das Spül-Fluid kann denkbar einfach physiologische Kochsalzlösung sein ( 0,9 % wäßrige NaCl-Lösung ) .
Die bei den im folgendem beschriebenen Versuchen benutzten Proben stammten von gesundem Lungengewebe des Schweins, um Basalwerte für geschädigtes Lungengewebe zu gewinnen.
Tabelle 1 :
belegt erstmalig, daß aus Lungengewebe des Schweins ( hier 2 mm x 2 mm große Probe ) nach Einwirkung physiologischer Kochsalzlösimg als Spül-Fluid Somatostatin freigesetzt wird.
Überraschend wird erst nach 40 min Einwirk-Dauer ein äquilibriertes System erreicht, von dem aus nachfolgend Prüf-Spül-Fluid verwendet werden kann.
Tabelle 2 :
Wird der Umspül- Ablauf von Lungengewebe des Schweins ( hier 2 mm x 2 mm große Probe ) nach Einwirkung physiologischer Kochsalzlösung als Spül-Fluid auf freigesetztes VIP ( vasoaktives intestinales (Poly-) Peptid ) untersucht, so zeigt sich erstmalig, daß dieser Mediator auch in der Lunge auftritt, wobei sich für "vTP bereits nach 20 min Einwirk-Dauer ( im Gegensatz zu 40 min bei Somatostatin ) ein äquilibriertes System einstellt.
TABELLE 1 :
Zeitabhängige Freisetzung von Somatostatin bei Einwirkung von physiologischer Kochsalzlösung auf 2 mm x 2 mm große Probe aus Lungengewebe des Schweins
Figure imgf000011_0001
TABELLE 2 :
Zeitabhängige Freisetzung von VIP ( vasoaktives intestinales (Poly-) Peptid ) bei Einwirkung physiologischer Kochsalzlösung auf 2 mm x 2 mm große Probe aus Lungengewebe des Schweins
Figure imgf000011_0002
Mediatoren generell sind in winzigen Mengen hochspezifische chemische Substanzen,
die von verschiedenen Geweben bzw. Zellen des Organismus produziert werden, regelmäßig insbesondere bei pathologischen Prozessen, insbes.
Immun - (allergischen) Reaktionen / Antigen-Antikörper-Reaktionen ,
Entzündungen,
Wundheilungsvorgängen,
Schmerzauslösungen,
Verbrennungen, sezerniert oder aus Bestandteilen des Blutplasmas freigesetzt werden (z.B. Plasmakinine aus Globulinen unter Einfluß von Kallikrein) und auf charakteristische Weise entweder in der Nähe ihrer Produktionsstätte oder entfernt wirksam werden (nach Verteilung über das Blut) ;
insbesondere gehören dazu :
Neurotransmitter ;
Kinine (Mediatoren humoraler Immunität) ;
Prostaglandine und Leukotriene (Lipid-Mediatoren) ;
Lymphokine (Mediatoren zellulärer Immunität) ;
LEM (leukocytäre endogene Mediatoren, Leukocyten) , die auch als Wundhormone angesehen werden können ;
Gewebshormone, insbes. Oligo- und Polypeptide wie
Prostaglandine, Thromboxane, PAF ;
Glykosaminoglykane wie Heparin ;
Sauerstoff-Radikale wie Sauerstoffderivat H2O2 ; biogene Amine wie Histamin, Serotonin ;
Angiotensinogen ;
Angiotensine, Spaltprodukte des aktivierten Komplements mit kininartiger, anaphylatoxischer und chemotaktischer Wirksamkeit (z.B. Anaphylatoxin) ; slow reacting substances ; ly sosomale Enzyme. Vitalität und Funktionsfähigkeit der Gewebeverbände sind erfindungsgemäß bis zu z.B. 12 h nach Probenentnahme gesichert, so daß mehrere unterschiedliche Parameter unter reproduzierbaren Bedingungen innerhalb ein und derselben Prüfanordnung innerhalb dieser 12 h erfaßt werden können.
Entscheidend bleibt, daß durch die gezielte Anwendung der Erfindung zur Analyse und Diagnostik von Einwirkungen innere und äußere Einflüsse auf biologische Strukturen, wie auf lebende Gewebe und Organe, simuliert und deren Reaktionsabläufe und Einwirk-Produkte in einem in-vitro- Verfahren experimentell nachvollzogen, analysiert, diagnostiziert und geprüft werden können.
Allgemein kann die Erfindung insbesondere aufzahlreichen Gebieten der Pharmakologie im Rahmen der Abklärung pharmakodynamischer Wirkmechanismen oder der toxikologischen Prüfung von Stoffen oder der nahrungsmittelinduzierten Allergie eingesetzt werden.
Zwar sind Organ - Kulturen für sich bereits bekannt geworden, jedoch ebenfalls nachteilig.
Verfahren sowohl nach Explantation unter Verwendung fester Medien, Plasmagerinsel-Methode, Agar-Methode ,
als auch nach Explantation unter Verwendung flüssiger Medien, Celluloseacetat-Stützgeflecht-Methode, Metallgitter-Methode , Explantation in Petrischale,
reduzieren Vitalität und Funktionsfähigkeit der Organproben nachhaltig.
Bei sämtlichen Techniken zeigen sich schon sehr bald schneller Strukturzerfall bzw. Funktionsverlust oder Funktionsänderungen,
Ziel herkömmlicher Organ-Kulturen ist es, verschiedene Zellarten in natürlicher anatomischer Beziehung zueinander zu kultivieren, die Organproben sollten dabei jedoch max. 2 mm2 nicht überschreiten, da sonst im Inneren Nekrosezonen entstehen,
Bei herkömmlichen Organ-Kulturen werden die Gewebeproben nur mit einem Kulturmedium benetzt oder sie sind nur in dieses eingelegt. Die Stoffwechselleistung ist daher aufgrund mangelnder Sauerstoff- und Substrat- Versorgung völlig unzureichend.
