DE2213709A1 - Verfahren zur Herstellung eines Interferonerzeugers - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines Interferonerzeugers

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DE2213709A1 DE19722213709 DE2213709A DE2213709A1 DE 2213709 A1 DE2213709 A1 DE 2213709A1 DE 19722213709 DE19722213709 DE 19722213709 DE 2213709 A DE2213709 A DE 2213709A DE 2213709 A1 DE2213709 A1 DE 2213709A1
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Description

PATENTANWALTSBÜPÖ ThOMSEN - TlEDTKE - BüHLING 2213709
TEL. (0611) 53 02 11 TELEX: 5-24 303 topgt
53 0212
PATENTANWÄLTE München: Frankfurt/M.:
Dipl.-Chem.Dr.D.Thomsen Dipl.-Ing. W. Weinkauff
Dipl.-Ing. H. Tiedtke (Fuchehohl 71)
Dipl.-Chem. G. Bühling Dipl.-Ing. R. Kinne Dipl.-Chem. Dr. U. Eggers
8000 München 2
Kaiser-Ludwig-Platze 21. März 1972
The Kitasato Institute Tokyo (Japan)
Verfahren zur Herstellung eines Interferonerzeugers
Die Erfindung bezieht sich auf einen Interferonerzeuger für die virale Infektion und auf ein Verfahren zu dessen Herstellung. Insbesondere betrifft die Erfindung einen Interferonerzeuger, welcher durch Verwendung der tiberstehenden Flüssigkeit eines flüssigen Kulturmediums oder einer Flüssigkeit gewonnen wird, welche einen aufgeschlossenen Zellkörper eines Phase IH-? Phase II- oder Phase I-Organismus von Bordetella pertusis (G.S. Wilson und A.A. Miles: Principles of Bacteriology and Immunity, Band 1, Seite 973 (5. Ausgabe, 1964), veröffentlicht von Edward Arnold Ltd. (London)) enthält. Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zur Herstellung dieses Erzeugers.
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Erfindungsgemäß soll ein Verfahren zur Herstellung eines Interferonerzeugers aus der überstehenden Flüssigkeit eines flüssigen Kulturmediums qeschaffen werden, in welchem ein Phase III-, Phase II- oder Phase I-Organismus von Bordetella pertusis kultiviert worden ist. Ferner soll erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung eines Interferonerzeugers aus einer Fraktion geschaffen werden, welch letztere man durch Aufschließen des Zellkörpers eines Phase III-, Phase II- oder Phase I-Organismus von Bordetella pertusis, und dann durch Entfernen des Lipopolysaccharidendotoxins und O-Antigens aus den somatischen Komponenten von Bakterien erhält. Ferner soll erfindungsgemäß ein Interferonerzeuger geschaffen werden, welcher gemäß einem der vorerwähnten Verfahren erhalten wird.
Bisher sind Interferonerzeuger zur Verhütung viraler Infektionskrankheiten gemäß vielen Forschungsberichten bekannt geworden, beispielsweise durch Julius S. Youngner: Jour.General Physiology, £6 (1), Teil 2, Seiten 25s bis 40s (1970); und J. Vilcek: Virology Monograph Band 6, Interferon (veröffentlicht von Springer-Verlag, 1969, Wien-New York), insbesondere Seiten 21 bis 22. Zu typischen Beispielen der bekannten Interferonerzeuger zählen verschiedene Virusarten, Bakterien, (insbesondere gramnegative Bakterien), Lipopolysaccharidendotoxin dieser Bakterien, Stoffwechselprodukte von Schimmel, Polysaccharide und doppeIsträngige Ribonuclelnsäure (double-stranted-RNA). Alle diese Interferonerzeuger sind jedoch toxisch und führen bei
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Verabreichung zu solchen Nebenwirkungen wie Fieber u.dgl., so daß sie nicht so häufig verwendet worden sind.
Erfindungsgemäß ist es möglich, einen Interferonerzeuger zu erhalten, welcher geringe Toxizität besitzt und welcher keine Nebenwirkungen hervorbringt.
Die Erfindung beinhaltet einen Interferonerzeuger zum Verhüten der viralen Infektionserkrankungen, wobei dieser Erzeuger bereitet wird aus der überstehenden Flüssigkeit von Kulturmedium, in welcher Bordeteile pertusis kultiviert worden ist, oder aus einer Fraktion, welche durch Aufschließen des Zellkörpers von Bordetella pertusis und anschließende Gewinnung der wirksamen Komponenten hieraus erhalten wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird gemäß einer der nachstehend erwähnten Arbeitsgänge durchgeführt.
