DE2119443A1 - N-Oxide von natürlichen, doppelstrangigen Ribonucleinsäuren sowie deren Salze, Verfahren zu ihrer Herstellung und Arzneipräparate - Google Patents

Description

¹¹ 17-Oxide von nat-ürlj^.v τ, doppelstrangii,cn Ribonucleinsäuren sov/ie deren Salze, Verfahren zu ihrer Herstellung und Ar sine ipräpar ate "

Priorität: 23. April 1970, Grossbritannien, ITr. 19 44S

Die Erfindung betrifft eine neue Klasse von Interferon induzierenden Verbindungen, nämlich Ii-Oxide von natürlichen, doppelstrangigon Ribonucleinsäuren sowie deren Salze, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung al« Araneipräparate.

Es hat sich gezeigt, dass aus den verschiedensten Steffen ge— winnbare doppelstrangige Ribonucleinsäuren (RlTS) bei Tieren antivirale Aktivität besitzen. Doppelstrangige Ribonucleinsäuren mit antiviraler Aktivität können z.T.. aus Viruspartikeln extrahiert v/erden, die in bestimmten infiaisrten Pilzen vorhanden sind, z.B. in bestimmten Pilzen der Gattung Penicillia, nämlich P. chrysogenum, P.stoloniferum, P. funicolosum und P. cyaneofulvum.

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Es wurde noch von einigen anderen Viren. burial·!-. b_i aus äntivirale, dojjpelstrarigige Ribonucleinsäuren extrahiert werden können. Es sind dies Sugar Beat icllow Virus, Rico JJv/arf Virus, Reovirus 3 und sehliesslich ein Cytoplasm ic Polyhcdrosis Insect Virus (obwohl in diesem letzteren Fall die Autoren die genaue Herkunft der eytoplasmatischen Pol;/hedro£cviron nic'it angeben ■- Proc. Soe„ Exp, Biol. and led. 122 (1969), S. 2.).

Ausser aus den genannten Substanzen wurden dojrpelstrangige Ribonucleinsäuren mit antiviralor Aktivität aus der replikativen Phagenform von HS2 aus E. coli, der replakativen Phagenform von KU9 aus E. coli und der replikativen Phagenform von Pseudononas aeroginosa extrahiert.

In-der Mehrzahl der genannten Fälle wurde bestätigt, dass die äntivirale Wirkung der doppelstrangigen Ribonucleinsäuren auf die Stimulierung der Interferonproduktion in den tierischen Zellen zurückzuführen ist. Eicht die doppel&traagi&e RlJS selbst wirkt als aktives antivirales Agens, sondern das von den Zellen als Reaktion auf die Verabreichung der RMS erzeugte Interferon. Aus diesem Grund scheint es exakter zu sein, von den doppelstrangigen Ribonucleinsäuren s,ls "Interferon-Induktoren" als von "antiviralen Agentien" zu sprechen.

Man hat erkannt, dass doppelstraijgige Ribonucleinsäuren bei der Prophylaxe und in geringerem Umfang bei der Therapie von Virus-Infektionen bei Tieren und Menschen wertvoll sein können. Es besteht jedoch Grund zu der Annahme, dass die medizinische Anwendung von doppelstrangiger RIiS natürlichen Ursprungs begrenzt ist, da doppeistrangige RIiS in der Form, in der sie aus natür-

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lic ei; Quollen cztrahiert wird, bestimmte toxische litbonv.'ij.'ki;.)'.!. gen zeigt, die anscheinend mit zuirjhnendcr Dosierung stärker hervortreten. Es wurde nun erfindungsgemäcs festgestellt, dass bestirnte Derivate von doppelstraiigigor. Hibonuclcinnäu-'-ei] natürlicioii Ursprungs weniger toxisch cind als die "betreffendoi natürlichen ilibonuclelnGäu^cn seibot und Ciooh deren ctarke Interferon induKiereude Aktivität behalten.

Geg&üctanü. der ISrfindung aiiid dengeraäss l*^r~O;eide von natü: doppelctrangigen Ribonucleinsäuren und deren Salze, wobei die K-Oxido und die Salze selbst doppelstrangig l±. 1,

Die Salze der erfincungsgemä.ssen ΪΙ-Oxide von natürlichen doppelatrangigen P.ibojiucl einsäur en können Ammonium- oder Alkaliliietallsalze, z.B. Natrium- oder Kaliumsalze, Salze mit organischen Das en, wie Amine, und Salze ir.it mehrbasigen organischen Substanzen, z.B. Poly lysin und *" "/'-Joxtrah', ' a ein.

Der hier verwendete Ausdruck "natürliche doppelstrangige Ribonucleinsäuren" betrifft nur doppelstrangige Ribonucleinsäuren natürlichen Ursprungs, z.B. die oben angeführten, und schliesst synthetische doppelstrangigc Ribonucleinsäuren, wie Polyr.nosin--: Polycytidylsäure (Poly τ -.Poly G), Polyadenyl-: Polyuridylsäure (Poly A: Poly U) oder PoIyguanyl-: Polycytidilsäure (Poly G: Poly C^-), nicht ein. Aur:serdern bezieht sien der Ausdruck "doppelstraügig" auf die Tatsache, dass zwei getrennte RibonucieinöUurciaoleküle durch '»asserKtoffbrückenbindung zwischen einigen oder j'.llen Basen längs des i-Ioleküls assoziiert sind. Solche doppeIstrangigen IMbonuclsinaäurcn sind relativ unempfindlich gcgenfber der Wirkung von .ilibonuclease im Gegensatz zu ein-

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strangigen Ribonucleinsäuren.

Die chemische Identität der W-Oxide der Erfindung ist für den Fachmann, der mit der Struktur von Ribonucleinsäuren vertraut ist, leicht zu verstehen. Eine Ribonukleinsäure ist ein Poli^r~ nucleotid. Das Molekül besteht aus sich wiederholenden Eibose/ Phosphateinheiten, die das Gerüst bilden, mit einer Pyrimidin- oder Purinbase, die an jede Riboseeinheit gebunden ist. In den natürlichen Ribonueleinsäuren, auf die sich die Anmeldung bezieht, 'ist eine von vier verschiedenen Basen an jeden Zuckerrest gebunden, nämlich Adenin, Cytosin, Uraci.1 JLid Guanin. Die Basenreste des Ribonucleinsäuremoleküls haben folgende Struktur formel:

Adenin (A)

Cytosin (C)

Uracil (U)

In jeder dieser Formeln ist .die freie Stickstoffvalcnz an einen Zuckerrest im Uucleinsäuregerüst gebunden. Ribonucleinsäuren unterscheiden sich in ihrem Molekulargewicht und in der Basensequenz entlang des Zucker/Phosphat-Gerüstes.

In den doppelstrangigen Ribonucleinsäuren sind zwei einstrangige Ribonucleinsäuren durch Wasaerstoffbrückenbindungen assoziiert. Eine Adeninbase eines Stranges ist an eine Uracilbase des anderen Stranges gebunden und eine Cytosinbase des einen Stranges an eine Guaninbase des anderen Stranges.