Vielfach ist ein schneller autolytischer Zerfall der Zellen nachzuweisen.
Insbesondere hochaktive Zellen (Nervenzellen, hormonbildende Zellen) stellen den Stoffwechsel spontan ein und sterben in kurzer Zeit ab. Schließlich ist bekanntgeworden folgender Stand der Technik, der allenfalls Nicht- in-vitro- Untersuchungen an Gewebe-Stücken betrifft, bei nur direkter Einwirkung, von einer Umspülung der Probe ganz zu schweigen.
DE 31 52 113 (THE WISTER INSTITUTE OF ANATOMY AND BIOLOGY ) :
Aus menschlichem Hepatom abgeleitete Zeil-Linie, Verfahren zu ihrer Herstellung und Verwendung hierfür
Anspruch 4
Verfahren zum Bestimmen ( a l l e i n ) der Metabolisierung ( Stojfwechselumwandlung ) bestimmter Chemikalien und Wirkstoffe, insbesondere potentieller Karzinogene und Mutagene , bei dem a) eine Kultur einer Hwnan-Leber - Zeil - Linie in Nährmedium gehalten, b) die Zeil-Linie der zu testenden Chemikalie oder dem Wirkstoff ausgesetzt , c) die Kultur ( i r g e n d w i e ) analysiert wird auf die Gegenwart von Metaboliten der Chemikalie oder des Wirkstoffs und d) die Metaboliten eingeführt werden in
Kulturen anderer Säugetier- Zellen zur Bestimmung ihrer Mutagenität .
S. 3 , Abs. 2 ff.
"Ziele der Erfindung" ( sind )
stabile Leber- Zeil - Linien zu produzieren, die brauchbar sind für Wirkstoff- Stoff Wechselstudien und besonders zur Auslese potentieller Karzinogene und Mutagene ; ...
Leber- Zeil - Linien zu produzieren, die brauchbar sind bei der Erzeugung von Hepatitis B -Viruskomponenten, woraus Vakzine hergestellt werden können ; ... ein Verfahren zum Ableiten von menschlichen Leber- Zeil - Linien , brauchbar zur Auslese von Wirkstoffen und insbesondere potentiellen Karzinogenen und Mutagenen, zum Züchten von Viren und zum Herstellen von Vakzinen ein Verfahren zur Erzeugung einer Hepatitis B - akzine unter Verwendung der Leber-Zeil-Linien. Chemical Abstracts 108 (15) : 126332b ; Cunha-Melo. J.R. etal.; Braz. J. Med. Biol. Res. 20 (1987) 393 - 401 :
Stücke ( "slices" ) aus der Magenwand von Ratten werden mit dem Toxin eines Skorpions inkubiert, und deren ACh (Acetylcholin) - Freisetzung wird bestimmt ;
Chemical Abstracts 106 (11) : 82135s ; Kimura, Robert E. ; Pediatr. Res. 21 (1987) 214 - 217 :
Oxidation von Glutamin anhand von Jejunum - Gewebe - Proben ;
Chemical Abstracts 101 (19) : 169559d; Gavino, Victor C. et al.; Arch. Biochem. Biophys. 233 (1984) 741 -747 :
Einfluß halogenierter Kohlenwasserstoffe auf die Ethan - und Pentan - Freisetzung aus intestinalen Gewebe - Proben ;
Chemical Abstracts 94 (17) : 132773e; Rainsford, K.D.; Agents Actions 10 (1980) 520 - 521 :
Prostaglandin PGE2 vermindert den θ2-Verbrauch und den 14Cθ2-Ausstoß aus 1-14C und 6-14C markierter Glucose in Gewebe - Proben der Magenmukosa von Ratten . Chemical Abstracts 115 (13) : 129485] ; Fisher, R. etal.;
Adv. Exp. Med. Biol., 283 (Biol. React. Intermed. 4), 717- 24 (1991) :
Metabolismus von Dichlorbenzolen bei kultivierten Leber - Stücken ( "süces" ) ;
Chemical Abstracts 112 (13) : 113 719r; Sano, Mitsuaki; Tappel, AI. L.; J. Agnic. Food Chem. 38 (1990) 437 - 441
Einfluß von halogenierten Kohlenwasserstoffen auf Leber - Stücke ( "slices" ) ; ggf. auch
Herz - , Nieren - , Hoden - , Lungen - und Milz - Stücke ( "slices" )
Chemical Abstracts 109 (15) : 123956t ; Stefaniάk, M. S. etal; Proc. West. Pharmacol. Soc. 31 (1988) 149 - 151 :
Toxizität von Acrolein bei Ratten - Lungen - Stücken ( "slices" ) ;
Chemical Abstracts 101 (21) : 185315b; Freeman, Bruce A. ; 'Neil, John J.; EHP, Environ. Health. Perspect. 56 (1984) 51 - 60
bei toxikologischen Untersuchungen
Studium des Lungen- Metabolismus an Stücken ( "slices" ) von Lungengewebe ; DE 32 11 789 (RES -DEL Group Ltd. ) :
S. 4 , Abs. 2
Untersuchungen von in-vitro gehaltenem menschlichen und tierischen Gewebe werden in einem
Perfusions-Bad vorgenommen, das insgesamt oder teilweise aus Glas oder ähnlichem transparentem Material hergestellt ist ; während derartiger Untersuchungen ist es erforderlich, daß das Gewebe in physiologisch ausgeglichener Lösung oder anderer Flüssigkeit eingetaucht ist, die gesteuerter Strömung durch das Bad ausgesetzt ist, damit Abfallstoffe und andere unerwünschte Materie aus dem Bad abgeführt werden ; es ist auch erforderlich, daß die Oberfläche der Flüssigkeit von der Umgebungsluft abgeschirmt wird, damit der Gasgehalt der Flüssigkeit innerhalb vorbestimmter Werte gehalten werden kann.