(1) Ein Phase III-, Phase II- oder Phase I-Organismus von Bordetella pertusis wird bei 30 bis 37°C 24 bis 94 Stunden unter Verwendung eines flüssigen Mediums wie einem modifizierten Cohen-Wheeler-Kulturmedium (S.M. Cohen und M.W. Wheeler: Am. J. of Public Health ft Nations Health, Band 36, Seiten 371 bis 376 (1946)) der Schüttelkultivierung unterworfen. Danach gewinnt man die tiberstehende Flüssigkeit des Kulturmediums mittels Zentrifuge und filtriert dann unter sterilen Bedingungen ab, und das Filtrat unterwirft man der Ultrafiltration
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oder Chromatographie, wodurch eine wirksame Fraktion isoliert werden kann.
(2) Ein kultivierter Zellkörper des oben erwähnten Phase III-, Phase II- oder Phase I-Organismus von Bordetella pertueis, wird aufgeschlossen, indem man den Zellkörper 10 bis 30 Minuten einer physikalischen Behandlung unterwirft, beispielsweise einer Schallbehandlung oder einer mechanischen Behandlung unter Anwendung einer geeigneten Presse, einer sogenannten "French Press", oder einer Schüttelvorrichtung. Danach zentrifugiert man die Flüssigkeit, welche den aufgeschlossenen Zellkörper enthält, um eine überstehende Flüssigkeit zu erhalten, welche im wesentlichen kein Lipopolysaccharidendotoxin und O-Antigen enthält. Die so erhaltene überstehende Flüssigkeit wird durch Chromatographie gereinigt, wobei man als Adsorptionsmittel DEAE-Cellulose (Diäthylaminoäthylcellulose), Sephadex (Warenzeichen für ein trocknes, unlösliches Pulver, zusammengesetzt aus mikroskopischen Kügelchen, welche synthetische organische Verbindungen sind, die sich vom Polysaccharid-Dextran herleiten, hergestellt und verkauft durch Pharmacia Fine Chemicals, Inc., New Jersey, USA), oder DEAE-Sephadex verwendet, wodurch eine gewünschte wirksame Fraktion isoliert werden kann.
(3) Der oben erwähnte Phase III-, Phase II- oder Phase I-Organismus von Bordetella pertusis, wird bei 35 bis 37°C 2 bis 3 Tage in irgendeinem der festen Kulturmedien kultiviert, welche
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zum Kultivieren von Bordetella pertusis geeignet si spielsweise in einem Kolzkohlemediura,, und den sich ergebenden Zellkörper behandelt man in der gleichen Weise wi@ ©fossa „ wodurch ebenfalls eine wirksame Fraktion isoliert werden kani»e
Arbeitsgänge zur Herstellung erfindungsgemäßes1 feronerzeuger sind nachstehend unter Bezugnahme auf <äl führungsbeispiele veranschaulicht. Es ist nicht beabsichtigt t mit diesen Beispielen über den Rahmsn der zusagen.
Beispiel ^1
Einen Phase III-Organismus von Bordetella pertwsis isnterwirft man bei 35 bis 37°C 72 Stunden in einem modifiaiertesi Cohen Wheeler-Kulturmedium der Schüttelkultivi@risng. Naeh der Kultivierung zentrifugiert man die Kulturflüssigkeit nnä ©sfhält 1000 cm3 einer überstehenden F!üasigk©it0 Di©s@ hende Flüssigkeit filtriert man unter sterilen wodurch 900 cm einer wirksamen Fraktion (A) erhalt©» t-;@rd@n.
In der gleichen Weise wie im Falle des Phase nismus, erhält man, 900 cm3 einer wirksamen Fraktion CB) nnter Verwendung eines Phase II-Organismus voss Bosdetslla
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In der gleichen Weise wie im Falle des Phase III-Organismus erhält man 900 en einer v/Irksamen Fraktion (C) unter Verwendung eines Phase !-Organismus von Bordetella pertusis.
Die oben e.;:währ»to wirksame Fraktion (A) konzentriert
3
man au Γ 50 cm ιν.ά 4 an η rc-./^i/t man dieses Konzentrat durch Chromatographie ■ üt-er virÄndu.nj vor; DFAE-Sephadex A-50, wobei man 50 cm einer wi.rxs eisen Fraktion erhält. Dann reinigt man die so erhaltene wirksame Fcurior; in ähnlicher Weise unter Verwendung von Sephadex >-~:Of vobei man 50 cm einer anderen wirksamen Fraktion -~: rl· alt.