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Theoretisch können die oben beschriebenen Basenradikale alle in-die entsprechenden K-Oxide verv/andelt v/erden:

NH,

OH

H₂ JL

O -N

" Auf diese V/eise können die doppelstrangigen Ribonucleinsäure-H-Oxide der Erfindung theoretisch in fünf hypothetische Gruppen unterteilt v/erden:

a) Solche, in denen Adenin als einzige Base oxidiert ist.

b) Solche, in denen Cytosin als einzige Base oxidiert ist.

c) Solche, in denen Guanin als einzige Ba'se oxidiert ist.

d) Solche, in denen Uracil als einzige Base oxidiert ist.

e) Solche, in denen awei oder mehr der vier Basen oxidiert sind.

In der Praxis weiss man jedoch, dass die Uracilbasen nicht in grösserera Umfang oxidiert werden und dass, wenn nicht sehr milde, selektive Oxidationsbedingungen verwendet werden, die Adenin~, Guanin- und Cytosinbasen im gleichen Molekül alle in mehr oder weniger grossen Umfang oxidiert werden.

Ausserdem ist es klar, dass für jede gegebene doppelstrangige Ribonucleinsäure verschiedene Oxidationsgrade möglich sind, angefangen von Η-Oxiden, in denen nur ein sehr geringer Anteil der gesamten oxidierbaren Basenpositicnen oxidiert ist, bis zu solchen, bei denen die Hehrheit der oxidierbaren Basenpositionen oxidiert ist. Im Rahmen der Erfindung wurde festgestellt, dass mit zunehmendem Oxidationsgrad, d.h. mit steigender Anzahl von

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',.oxidierten Basenposition on, das doppelstrangi/jo liolekül mehr und mehr dazu neigt, sich in einstrangiges Material aufzutrennen. Da sich die Erfindung nur auf solche Ii-Oxide bezieht, die selbst doppelstrangig sind, folgt daraus, dass die ϊί-Oxide der Erfindung mindestens einige nichtoxidierte Basenpositionen aia Molekül aufweisen.

Zur Messung des Oxidationsgrades der doppelstrangigen K-Oxide der Erfindung v/ird ein empirisches Verfahren verv/endet. Das ) UV—Spektrum einer natürlichen, doppelstrangigen Ribonucleinsäure v/eist eine starke; AboG^pfcionsbande bei 258 rau und eine schwache Absorptionsbande bei 250 mu auf. Mit zunehmender Anzahl von oxidierten Basenpositionen im doppelstrangigen Molekül nimmt die Absorption bsi 230 rau zu, während sie bei 258 mu abnimmt. Aus diesem Grund ist das Verhältnis der Absorptionsmaxima ein Mass für den Grad der Ιϊ-Oxidation der doppelstrangigen Piibonucleinsäure, d.h. das Verhältnis:

Absorption bei 230 mu
Absorption bei 258 mu

steigt mit steigendem Oxidationsgrad.
(Dieses Verhältnis v/ird im Folgenden als A geschrieben).

Zwei andere von uns verwendete Parameter zur Messung des Oxidationsgrades der Materialien der Erfindung sind die llyperchromizität des Materials und sein Tm-Wert. Diese Parameter v/erden durch Aufzeichnung der UV-Absorption des Materials bei einer bestimmten Wellenlänge erhalten, während die Temperatur allmählich gesteigert wird. Die UV-Absorption einer doppelstrangigen EKfS bei 258 mu ist immer geringer als die Absorption

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des gleichen ilaterials in einstrangiger Form bei derselben Wellenlänge. Hit steigender Temperatur'des doppeistraurigen Materials v;ird die Was sera torf bindung zwischen den Strängen immer schwächer, bis sich schlieaslich die Stränge trennen. Daraus folgt, dass die UV-Absorptioii eines doppelstrangigen Materials mit steigender Temperatur abnimmt. Die Differenz zwischen den beiden Grenzwerten der Absorption, ausgedrückt als Prozentsatz der Absorption des doppelstraaigigen Materials, wird als die "Hyperchromizität" dieses Materials bezeichnet.

Wird also die UV-Abs-^r^t ion bei 258 iau der Ϊί-Oxide der Erfindung gegen die Temperatur aufgetragen, so stellt man fest, dass die Absorption bei hohen Temperaturen grosser als bei niedrigen Temperaturen ist. Die Absorptionszunähme geht allmählich vor sich,und es ist möglich, eine Temperatur zu bestimmen, bei der die Absorption in der Mitte zwischen der Absorption des doppelstrangigen Materials und des einstrangigen Materials liegt. Diese Temperatur wird als Tm des N-Oxids bezeichnet und hängt vom Oxidationsgi'ad ab. Es wurde festgestellt, dass der Tm-V,^Tert mit steigendem Oxidationsgrad abnimmt.

Ausserdera kann ein Η-Oxid der Erfindung hydrolysiert werden, um das Material in seine einzelnen Nucleotidbestandteile (sowohl oxidierte als auch niclitoxidierte) zu zerlegen. Die relativen Verhältniese von nichtoxidierten Basen zu oxidierten Basen können dann rechnerisch bestimmt werden. Dadurch kommt man zu einer direkten Charakterisierung der H-Oxide der Erfindung.

Zusammenfassend kann man sagen, dass die Erfindung eine neue Klasse von Derivaten von doppeistrangigen Ribonucleinsäuren

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zum Gegenstand hat, nämlich die li-Oxide. Diese neue Klasse von Ii-Oxiden enthält eine grosse Anzahl von verschiedenen If-Oxiden, - die sich in der Anzahl der oxidierten Basenpositionen, d.h. dem Oxidationsgrad unterscheiden. Es wurden zwei Paravaeter gefunden, nämlich das Verhältnis der UV-Absorption 230 mu zu 258 rau und der Tm-viert, die als Mass für den Oxidati ons grad verwendet v/erden können, während die relativen Verhältnisse von nichtoxidier— ten und oxidierten Basen direkt berechnet v/erden können.

Eine spezielle Unterklasse von Η-Oxiden der Erfindung hat wegen ihrer hohen antiviral¹ en Aktivität gegen eine grosse Anzahl von Viren und ihrer geringeren Toxizität im Vergleich zu den natürlichen Ribonucleinsäuren besondere Bedeutung. Es handelt sich dabei um doppelstrangige li-oxidierte Ribonucleinsäuren und deren Salze, welche dadurch charakterisiert sind, dass die Uracilbasen ia wesentlichen nicht oxidiert sind und dass 5 bis 40 Prozent der Adeninbasen, 5 bis 60 Prozent der Cytosinbasen und 5 bis 70 Prozent der Guaninbasen oxidiert sind. Der doppelstrangige Charakter der IT-Oxide geht bei hohem Oxidati ons grad

^w verloren, aber es ist leider nicht möglich, eine allgemein anwendbare obere Grenze für den Oxidationsgrad anzugeben, oberhalb welcher einstrangiges Material erhalten wird. Eine·solche obere Grenze hängt von vielen Paktoren ab, insbesondere von der Temperatur und der als Ausgangsmaterial verwendeten Ribonucleinsäure.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung der neuen ii-Oxide von doppelstrangigen Ribonucleinsäuren und deren Salzen, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass eine doppel-

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strangige Ribonucleincäure oder deren Sals rait V/asserstoffperox! d oder einer Persäure umgesetzt wird.