S. 4 , Abs. 4 , S. 5 , Abs. 1 , 2 :
"Ziel (e) der Erfindung" (sind), ein verbessertes (Perfusions-) Bad zu schaffen, bei dem der Fluidpegel im Bad im wesentlichen konstant gehalten werden kann, und zwar auch bei erheblichen Änderungen der Fluidströmungsrate in das Bad hinein ; das eine höhere Fluidströmungsrate durch das Bad hindurch aufweist als bei bisher bekannten Formen von Perfusions-B dern ; das weniger anfällig für eine Vibration der suspendierten Gewebepräparation ist als bisher bekannte Arten von Perfusions-Bädern.
Abgesehen von den offensichtlichen Erfordernissen ist sehr schwierig die Reinigung der Fluidströmung-Regelorgane, gerade nach Verwendung schleimhaltige Perfusionslösungen oder infektiösen Reagentien. Erfindungsgemäß ist dagegen gesichert,
Einwirkungen in Abhängigkeit von der Einwirk-Dauer an lebenden Geweben und Organen zu prüfen und deren Einwirk-Produkte durch gewebe-schondende Spülvorgänge in zeitlicher Abfolge zu analysieren bzw. zu diagnostizieren.
Darüber hinaus werden durch Aktivierung organspezifischer Stoffwechselleistungen der Gewebe oder der Organe spezifische Einwirk-Produkte freigesetzt, die bei herkömmlicher Kultur garnicht oder nur unspezifisch aus Zellfragmenten freigesetzt werden.
Die Prüfung in Wirk - Feldern gemäß Anspruch 3 ist besonders zweckmäßig bei Proteinen als biologischer Struktur.
Proteine besitzen nämlich außer einer Primär- "Struktur" regelmäßig komplexere Sekundär - , Tertiär - und Quartär - "Struktur", die durch Erhitzung, UV - oder Röntgen - Strahlung od. dgl. Strahlung (auch starke pH-Wert - Änderungen und Detergentien) zerstört ( "denaturiert" ) werden können.
Eine derartige "Denaturierung" führt zu völlig veränderten physikalischen und chemischen Eigenschaften des Proteins
(z.B. als Gerinnung erkennbar) und auch zum Verlust seiner biologischen Aktivität.
Die Lehre des Anspruchs 12 umgeht insbesondere die Fehlerquelle herkömmlicher Diagnostik (vgl. oben) , da die freigesetzten Einwirk-Produkte in physiologischer Lösung aufgefangen und unmittelbar nach Freisetzung der Analyse zugeführt werden können. Die erfindungsgemäße Lösung dieser Aufgabe erfolgt auch durch die V o r ri ch t u ng nach Anspruch 41 .
Ein seit langem für die Untersuchung von Geweben, insbesondere des Magen-Darm-Trakts, verwandtes
Zwei-Kammer-System, bei dem ein Gewebestück von zwei getrennten Seiten umspült wird,
hat sich allenfalls für transmurale Potentialmessungen oder H+ -Messung bewährt,
für andersartige Messungen also, z.B. der Freisetzung von Mediatoren, nachweislich als ungeeignet erwiesen,
Die Lehre nach Anspruch 53 gestattet, ein elektrisches oder ein magnetisches Feld um die Proben anzulegen, oder auch mit ionisierender Strahlung und I oder Licht zu bestrahlen, zumal aus klinischen Untersuchungen bekannt ist, daß gerade Salben unter Licht - Einwirkung in Abhängigkeit von Einwirk-Dauer und Lagerdauer z.T. erheblichen Umbauvorgängen unterliegen.
Diese Vorgänge können erfindungsgemäß erstmalig experimentell überprüft werden.
Anhandder Z e i ch n u n g wird die Erfindung beispielsweise näher erläutert. Es zeigen :
Fig. 1 eine erfindungsgemäße Vorrichtung ,
Fig. la - c die Vorrichtung von Fig. 1 mit angelegten Wirk-Feldern,
Fig. 2 den Verfahrens - Ablauf in der Vorrichtung von Fig. 1 ,
Fig. 3 - 11 mit der Vorrichtung von Fig. 1 gewonnene Meßwerte , vgl. die Legende der einzelnen Figuren.
Die Vorrichtung besteht aus zwei Kammern, einer Vorkammer 1 und einer Hauptkammer 2, umgeben von einem Temperatur-Raum 3.
In der Hauptkanvner 2 werden Proben 4 ( = Gewebe und Gewebeverbände wie Organe) von über einen Zufuhr - Schlauch 12 zugeführtem
Referenz - Spül-Fluid 5 bzw. Prüf- Spül-Fluid 6 umspült.
Über einen Ablauf - Schlauch 7 wird Spül-Fluid über eine Schlauchpumpe 8 einem
Fraktions-Sammler 9 zugeführt.
Anfallende Einwirk-Produkte ( = Prüf werte) können nachfolgend verschiedenen Nachweisverfahren unterworfen werden (vgl. unten).
Das Verfahren ermöglicht Analyse und Diagnostik lokaler fiinktioneller Regelkreise in biologischen Strukturen.
a) Präparation der Organproben
Proben 4 der biologischen Struktur, wie Gewebe oder Gewebsverbände, können gewonnen werden durch :
Gewebeentnahme nach Tötung der Tiere, an Schlachthofmaterial oder bei der Sektion, Biopsie (Endoskopie, Gastroskopie, Bronchoskopie, Arthroskopie) oder operativen Eingriff aus Geweben und Organen der inneren oder äußeren Körperoberfläche und /oder Organen , z.B. der Haut, des Magen -Darm - Trakts, des Atmungs-Trakts, des Urogenital-Trakts, endokriner Organe, aus Nervengewebe, dem Knochenmark, aus lymphatischen Organen, der Fruchthüllen, der Plazenta oder aus Tumoren .
