DE2420706C3 - Verfahren zum Herstellen von spezifischen Antigenen aus Schistosomen und jene enthaltendes Mittel - Google Patents

Verfahren zum Herstellen von spezifischen Antigenen aus Schistosomen und jene enthaltendes Mittel

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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Antigenen aus lebenden adulten Schistosomen und Diagnostika zum Nachweis der Bilharziose in vivo und in vitro, enthaltend die erfindungsgemäß hergestellten Antigene oder korrespondierende Antikörper.
Die Bilharziose ist eine Erkrankung, die von Parasiten der Gattung Schistosoma hervorgerufen wird. Man schätzt, daß annähernd 200 Mio. Menschen, insbesondere in Asien, Afrika. Süd- und Mittelamerika von menschenpathogenen Schistosoma-Arten infiziert sind, insbesondere von S. mansoni, S. haematobium und S. japonicum.
Seit etwa 50 Jahren werden serologische Methoden für die Diagnose der Bilharziose angewandt, die gegenüber parasitologischen Verfahren wegen der Einfachheit der Durchführung wesentliche Vorteile aufweisen. Die Spezifität dieser Testverfahren ist im weitesten Sinne abhängig von der Qualität des dafür verwendeten Aniigenmaterials.
Es ist bekannt, daß Bilharziose-Patienten in einem frühen Stadium der Erkrankung eine spezifische Hautempfindlichkeit zeigen, die auf vorhandene Antikörper gegen den Erreger zurückzuführen ist und mit entsprechenden Antigenen provoziert werden kann. Eine inlradermale Injektion eines Schislosomen-Extraktes führt zu einer nach wenigen Minuten auftretenden Rötung und Induration (Quaddelbildung) im injizierten Hautbereieh.
In vitro lassen sich die Antikörper mit bekannten Testverfahren nachweisen, wenn geeignete Antigene benutzt werden.
Als Ausgangsmalerial für die Gewinnung der Antigene werden α ä. bestimmte Entwicklungsstadien aus dem Lebenszyklus Von Bilharziose»Erregern eingesetzt, vorzugsweise adulte Schistosomen, die in einem Wirtstier, am häufigsten in Nagern, zur Entwicklung gebracht werden. Die Gewinnung der Organismen erfolgt mittels einer von P e 11 e g r i η ο und S i q u e i r a (1956) beschriebenen Perfusionstechnik. Die aus der
·, Perfusionslösung zu gewinnenden Schistosomen werden mit isotonischer Kochsalzlösung gewaschen und anschließend entweder sofort zur Antigenherstellung eingesetzt oder getrocknet und bis zum Bedarf in Ampullen aufbewahrt.
κι Für die Diagnostik einsetzbare Antigene werden entweder durch Extraktion der getrockneten Würmer mit isotonischer Kochsalzlösung hergestellt (Kochsalz-Extrakt) oder durch Extraktion mit Hilfe der Lösung nach Coca (Coca-Extrakt) oder entsprechend dem
π, Vorschlag Melchers durch Delipidisierung der Schistosomen mit Petroläther und anschließender Extraktion mit Boratpuffer und einer Reinigung durch Säurefällung, wonach die säurelösliche Frakrjn als sogenanntes Melchers-Antigen erhalten wird. Es sind
2Ii mehrere Versuche unternommen worden, um die im wesentlichen nach diesem Verfahren erhaltenen Antigene weiter zu reinigen. Es wurden dabei auch im Hauttest reaktive Fraktionen erhalten. Es konnte jedoch auch weiter gezeigt werden, daß der aktive Anteil des
2'. Hauttest-Antigens nicht auf die reinen Fraktionen zu beschränken ist Vielmehr konme ermittelt werden, daß die Reaktivität des Antigens mit dessen Stickstoffgehalt in Korrelation zu bringen ist. Dabei wird immer die Forderung nach Ausschaltung von unspezifischen
3ii Reaktionen erhoben, die durch den Einbau von wirtsspezifischen Bestandteilen in dem Organismus der Schistosomen hervorgerufen werden können.
