DE2463143C2

DE2463143C2 - Polyvalente Rindervirus-Lebendimpfstoffe

Info

Publication number: DE2463143C2
Application number: DE2463143A
Authority: DE
Inventors: Constant Huldenberg Huygelen; Nathan Brüssel Zygraich
Original assignee: Individual
Current assignee: Smithkline Beckman - Animal Health Products Sa
Priority date: 1973-05-14
Filing date: 1974-05-13
Publication date: 1985-04-11
Also published as: GB1430711A; JPS5710845B2; DD112663A5; DE2423129A1; HU169758B; NL7406407A; JPS5052226A; CH589141A5; AR203646A1; IE40924L; FR2229398A1; IE40924B1; FR2229398B1; DE2423129C2; US3927208A; AU6888474A; ES426215A1; CA1039186A

Description

Im wesentlichen wird die in vitro Vermehrungsfahlgkeit bzw. Replikation eines temperaturempfindlichen (is) Virus-Mutantenstammes durch die Temperatur begrenzt, die unterhalb des Temperaturwertes (Hemmiemperatür) liegt, bei der die Infektiosltat wesentlich vermindert ist. Obwohl In vitro erhaltene Ergebnisse nicht ohne weiteres auf in vivo Bedingungen übertragen werden können, wird in einigen Veröffentlichungen angedeutet.

daß ts-Mutanten sich In vivo anders verhalten als Wildvlren; vgl. B. R. Murphy. E. G. Chalhud. S. R. Nusinoff und R. M. Cbanock. J. of Inf. Dis., Bd. 126, Nr. 2 (1972), Selten 170 bis 178.

Dieses Phänomen wurde bei der Entwicklung einiger Lebendvirusimpfstoffe gegen Erkrankungen der

Atmungswege angewendet. Unter besten ts-Bedingungen sollte eine ts-Mutante mit einer Hemmtemperatur Im Bereich der normalen Körpertemperatur fähig sein, sich In der Schleimhaut der oberen Atmungswege (in denen die Temperatur mehrere C° niedriger Ist als In den unteren Atmungswegen und im Körper) zu vermehren, während ihre Vermehrung teilweise oder völlig In den unteren Atmungswegen und Im Körper Inhibien würde. Versuche mit Labortieren und mit Menschen haben gezeigt, daß - wenigstens für einige Viren, die für die

.*» Erkrankung der Atemwege verantwortlich sind - diese theoretische Überlegung durch Versuche bestätigt wurden: vgl. z. B. N. Zygralch, M. Lobmann und C. Huygelen, J. Hyg. Camb.. Bd. 70 (1972). Seilen 229 bis 234. Trcizdem und Insbesondere wegen der hohen Spezlflzltät, die auf diesem Gebiet existiert, war es keineswegs naheliegend, daß das gleiche Prinzip auch auf andere Viren angewendet werden könnte. Insbesondere für Rlnder-Adeno-Viren, wie Adeno-3-Virus, um Mutanten-Stflmme zu bilden, die für die Herstellung von Immu-

js nogenen und nichtpathogenen Rinder-Adeno-Virus-Lebendlmpfstoffen von Wichtigkeil sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, polyvalente Rlndervirus-Lebendlmpfstoffe zur Intranasalen Verabreichung zu entwickeln, bei denen als Ausgangsmaterial temperaturempfindliche, nicht pathogene Mutantenstämme eingesetzt werden, die ihrerseits aus pathogenen Rlnder-Adeno-Vlrussiämmen durch Behandlung mit salpetriger Säure unter bestimmten Bedingungen erhalten werden. Mit diesen Impfstoffen ist es möglich, die

■»η Nebenwirkungen der bekannten Rinder-Adeno-Virus-Lebendlmpfstoffe zu vermeiden, die durch die Rlnder-Adeno-Viren In den Atmungswegen und im Verdauungstrakt oder im Auge hervorgerufen werden.

Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß durch mutagene Behandlung von pathogenen Rinder-Adeno-Viren, beispielsweise Rlnder-Adeno-3-Vlrus. mit salpetriger Saure unter sehr spezifischen Bedingungen temperaturempfindliche, nicht-pathogene Rlnder-Adeno-Viren-Mutantenstämme mit einer Hemmtemperatur von 39 bis 40° C Isoliert werden können, die für die erfindungsgemäßen polyvalenten Rlndervirus-Lebendlmpfstoffe zur intranasalen Verabreichung geeignet sind, da sie nicht nur genetisch stabil. Immunogen und nlchtpathogen sind, sondern bei Verabreichung an empfindliche Tiere auch keine nachweisbaren Nebeneffekte auftreten. Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen 1 bis 3 gekennzeichneten Gegenstand.

Vi Der erflndungsgcmäß verwendete temperaturempfindliche, nicht-pathogene Stamm von Rlnder-Adeno-Virus mit einer Hemmtemperatur von 39 bis 40° C Ist erhältlich i*urch Behandlung eines pathogenen Rlnder-Adeno-Vlrusstammes bei Raumtemperatur mit einer wäßrigen Lösung von salp?:rlger Säure In Acetatpuffer, in der die Konzentration der salpetrigen Säure 1 normal und der Acetationen im Reaktionsmedium 0.25 normal Ist. während eines Zeitraumes von 2 bis 5 ± I Minuten bei einem pH-Wert von 4,2 ± 0,1 bis 15 bis 25 ± 1 Minu-

i< ten bei einem pH-Wert von 5 ± 0.1 und Isolieren des temperaturempfindlichen Stammes aus der Lösung durch wenigstens eine Endverdünnungspassage In einer üblichen Gewebekultur, die sowohl für das Wachstum des Virus als auch als Substrat für die Impfstoffherstellung geeignet Ist, Vermehrung In einer üblichen Gewebekultur, die für das Wachstum von Rlnder-Adeno-Virus geeignet Ist, bei einer Temperatur von höchstens 37 ~ I³C und Ernten des erhaltenen Virusmaterials. Vorzugsweise wird als Gewebekultur eine primäre Rlndernlerenzell-

Wi kultur verwendet.

Die verwendeten Rinder-Adeno-Vlrus-Stämme vermehren sich nur lokal In den oberen Atmungswegen der Tiere, ohne daß eine nachweisbare Virusvermehrung Im Organismus In den wärmeren Temperaturbereichen, d. h. In den Inneren Organen der Tiere auftritt.
Zur Herstellung der nlcht-pathogenen Mutantenstämme, wird entweder ein Rlnder-Adeno-Vlrusstamm. wie

fö ein Rlnder-Adeno-3-Virusstamm, direkt aus einem klinischen Material Isoliert oder es kann ein Rlnder-Adeno-Virusstamm verwendet werden, der am Ende von Serienpassagen In Gewebekulturen von beispielsweise primären Rindernieren (PBK)-Zellkulturen. z. B. dem WBR I-Stamm, der von J. H. Derbyshire et al.. Nature. Bd. 208 ). S. 307 bis 308. beschrieben Ist. oder primären foetalen Rindernieren (PFBK)-Zellkulturcn als Ausuanüs-

material erhalten wird.

Die zur Induktion der lemperaturempflndlichen Mutantenstämme erforderliche mutagene Behandlung wird so durchgeführt, daß man einen Rlnder-Adeno-Vlrus, wie einen Adeno-3-Vlrusstamm, bei Raumtemperatur mit der aceiatgepufferten wäßrigen Lösung von salpetriger Saure behandelt. Vorzugswelse betragt die Behandlung 15 + 1 Minuten bei einem pH-Wert von 4,6 ±0,1. _v S

Es Ist offensichtlich, daß die pH-Werte und Temperaturbedingungen voneinander abhangen, aber die Grenzen der vorgenannten Bedingungen sind so, daß eine anfängliche Vlruspopulation von etwa 10* auf etwa 10² nach der muiagenen Behandlung vermindert wird und daß die Induktion der temperaturempfindlichen Mutantensiämme mit einer Hemmtemperatur von 39 bis 40° C eintritt.

Die so erhaltenen temperaturempfindlichen Os) Mutantenstamme werden durch wenigstens eine Endverdün- iq nungspassage in einer üblichen Gewebekultur isoliert, die sowohl das Wachstum des Virus als auch als Substrat für die Impfstoffherstellung geeignet ist, wie beispielsweise Rindernleren-Zelllculturen.