Als Persäuren können z.B. Peressigsäure, Perbenzoesäure, Ilonoperpht"aalsäure oder m-Chlorperbenzoesäure verwendet werden. m-Chlorperbensoesäure ist bevorzugt, da bei ihrer Verwendung die Reaktion glatt und kontrollierbar abläuft.

Die Reaktion wird üblicherweise in einem für die doppelstrangige Ribonucleinsäure geeigneten Lösungsmittel durchgeführt. Geeignete Lösungsmittel sind üblicherweise leicht alkalisch, um die Lösung der Ribonucleinsäure zu erleichtern, z.B. ist Kaliumacetat in Wasser und Äthanol bei einem p^-Wert von etwa 8 ein geeignetes Reaktionsmedium. In diesem Fall erhält man das Produkt in Porm des Kaliumsalzes.

Die Temperatur, bei der die Reaktion stattfindet, ist für das Verfahren der Erfindung nicht entscheidend. Vorzugsweise werden sehr niedere Temperaturen, bei denen die Reaktion extrem, langsam abläuft, und sehr hohe Temperaturen, bei denen man Gefahr läuft, die Doppelstrangigkeit der Ribonucleinsäuren zu zerstören, vermieden. Im allgemeinen sind Temperaturen von etwa 20 bis 25°C sehr zweckmässig, obwohl sich auch Temperaturen von 5 bis 5O⁰C eignen.

Die Reaktionszeit hängt von dem erforderlichen Oxidationsgrad und der Temperatur des Reaktionsgemisches ab. Viird eine Reaktionstemperatur von etwa 20 G verwendet und die Reaktion mit ni-Ghlorperbenzoesäure als Oxidationsmittel durchgeführt, so steigt der Oxidationsgrad des Produktes allmählich über einen

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'Zeitraum von einigen Stunden an. Unter diesen Bodinrunrrcn erhält man im allgemeinen nach etwa 16 Standen einötrangJ^e N-Oxide, wenngleich anzumerken ißt, dass der genaue Zeitpunkt, an dem einstrangiges Ilaterial erhalten wird, in s ta deem Umfang von den anderen -Realctionsparamctorn· abhängt.

Die N-Oxide der Erfindung können aus dem Keaktionsniedium durch Fällung mit nichtlösenden Flüssigkeiten gewonnen werden. Sin geeignetes Pällungsmittel für die Ji-Oxide ist Äthanol. Der Kie- W derschlag selbst wird zweckdienlich durch Zentrifugieren gewonnen. Alle allgemein üblichen Reinigungsverfahren für Nucleinsäuren können für die erfindungsgemässen ii-Oxide und deren Salze verwendet werden, z.B. Chromatographie und Elektrophorese.

Es gibt einige Hinweise dafür, dass die Ribonucleinsäuren natürlichen Ursprungs in Wirklichkeit Gemische aus zwei oder mehr Ribonucleinsäuren sind. Z.B. spalten einige Pilz-Ribonucleinsäuren bei der Polyacrylamid—Gelelektrophorese in bis zu 5 Banden auf. Demgenäss bezieht sich die Erfindung auch auf Ii-Oxide von solchen Ribonucleinsäure-Genischen. Es ist manch-, mal möglich, die II-Oxide selbst durch Elektrophorese in 2 oder mehr verschiedene Banden aufzutrennen.·

Wie schon erwähnt, sind die doppelstrangigen IT-Oxide der Erfindung in der lage, bei Tieren und Menschen die Interferonproduktion zu induzieren. Diese Η-Oxide sind im allgemeinen weniger toxisch als die natürlichen Ribonucleinsäuren, aus denen sie gewonnen v/erden, wie durch Toxizitätsuntersuchungen an Tieren, wie Mäusen, gezeigt werden konnte, aber sie weisen trotzdem eine starke antivirale Aktivität auf. Da Interferon im wesentlichen

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ein nichtspezifisches an ti\^ri rales I-Iittel ist, folgt daraus, de.cs die ii-Oxide der Erfindung bei der Prophylaxe und der Therapie einer gronsen Anzahl von Virusinfect ionen wertvoll sind, z.B. bei Infektionen durch den Coxsackie-Virus, Scnliki Forost-Virus, Pockenvirus, I'Iaul- und Klauenseuche-Virus, Vescieulären Stonatitis-Virus, !L'ollwutvirus und Grippevirus.

Deshalb betrifft die Erfindung auch Arzneipräparate-, welche aus einen oder mehreren doppelstrangigen 2-Oxiden von doppelstrangigen natürlichen Ribonucleinsäuren oder deren nichttoxisehen Salzen und gegebenenfalls einem oder mehreren pix&rmakologisch verträglichen Trägeratoffen und Verdünnungsmitteln bestehen.

Das Arzneipräparat der Erfindung kann als Aerosol, z.B. zur intranasalen Verabreichung, als injizierbares Arzneipräparat zur intraperitonealen Injektion oder in einer zur lokalen Anwendung geeigneten Form vorliegen, wobei natürlich die Verabreichungsform der ITatur der Infektion angepasst wird. In allgemeinen sind die Arzneipräparate der Erfindung besonders wirksam bei der Prophylaxe von Virusinfektionen, wenngleich sie auch bei * der Behandlung von solchen Infektionen wirksam sind.

Die ll-Oxide und die entsprechenden Arzneipräparate der Erfindung eignen sich auch als Immunosuppressiva oder als Hilfsstoffe zur Verstärkung der Iiamunreaktion.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

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·■" _L t_ ^mmm

B e i s ρ i e 1 1

Penicilliun clirys'jgenuni A.I'. CC. 10 002 wurdo .folgend creaseen gezüchtet:

Spo yj^nb i l·.:.endeg A^rν: g/Liter

Glycerin 7,5

Schwarze llelasse 7,5

Hefoextralct 5,0

NaCl 10,0

.7H₂O 0,005

0,0C6

_2454242O 0,0016

CuSO,.5H₂O u,0001

CaSO^ 0,25

Agar 2C,0

Das liälirraediun wurde nit enfcionisierten Vfesaer auf^c-füllt und auf den p^-V/ert 6,6 eingestellt. Jeweils 40 ml dos Ijährmoäiuns wurden in Flaschen von 225 ral Passung η ν er mögen gefüllt, lüc Flaschen v/urden mit Baumwollpfropfen verschlossen und 15 Hinuten "bei 121 C sterilisiert.

Die rlährmedien vrardoaj dann in Porüi von cchräßen flächen, nit

sterilisiei^tur

der in/irae aufbeviahrten Vorratslcultur angeimpft und. bis- sur guten Sporenbildung bei 26 C inkubiert.