Es wurde nun gefunden, daß die durch Perfusion aus Nagerblut gewonnenen Schistosomen von einem
x, großen Anteil von wirtsspezifischem Material befreit werden können, wenn die Schistosomen in geeigneten proteinfreien Salzmedien mehrere Stunden gehalten werden, und daß diese vorgereinigten Schistosomen somatische Antigene erhöhter Spezifität liefern.
4(i Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zum Herstellen von spezifischen Antigenen durch Extraktion von Schistosomen mit einem wäßrigen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß die aus infizierten Tieren gewonnene Schistosomen vor der
4!i Extraktion 12-93 S'unden in dem 10-lOOfachen ihres Volumens einer sterilen Protein- und Stickstoff-freien.
physiologisch verträglichen wäßrigen Salzlösung bei 10 - 400C lebend gehalten werden.
Als Salzlösungen, in denpn die Schistosomen nach
Mi ihrer Gewinnung einige Zeit lebend gehu.ten werden, sind alle physiologisch verträglichen wäßrigen Salzlösunger geeignet, deren Osmolarität etwa 200-450 Milliosmol/1 beträgt. Neben physiologischer Kochsalzlösung gehören hierzu die bekannten Nährlösungen.
5·, beispielsweise nach Locke, Tyrode oder Ringer. Zusätze von etwa 0.5% Glucose und/oder etwa 1% Asparagin, von denen bekannt ist, daß sie es ermöglichen, Schistosomen in Nährlösungen 2-12 Tage am Leben zu erhalten, sind auch bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorteilhaft.
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform werden die durch Perfusion gewonnenen Schistosörnen in dem etwa 5Öfachen ihres Volumens einer wäßrigen Lösung enthaltend NaCI, KCl, MgSO«, Glukose,
6«. NaHCOj, Na2HPO und CaCI2 mit einer Konzentration von insgesamt 200=450 Milliosmo! bei 35-40" gehalten mit der Maßgabe, daß mindestens die Hälfte der Osmolarität der Lösung durch den Gehalt an
15
Kochsalz bedingt ist und die übrigen Bestandteile jeweils 2-50 Milliosmol zu dem Gehalt an dissoziierter Substanz in der Lösung beil ragen. Dabei darf als bekannt vorausgesetzt werden, daß für die Herstellung einer optisch klaren Lösung die angegebenen Salze nicht in jedem beliebigen Mischungsverhältnis dem Lösungsmittel Wasser zugegeben werden können. Beispielsweise kann die wäßrige Lösung folgende Zusammensetzung haben:
0,120 Mol entspr. 240 Milliosmol NaCl
0,004 Mol entspr. 8 Milliosmol KCl
0,0007 MoI entspr. 2 Milliosmol MgSO*
0,0055 MoI entspr. 5 Milliosmol Glukose
0,018 Mol entspr. 36 Milliosmol NaHCO3
0,0035 MoI entspr. 10 Milliosmol Na2HPO4
0,001 MoI entspr. 3 Milliosmol CaCl2
Es hat sich als zweckmäßig erwiesen, die Lösung im Abstand von einigen Stunden mehrfach zu wechseln, beispielsweise bei e=r>er 24stündigen Haltung der Würmer den Wechsei der Lösung alle 8 Stunden durchzuführen.
Es war bisher nicht bekannt, daß Schistosomen während der Inkubationszeit in den entsprechenden Medien die in ihrem Darm aufgenommenen Nährsubstanzen freizugeben vermögen, und daß daraus — wie erfindungsgemäß gezeigt werden konnte — ein wesentlicher Reinigungseffekt in der Herstellung der somalischen Antigene resultiert. Es kann nämlich gezeigt werden, daß das Feuchtgewicht der durch }0 Perfusion aus einem Wirtstier gewonnenen Schistosomen durch die erfinciungsgemäße Inkubation um 10-30% abnimmt. Diese Abnahn.e des V.urmgewichts führt zu einem spezifisch wesentlich fe-neren Ausgangsmaterial für die Herstellung der somatische. Antigene. 35·
Während nicht inkubierte Schistosomen nur durch sehr schonende Maßnahmen von Extraktionsverfahren zur Gewinnung der Antigene eingesetzt werden können, erlaubt die erhöhte Reinheit des Ausgangsmaterials den Einsatz von intensiveren Scher· und Kavitationskräften, beispielsweise von Ultraschall, und führt danach zu einer höheren Ausbeute an spezifischem Antigenmaterial.