Mar> k ι :v c~\ e%.\■..--;_,. Phase Tll-Organismus von Bordetella ertub ·..?· 48 Stunden bei. ~iZ- bis 37 C in einem Holzkohle-Agar-Ku i tu ε radium (ο ,V., K'orri« κκΐ D, W, Ribbons % Methods in Microbiology.* Seite?; 4f 97 und 283 U97O) , veröffentlicht von Acsdemi«.' Pre&s In :u . X-^n "on- -1Ni-: ^ York}» Danach suspendiert man 10 g dra g; ff^r-wsejtc: 5;e-Hkörpers in 100 cm einer mit
^i: qiip'.-'^^^rrui I ,.i1: :■* ilö;- ang und tUs sich ergebende Zeil** su«?jc:^w.ion ,a.;f.eri..';::c "liji 'U1· l:u.f sch ließen des Zellkttrpers 3O Min'.-i-ii-u ίϊir,·■«.- Π :.'s.ü J .^i-^r,-!. ■ .;ng mj t 50 kK?.. Danach zent'ci" ■*u>; ::'>-.'..>■'■ sft-K c? ·ΐ ί, ι . · ι. '-,...-'".^ ιλι,ννϊβη^α !-'α f. .Lköx"po)C oivthiiitenda Fi(iiih»:vi·}, ;>■?. f- und ι:;;ν/:ί μ<,γ. 5ο cKi^ einer -".iWors^-ßh&riden Flüssigkeit.
Diese überstehende Flüssigkeit behandelt man chromatographisch unter Verwendung von Sephadex G-15O, wodurch 40 cm einer wirksamen Fraktion (D-I) erhalten werden. In der gleichen Weise wie oben kultiviert man den Phase HI-Organismus von Bordetella pertusis 72 Stunden bei 35 bis 37°C, wodurch 40 cm einer wirksamen Fraktion (D-2) erhalten werden.
In der gleichen Weise wie im Falle des Phase III-Organismus, erhält man 40 cm3 einer wirksamen Fraktion '(E) durch Verwendung eines Phase II-Organismus von Bordetella pertusis.
In der gleichen Weise wie im Falle des Phase III»Organismus, erhält man 40 cm einer wirksamen Fraktion (F) durch Verwendung eines Phase I-Organismus von Bordetella pertusis«, Ferner wird die Flüssigkeit, welche den aufgeschlossenen Zellkörper des Phase I-Organismus enthält, zentrifuiert, wobei man eine überstehende Flüssigkeit erhält, wslche man dann der Chromatographie unterwirft, wobei man als Adsorptionsmittel DEAE-Cellulose verwendet; dadurch erhält man 30 cm einer wirksamen Fraktion (G).
Die Ergebnisse der Bestimmung der Interferonerzeugung der in den Beispielen 1 und 2 erhaltenen wirksamen Fraktionen (A) bis (G), sind nachstehend mit Bezugnahme auf die folgenden Bezugsbeispiele erwähnt.
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Bezugsbeispiel 1 Bestimmung der Produktionsmengen von Interferon (in vitro-Test):
Eine gemischte Lösung aus 1,4 Volumenteilen einer mit Phosphat gepufferten Salinelösung und einem Volumenteil Ringer-Lösung» vermischt man mit 0,6 Volumenteilen eines KHlberserums. Das sich ergebende Gemisch zersetzt man mit 3 Volumenteilen destillierten Wassers, um eine hypotonische Lösung zu bereiten. Unter Verwendung dieser hypotonischen Lösung verdünnt man jede der wirksamen Fraktionen (A) bis (G) auf verschiedene Konzentrationen, um verdünnte Proben zu bereiten. Andererseits bereitet man eine Zellsuspension in solcher Weise, daß man ein Kaninchen mit einem Körpergewicht von 500 bis 1000 g durch Kardialpunk.tierung tötet, die Milz und Lymphe (Lymphnode) gewinnt, die Gewebe dieser Organe mit Zangen zerreißt, um Zellen zu dispergieren, und man die so erhaltenen Zellen in einem Kulturmedium in einer Konzentration von 5 χ 10 Zellen je Schale an Milz und Lymphnode suspendiert. Anschließend vermischt man jede der oben genannten verdünnten Proben mit der oben erwähnten Zellsuspension und kultiviert 24 Stunden bei 25°C. Die kultivierte Flüssigkeit wird dann zur Gewinnung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert, welche man dann der Bestimmung der Interferonerzeugung unterwirft. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt.