Flaschenkulturen auf Gerate

Mit Baunwollpfropfen verschlossene Thompson-Plascliuu, v.'ülehe ,jeweils 150 g Vollkorngerste enthielten, wurden 2 Stunden bei 121 c stez'ilisiert. Die Sporen aus oincr Schräc^ultur A-.'iii\1on in 25 ml einer 3 Gewic-itsprosent Glycerin und 0,1 Gewieher·pi*o;:ent Asparagin enthaltenden Lösung suspend j ort. Mit diesem Geiiiiccii wurde die Ger,s.,t,e ,von 5 Thompnonflascien angeimpft luid ,jede

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he v/urde mit weiteren 5? nl des Suspcnclierniediuina vercetzt, Die Flaschen wurden box 26⁰C inkubiert und von Hand ;jüden 'Jag ungeschüttelt, bis gute Sporenbildung eintrat, üblicherweise nach 3 bis 4 "Tagen. Die flaschen konnten einige Monate bei 2 bio 3 C gelagert werdeii.

Gew. ■·<$

Glycerin 0,5

Glucose 0,5

Trypton 0,25

Bakteriologisches Pepton 0,25

Hefeextrakt 0,125

Maisquellwasser 1,25

K₂IIPO₄ 0,1

NaCl 0,5

Schaunibreinsen.deω Mittel *) 0,03 Pg-V/ert auf 7,0 eingestellt.

*) Es v/urde eine lOprozentige Lösung eines Handelsproduktes (Pluronic 181) in Sojabohnenöl verwendet. Das Uährmedium wurde mit Leitungswasser aufgefüllt.

Vegetative Anzucht

75 Liter des Nährmediunis wurden in einem 100 Liter fassenden, mit Prallplatten versehenen Fermenter aus korrosionsbeständigen Stahl sterilisiert. Eine durch Zusatz von 100 ml steri~ lern V/asser mit 0,01 Prozent oberflächenaktivem Mittel zu einer Thompsonflasche unter Schütteln erhaltene Sporensuspension v/urde zum Aniiapfen des Ferment er s verwendet. Man inkubierte 56 Stunden bei 26 C unter Belüften und Rühren.

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_fev .

Züchtun."

1500 Liter des Fermentation;:; medium 3 wurden in einem :.iit Prallplatten ausgestatteten .?qr:.ionter nit 2000 Liter Pas sung svermögen aus korrosionsbeständigem Stahl sterilisiert. Man impfte mit 75 liter der Anzuchtkultur ar. und inkubiarte 5 Tage unter Belüften und Rühren' bei 26⁰C.

Das gesamte Fercentatioris/nediuni (1500 Liter) v.airde durch Zentrifugation geklärt und das I-Iyeel wurde verworfen. Dar; gekühlte Filtrat der Kultur v/urde mit 300 g handelsüblicher Ribonuclein- ^w in Form des

säure /Natriumsa^es,£pl >"rt in 20 Litern Y/asa er, versetzt. Dann wurde das Gemisch unter Verwendung von 25prοζentiger (Vol./Vol.) Schwefelsäure auf den Pj~-Y/ert 4,0 angesäuert und mit 0,5prozentiger (Gew./Vol.) Diatomeenerde-^ilterhilfe versetzt. Nach 30-minütigem Rühren wurde das Gemisch mit einer PiIterpresse gefiltert. Die in der Presse zurückgehaltenen ü'estctoffe wurden mit 100 Liter Citratpuffer vom p_H-Uert 4,0 (1,205 g Tr!natrium-. citrat und 1,235 g Citronensäure pro Liter) gewaschen,und die

. Waschflüssigkeit v/urde verworfen. Die gewaschenen D'eststoffe

wurden mit 150 Liter 2prozentiger (Gew./Vol.) Hatriumbicarbonatlösung extrahiert, indem die Lösung 1 Stunde im Kreislauf durch die Filterpresse geleitet v/urde.

Der so erhaltene Extrakt wurde durch Heinbranfiltratj on (Gesamtoberfläche 3120 cm ) auf 5 Liter konzentriert, und das Konzentrat v/urde durch einstündiges Zentrifugieren bei 23000 g geklärt. Bei 186 000 g wurden virusähnliche Teilchen sedimentiert und nach dem folgenden Verfahren gereinigt.

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^U^elcien aus roh on, vir-UücibrilicLen !artikeln v.'urden in ruf f--;r~ lösung (0,01 η ^rx¹rirj(-"_i;-droxii::.:-ta7l)aniino:nGth.an, 0,15 Ki I.atriuncjilorid liiit 10 ug/ml Penicillin G und 50 jig/inl !uconycin) aus-Twridiyri ,v.nö. feinverteilte Verunreinigungen wurden durch drcissignnniHig·^ Zoj'itrifu^iercii bsi 12 OGO g entfernt. :cino v/eitorc Keini^an^ wurde durch Aufbringen der Suspension auf eine lOpro- £!entire iraco-iarocolüsung uiiu unraittelbar darauffolgendec neunai^rninilticoH Zentrifugieren bei 186 000 g erzielt. Die i.'Ugelclicii vrtirdon v.'ie oben beticbrieben wieder suspendiert und bei 12 000 g a

Aus diesen gereinigten virusähnlichen -eilchen wurde dann doppelstrangige Ribonucleinsäure durch Behandlung mit einem Detergent und lhenöl freigesetzt. Dazu wurde 0,1 Prozent (Ge-././Vol. ) liatriundodecylsulfat zugesetzt und die Suspension 45 Minuten bei 37 0 mit einen gleichen Volumen an phenolgcsättigt-em Puffer extrahiert. Die Phasen wurden durch Zentrifugieren bei 500 g getrennt und weitere Pheiiolextraktionen wurden bei 20 C durchgeführt, bis bei 2 aufeinanderfolgenden Extraktionen eine klare Grenzfläche erhalten wurde. Sobald die Entfernung der Eiweißstoffe vollständig _war> v.'urde das Phenol durch Äther extrakt ion entfernt, der Puffer auf eine liatriuniacetatkonζentration von 0,2 m gebracht und dann die doppelstrangige E]CS durch Zusatz von 2 Volumina wasserfreiem Äthanol gefällt. Das Gemisch wurde bad -20° C zur vollständigen Ausfällung aufbewahrt. Las I-iaterial konnte in dieser Form bleiben, bis es benötigt wurde, oder es konnte in iris-Puffer aufgenommen und lyophilioiert werden.

ÖAÜ

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20 mg von auf diese V/eiso erhaltener doppeistrangiger RIiS wurden in 20 ml 0,4 πι Kaliumacetat vom p„-V/ert 8,2 gelöct,und eine Lösung von 500 mg m-Chlorperbenzoesäure in 10 ml Äthanol wurde - zugesetzt. Dieso Lösung Ij ess man eine Stunde bei 20 C stehen,

dann wurden 60 ml Äthanol zugesetzt. Der auf diese './eise erhaltene niederschlag aus Η-oxidierter RIiS wurde dux"ch Zentrifugieren abgetrennt und mit Äthanol "gewaschen*

Eine Probe des Niederschlags aus !!--oxidierter EHS wurde in " 0,4 πι wässriger Kaliumacetatlösung vom p™—V/ert 8,2 gelöst und das Verhältnis A ττετγ-',' v/urde gemessen. Dieses Verhältnis wur— de dann auch für das doppelstrangige PJTS-Auegangsmaterial bestimmt, und die zwei 3rgebnisse wurden verglichen:

A -2y L fü_r (Xq₁Q doppelstrangige IIRS-Ausgangsmaterial = 0,45; 258 rrru

ru

258 mu

für IT-oxidiertes Produkt = 0,57.