Nach Entfernung möglicher Auflagerungen (z.B. Futterreste, Nahrungsbrei, Verschmutzungen, Blut etc.) durch Spülung oder Präparation (Organkapsel, Binde - und Stützgewebe, Knochensplitter) werden die Proben schonend in kleine Teilstücke zerlegt und ggf. zum Transport oder bis Überführung in die Hauptkammer 2 in einer gekühlten, physiologischen Lösung gelagert.
Die Lagerdauer der Proben kann bis zu z.B. 12 h betragen. b) Verfah ~en
Vor Prüfbeginn wird für eine Dauer von z.B. 30 min die Vorrichtung mit einem Referenz - Spül-Fluid 5, z.B. einer physiologischen Lösung , bei konstanter Durchflußmenge (z. B. 0,5 - 0,7 ml I min) , gesteuert durch die Schlauchpumpe 8 , durchspült und bei 37 °C äquilibriert (Vorlaufphase A).
Gleichzeitig werden durch Begasung der Vorkammer 1 der Sauerstoff- Partialdruck
(pÖ2 ) und der Kohlendioxid - Partialdruck (pCÖ2 ) des Referenz - Spül-Fluid 5
(pH-Wert konstant zwischen 7,35 - 7,40) durch Carbogen - Begasung
(95 % 02 unά $ % COl ) (ßegaser 10) eingestellt und während des gesamten
Versuches kontrolliert (Sauerstoff- Partialdruck pO_\ 260 - 360 Torr,
Kohlendioxid - Partialdruck pCO^ 16 - 20 Torr).
Zusätzlich können der Vorkammer 1 über den Begaser 10 andere Gase dem
Spül-Fluid zugeführt werden (Vorlaujphase A).
Nachfolgend erfolgen Einbringen und Feststellen der Probe 4
(Probengröße max. 5x 5 mm) in der Hauptkammer 2.
Im weiteren wird die Probe 4 durch Umspülung mit erwärmtem und begastem
Referenz - Spül-Fluid 5 (z.B. physiologischer Lösung) (siehe oben) für weitere 20 min äquilibriert (Äquilibrierungsphase B ).
Daran schließt sich für weitere 20 min die Sammelphase für den Basalwert (C ) an , während der die Probe allein von einem Referenz - Spül-Fluid 5 umspült wird.
Nach dieser Phase wird durch das Steuer - Gerät 11 das Referenz - Spül-Fluid 5 durch das Prüf - Spül-Fluid 6 ersetzt (Zeitpunkt "0").
Das Prüf - Spül-Fluid 6 kann in der Hauptkammer 2 auf die Probe 4 einwirken.
Durch spezifische Reaktion werden Einwirk - Produkte in der Probe 4 freigesetzt und können im Umspül - Ablauf innerhalb regelmäßiger Zeitabstände
(z.B. von 2,5 min bis z.B. 10 min ) fraktioniert gesammelt werden
(Fraktions - Sammler 9) (Einwirk-Dauer und Prüf werte D).
Zusätzlich kann vor Umspülung der Probe 4 mit einem Spül-Fluid ein Wirk-Feld in der Hauptkammer 2 angelegt werden (Fig. la - c).
Nach Sammeln der Prüf werte wird die Vorrichtung abermals mit Referenz - Spül-Fluid 5 (z.B. physiologischer Lösung) gespült und diese für weitere 10 min gesammelt, um mögliche Nachlaufreaktionen ohne Prüf - Spül-Fluid 6 analysieren zu können (Nachlaufwert E . Nach dieser Spülung wird mit einer physiologischen Lösung die Vorrichtung für z.B. 15 min gereinigt (Reinigungsphase F), eine erneute Prüfung mit einem anderen Prüf- Spül-Fluid 6 kann an der identischen oder einer neuen Probe 4 angeschlossen werden.
Die während der Wirk-Stoff- Prüfung fraktioniert gewonnenen Umspül - Abläufe (Prüfwerte D) können ebenso wie die Umspül - Abläufe des Basάlwerts (C ) und der Umspül - Abläufe - Wert für den Nachlauf (Ε) sämtlichen biochemischen, biophysikalischen, serologischen, enzymatischen, enzymchemischen, immunologischen oder immunbiologischen oder anderen Nachweisverfahren von Inhaltsstoffen aus Körperflüssigkeiten oder aus Organen zugänglich gemacht und Einwirk - Produkte erfaßt werden.
Zusätzlich können histologische, histochemische oder immunhistochemische Untersuchungen an den biologischen Strukturen vor und nach Einwirkung eines Wirk-Stcffs und /oder eines Wirk-Felds und vor und nach Umspülung durchgeführt werden.
c) Validierung (Gültigkeitsüberprüfung) des Verfahrens
Die Validierung des Verfahrens erfolgte durch Stimulation isolierter Organproben aus der Magen-Schleimhaut mit unterschiedlichen tierischen und pflanzlichen Wirk-Stoffen (Proteinen, Antigenen und Toxinen, Neurotransmittern) als Prüf - Spül-Fluid.
Dabei wurden im Umspül -Ablauf die Hormone Gastrin und Somatostatin zum Nachweis funktioneller Reaktionsabläufe gastraler Verdauungsprozesse gewählt.