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(Der Interferontiter ist ausgedrückt als die stärkste Verdünnung, welche eine 50%ige Inhibierung der Zahl und Größe der Piaauen, im Vergleich zu unbehandelten Kontrollproben, verursacht.)
Tabelle I
Bestimmung der Interferonerzeugung (in vitro-Test)
probe Konzentration Interferontiter
der Probe Milzzelle Lvmphnodezelle
1. PhaseIII-Organismus . 10 100 χ Verdünnung 80 85
von Bordetella 100 1000 χ " 220 700
pertusis 1000 10000 χ " 220 680
(1) überstehende Flüs 100 χ Verdünnung 430 330
sigkeit von Kultur
medium /wirksame		 1000 Fraktion (D-2)J 100000 χ " 340 310
Fraktion (A)J 10000 X 230 330
(2) überstehende Flüs
sigkeit von aufge
schlossenem Zell		 Fraktion (D-I)} 100000 X + 100
körper '(48 Std. (2) überstehende Flüs χ Verdünnung 500 +
Kultur).^Wirksame sigkeit von aufge
schlossenem Zell		 χ · 360 230
körper (72 Std. χ H 205 220
Kultur (wirksame
χ - 50 85
2. Phase H-Organismus
von Bordetella pertusis
(1) überstehende Flüssigkeit von Kulturme- 100 χ Verdünnung 280 + dium (72 Std.-Kultur) (wirksame 1000 χ * 220 + Fraktion (B)J
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- ίο -
Tabelle I (Fortsetzung)
(2) Überstehende Flüssigkeit von aufgeschlossenem Zellkörper
(48 Std.-Kultur) 100 χ Verdünnung 320
Cwirksame Fraktion
(E)) 1000 χ ■ " 300
3. Phase I-Organismus 20 χ Verdünnung 106 17
von Bordetella 100 χ M 320 52
pertusis 500 χ . ■ " 160 72
(D überstehende Flüs enthaltend 10 ^ig 930 240
sigkeit von Kultur
medium Wirksame		 Feststoff je ml
Fraktion (C)JJ (unbehandoit)
(2) überstehende Flüs (behandelt bei
56°C, 30 Min.)		 1400 +
sigkeit von aufge lOfache Verdünnung
schlossenem Zell der Flüssigkeit des
körper (wirksame
Fraktion (Fp		 Gehaltes mit 45 üg
(3) Nekrotoxin Feststoff je cm3 720 19OO
Cwirksame BOfache Verdünnung
Fraktion (G)) dieser Flüssigkeit 630 19OO
25Ofache Verdünnung
dieser Flüssigkeit 230
+ nicht durchgeführt
Bezugsbeispiel 2
Bestimmung der Interferonerzeugung (in vivo-Test3): Jede der verdünnten Proben, welche im Bezugsbeispiel 1 bereitet wurden, wird in einer Dosis von 0,5 cm3 durch intravenöse Injektion einem Kaninchen mit einem Körpergewicht von bis 1000 g verabreicht. Zur zweiten und fünften Stunde
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nach der Injektion, werden jeweils 3 cm3 des Blutes des Kaninchens durch Kardialpunktierung aufgenommen. Das aus diesem Blut isolierte Serum wird der Bestimmung der Interferonerzeugung in der gleichen Weise wie im Bezugsbeispiel 1 unterworfen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II angegeben:
Tabelle II Bestimmung der Interferonerzeugung (in vivo-Test)
Probe
Konzentration der Probe
Kanin- Interferontiter chen Nr. nach 2 Std. nach 5 Std.
1. Phase H-Organismus 10 χ Verdün 7 490 50
von Bordetella nung 8 18OO 210
pertusis
überstehende Flüssig
keit von Kulturmedium
(wirksame Fraktion (A))
1 600 40
2. Phase I-Organismus 10 χ Verd. 2 2200 130
von Bordetella 10 χ " 3 2200 210
pertusis 10 χ
(1) überstehende Flüs enthaltend
sigkeit von Kultur
medium (wirksame 		IO ug Fest-,
Fraktion (C)) stoff je cnr 4 12OO 40
(2) überstehende Fltis- (unbehandelt)
keit von aufge
schlossenem Zell behandelt bei 5 1250 +
körper (wirksame 56°C 30 Min.)