Die als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren dienenden Schistosomen werden auf an sich 4 > bekannte Weise z. B. mit Hilfe der Perfusionstechnik aus dem Blut von infizierten Tieren gewonnen. Geeignete Tiere sind z. B. Schweine oder vorzugsweise Nager wie Kaninchen, Meerschweinchen, Goldhamster oder insbesondere Ratten oder Mäuse. Die Tiere werden für die Schistosomen-Gewinnung zweckmäßig artifiziell infiziert, jedoch können auch natürlich infizierte Tiere in gleicher Weise zur Schistosomen-Gewinnung herangezogen werden, wobei man allerdings in Kauf nehmen muß, ein weniger homogenes Ausgangsmaterial zu 5'i erhalten.
Die Schistosomen werden sodann, zweckmäßig auf einem Sieb geeigneter Maschenweite, gesammelt und, z. B. auf diesem Sieb oder auch durch Dekantieren nochmals gewaschen. Als Waschlösung dient eine «» gegenüber den Organismen isoionische wäßrige Salzlösung, zweckmäßig Kochsalzlösung.
Die so Vorbereiteten Schistosomen Werden in der bereits beschriebenen Weise in einer Salzlösung am Leben erhalten, 6ü
Anschließend werden die inkubierten Schistosomen Von der Salzlösung durch Dekantieren oder Absieben abgetrennt Und gewünschtenfalls nochmals mit isotonischer Salzlösung oder reinem Wasser gewaschen.
Für die nachfolgende Extraktion dienen als Extraktionsmittel die in der Technik bekannten und weiter oben beschriebenen Medien, die schon bisher für die Extraktion von nicht erfindungsgemäß vorbehandelten Schistosomen verwendet wurden, die aber mit den erfindungsgemäß vorbehandelten Schistosomen einen wesentlich verbesf erten Extrakt liefern.
Gewünschtenfalls können die aus der Salzlösung isolierten Schistosomen vor der Extraktion gefriergetrocknet und/oder mit dem mindestens 50fachen ihres Trockengewichts an Lipidlösungsmitteln wie Diäthyläther delipidisiert werden. Vor oder während der Extraktion kann die Anwendung von Scher- oder Kavitalionskräften zweckmäßig sein, z. B. die Behandlung mit einem schnellen Rührer oder mit Ultraschall oder auch ein einfaches mechanisches Zerreiben. Im Anschluß an die Extraktion kann der erhaltene wäßrig** Extrakt gewünschtenfalls weiteren Reinigungsoperationen wie Dialyse oder Chromatographie unterworfen werden.
Das gereinigte Produkt kann entsprechend den Anforderungen der diagnostischen Testsysteme für den Nachweis der Bilharziose standardisiert werden.
Für den Intradermaltest hat es sich aufgrund ausgedehnter Feldversuche als zweckmäßig erwiesen, eine Sticksloffbestimmung in dem Antigenmaterial durchzuführen und die Lösung der somatischen Antigene auf eine Endkonzentration von 0,03 mg Stickstoff pro ml mit Hilfe einer physiologisch verträglichen Salzlösung einzustellen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ferner diagnostische Mittel zur In-vitro- oder Intradermal-Diagnostik von Bilharziose, gekennzeichnet durch einen Gehalt von Antigenen, die aus Schistosomen erhalten werden können, nachdem sie 12-96 Stunden in dem 10-lOOfachen ihres Volumens in einem sterilen Protein- und Stickstoff-freien chemisch definierten isotonischen Salzmedium bei 10-40°C lebend gehalten wurden, bzw. den daraus hergestellten Antikörpern.