Eine zv/eite Probe von IT-oxidier tea Produkt wurde dann an- einer Sepharose 2B-Säule (Gelfiltration) chromatographiert. Dazu wurde eine 90 cm lange Säule mit einem Volumen von etwa 500 ml bei einem Innendurchmesser von 2,5 cm verwendet. Die Säule wurde von unten nach oben mit einem 0,15 m Natriumchlorid und 0,005 MagnesiumChlorid enthaltendem 0,05 m Iris-Puffer vom pjT-V/ert 7,5 mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 0,4 ml pro Minute eluiert. Fraktionen von ^ev/eils 7,2 ml wurden gesamr.ielt und auf ihren Gehalt an Ii-oxidi3rtein Produkt durch Bestimmung der UV-Absorption bei 258 ηψ. untorcucht. Ss v/urde festgestellt, das.'3;das Produkt aus der Sepharose 23-Si^:ulc in den glcichon Fraktionen wie das doppe] ütrangi^e RK^TS-Auo_t;;.-aigömateri;ü eluiert

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.. ,-. - SAD OWG'INAL

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wurde, vas am-; α igt, daas öac ^-oxidierte- Produkt dasselbe Molekulargewicht und das gleiche I-Iolekulargerüst v/ie das Ausgangsmaterial aufweist und deshalb vollständig doppeistrangig ist.

Eine dritte Probe des IT-oxidierten Produktes wurde dann der Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen. Diese wurde unter Verv/endung eines 4prozentigen Acrylamidgels und eines mit

• Essigsäure auf den p^-V/ert 7,8 eingestellten 0,04 m Tris-Puf-

Äthylendiamintetraessigsäure war, fers, der 0,02 m an llatriumacetat und 2 nano-molar an Natrium- / durchgeführt. Die Elektrophorese wurde in einem Rohr von 0,6 cm innerem Durchmesser ->ηΊ 10 cm länge bei 20⁰C durchgeführt. Ein bis drei.Stunden lang wurden 10 Volt/cm bei 5 mA/Gel angelegt. Das Gel wurde entnommen und mit einer Methylenblaulösung angefärbt. Das Verfahren wurde für das doppelstrangige RIiS~Ausgangsmaterial wiederholt ,und die Ergebnisse wurden verglichen. Bs wurden zwischen den in den beiden Fällen erhaltenen Banden Unterschiede festgestellt. Die Hauptbande im N-oxidierten Produkt wanderte kaum im Gel, während das Ausgangsmaterial eine grössere Beweglichkeit zeigte und in drei Banden aufspaltete. Dies scheint ein Hinweis auf die Aggregation des N-Oxids im Vergleich zum Ausgangsmaterial zu sein.

Von einer vierten Probe des N-oxidierten Produktes wurde die Hyperchromizität und der Tm-Wert bestimmt. Die Messungen wurdwurden in 1 cm-Küvetten in einem Unicam Sp. 800 B-Spektrophotometer durchgeführt. Die Probe war in einer 1 Prozent Äthylenglycol enthaltenden 0,03 η wässrigen Natriumchloridlösung gelöst. Die Lösungstemperatur wurde jede Minute um ein halbes Grad Celsius angehoben und die UY-Absorption wurde gegen die

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Zeit aufgetragen. Es wurde festgestellt, dass das IT-oxidierte Produkt einen Tm--V/ert von 79 C und eine Hyperchroniiaität von 34,6?rosent aufwies.

Da.s Η-oxidierte Produkt schützte Mause bei intraperitonealer Verabreichung von 10 und 100^ pro Haus, die 24 Stunden später mit Sncephalomyokarditis-Virus ebenfalls durch intraperitoneale Verabreichung infiziert v/urden. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengestellt:

Tabelle I

IT-Oxid dosis	Virus dosis	Sterblichkeit innerhalb von 12 Sagen, bei Tie ren, denen IT-Oxid ver- abreiciit worden war	Sterblichkeit inner halb von 12 Tagen bei Kontrolltieren, denen kein H-Oxid verabreicht worden war
ίο <r	ΙΟ-*	5/10	9/10
ίο r	ΙΟ"5	0/10	8/10
100 y Q	10~5	2/10	8/10

Die Hause wurden auch gegen Semliki Forest-Virus und Coxsackie-Virus geschützt:

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Tabelle TI

Aktivität von K-Ozcid gegenüber SoLiliki Forsst-ViruG und Coxoackie-Virus (COX)

:K-Oxid- xlosi.s	Virus dosis	* Sterblichkeit inner halb von 12 Tagen, bei Tieren, denen Ίί-Oxid verabroi eilt worden λ-zar	Sterblichkeit inner halb von 12 r.L'a,;;on bei i-ontrolltieren, denen kein N-Oxid verab reicht worden v/ar
10 fr ioy 10 f	SW 10"5 SPY ΙΟ*""1" SPV 10~5	9/10 8/10 5/10	10/10 10/10 10/10
10 </' 10 ^ 10 ^	COX ΙΟ*"1 0OX 10"2 COX 10~3	6/10 5/10 2/10	10/10 7/10 4/10

Die Wirkung dec !!-oxidierten Produktes auf die Iramunreaktion von Hausen wurde folgendermassen untersucht:

Mäuse wurden durch intravenöse Injektion einer lOprosentigen Suspension von roten Blutkörperehen von Schafen immunisiert. Die zn untersuchende Verbindung wurde gleichzeitig auf demselben Wege injiziert.

Die Wirkung der Verbindung v/urde drei Tage später mit Hilfe der "lokalisierten Hämolyse in Gel-Kethode" bestimmt, dieses Verfahren ist eine modifizierte Version der "Jerne-riaque-Bestiralaung", beschrieben von Jerne, Horden und Henry in "Cell Bound Antibodies" Wistar Inet. Press, Philadelphia (1963), S. 109, Herausgeber Arnos und Koprowski).

Kach der Tötung der Käuse wurden die Ililaorgane entfernt und zur Freisetzung c.er Lynphoidzellen zerkleinert. Die HiIsorgane von je 5 Käusen wurden für jede untersuclrte Verbindung ver-

10

5/1956

ORIGINAL

einigt. ITach geeigneter Verdünnung in !währiiüdium wurden "0,1 ml Suspension von Hilzzellen mit flüssigem Agar und roten Blutkörperchen von Schafen vermischt und in dünner Schicht in eine Petrischale gegossen, lach zweistündiger Inkubation "bei 37°C ν/aren aus einigen Zellen Antikörper in das umgebende Agar diffundiert. Ss folgte ein Zusatz von Meerschweincheiißerum zur Auflösung der roten Blutkörperchen des Schafsblutes in den Bereichen, v/o Antikörper vorhanden waren. Hach weiterer Inkubation zur Auflösung der roten Blutkörperchen wurden die Platten F unter einen Kolonienzäiiler (Verstärker mit indirekter Lichtquelle) gebracht ,und die Flächen mit Auflösung ("Plaques") wurden gezählt. Diese erschienen als klare Flächen gegen den trübroten Hintergrund von nichtgelösten roten Blutkörperchen.

