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Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes gegen die Rhinotracheitis
der Rinder Die Erfindung bezieht sich auf die Züchtung und Modifizierung von Viren
der infektiösen Rhinotracheitis von Rindern Gewebskulturen von Rindernieren. Insbesondere
bezieht sich die Erfindung auf die Entwicklng eines Impfstoffes gegen die Rhinotracheitis
mit modifiziertem Virus und zur Verhütung dieser Krankheit beim Rindvieh.
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Die infektiöse Rinder-Rhinotracheitis ist eine Virus krankheit, die
schwere wirtschaftliche Verluste in der Rindviehzucht hervorruft. Diese Viruskrankheit
und ihre verheerende Wirkung auf Rinder sind von MeKercher (D. G. McKercher et al.,
Proc. 58th Annual Meeting, United States Livestock Sanitary Association, 1954, S.
260 bis 269; D. G. McKercher et al., Proc. 59th Annual Meeting, United States Livestock
Sanitary Association, New Orleans, Louisiana, im Druck) und Miller (N. J. Miller,
Journ. Amer. Vet. Med. Assn., 126 : 939, Juni 1955, S. 463, 467) beschrieben.
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Bisher gab es keinen Impfstoff zum Schutze des Rindviehs gegen das
Virus der Rhinotracheitis. Forschern in Kalifornien (McKercher, op. cit.) und in
Colorado (T. L. C ho w et al., Proc. 59th Annual Meeting, United States Livestock
Sanitary Association, New Orleans, Louisiana, 1955, im Druck), die mit Virussuspensionen
arbeiteten, die sie aus Nasenabwaschungen oder Gewebesuspensionen von natürlich
infizierten Rindern erhalten hatten, gelang es nicht, befruchtete Eier, Meerschweinchen,
Kaninchen, junge säugende Mäuse und andere Versuchstiere zu infizieren. Diese Mißerfolge
traten auf, obwohl die Nasenabwaschungen oder Gewebesuspensionen der infizierten
Källber die höchste Konzentration an Virus enthielten, die von infizierten Rindern
geweonnen werden kann.
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Nach der Erfindung wurde gefunden, daß das Virus der Rhinotracheitis
in Wälzrohr-Gewebskulturen aus Kälbernierengewebe, K älbertestikelgewebe und Kälberlungengewebe
gezüchtet werden kann. Es wurde auch gefunden, daß zerkleinerte Nieren oder Muskeln
zur Züchtung des Rhinotracheitisvirus verwendet werden können. Weiterhin wurde gefunden,
daß in der Gewebskultur gezüchtete Teilen modifiziert werden können, so daß ihre
krankheitse. r egende Kraft verlorengeht, wenn sie Kälbern intramuskulä. injiziert
werden, daß aber die Kälber gegen die xgirulente Rhinotracheitis immunisiert werden.
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Bei der Druchführung dei Erfingung werden embryonale Rindernierenzellen
in geeigneten Behältern gezüchtet, wobei ein flüssiges Gewebskulturmedium verwendet
wird, das für das Wachstum der Zellen geeignet ist. Die vorzugsweise verwendete
Nährflüssigkeit besteht aus 8 Teilen Earlescher eingestllter Salzlösung (Ear'les
BSS @ Production of malignancy in vitro IV. Mouse Fibrobalst Cultures and Chages
Seen in LivingCels « von W. R. Earle, J. National Cancer Institute 4, 194, S. 165]),
I Teil 5%igem Lactalbumihhydrolsat und I Teil inakti-
viertem Pferdeserum. Nachdem
die embryonalen Rindernierenzellen ein ausreichendes Wachstum zeigen, wird infektives
Rhinotracheitisvirusmaterial in die Gewebskulturflüssigkeit, die die Nierenzellen
bedeckt, eingeimpft.