Beispielsweise kann die Isolierung durch wenigstens eine Endverdünnungspassage In primären foetalen Rindernieren (PFBK))-Zellkulturen bei 30 ± TC wahrend sines Zeltraums von 10 bis 20 Tagen, vorzugsweise während 14 ± 1 Tagen durchgeführt werden.

Die isolierten temperaturempfindlichen Mutantenstämme werden zweckmäßig noch in einer üblichen Gewebekultur, die das Wachstum des Rinder-Adeno-Vlrus begünstigt, wie beispielsweise Rindernieren-Zellkulturen und insbesondere primäre foetale Rlnderaleren-Zellkulturen, beispielsweise 2- oder 3mal in primären foetalen Rindernieren (PFBK)-Zellkulturen welter passagiert (kionlert) um dabei eine wesentliche Menge der temperaturempfindlichen .V.utantenstämme zu erhalten.

Als Ausgangsnsateris! eignet sich beispielsweise ein pathogener Stamm von Rlüder-Adep.o-3-Yirus, der aus dem WBR I-Stamm nach 7 Reihenpassagen in primären foetalen Rindernieren-Zellkulturen erhalten wurde und der nachstehend als Ausgangsstamm bezeichnet wird. Ein genetisch stabiler nlcht-pathogener, temperaturempfindlicher Stamm von Rinder-Adeno-3-Vlras, der nach diesem Verfahren erhalten wurde, hat die Kurzbezeichnung Eunice-Stamm erhalten.

Die temperaturempfindlichen Rinder-Adeno-Vlrusstämme, die auf die vorstehend beschriebene Weise erhalten werden, zeigen keinen wesentlichen Verlust an Immunogenltät gegenüber dem als Ausgangsmaterial verwendeten Rinder-Adeno-Vlrusstamm; sie sind temperaturempfindlich und nlcht-pathogen.

Vorzugswelse werden zur Vermehrung der temperaturempfindlichen Rinder-Adeno-Vlrusstämme primäre foetale Rindernieren (PFBK)-Zellkulturen verwendet, und die Vermehrung wird vorzugsweise bei 35 ± I⁰C durchgeführt.

Um die Herstellung der Lebendimpfstoffe In industriellem Umfange und in vielen Ansätzen durchzuführen, kann der Verfahrensschritt zur Herstellung einer großen Menge des Virusmaterials offensichtlich mehr als eine Passage umfassen, wobei eine oder mehrere Zwischenstufen durchgeführt werden, um die Herstellung von Virus-Elnsaatmaterial zur Herstellung von Impfstoffansätzen durchzuführen.

Zur Herstellung von Impfstoff wird das Virusmaterial vorzugsweise In lyophlllslerter Form aufbewahrt. Aus dem lyophillslerten Virusmaterial erfolgt die Wiederherstellung der Lebendimpfstoffe unter Zugabe von Wasser oder jedem anderen bekannten pharmakologlsch verträglichen Verdünnungsmittel, das zur Herstellung von In die Nase verabreichbaren Präparaten, wie Sprühmittel, verwendet werden kann.

A. und B. erläutert die Herstellung eines erfindungsgemäß verwendeten, temperaturempfindilchen, nichtpathogenen Stammes von Rlnder-Adeno-Virus.

A.

Rlnder-Adeno-3-Vlrus wird in Gewebekulturen In Eagle-Minlmalerhaltungsmedlum (MEM) zu einer Virussuspension suspendiert, die ΙΟ⁶·⁵ TCIDs₀ enthält. Der Ausgangsstamm wurde aus dem bekannten WBR I-Stamm durch 7 Reihenpassagen in primären, foetalen Rindernieren-Zellkulturen erhalten.

1 ml dieser Virussuspension wird mit 0,5 ml einer 4molaren wäßrigen Natriumnitritlösung In 0,5 ml einer 1 molaren Esslgsäure/Natriumacetatpufferlösung vermischt. Dieser Puffer wurde durch Vermischen von 6 g Eisessig mit destilliertem Wasser bis zu einem Volumen von 100 ml und 3 Volumina einer Lösung von 13,6 g Natriumacetat In 100 ml destilliertem Wasser hergestellt. Beide Losungen wurden 30 Minuten bei 121° C sterilisiert. Der End-pH-Wert beträgt 4,6.