Die Validierung der basalen Gastrin-Freisetzung (Basalwert) ergibt einen über den gesamten Versuchsablauf konstant niedrigen Wert, der deutlich unter den nach Stimulation mit einem Prüf- Spül-Fluid induzierten hormoneilen Meßwerten liegt.
Nach Stimulation mit einem Prüf- Spül-Fluid besitzen
Proben mit niedrigeren Basάlwerten absolut nur eine geringe Steigerung der Gastrin-Freisetzung,
Proben mit erhöhten Basalwerten nach antigener Stimulation mit Prüf- Spül-Fluid hingegen setzen, absolut gesehen, deutlich mehr Hormon frei. Im einzelnen zeigen in Abhängigkeit von der Einwirk-Dauer bei Einwirkung von :
Fig. 3 Herzmuskelgewebe bzw. Fischmehl auf Magen-Schleimhaut des Hunds freigesetztes Gastrin ;
Fig. 4 Soja extrakt (10% iger) - Lösung auf Magen-Schleimhaut des Schweins freigesetztes Gastrin ;
Fig. 5 Soja mehl (unbehandeltem) als Lösung auf Magen-Schleimhaut des Schweins freigesetztes Gastrin ;
Fig. 6 Nitrophenylessigsäure (NIP) , gebunden an humanes Gammaglobulin (HGG auf Magen-Schleimhaut der Ratte freigesetztes Somatostatin ;
Fig. 7 Soja konzentrat bzw. Fischmehl bzw. Ovalbumin bzw. Kartoffel auf Magen-Schleimhaut des Schweins freigesetztes Gastrin ;
Fig. 8 Soja isolat auf Magen-Schleimhaut des Schweins freigesetztes Gastrin ;
Fig. 9 Tetanus - Toxoid auf Magen-Schleimhaut des Menschen freigesetztes Gastrin ;
Fig. 10 Tetanus - Toxoid auf Magen-Schleimhaut des Menschen freigesetztes Somatostatin ;
Fig. 11 Actin auf Magen-Schleimhaut des Schweins freigesetztes Gastrin . Durch die Erfindung wird erstmalig erkannt, daß bei Einwirkung von pflanzlichen bzw. tierischen Proteinen auf eine Magen-Probe spezifische Wirkungsprodukte freigesetzt werden und diese in Abhängigkeit von der Einwirk-Dauer qualitativ und quantitativ analysiert werden können.
Fig. 3 zeigt, daß durch Einwirkung von Herzmuskelgewebe bzw. Fischmehl in gelöster Form als Prüf - Spül-Fluid aus der Magen-Schleimhaut des Hundes Gastrin freigesetzt wird, und zwar mit einem Maximum nach einer Einwirk-Dauer von 5 min im Spül-Fluid nachgewiesen werden kann ( "pg" = Pikogramm = 10"12 g ) .
Dabei wurde überraschend gefunden , daß diese beiden tierischen Proteine quantitativ unterschiedlich Gastrin freisetzen ; das Prüf - Spül-Fluid mit Herzmuskelgewebe setzt gegenüber dem Prüf - Spül-Fluid mit Fischmehl fast die fünf-fach größere Menge an Gastrin frei.
Eine vergleichbare Freisetzung von Gastrin kann auch durch die Einwirkung von 10% iger Soja extrakt - Lösung als pflanzliches Protein erreicht werden ; Fig. 4 .
Am Beispiel der Magen-Schleimhaut des Schweins kann nachgewiesen werden, daß freigesetztes Gastrin nach etwa 10 min Wirkdauer aufwerte des Basalniveaus zurückfällt.
Verwendet man anstelle 10% iger Sojaextrakt - Lösung
Soja mehl (unbehandeltes) als Lösung , Fig. 5 ; so wird an der Magen-Schleimhaut des Schweins Gastrin nur innerhalb der ersten
2,5 min freigesetzt, dann tritt eine signifikante Hemmung der Freisetzung dieses
Hormons ein. Erst im Nachlauf ist ein erneuter Anstieg zu erkennen.
Der unmittelbare Vergleich von Fig. 4 und 5 zeigt, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erstmalig eine Unterscheidung der biologischen Wirksamkeit zwischen
Soja extrakt und Soja mehl möglich ist.
Diese Erkenntnis ist für die Ernährung von Tier und Mensch, insbesondere zur Vermeidung von Störungen und Erkrankungen des Magen-Darm-Trakts, aber auch im Hinblick auf die Ausbildung von Allergien, besonders wichtig.
Bei Einwirkung von Nitrophenylessigsäure (NIP) , gebunden an humanes Gammaglobulin (HGG), als synthetisches Protein als Prüf - Spül-Fluid kann an der Magen-Schleimhaut der Ratte neben Gastrin signifikant auch Somatostatin als Einwirk-Produkt in Abhängigkeit von der Einwirk-Dauer festgestellt werden ; Fig. 6 . Sehr wichtig für die Ernährung ist die Erkenntnis der unterschiedlichen Einwirkung von Soja konzentrat und Kartoffel als pflanzlichen Proteinen und von Fischmehl und Ovalbumin als tierischen Proteinen in gelöster Form als unterschiedliche Prüf - Spül-Fluids ; Fig. 7.
Auch hier wird erstmalig nachgewiesen, daß die verschiedenen Proteine in ganz unterschiedlicher zeitlicher Abfolge und mit unterschiedlicher Intensität an der Magen-Schleimhaut des Schweins Gastrin freisetzen.
So wird nach 2,5 min Einwirk-Dauer durch Ovalbumin deutlich mehr Gastrin freigesetzt als durch Soja - Protein.
Werden Schweine vor Fütterung mit Soja gegen dieses pflanzliche Protein sensibilisiert, so wird die Einwirkung von Soja auf die Freisetzung von Gastrin aus der Magen-Schleimhaut deutlich verstärkt.