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Nach einer Inkubationszeit von 4 Tagen bei 35° zeigt sich eine Vermehrung
des Virus um das Mehrfache. Ein Reihendurchgang des Virus, bestehend aus 52 Durchgängen,
die alle 4 Tage erfolgen, liefert noch Viren, die eine fiebrige Erkrankung hervorrufen,
wenn man sie einem empfänglichen Kalb intramuskulär injiziert. Nach sieben oder
mehr 4tägigen Druchgängen werden schnelle Reihrendurchgänge mit Intervallen von
1 oder 2 Tagen, bestehend aus einer auserichenden Zahl von druchgängen, durchgeführt,
um das Virus so weit zu schwächen, daß eine intramuskuläre Injektion bei empfänglichen
Rälbern bewirkt, daß sie gegen Rhinotracheitis geschützt sind, ohne daß irgendwelche
Symptome der Krankheiten oder eine Temperaturerhöhung auftreten. Die konzentrerte
virushaltige Flüssigkeit wird dann gesammelt und bei - 70° bis zur Verwendung gelagert.
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Wurden Anteil von virushaltigen Gewebektulturflüssigkeiten nach vierzig
1- bis 2tägien Passagen Kälbern intramuskulär injiziert, traten keine Krankheitsmerkmale
auf, Wenn die gelchen Kälber 2 Wochen später mit virulentem, krankheitserzeugendem
Rhinotracheitisvirus infiziert wurden, entwickelten sich keine Krankheitssymptome,
was
bees, daß durch die Impfung mit dem Gewebskulturvirus eine Immunität gegenüber dem
Virus erzeugt worden war. Die Tiere entwickelten nach dem Impfen mit dem in der
Gewebskultur gezüchteten Virus ImmunköIper, die durch einen Neutralisationsversuch
in der Rindernierengewebskultur, wie er durch einen cytopathogenen Effekt gemessen
wird, nachweisbar waren.
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Die Ausführungsweise der Erfindung wird im einzelnen im Zusammenhang
mit den nachstehenden genauen Versuchen beschrieben. Selbstverständlich sind diese
ausführlichen Versuche nur zur Veranschaulicllung, aber nicht zur Begrenzung angegeben.
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Züchtung und Modifizierung des Virus Bei Versuchen, die unter Verwendung
von Rindernierenrindengewebskulturen in Nvälzrohren durchgeführt wurden, wurden
0,2 ccm 10%ige Suspension von Trachea, Kehlkopf und unterer Nasenmuschel in die
einzelnen Rohre injiziert. Die zur Herstellung dieser Suspension verwendeten Gewebe
wurden aus einer auf natürlichem Wege infizierten Färse gewonnen, die die klinischen
Anzeichen der Rinderrhinotracheitis zeigte. Das zur Aufrechterhaltung des Wachstums
der Gewebskulturzellen verwendete Medium besteht aus 8 Teilen Earlescher eingestellter
Salzlösung (6, 8 g Natriumchlorid; 0, 40 g Kaliumchlorid; 0,20 g Calciumchlorid;
2,20 g Natriumbicarbonat, mit Wasser auf 1 l aufgefüllt), 1 Teil 5%igem Lacrtalbuminhydrolysat
und 1 Teil inaktiviertem Pferdeserum. Die Nährflüssigkeit wur de auf eine PH- von
7,6 bis 7,8 eingestellt. Die Reihenübertragungen wurden so ausgeführt, daß man jeweils
0,2 ccm Flüssigkeit aus diesen Gewebskulturrohren in die einzelnen neuen Wälzrohrkulturen
einimpfte. Diese Passagen wurden in Intervallen von 3 bis 4 Tagen durchgeführt.
Jede Übertragung ergab ungefähr die 10fache Verdünnung der ursprünglichen Gewebssuspension.
Die Beobachtung der Rohre unter dem Mikroskop zeigte eine cytologische Veränderung
in den Zellen, die darin bestand, daß sich die Granulate vergrößert hatten, die
Zellen zu traubenförmigen Massen zusammengeballt waren und gegebenenfalls an der
Wand des Rohres Zellen zerstört und aufgelöst waren. Sowohl Epithel- als auch Fibroblastenzellen
wurden angegriffen. Dieser cytopathogene Effekt auf die Zellen, der auf die Impfung
zurückzuführen war, trat bei der ersten präparierten Rohrserie auf und wurde der
Reihe nach auf alle folgenden geimpften Gewebskulturrohre übertragen. Gewebskulturflüssigkeit,
die aus den im 15. Durchgang verwendeten Rohren entnommen wurde und die eine Verdünnung
von 10- 15 des ursprünglichen infektiösen Materials darstellte, wurde einem Kalb
intramuskulär injiziert. Nach einer Inkubationszeit von 3 Tagen trat eine fiebrige
Reaktion auf, die 3 Tage dauerte.