Das Gemisch wird 15 Minuten bei Raumtemperatur umgesetzt. Die Reaktion wird dann durch tropfenweise Zugabe von 1 η-Natronlauge unter Rühren bis zu einem pH-Wert von 7,5 ± 0,5 beendet. Die pH-Einstellung wird mit Hilfe der Farbänderung des In der Virussuspension enthaltenen Phenolrot-Indlkators verfolgt.

Das Medium wird dann sofort 5 Stunden bei + 4 ± Γ C gegen phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung dlalysiert. [Diese Lösung besteht aus 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na₂HPO₄, 0,2 g KH₂PO* in destilliertem Wasser (bis auf 800 ml), vermischt mit einer Lösung von MgCI₂ · 6H₂O in 100 ml destilliertem Wasser und anschließend mit einer Lösung von 0,1 g CaCl₂ In 100 ml destilliertem Wasser. Die so erhaltene Lösung wird durch Filtration sterilisiert; der End-pH-Wert liegt bei 7,2 bis 7,4.] Die phosphatgepufferte physiologische Koch-Salzlösung wird mehrmals bis zur Entfernung der Nitritionen erneuert. Eine Probe wird titriert und das Vlrusmaterlal bei -70°C aufbewahrt. Die Titration wird mittels der Röhrchen-Endpunkt-Verdünnungsmethode in primären foetalen Rindernieren-Gewebekulturen bei 39 ± I⁰C unter Verwendung von 2 Röhrchen pro Verdünnung durchgeführt.

Nach 2wöchiger Inkubation wird der Titer bestimmt und die bei -70⁰C aufbewahrte Probe wird soweit verdünnt, bis sie 1 TCIDjo/0.2 ml enthält. Diese verdünnte Probe wird In 28 Röhrchen mit primären foetalen Rindernieren-Gewebekulturen unter Verwendung von 0,1 ml Inoculum/Röhrchen beimpft. Die Röhrchen werden bei 30 ± 1°C Inkubiert. Nach verschiedenen Inkubationszeiten von 7 bis 17 Tagen zeigen 10 beimpfte

Röhrchen einen typischen Rlnder-Adeno-S-Virus-cytcpathogenen Effekt; diese Röhrchen werden mit den Nummern 1 bis IO markiert und bei -70° C aufbewahrt. Es werden Paralleltltrationen dieser 10 positiven Proben bei 30° C und bei 39° C durchgeführt. Die Proben, die einen signifikanten Unterschied im Titer zwischen diesen beiden Temperaturen aufweisen, werden durch Grenzverdünnungs-Passagen zwei Mal weiter geklont.

Das so erhaltene Virusmaterial wird dann durch 2 Passagen in primären foetalen Rindemieren (PFBK) Zellkulturen wie folgt vermehrt: Rlnderfoeten werden als Nierenspender verwendet. Die Nieren werden unter aseptischen Bedingungen entfernt. Zerkleinertes Nierengewebe wird mit phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung gewaschen [diese Lösung besteht aus 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na₁HPO₄, 0,2 g KH₂PO₄, 0.2 g KH₂PO₄ !r. destilliertem Wasser (bis auf 800 ml), vermischt mit einer Lösung von MgCl₂ · 6H₂O in 100 ml

ίο destilliertem Wasser und anschließend mit einer Lösung von 0,1 g CaCl₂ in 100 ml destilliertem Wasser. Die so erhaltene Lösung wird durch Filtration sterilisiert; der End-pH-Wert liegt zwischen 7,2 und 7,4]. Anschließend wird das Nierengewebe mit einer gepufferten physiologischen Kochsalzlösung von Trypsin (2,5 g/Liter) trypsiniert. Das Gemisch wird dann 10 Minuten ohne Unterbrechung bei 37° C gerührt. Sodann wird die Flüssigkeit abgegossen und duich dasselbe Volumen an frischer Trypsinlösung ersetzt. Die Trypsinbehandlung wird dann

is unter Rühren bis zur Erschöpfung des Gewebes fortgesetzt. Die In der Flüssigkeit suspendierten Zellen werden von Zeit zu Zeit entfeint und dann bei 1000 UpM zentrifugiert. Das Zellsediment wird in einem Wachstumsmedium (Eagle's Basalmedium, das mit 10 Prozent auf Virus geprüftes Kalbsseram versetzt Ist und pro ml 100 Einheiten Penicillin G-Natrium und 100 γ Streptomycin-sulfat enthalt) suspendiert, daß auf 1 ml etwa 200 000 Zellen kommen.