Fraktion (F))
(3) Nekrotoxin
(wirksame Fraktion (G))
5OO /ug/kg Gewicht (ungehandelt)
(behandelt bei 56°C 30 Min.)
+ nicht durchgeführt
340 40
43 weniger als
10
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Wie aus den in den Tabellen I und II gezeigten Ergebnissen klar wird, ist bestätigt, daß die Oberstehenden Flüssigkeiten der Kulturmedien und aufgeschlossenen Zellkörper der Phase ΠΓ-» Π-» und 1-Organismen von Bordetella pertusis, unter Verwendung von Kaninchen sowohl in vitro- als auch in vivo-Tests Interferone erzeugen» Insbesondere wurde beobachtet, daß die überstehenden Flüssigkeiten, welche aus Phase m-Organismen von Bordetella pertusis erhalten werden, geringste Toxizität besitzen und hinsichtlich Wirkung des Einlei tens der Interferonerzeugung ausgezeichnet sind.
Ferner wurde bestätigt, daß virusinhibierende Faktoren, welche durch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Interferonerzeuger induziert werden, bei Kückenembryozellen unterschiedlicher Arten nicht wirksam sind; daß sie inhibierende Wirkungen auf die Fortpflanzung des visikulären Stomatitisvirus und Vacciniavirus auf befallener (lined) Zelle RK.13 besitzen und solche Eigenschaften der Interferone besitzen, daß sie mit 0,08% Trypsin bei 37°C inaktiviert werdenι daß sie selbst beim Zentrifugieren mit einer Zentrifugalkraft von 100 000 g nicht ausgefällt werden und mit einem Cellophanbeutel nicht dialysiert werden.
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Claims (9)

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung eines Interferonerzeugers für virale Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß man Bordetella pertusis in einem Kulturmedium kultiviert und daß man wirksame Fraktionen aus dem Kulturmedium und dem Zellkörper der Bakterien gewinnt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame Fraktion gewonnen wird, indem man Bordetella pertusis in einem flüssigen Kulturmedium kultiviert, daß man eine überstehende Flüssigkeit von dem kultivierten Medium abtrennt, daß man die so erhaltene überstehende Flüssigkeit zwecks Gewinnung eines Filtrats unter sterilen Bedingungen filtriert, und daß man das so erhaltene Filtrat zwecks Gewinnung der wirksamen Fraktion durch Ultrafiltration oder Chromatographie extrahiert.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame Fraktion gewonnen wird, indem man Bordetella pertusis in einem flüssigen Kulturmedium kultiviert, daß man den Zellkörper von Bordetella pertusis vom kultivierten Medium abtrennt, daß man den Zellkörper in einer phosphatgepufferten Salzlösung suspendiert, daß man den Zellkörper aufschließt, daß man die Flüssigkeit, welche den aufgeschlossenen Zellkörper
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enthält, zwecks Gewinnung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert, und daß man eine wirksame Fraktion aus der überstehenden Flüssigkeit durch Chromatographie gewinnt.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die wirksame Fraktion gewonnen wird, indem man Bordetella pertusis in einem festen Kulturmedium kultiviert, daß man den Zellkörper von Bordetella pertusis aus dem Kulturmedium sammelt, daß man den Zellkörper in einer phosphatgepufferten Salzlösung suspendiert, daß man den Zellkörper in der Suspension aufschließt, daß man die Flüssigkeit, welche den aufgeschlossenen Zellkörper enthält, zwecks Erzielung einer überstehenden Flüssigkeit zentrifugiert, und daß man eine wirksame Fraktion aus der überstehenden Flüssigkeit durch Chromatographie gewinnt.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Bordetella pertusis einen Organismus verwendet, welcher Phase HT-, Phase Π- oder Phase I -Organismus von Bordetella pertusis ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Bordetella pertusis in einer Schüttelkultur kultiviert, indem man ein modifiziertes Cohen Wheeler-FlUssigkeitsmedium bei 35 bis 37°C 24 bis 72 Stunden vorwendet.
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7. Verfahren nach Anspruch 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dafi man die Chromatigraphie ausführt, indem man als Adsorptionsmittel DEAE-Cellulose, Cephadex oder DEAE-Sephadex verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als festes Kulturmedium Holzkohle-Agarmedium verwendet.
9. Interferonerzeuger, dadurch gekennzeichnet, daß er nach einem der vorhergehenden Ansprüche hergestellt ist.
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