Erfindungsgemäß hergestellte und auf Stickstoffmenge bezogene standardisierte Antigene aus Schistosomen erlauben epidemiologische Untersuchungen bei Bilharzioseerkrankten Personen. 0.05 ml der Antigenlösung führt nach einer intradermalen Injektion zu einer Quaddel in der Haut an der Injektionsstelle, deren Fläche von mehr als lern' 15 Minuten nach der Injektion als zuverlässiger Hinweis auf das Vorliegen von Schistosomen-Antiköryern gilt Aufgrund serologischer Kreuzreaktionen mit tierpathogenen Schistosomen, z. B. Tnchobilharzia spp. und Ocellata sppM die den Menschen als Fehlwirt invadieren, kann das obengenannte Antigen diagnostisch zum Nachweis des stattgefundenen Kontaktes mit den betreffenden Schistosomen-Stadien eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäß gewonnenen Antigene erweisen sich jedoch auch für die Durchführung des Haemagglutinationstestes geeignet, wie der von K a ■ gan 1955 für die Bilharziose-Diagnostik beschrieben wurde. Ebenso läßt sich das erfindungsgemäß gewonnene Antigen für die Kornplementbindungsreaktion einsetzen, die als diagnostisches Verfahren für den Schistosomen-Nachweis in Wld.Hlth.Org. 1061, 25, 611 - 674, erläutert wurde-
Neben den hier aufgezählten Methoden sind die erfindungsgemäß gewonnenen Antigene für eine Reihe weiterer serologischer Testverfahren als Antigen in der Bilharziose-Diagnostik einzusetzen. Sie sind jedoch
OA Of\ 7rtfi
Λ·~Τ £.\J I \J\J
g/l
NaCI 7,4
KCl 0,75
CaCl2 0,55
MgCI2 · 6 H2O 0,2
Na2HPO4 · 2 H2O 2,7
NaHCO3 0,84
Na-Citrat 2,9
Glukose 3,6
und insgesamt 24 Stunden bei 37° C gehalten. Nach jeweils 8 Stunden erfolgt ein Wechsel der Lösung durch weitere 500 ml.
Die Würmer werden sodann auf dem Sieb mit 100 ml steriler isotonischer Kochsalzlösung gewaschen, in etwa 100 ml sterilem destilliertem Wasser suspendiert und in einer Gefriertrocknungsanlage getrocknet Es werden 6,25 gTrockenschistosomen erhalten.
Für die Gewinnung der somatischen Antigene aus den SchistC3omen wird das getrocknete Wurmmaterial in einem Mörser fein pulverisiert und anschließend portionsweise in einem Gewebehomogerüsator nach Potter (hergestellt von der Firma B. Braun Melsungen) mit insgesamt 950 ml Diäthyläther homogenisiert.
Das Homogenisatorgefäß wird dabei außen mit einer
auch zur Gewinnung von Antiserum verwendbar, das durch Immunisierung geeigneter Versuchstiere mit dem Schistosoma-Antigen erhalten werden kann. Dabei sind Seren zu gewinnen, die sich in immunologischen Systemen ähnlich denen verhalten, die von Bilharzioseerkrankten Patienten entnommen werden können.
Die Erfindung soll im nachstehenden Beispiel näher erläutert werden.