Fig. 8 belegt erstmalig, daß die
Futttermittel - abhängige Freisetzung von Gastrin durch die Erfindung direkt an der
Magen-Schleimhaut quantitativ gemessen werden kann.
Auch Tetanus - Toxoid als Prüf - Spül-Fluid setzt in der Magen-Schleimhaut des Menschen Gastrin als Einwirk-Prodükt in Abhängigkeit von der Einwirk-Dauer frei ; Fig. 9 .
Überraschend ist hierbei, daß nach Absetzen des Prüf-Fluids noch für längere Zeit im Nachlauf Gastrin nachgewiesen werden kann, im Gegensatz zum freigesetzten Somatostatin, das während der Nachlauf phase beinahe wieder Ausgangswerte erreicht ; Fig. 10 .
Verwendet man nur 0,003% Actin in gelöster Form als Prüf - Spül-Fluid, reicht diese geringe Protein-Menge bereits aus, aus der Magen-Schleimhaut des Schweins Gastrin in erheblicher Menge freizusetzen ; Fig. 11 .
Gegenüber anderen Prüf-Fluids setzt durch Actin die Freisetzung dagegen verzögert erst nach 7,5 min Einwirk-Dauer ein.

Claims

ΔNSPRUCHE 1. V e r f ah r en zur in - vitro - Prüfung
- von Einwirkungen
- auf Strukturen , vorzugsweise biologische ,
- insbesondere als
- Analytik und
- medizinische Diagnostik ,
- Verträglichkeits -, Toxizitäts -, Nebenwirkungs - und Wirksamkeits - Prüfung ,
gekennzeichnet durch
Gewebe oder
Gewebe - Verbände , wie Organe oder Organ - Systeme , von
Tieren, Menschen und Pflanzen als biologische Strukturen ,
chemische und / oder physikalische und /oder biologische und /oder sonstige
Einwirkungen ,
Umspülen einer Probe der Struktur mit
Spül - Fluid ( Flüssigkeit, Gas oder sonstigem druck-isotropen Medium ) , und
Auswerten des Umspül - Ablaufs auf Einwirk-spezifisch in /an der Probe anfallende Einwirk - Produkte , insbesondere
Mediatoren wie Cytokine , Transmitter oder Signalstoffe , z.B. Gewebs-Hormon Biotransformanten .
2. Verfahren nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch
- Wirk - Stoffe und / oder
- pH - Wert - Änderung
- als chemische Einwirkungen.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 , gekennzeichnet durch
- Wirk - Felder wie
- mechanische ,
- Wärme - ,
- elektrische / magnetische ,
- Strahlungs - , z.B. UV -, Mikrowellen - und Röntgen - , Felder
- als physikalische Einwirkungen.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche , gekennzeichnet durch
- Mikroorganismen wie
- Viren / Viroide,
- Bakterien,
- Protozoen,
- Hefen,
- niedere Algen und
- Pilze,
- als biologische Einwirkungen.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche , gekennzeichnet durch
- Reize wie Stress / Schock
- als sonstige Einwirkungen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 5 , gekennzeichnet durch
- Einwirkung
- vor Umspülen der Probe.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 5 , gekennzeichnet durch
- Einwirkung
- während Umspülen der Probe.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 5 , gekennzeichet durch
- Einwirkung
- durch stehendes Fluid und
- nachfolgendes Umspülen der Probe.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8 , gekennzeichnet durch
- Referenz - Spül - Fluid
- vor / nach Einwirkung.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8 , gekennzeichet durch
- Prüf - Spül - Fluid
- als / bei und nach Einwirkung.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8 , gekennzeichnet durch
- fraktioniertes Sammeln von Emwirk-Produkten im Umspül-Ablauf
- vor , während und nach Einwirkung.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche , gekennzeichnet durch
- physiologische Flüssigkeit
- als Spül - Fluid.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 11 , gekennzeichnet durch
- Körperflüssigkeit
- wie
- Blut,
- Lymphe,
- Harn,
- Speichelflüssigkeit,
- Magensaft,
- Dünndarmsaft,
- Galle,
- Pankreassaft,
- Pansensaft,
- fetales Fruchtwasser ,
- Gelenkflüssigkeit,
- Liquor cerebrospinalis ,
- Aszites,
- Zystenflüssigkeit,
- Lungenwasser,
- Rippenfellwasser
- als Spül - Fluid.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 , gekennzeichnet durch - die Wirk - Stoffe
a. - Lebensmittel, Futtermittel , b. - Inhaltsstoffe von
- Lebensmitteln und Futtermitteln , c. - Zusatzstoffe
- wie Farbstoffe, Konservierungsstoffe,
- insbesondere in
- Lebensmitteln und Futtermitteln , d. - Fremdstoffe
- wie Rückstände von
- Extraktionsverfahren, Pflanzenbehandlungsmitteln, Arzneimitteln,
- in Lebensmitteln und Futtermitteln .
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 , gekennzeichnet durch - die Wirk - Stoffe
a. - Pflanzenbehandlungsmittel , b. - Kosmetika , c. - Arzneimittel , d. - Antigene / Allergene / Toxine , e. - Umwelt - Schadstoffe und - Gifte .
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 , gekennzeichnet durch - die Wirk - Stoffe
a. - Allergene tierischen, pflanzlichen, bakteriellen, viralen, protozoischenund chemischen Ursprungs, b. - Arzneimittel .
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 , gekennzeichnet durch - die Wirk - Stoffe
a. - Inhalations - Allergene tierischen, pflanzlichen, bakteriellen, viralen, protozoischenund chemischen Ursprungs, b. - Gase , Gasgemische, Gase als Träger chemischer Substanzen, Rauch und Aerosole .