An einer Probe der Zellsuspension wurde nach Herstellung einer Agarplatte eine Zellzählung durchgeführt. Die Ergebnisse werden als Plaque-bildende Zellen (PFC) pro Million Hilzzellen oder pro Milz angegeben.

k Die Wirkung der Verbindung (der "immunologische Index") wird. als Verhältnis von PFC/10 bei den behandelten Tieren zu den Kontrolltieren (Verabreichung von Kochsalzlösung) ausgedrückt^ d.h. ein Verhältnis von 1 : 1 bedeutet keine 'Wirkung. Ein Verhältnis unter 1 : 1 bedeutet Immunosuppression und über 1 : 1 Verstärkung der Immunreaktion.
Ergebnisse:

Immunologischer Index: bei 10# - 1,07

bei 100^ =2,29

BAD ORIGINAL

^iA;>i"·'■" -""" 1 0 9 8 4 S / 1 9 S 6

Das ϊί-oxidierte Produkt zeigte also eine verstärkende Wirkung auf die Iramunreaktion.

Die Toxisität des doppelstrangigen KITS-Ausgangsmaterials und des Ii-oxidiert en Produktes v/urde an Mäusen verglichen. Die experimentellen Daten waren folgende:

Tiere:

Stamm

Geschlecht:

Bedingung:

Gewichtsbereich:

Verabreichtes Volumen:

Verdünnungsmittel:

Anzahl der '^iere/Dosis: Ergebnisse .

Mäuse

Charles River Prance S.P.F, (nännlich) </* nicht ausgehungert

20 - 25 g

0,1 ml/10 g Maus

Steriles, Eur Injektion geeignetes V/asser (pyrogenfrei)

Tabelle III

r ... Dosierung	Sterblichkeit von Mäusen, denen das Ausgangsinaterial verabreicht worden war	Sterblichkeit von.Mäusen, denen das N-oxidierte Produkt verabreicht wor den war
30 mg/kg	3/6 - Tod tritt 24 - 72 Stunden nach Ver abreichung ein	0/6
16 "	2/6 »	.0/6
12-8 «	0/6 »	0/6
10,4 "	0/6 »	0/6
8 »	0/6 »	0/6

109846/1356

loxizi tätssyriptome:

Doppel strangige RiTS: Lethargie, SchweiEaabsoiKU-rungen un j'.'aco und Augen, struppiges ?ell, Diarrhöe.

Modifizierte IiKS: "Anaesthesie" für annähernd 2 Minuten nach Verabreichung.

Zustand während der Beobachtungsdauer: gut.

Diese Ergebnisse zeigen klar,- dass das ^-oxidierte Produkt an Hausen weniger stark toxisch als das Ausgangsiaaterial wirkt.

■ Beispiel2

Mach Beispiel 1 erhaltenes doppelstrangiges RIiS-Aus gangsmaterial wurde mit m-Chlorperbenzoesäure unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 oxidiert, mit der Abänderung, dass die Reaktionszeit auf 2,5 Stunden ausgedehnt wurde. Das Verhältnis A ^^ür Ausgangsmaterial und Produkt wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise bestimmt.

A ^fu'^r aas Ausgangsmaterial = 0,45; A H^ für das ll-oxidierte Produkt = 0,61.

Das Produkt wurde wie in Beispiel 1 an Sepharose 2B fraktioniert, und die Hauptmenge wurde in den gleichen !Fraktionen wie das RliS-Ausgangsmaterial eluiert.

Bei der Acrylamid-G-elelektrophorese nach dem Verfahren von Beispiel 1 wurden die gleichen Ergebnisse wie für das Produkt aus Beispiel 1 erhalten.

Das Produkt hatte einen Tm-Vert von 77,5°C und eine Hyperchromi zitat von 34,6 Prozent. Beide Parameter entsprachen den in

1098AS/1 956 sad

Beispiel 1 bestimmten· Werten.

In Dosen von IO und 100 J'wurden 1-iäuse folgendermassen gegen Elicephalomyokarditis-Vxrus, Semliki Forest-Virus und Coxüaclvie-Virua geschützt:

Tabelle IV

En c e phalοmyokard	Virus- dosiü	itis-Virus
IJ-Oxid- dosis	ΙΟ"4 10~5 ΙΟ"5
10/- 10^ 100/-
Sterblichkeit inner halb von 12 ±e,ßen, bei 'fieren, denen ll-Oxid verabreicht v; or den war
5/10 1/4-0 1/10
Tabelle V

Sterblichkeit innerhalb von 12 Tagen bei Kontrolltieren, denen kein Ii-Oxid verabreicht v/ or do η war

9/10 8/10 8/10

Secliki Forest-Virus (S?V) und Coxsackie-Virus (GOX)

H-Oxid dosis	Virus dosis	Sterblichkeit inner halb von 12 Tagen, bei Tieren, denen IT-Oxid verabreicht worden war	Sterblichkeit inner halb von 12 Tagen bei Kontrolltieren, denen kein N-Oxid verab reicht worden war
10 </' 10^ ioy	SFV 10""3 SFV 10"4 SFV 10"5	8/10 8/10 4/10	10/10 10/10 10/10
10/' ίο/- 10/ .	COX ΙΟ"1 COX 10"2 COX 10"3	7/10 5/10 2/10	10/10 8/10 5/10

Immunologischer Index: 10/ : 0,63; 100^ : 1,26 (geraessen wie in Beispiel 1). Die Toxizitätsuntersuchungen an Mäusen wie in Beispiel 1 deuten auf eine verminderte Toxizität im Vergleich zu unmodifizierter doppelstrangiger RNS hin. Die in Beispiel 1 und

10 9845/1956

SADORlGiNAL

2 erhaltenen Ergebnisse waren identisch..

Beispiel 3

Geraäss Beispiel 1 erhaltenes doppeistrangiges RiIS-Ausgangsmaterial wurde unter- den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen mit m-Chlorperbenzoesäure oxidiert, mit der Abänderung, dass die Reaktionszeit auf 5 Stunden ausgedehnt wurde. Wiederum. • wurden die verschiedenen Parameter nach den in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren bestimmt:

A "|'*"ΐηυ: ^für ^^as ^^usS⁸^Ssrnaterial = 0,45;

für das IT-oxidierte Produkt = G,67.

ElU

Das Produkt wurde an Sepharose 2B fraktioniert und die Hauptmenge wurde in den gleichen Fraktionen wie das Ausgangsmaterial eluiert.

Bei der Acrylamid-G-elelektrophorese wurden entsprechende Ergeb-■ nisse, wie beim Produkt des Beispiels 1 beschrieben, erhalten.