Μ 1 ml Proben der Zellsuspension werden In sterile Röhrchen gegeben und 4 bis 5 Tage bei V C inkubiert. Am Ende dieser ersten Inkubaticnspcricdc wird das V/achsturnsniediurr. entfernt und pro Röhrchen durch 1.5 rnl Eagle's Basalmedium ersetzt, das ledig.'ish 2 Prozent Gammaglobulin-freles, auf Virus geprüftes Kalbsserum enthält, 10 Röhrchen werden mit 0,2 ml der vorstehend erhaltenen Virussuspension beimpft und bei 35³C während 7 bis 14 Tagen Inkubiert. Das Wachstum des Virus zeigt sich an dem typischen cytopathogenen Effekt.

Die Passage des Virus auf eine zweite primäre foetale Rlnderr\Ieren-(PFBK)-Gewebekultur wird durchgeführt, wenn etwa 50 Prozent der Zellen den cytophatogenen Effekt aufweisen. Die überstehende Flüssigkeit wird dann geerntet; eine 0,2 ml Probe des Überstands wird als Inoculum für die nächste Passage verwendet.

Die überstehenden Flüssigkeiten der zweiten Passage werden geerntet, vereinigt und Im Volumenverhältnis 1 :2 mit einer Stabilisierlösung verdünnt, die aus 60 g Casiton, 100 g Rohrzucker, 75 ml (m/15) dlbaslsches Natriumphosphat. 25 ml (m/15) monobasischem Kailumphosphat, 20 g Monokaliumglutamat und einer zur Herstellung von 4,25 Liter ausreichenden Menge an destilliertem Wasser besteht. Das Gemisch wird lyophillsiert, wobei ein temperaturempfindlicher, nlcht-pathogener Rlnder-Adeno-3-Virusstamm erhalten wird, der nachstehend kurz mit Eunice-Stamm bezeichnet wird.

/s-Charakter des Eunlce-Stammes

Das Viruswachstum bei verschiedenen Temperaturen wird durch Titration bestimmt. Die Ergebnisse sind in

der Tabelle 1 zusammengefaßt, aus der hervorgeht, daß die Hemmtemperatur, also die Temperatui. bei velcher die Infektlosltät auf etwa 3 logio reduziert wird, 39,5 ± 0,5° C beträgt. Die Ausbeutedlfferenz zwischen dem

<to Eunlce-jtamm und dem Ausgangsstamm ist ebenfalls In Tabelle I angegeben und zeigt die geringe Vermehrbarkeit des Eunice-Stammes.

Tabelle I Stamm Virusausbeute TClD₅₀ Unterschied zwischen

(ausgedrückt in log₁₀/0,l ml) bei 39.5° C und 35° C

35° C 39.5⁰C

J₀ Ausgan?,sstamm 6,5 6,5 0

Eunice 4,5 1,7 2,8

Die Stabilität des /s-Charakters des Eunlce-Stammes wird ^lr>. vitro, wie nachstehend beschrieben, gezeigt:
Der Eunlce-Stamm wird In primären foetalen Rindernieren (PFBK)-Zellkulturen bei 30 bis 35⁰C passagiert. Die In Tabelle II zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß der «-Charakter während 7 Passagen bei 30 bis 35⁰C stabil bleibt, während das Wachstum des Stammes bei 39,5° C beträchtlich vermindert Ist.

Tabelle II

Passage	Virusliter TCID₅₆,	ml	bei 39,5° C
	ausgedrückt in Iog_lo/0,l	0.5
	bei 3O-35°C	1.5
I	5	1,5
4	6,25
7	6,3

Außerdem wurde der fs-Charakler des Virus, das bei 39,5° C hergestellt wurde, getestet. Wie aus Tabelle Ii ersichtlich Ist, zeigt der Eunlce-Siamm bei dieser Temperatur ein schlechtes Wachstum und die In Tabelle III zusammengefaßten Ergebnisse zeigen, daß das so hergestellte Virus seinen rs-Charakter beibehalten hat.