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 , gekennzeichnet durch
- die Wirk - Stoffe
a. - Allergene wie
- Nahrungs - und Futtermittel,
- Inhalations - Allergene,
- Kontakt - Urtikariogene,
- Enzyme,
- Detergenzien,
- sonstige organische und anorganische Fremdstoffe , b. - Arzneimittel , c. - photo - toxische Substanzen , d. - toxische Substanzen von Insekten und Pflanzen , e. - Allergene wie
- Azetylsalizylsäure,
- Analgetika,
- Desinfektionsmittel,
- Konservierungsstoffe,
- Farbstoffe ,
/. - belastetes Wasser .
19. Verfahrennach einem der Ansprüche 1 - 13 , gekennzeichnet durch - die Wirk -Stoffe:
Figure imgf000035_0001
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 19 , gekennzeichnet durch - die Einwirk - Produkte
a. - Peptide und Proteine ,
b. - Mediatoren des Immunsystems wie
- Interferone, Interleukine,
- Immunglobuline, Immunkomplexe, Komplemente ,
- Hormone , insbes. Gewebshormone , wie
- Peptidhormone, insbes. gastrointestinale,
- Prostaglandine und deren Metaboliten ( z.B. Leukotriene)
- Histamine ,
Aminosäuren ,
Kohlenhydrate wie
Fruktose, Glykogen, Glukose ,
- Glykoproteine wie
- Intrinsic - Faktor ,
g. - Nukleinsäuren
- Enzyme ,
- Coenzyme ,
Fettsäuren , Fettsäureester , Lipide , wie Cholesterin, Triglyceride , Lipoproteine ,
Alkohole , k. - Elektrolyte ,
. - freie Radikale ,
m. - Vitamine ,
n. - Harnstoff , Ammoniak , Harnsäure ,
o. - Neurotransmitter wie
- Katecholamine ,
- Nukleotide ,
- Neuropeptide ,
p. - Gerinnungssystem - Faktoren ,
q. - Rheuma - Faktoren ,
r. - Tumoπnarker ,
s. - Zellen und Zellbestandteile .
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 19 , gekennzeichnet durch - die Einwirk - Produkte
A. - Porphyrine ,
- Bilirubin,
- Urobilinogen,
- Gallensäuren,
- Thromboxan,
- Tumornekrosefaktor,
- Phenole,
B. - Bauchspeicheldrüsen - Saft ,
- Kallekrein - Kinin - Komplex,
- Trypsin,
- Chymotrypsin,
- Speichel ,
- Lactoferrin,
- Beta - 2 - Mikroglobulin,
- Albumine,
- Transferrin,
- Blutgruppensubstanzen,
- Amylase,
- Lysozym,
- Hydantoine,
- Lithium,
- Theophyllin,
- Digitalis,
- Koffein ,
D. - Mikroglobuline
- Hämoglobin ,
- M oglobin ,
- Kreatinin,
- Urämietoxine,
- Chromogene,
- Muzine,
- Insulin,
- Kristalle , - Plasmin ,
- Kollagenase, Elastase, Proteasen,
- hypophysäre Gonadotropine,
- extrahypophysäre Gonadotropine,
- Steroidhormone,
- Prolaktin,
- Oxytocin,
- Relaxin,
- Kortisol,
- ACTH,
- Endorphine,
- Enkephaline,
- Lipόtropine,
- Melanocortine ,
- Inhibin ,
- Anti - Müller - Hormon,
- Androgen - bindende - Proteine,
- Albumine,
- Elastase,
- Proteasen,
- hypophysäre Gonadotropine,
- Steroidhormone,
- Kortisol,
- Zitrat,
- Laktat,
- Glutamat,
- Inositol,
- Hydrogencarbonat,
- Stickstoff,
- Sauerstoff ,
- Peroxidase,
- Esterase,
- Phosphatase,
- Hämopoetine,
- koloniestimulierende Faktoren (CSF) ,
- Erythropoetin,
- Neopterin,
- immunologische Phänotypisierung durch monospezifische Antikörper,
- Natriumfluorid,
- PAS - Reaktion,
- Ferritin,
- Transferin .
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit Wirk - Stoffen nach Anspruch 18 und Einwirk - Produkten nach Anspruch 20 , gekennzeichnet durch
- Kopf - Darm ,
- Vorder - Darm ,
- Magen und / oder
- Darm
- als biologische Struktur.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit Wirk - Stoffen nach Anspruch 18 und Einwirk - Produkten nach Ansprüchen 20, 21 A, B, C, D, gekennzeichnet durch
- Leber ,
- Gallenblase ,
- Bauchspeicheldrüse und / oder
- Speicheldrüse
- als biologische Struktur.
24. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit Wirk - Stoffen nach Anspruch 17 und Einwirk - Produkten nach Anspruch 20 a - m, o, p, r, s, gekennzeichnet durch
- Schleimhaut der oberen und tiefen Atemwege und / oder
- Lunge
- als biologische Struktur.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit Wirk - Stoffen nach Anspruch 18 und Einwirk - Produkten nach Ansprüchen 20 a - o, r, s, 21 D, gekennzeichnet durch
- Niere und / oder
- harnableitende Organe
- als biologische Struktur.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit Wirk - Stoffen nach Anspruch 18 und
Einwirk - Produkten nach Ansprüchen 20 a - m, o, p, q, r, s, 21 E, gekennzeichnet durch
- Organe des weiblichen Geschlechtsapparates
- als biologische Struktur.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit Wirk - Stoffen nach Anspruch 18 und
Einwirk - Produkten nach Ansprüchen 20 a - m, o, p, q, r, s, 21 F, gekennzeichnet durch
- Organe des männlichen Geschlechtsapparates
- als biologische Struktur.
28. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit Wirk - Stoffen nach Ansprüchen 17 , 18 und Einwirk - Produkten nach Anspruch 20 a - m, o - s, gekennzeichnet durch
- Haut und Hautanhangsorgane
- als biologische Struktur.
29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit Wirk - Stoffen nach Anspruch 17 b und Einwirk - Produkten nach Ansprüchen 20 a - s, 21 G, gekennzeichnet durch
- hämoretikuläre Organe
- als biologische Struktur.
30. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit Wirk - Stoffen nach Anspruch 17 b und Einwirk - Produkten nach Ansprüchen 20, 21 G, gekennzeichnet durch
- lymphatische Organe und
- Immunsystem
- als biologische Struktur.
31. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit Wirk - Stoffen nach Anspruch 18 und
Einwirk - Produkten nach Anspruch 20 a - i, k - m, o, q, r, s, gekennzeichnet durch
- endokrine Organe
- als biologische Struktur.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit Wirk - Stoffen nach Anspruch 17 b und Einwirk - Produkten nach Anspruch 20 a - i, k - m, o, q, r, s, gekennzeichnet durch
- Nervengewebe
- als biologische Struktur.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit Wirk - Stoffen nach Anspruch 17 b und Einwirk - Produkten nach Anspruch 20 a - i, k - m, o, q - s, gekennzeichnet durch
- Auge
- als biologische Struktur.
34. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit
Wirk - Stoffen nach Ansprüchen 18 a, b, d, e, 19 und Einwirk - Produkten nach Anspruch 20 , gekennzeichnet durch
- Gelenke und Bindegewebe
- als biologische Struktur.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit
Wirk - Stoffen nach Ansprüchen 18 a, b, d, e, 19 und Einwirk - Produkten nach Anspruch 20 a, b, q, r, s, gekennzeichnet durch
- Knochen und Knorpel
- als biologische Struktur.
36. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit
Wirk - Stoffen nach Ansprüchen 18 b - e, 19 und Einwirk - Produkten nach Anspruch 20 , gekennzeichnet durch
- Muskulatur
- als biologische Struktur.
37. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit
Wirk - Stoffen nach Ansprüchen 17 b, 18 a - e und Einwirk - Produkten nach Anspruch 20 a, h, i, r, s, gekennzeichnet durch
- fetale Fruchthüllen
- als biologische Struktur.
38. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit
Wirk - Stoffen nach Anspruch 17 b, 18 a - e und
Einwirk - Produkten nach Anspruch 20 a, h, i, k, 1, m, p, r, s, gekennzeichnet durch
- Plazenta
- als biologische Struktur.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit Wirk - Stoffen nach Ansprüchen 17, 18, 19 und Einwirk - Produkten nach Anspruch 20 a - m, o, p, r, s, gekennzeichnet durch
- Gefäße
- als biologische Struktur.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 13 mit Wirk - Stoffen nach Ansprüchen 17, 18, 19 und Einwirk - Produkten nach Anspruch 20 a - c, h, i, 1, p, r, s, gekennzeichnet durch
- Tumore
- als biologische Struktur.
41. Vorrichtung zur Durchführung des
Verfahrens nach einem der vorhergehenden Ansprüche , gekennzeichnet durch
- eine mit Spül-Fluid füllbare
- Hauptkammer (2)
- zur Aufnahme einer Probe (4) der Struktur
(Fig. 1) .
42. Vorrichtung nach Anspruch 41 , gekennzeichnet durch
- einen Behälter (5) für Referenz- Spül-Fluid und
- einen Behälter (6) für Prüf- Spül-Fluid.
43. Vorrichtung nach Anspruch 41 oder 42 , gekennzeichnet durch
- eine Vorkammer (1) ,
- die mit Träger - Gas für Wirk - Stoffe füllbar ist.
44. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 41 - 43 , gekennzeichnet durch
- einen Temperatur - Raum (3) ,
- der um Vorkammer (1) und Hauptkammer (2) angeordnet ist.
45. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 41 - 44 , gekennzeichnet durch
- einen Zufuhr - Schlauch (12) für Spül - Fluid , der
- durch den Temperatur-Raum (3) und
- die Vorkammer (1) in
- die Hauptkammer (2) geführt ist.
46. Vorrichtung nach Ansprach 45 , gekennzeichnet dadurch, daß
- der Zufuhr - Schlauch (12) für Spül - Fluid
- für Träger - Gas aus der Vorkammer (1) durchlässig ist.
47. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 41 - 46 , gekennzeichnet durch
- einen Begaser (10)
- zum Begasen des Spül-Fluids
- mit 95% O2, 5% CO2
- zum Einstellen des Spül-Fluids auf
- Säurewert (pH -Wert) 7,35-7,40,
- Sauerstoff - Partialdruck (pO2) 260-360 Torr,
- Kohlendioxid - Partialdruck (pCO2) 16-20 Torr
48. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 41 - 47 , gekennzeichnet durch
- einen Proben (4) -Halter
- in der Hauptkammer (2) .
49. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 41 - 48 , gekennzeichnet durch
- einen Ablauf - Schlauch (7) für das Spül-Fluid
- von der Hauptkammer (2)
- zu mindestens einem Auffangbehälter .
50. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 41 - 49 , gekennzeichnet durch
- Fraktions - Sammler (9) als
- Auffangbehälter .
51. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 41 - 50 , gekennzeichnet durch
- eine Schlauchpumpe (8)
- am Ablauf - Schlauch (7) .
52. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 41 - 51 , gekennzeichnet durch
- ein Steuer - Gerät (11)
- zum Umschalten zwischen
- den beiden Spül-Fluid - Behältern (5, 6) .
53. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 41 - 52 , gekennzeichnet durch
- mindestens einen Wirk - Feld - Erzeuger
- an der Hauptkammer (2) (Fig. la, b, c) .
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