Das Produkt hatte einen Tm-V/ert von 75°C und eine Hyperchromizität von 34,1 Prozent.

Hause wurden durch Dosen von 1Oy und 100'^ gegen EMC-Virus folgendermassen geschützt:

109846/ 1 966 ^{aA0 G}

- 25 !Tabelle VI

JT-Qxid- dosis	Virus dosis	Sterblichkeit inner halb von 12 Tagen, bei 'fieren, denen IT-Oxid verabreicht worden v/ar	Sterblichkeit inner halb von 12 Sagen bei Kontrolltieren, denen kein N-Oxid verab reicht worden v/ar
10 ^ 100^	ΙΟ"4 ΙΟ"+	2/10 1/10	ίο/ίο' 10/10

Immunologischer Index: 10j>: 1,30; 100^: 1,17.

Beispiel 4

Gemäss Beispiel 1 erhaltenes doppelstrangiges RMS-Ausgangsmaterial wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 1 mit ra-Chlorperbenzoesäure oxidiert, mit der Abänderung, dass die Reaktionsseit auf 16 Stunden ausgedehnt wurde. A || g^ für das Ausgangsmaterial =0,45

für das N-oxidierte Produkt = 2,22.

Das Produkt wurde an Sepharose 2B fraktioniert und als eine Fraktion mit einem Elutionsvolumen, das etwa dem Dreifachen des für unmodifiziertes Ausgangsmaterial beobachteten Volumens entsprach, eluiert.

Das Produkt war im wesentlichen einstrangig. Es wies eine Hyperehromizität von 10 $ auf und zeigte keinen definierten Tm-Wert.

Das Produkt? zeigte in Dosen von 10 y bei Mäusen nur eine geringe Schutzwirkung gegen EHC-Virus. Immunologischer Index: IQ U: 1,10.

109845/1956

Beispiel 5

Die in den Beispielen 1, 2 und 3 erhaltenen 17-Oxide (als HiT 9, INT 10 bzw. IHT 14 bezeichnet) wurden zur Bestimmung des Basenverhältnisses und des'Oxidationsgrades untersucht.

Die Basenverhältnisse wurden durch achtzehnstündige Hydrolyse von doppelstrangiger Ribonucleinsäure und ihrer Ϊί-Oxidationsprodukte IUT 9, 10 und 14 bei 37°C in 0,3 η 2IaOH bestimmt.. Das Hydrolysat wurde mit JiJLCl neutralisiert und das Gemisch von Nucleosid-2¹,3'-Phosphaten an einer Dowex Ix8-Säule

Maschen (Teilchengrösse: Siebmaschenweite : ^00 /bis 0,076 nun) mit Salzsäure zunehmender Konzentration eluiert. Cytidylsäuren wurden mit 0,003 ή, Adenylsäuren mit 0,005 n, Uridylsäuren mit 0,007 η und Guanidylsäuren mit 0,1 η Salzsäure eluiert. Die Fraktionen mit den gleichen nucleotiden wurden vereinigt und die Nucleotidkonzentration wurde aus der UV-Absorption bestimmt. 17-Oxide von Purinen und Pyrimidinen werden sowohl durch verdünnte Laugen als auch verdünnte Säuren zu Produkten abge-' baut, die im UV" nicht absorbieren, (vergl. J. Gangloff und J.B. Ebel, Bull. Soc. Chim. Biol., 50 (1968), S. 2335) und können deshalb nicht direkt bestimmt werden.

BAD

109845/1958

Tabelle VII

Verbindung	Reaktions zeit der N-"Oxida ti on (-Stunden)	Basenverhältnisse	A	U	. c	G	'/■> oxidierte Basen a	U	C	G
doppelsträn- gige iL;S (nicht oxi diert) IHT 9 IKT 10 HiT 14	C 1 2,5 5	C,97 0,80 0,75 0,70	1,04 1,00 1,00 1,00	0,98 0,74 0,70 0,45	1,00 0,72 0,72 0,36	A	0 0 0 0	0 . 26 30 55	0 28 28 64
0 20 25 30

a__ Das durch Hydrolyse einer vorbestimmten Menge von N-0xidationsprodukten erhaltene Gesafiituridin-2¹,3'-phc^^hat entsprach in jeden Pail dem aus der gleichen Menge an unmodifizierter RNS erhaltenen Produkt, ^ios erlaubt zusammen mit der Beobachtung, dass unter identischen Oxidationsbedingungen Polyribouridylsäure keine signifikante Oxidation erleidet, den Schluss, dass die "üracilrente von doppelstraiigiger RNS nicht oxidiert werden. Die Prozentzahlen für die Oxidation der anderen Basen wurden unter dies ex* Annahme bereiehnet.

Beispiel6 Biologische Daten

A. Schutz gegen Sncephalorayokarditisvirus (EMC) Intraperitoneale Injektionen von 10 ^ig und 100 jag der N-oxidierten" Ribonucleinsäuren INT 9, 10, 14 und 6 (Produkte der Beispiele 1, 2, 3 bzw. 4) wurden in 0,15 m NaCl an Mäuse des Stammes CDI von 16 bis 20g Gewicht verabreicht. 24 Stunden später wurden diese Mäuce auf intraperitonealem Wege- mit EMC in verschiedenen Verdünnungen infiziert. Die Sterblichkeitsquote in den ,folgenden-J.2 Tagen wurde für mit N-Oxid und für unbehandelte

Kontrolltiere bestimmt.

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BAi

- 28 Tabelle VIII

Verbindung	Dosis - pro Hau ß : (jig)	ι Verabreichtej VirusRienge (vielfaches j der LD50)	S t er bli ehkeit in 12 Tagen bei Tieren, denen Ei-Oxid verabreicht worden war	• ■ - ι ^Sterblichkeit j !innerhalb von 12 ■ Tagen bei lion- j trolltieren, denen! kein ii-Oxid verab-i reicht worden war
	10	10	ZlO	16/20
	100	10	2ZlO	16/20
	-ίο - -	20	6ZiO	9Z9
	1	32	5/10	2°Z20
	2,5	32	4ZiO	20/20
;IHT 9 . .ι (Beispiel Ij	5 10	32 32	3ZiO	ο ο OJ OJ O^ O OJ OJ
	20 .;	32	8ZiO	2°Z20
	40	.32	6ZiO '	20/20
	SO		3/8	2°Z20
	10	100	5ZiO	9ZlO
	10	200	7ZiO	10ZlO
	10	2000	10ZiO	10ZiO
	10	1	1ZiO	5/10
	10	10	3Z20	25/30
	100	10	1ZiO	25/30
	1	32	8ZiO	...... 20/20
	2,5	32	5ZiO	20/20
lira ίο	VJI	32	8ZiO	20/20
(Beispiel 2)	10	32	9ZiO	20Z20
	20	32	7ZiO	20Z20
	40	32	3ZiO	2°Z20
	80	32	5ZiO	2°Z20
	10 10	100 1000	14Z20 10ZiO	19Z2O 10ZlO

1098^5/1956

ORiQlMAL

- 29 Tabelle VIII - Portsetzung

Verbindung	Dosis pro Maus tys)	Verabreichte Virusiaenge (vielfaches der LD50)	Sterblichkeit in 12 Sagen bei Tieren, denen IT-Oxid verabreicht worden war	Sterblichkeit innerhalb von 12 Tagen bei Kon trolltiaren, denen kein Ii-Oxid verab reicht worden v/ar
IUT 14 (Beispiel 3]	10 100	10 10	2/10 Vio	19/20 19/20
IHT 6 (Beispiel 4)	10	10	5/io	16/2O

B. Einfluss des Zeitpunkts der Verabreichung des Arzneipräparats auf den Schutz gegen SMG
RNS-li-Oxid (10 jxg pro Maus) und EMC-V ir en (10-fache ID₅₀) wurden wie vorher intraperitoneal verabreicht, aber"der Zeitpunkt der Verabreichung des Arzneipräparats in Bezug auf die Virusinfektion wurde variiert.