Tabelle III Titer (log,,, TCIDsn/0,1 ml)

des Virus, das hei 39,5° C hergestellt wurde

Inkubationstemperatur der Virus-Titration Titer

35⁰C 3

39,5° C <0,5

B.

Foetale Rindernieren werden unter aseptischen Bedingungen entfernt, zerkleinert und In phosphatgepufferter \

physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. [Diese Lösung besteht aus 8 κ NaCl. 0,2 r KCI. 1.15 g NaiHPO₄, 0.2 g KH~jPO₄ In destilliertem Wasser (bis auf 800 ml), vermischt mit einer Lösung von MgCI₂ ■ 6HjO In 100 ml destilliertem Wasser und anschließend mit einer Lösung von 0,1 g CaCI₂ In 100 ml destilliertem Wasser. Die so erhaltene Lösung wird durch Filtration sterilisiert; der End-pH-Wert liegt bei 7,2 bis 7,4|. Die gewaschenen, zerkleinerten Nieren werden mit einer Lösung von Trypsin (2,5 g/Llter) In gepufferter physiologischer Kochsalzlösung behandelt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 37° C ohne Unterbrechung gerührt. Die Flüssigkeit wird dann abgegossen und durch das gleiche Volumen an frischer Trypslnlösung enetzt. Die Trypslnbehandlung wird unter Rühren bis zur Erschöpfung des Gewebes fortgesetzt. Die In der Flüssigkeit suspendierten Zellen werden von Zelt zu Zelt entfernt und dann 5 Minuten bei 1000 UpM zentrifugiert. Das Zellsediment wird In einem Wachstumsmedium (Hank's basischer Salzlösung, die mit 10 Prozent "irus geprüftem Kalbsserum, 0,5 Prozent Lacialbumlnhydrolysat, 0,1 Prozent Hefeextrakt und 50 γ Neomycln-sulfat/ml versetzt ist) so suspendiert, daß auf 1 ml etwa 200 ÖOfl Zellen kommen. ^w

Aliquoitelle von 1 ml der Zellsuspenslon werden In Roux-Kolben (500 cm¹) gegeben und 4 bis 5 Tage bei 37° C Inkubiert. Am Ende dieser ersten Inkubationsperiode wird das Wachstumsmedium entfernt und die ZeIlmonoschlcht zweimal mit einem Erhaltungsmedium gewaschen, das aus Earle's basischer Salzlösung besteht, die 0.5 Prozent Lactalbuminhydrolysat, 0,1 Prozent Hefeextrakt, 0,1 Prozent Tryptosephosphat-Brühe und 50 γ :

Neomycln-sulfat/ml enthält. ^}i '

Jeder Kolben mit foetaler Rindernieren-Zellkultur wird mit 1 ml einer Suspension des gemäß A. erhaltenen Eunlce-Stammes In destilliertem Wasser bdmpft. Die Suspension enthält etwa 2,10' TClD,₀/ml (d. h. beim Multlpllzitätslndex von 0,1). Jeder Kolben wird mit Erhaltungsmedlum mit der gleichen Zusammensetzung wie das vorstehend zum Waschen verwendete Medium versetzt. Die Kultur wird bei 35° C während einer solchen Zeitspanne Inkubiert, die zum Waschen einer großen Virusmenge ausreichend ist, d. h. mindestens 5 bis 10 Tage, wie sich mittels des typischen cytopathogenen Effektes des Rinder-Adeno-3-Virus nachv/elsen läßt.

Die überstehenden Flüssigkelten werden dann geerntet, vereinigt und im Volumenverhältnis von 1 : 2 mit einer Stablllslerlösung verdünnt. Diese Lösung besteht aus 60 g Caslton, 100 g Rohrzucker, 75 ml (m/15) dlbaslschem Natriumphosphat, 25 ml (m/15) monobasischem Kaliumphosphat, 20 g Monokallumglutamat und einer zur Herstellung einer Lösung von 1 Liter ausreichenden Menge an destilliertem Wasser. ·>5

Das Präparat wird in Glasampullen abgefüllt, die wenigstens 2.10' TCID₅₀ oder ein Vielfaches davon enthalten. Der Inhalt der Ampullen wird lyophlllslert. Die Ampullen werden abgeschmolzen.