Beispiel
35 g feucht ausgewogene, mittels Perfusionstechnik aus den Blutgefäßen des Mesenteriums experimentell infizierter Mäuse gewonnene Schistosomen werden unter sterilen Bedingungen auf einem Sieb mit einer Maschenweite von 0,5 mm mehrfach mit jeweils i00 ml steriler isotonischer Kochsalzlösung gewaschen. Die auf diese Weise von anhaftenden Fremdstoffen befreiten Würmer werden in 500 ml einer wie folgt zusammengesetzten und anschließend keimfrei filtrierten Lösung vom pH-Wert 83 gegeben:
Mischung aus Methanol und Trockenkohlensäure gekühlt. Die ätherunlöslichen Bestandteile werden durch Zentrifugation in einer explosionsgeschützten Kühlzentrifuge bei -10" C abgeschleudert Der Überstand wird verworfen und der Rückstand in einem Exsiccator unter Vakuum vom restlichen Äther befreit Die Gesamtmenge der erhaltenen Trockensubstanz wird in 625 ml einer mit Natriumborat gepufferten Kochsalzlösung (pH 7,4), bestehend aus 6,202 g H3BO3, 50 ml In NaOH, 2,925 g NaCl, 46,5 ml 1 η HCI ad 1000 ml mit dest Wasser aufgefüllt, suspendiert und mit dem erwähnten Gewebehomogenisator gleichmäßig in der Lösung verteilt Danach wird das Homogenat 10 Minuten lang einer Ultraschall-Behandlung bei 0,6 A, 220 V unterworfen (Hersteller des Gerätes: Schöllerschall). Anschließend wird 1 Stunde bei 30 000 g zentrifugiert das Sediment verworfen und der Überstand, der das somatische Antigen enthält, gegen das lOfache Volumen der genannten boratgepufferten Kochsalzlösung 10 Stunden dialysie" Die im Innendialysat erhaltener, somatischen Antigsne können zur Herstellung von Diagnostika für Bilharziose-Infektionen eingesetzt werden.
Gewünschtenfalls können die Antigene durch geeignete chromatographische Maßnahmen auch weitergereinigt werden und für besondere Untersuchungen in Einzelkomponenten zerlegt werden.
Die Prüfung der biologischen Aktivität der erhaltenen somatischen Antigene erfolgt an Meerschweinchen, denen Serum von Bilharziose-Patienten mit gesichertem parasitologischen Befund injiziert worden war, durch den Nachweis der passiv kutanen Anaphylaxie:
Wenn den mit diesen Patienfenseren sensibilisierten Tieren 48 Stunden nach der Serumgabe das gemäß dem vorstehenden Beispiel hergestellte Antigen in einer Verdünnung von 1 :50 intrakutan appliziert wird und gleichzeitig pro Tier 1,2 ml einer 0,12%igen Lösung von Evans blue intravenös verabreicht wird, ericheint an der Injektionsstelle ein blauer Hof.
Die serologische Aktivität wird bestimmt durch Ti:ration mittels der passiven Hämagglutinationstechnik nach Kagaη 1955, wobei als Serumstandard ausgesuchte Seren von Bilharziose-Patienten eingesetzt werden.

Claims (3)

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Herstellen von spezifischen Antigenen, durch Extraktion von Schistosomen mit einem wäßrigen Medium, dadurch gekennzeichnet, daß die aus infizierten Tieren gewonnenen Schistosomen vor der Extraktion 12-96 Stunden in dem 10- lOOfachen ihres Volumens einer sterilen, Protein- und Stickstoff-freien, physiologisch verträglichen wäßrigen Salzlösung bei 10 bis 40° C lebend gehalten werden.
Z Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die sterile Protein- und Stickstoff-freie physiologisch verträgliche Salzlösung Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Glukose, Natriumhydrogencarbonat, Dinatriumphosphat und Kalziumchlorid mit einer Konzentration von insgesamt 200 bis 450 Milliosmo! enthält mit der Maßgabe, daß mindestens die Hälfte der Osmolarität der Lösung durch den Gehalt an Kochsalz bedingt ist und die übrigen Bestandteile jeweils 2 — 50 Millimol zu dem Gehalt an dissoziierter Substanz in der Lösung beitragen.
3. Diagnostische Mittel zur In-vitro- oder Intradermal-Diagnostik von Bilharziose, gekennzeichnet durch einen Gehalt an einem Antigen, gewonnen nach den Ansprüchen 1 und 2, bzw. den daraus hergestellten Antikörpern.
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