Tabelle IX

Verbindung	Verabreichungszeit, in Bezug auf Zeitpunkt der Virus- verabrei chung	Sterblichkeit in 12 Tagen
INT 9 (Beispiel 1)	3 Tage vorher 1 Tag vorher 2 Std. vorher 1 Tag danach	* 6/10 3/10 . .Vio 8/10
IHT 10 (Beispiel 2)	3 Tage vorher 1 Tag vorher 2 Std. vorher 1 Tag danach	6/10 3/10 1Ao 9/10

19/20 der Kontrolltiere, die mit der gleichen Virusmenge infiziert worden waren, aber kein Arzneipräparat erhalten hatten, starben innerhalb von 12 Tagen.

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C. Schutz gegen Coxsacklo Bl (COX) und Semliki Forest (SFY)-Viren

Intraperitoneale Injektionen von 10 ug UJT 9 (Beispiel 1) wurin 0,15 η HaCl an Mäuse vom Stamm CDI von 16 "bis 20 g Gewicht verabreicht. 24 Stunden später wurden die Iläuse mit verschiedenen Verdünnungen von COX oder SFV auf intraperitonealem Vie ge infiziert. Die Sterblichkeitsquote in den folgenden 12 Sagen wurde für behandelte Tiere und nicht behandelte Kontrolltiere bestimmt.

Tabelle X

Virus	Verabreichte Virusmenge (vielfaches der LD50)	Sterblichkeit ,in 12 Tagen bei ^-ie- ren, denen H-Oxid verabreicht wor den war ·	Sterblichkeit inner halb von 12 Tagen bei Kontrolltieren, denen kein l\~0xid verab reicht v/orden war
	50	5/10	11ZH
	500	8/10	10ZiO
SPV	5000	9/io	10ZiO
	50000	10ZlQ	10ZiO
	0,4	2Ao-	4ZiO .
COX	4	5/io	7ZiO
	40 ·	6/10	10ZiO

D. Toxizitätsuntersuchungen an Mäusen

Intravenös

Die Toxizitäten des doppelstran&igen RNS-Ausgangsmaterials und des ll-oxidierten Produktes INT 9 (Beispiel 1) und IHT 10 (Beispiel 2) wurden an weiblichen Mäusen vom Stamm Charles River France S.P.F. von 20 bis 25 g Gewicht verglichen. Die

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BAD ORsG₁ ¹NAiI

Ku Oleinsäuren wurden in 0,2 ml pyrogeiifreicin, sterilem i/aas er verabreicht.

Tabelle XI

Oo sieruns	Kicht modifisierte ds-R:;S Sterblichkeit	( ":>	5:·.■■:· 9 r.oijpiol 1) torblic^keit	UIT 10 (Beispiel 2) Sterblichkeit
8 10,4- 12,8 16 30	G/6 °/6 °/6 /6) Innerhalb ) von 24 bis 3/;g\ 72 stunden	% • °/6 °/6 °/6 °/6	°/6 °/6 °/6 °/6

Intrapevit one al

Die Ϊoxi21 !täten des doppelstrangißen EITS-Ausgangsnaterials und des Η-oxidierten Produktes IKT 9 (Beispiel 1) wurden an Mäusen vom Stamm CDI von 16 bis 20 g Gewicht verglichen. Die Hueleinsäur en wurden in 0,15 η liaCl intraporitoneal verabreicht.

Tabelle'XII

Dosierung

!licht modifizierte RlIS Sterblichkeit in 10 Taren

IJJT 9 (Beispiel 1) Sterblichkeit in 10 Taρ en

10 20 40 60 70

120-

0 0

/8 '/8 78

kein Exitus

⁸/8

^B/8

kein Exitus

⁸/a

⁷/8

kein Exitus

kein Exitus

°/2

°/2

kein Exitus

°/2

kein Exitus

kein Exitus kein Exitus

1 09845/19S6

'/2

'IL

BAD

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. 1-Oxide von natürlichen, doppeistrangigen Ribonucleinsäuren und deren Salze, wobei die Η-Oxide und die' Salze selbst

   - ...doppelstrangig sind,

   2. H-Oxide und deren Salze nach Beispiel 1, dadurch, gekennzeichnet, dass die Uraeilbasen im wesentlichen nicht oxidiert sind, während die Adeninbasen zu 5 bis 40 Prozent, die Cytosinbasen von 5 bis 60 Prozent und die'Guaninbasen von 5 bis 70 Prozent oxidiert sind.

   (-Jl) Verfahren zur Herstellung von N-Oxiden von natürlichen, doppelstrangigen Ribonucleinsäuren und deren Salzen nach

   Anspruch 1 und 2 , dadurch gekennzeichnet, dass eine natürliche doppelstrangige Ribonucleinsäure oder deren Salze mit Wasserstoffperoxid oder einer Persäure behandelt werden.

   4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als Persäure m-Chlorperbenzoesäure verwendet.

   5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4» dadurch gekennzeichnet, dass man als natürliche, doppelstrangige Ribonucleinsäure eine aus einem Pilzvirus erhaltene Ribonucleinsäure verwendet.

   6. Verfahren nach Anspruch 5» dadurch gekennzeichnet, dass man als natürliche, doppelstrangige Ribonucleinsäure eine aus-

   ■ Penicilliura elirysogenum erhaltene Ribonucleinsäure verwendet.

   109845/1956 original inspected

   7.. Verfahren nach den Ansprüchen 3 bis 6,- dadurch gekennzeichnet, dass die Oxidationsbehandlung bis zur Bildung von Ii-Oxiden aus 5 biö 40 Prozent der Adeninbasen, aus 5 bis 60 Prozent der Cytosinbacon und aus 5 bis 70 Prozent der Guaninbasen durchgeführt wird , während die Uracilbasen im wesentlichen unoxidiert bleiben.

   8. .Ar zn ei präparat, welches aus einem oder mehreren doppe1-straiigigen Π-Oxiden von doppelstrangigen natürlichen Hibonucleinaäuren oder deren nichttoxischen Salzen und gegebenenfalls einem oder mehreren pharmakologisch vertraglichen Trägerstoff 021 und Verdünnungsmitteln besteht.

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