Beispiel I erläutert die Herstellung eines polyvalenten Rindervlrus-Lebendlmpfstoffes der Erfindung. Beispiel 1

Es wird die in B. beschriebene Methode angewendet, wobei jedoch die geernteten Oberstehenden Flüssigkeiten, die mit der Stabilisierlösung verdünnt werden, mit dem RLB 103 temperaturempflndlichen Mutantenstamm von Rlnder-Parainfiuenza 3 (Plj)-Vlrus, beschrieben von N. Zygraich, M. Lobmann und C. Huygelen in j. Hyg. Camp.. Bd. 70 (1972), 229-234 und dem RLB 106 temperaturempfindlichen Mutantenstamm des Infektionösen Rinder-Rhinotracheitis (IBR)-Vlrus (beschrisben in Research In Veterinary Science) ergänzt werden. Das Gemisch wird in Glasampullen abgefüllt, die ΙΟ⁶⁵ TClD₅₀ an Rlnder-Ader.oO-Vlrus-Eunice-Stamm, 10"TCIDs₀ an Rinder-PIj-Virus und 10⁶⁸TCID₅₀ an IBR-Virus oder ein vielfaches jeder dieser Dosen enthalten. Der Inhalt dieser Ampullen wird Iyophilisiert, und die Ampullen werden abgeschmolzen. Auf diese Weise werden entweder ,

Einfach- oder Vielfachdosen erhalten. Nach der Wiederherstellung durch Zugabe von 4 bis 5 ml Wasser/Dosis μ wird der polyvalente Impfstoff dem Tier Intranasal als Nasenspray verabreicht.

Klinische Prüfung Die Prüfung wird an vier 3 bis 6 Monate alten Kälbern (Friesisches Milchrind) durchgeführt. Eine Einheitsdosis des erhaltenen trivaleiiten Impfstoffes wird in die Nasenlöcher jedes Tieres eingesprüht. Blutproben für serologische Untersuchungen werden vor und 6 Wochen nach der Impfung abgenommen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

	Serologische	24	nach der Impfung	63 143	nach der Impfung	Haemagglulinations- Hemmungstiter für	nach der Impfung	I
Tabelle IV		16		2	Plj-Virus	128	1
Nummer	Reaktion, ausgedrückt	32	in	2	vor der Impfung	32	!"*
des Tieres 5	Seroneutralisations-Antikörpertiter	32	ur	8	< 8	128	Πι
	Adeno-3-Virus	64	IBR-Virus	1	8	32	I
	vor der Impfung	vor der Impfung		< 8	f.
O 1	< 4	0		32
2	<16	0			I
3	< 4	0		I *
5 4	8	0

Die zusätzlichen Rlnder-PIj- und IBR-Vlren störten die Impfung mit Adeno-3-Impfstoffen nicht; umgekehrt stöne das Adeno-3-Virus nicht die Serokonversion der Tiere für die Rlnder-PIj- und IBR-Vlren.

Claims

Patentansprüche:

1. Polyvalenter Rindervirus-Lebendimpfstoff zur Intranasalen Verabreichung, enthaltend

a) einen temperaturempflndüchen, nichtpathogenen Stamm von Rinder-Adeno-Virus mit einer Hemmtemperatur von 39 bis 40° C und

b) wenigstens einen weiteren intranasal verabreichbaren Rindervirus-Lebendimpfstoff für die Behandlung von Erkrankungen der Atemwege.

2. Polyvalenter Lebendimpfstoff nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Komponente b) ein infektiöser Rinder-Rhinotracheitls-Virus-Lebendimpfstoff und/oder ein Rinder-ParaInfluenza-Lebendimpfstoff Ist.

3. Polyvalenter Lebendimpfstoff nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Rinder-Parainfluenza-Lebendimpfstoff ein Rlnder-Parainfluenza-3-Virus-Lebendimpfstoff ist.