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Die Prüfung der aufeinanderfolgenden Reihendurchgänge dieses cytopathogenen
Virus in Gewebskulturrohren wurde beim 35. und 58. Durchgang durchgeführt.
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Die Gewebskulturflüssigkeit des 58. Durchgangs zeigte bei der Titration
in Gewebskulturrohren, daß sie auf 10-7s3 verdünnt werden und dennoch cytologische
Veränderungen in den Zellen hervorrufen konnte. Sowohl die 35. als auch die 58.
Gewebskulturflüssigkeit erzeugten leicht eine fiebrige Reaktion bei Kälbern, wie
es beim 15. Durchgang oben beschrieben wurde. Das Ergebnis der Anwendung des 58.
Durchganges zeigte, daß das Virus mindestens um das 10-58fache der ursprünglichen
Impfung verdünnt ist und daß der Virusgehalt in der Gewebskulturflüssigkeit noch
mindestens 107 beträgt.
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Das wird als Beweis dafür angesehen, daß sich das Virus in den Zellen
von Rindergewebskulturen vermehrt hat.
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Beginnend mit dem Material des 52. Gewebskulturdurchganges, das in
Intervallen von 3 bis 4 Tagen übertragen worden war, wurden die Passagen in einer
schnelleren Weise durchgeführt, und zwar wurden die 40 aufeinanderfolgenden Durchgänge
in Intervallen von 1 oder 2 Tagen durchgeführt. Nach Beendigung des 40. schnellen
Durchgangs wurde eine Mindestmenge von 100 000 infektiven Gewebskulturdosen je vier
Kälber injiziert.
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Es traten keine Krankheitsmerkmale auf, und bei Behandlung mit virulentem
Rhinotracheitisvirus erfolgte keine Reaktion, was bewies, daß durch das Gewebskulturmaterial
eine Immunität erzeugt wurde. Nach dem Impfen mit dem Gewebskulturmaterial entwickelten
diese Tiere auch neutralisierende Antikörper, wie es durch die Unterdrückung des
cytopathogenen Effekts in der Gewebskultur gezeigt wird.
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Beginnend mit dem siebenten Durchgang, welche Passagen in Intervallen
von 3 oder 4 Tagen durchgeführt waren, wurden für die 40 folgenden Durchgänge auch
schnelle Durchgänge in Intervallen von 1 bis 2 Tagen angesetzt. Nach dem 40. Durchgang
wurde ein Kalb intramuskulär geimpft, ohne daß Krankheitsanzeichen auftraten. Dieses
Tier war nach Behandlung mit virulentem Rhinotracheitisvirus immun, und nach der
Impfung mit dem Gewebskulturmaterial konnten in seinem Serum neutralisierende Antikörper
nachgewiese werden.
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Die spezielle Nährflüssigkeit, die im beschriebenen Beispiel verwendet
wurde, bewirkt ein gutes Wachstum der gewünschten Zellen aus embryonaler Rinderniere
und ist für das Wachstum des Rhinotracheitisvirus geeignet. Andere Srährmedien,
die zur Vermehrung der gewünschten Zellen von embryonalem Rindernierengewebe geeignet
sind, können ebenfalls verwendet werden, z. B. 8 Teile Earle-Simsscher Lösung, 1
Teil Lactalbumin, 1 Teil inaktiviertes Pferdeserum, weiterhin Aledium Sr. 199 von
Organ tY Parker mit 5 bis 1001, inaktiviertem Pferdeserum (J. F. Organ et al. Proc.
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Soc. Esp. Biol. & Med., 150, 73, 1 bis 8).
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Zusätzlich wurden unter Verwendung des gleichen geeigneten Mediums
und der gleichen Verfahren, wie sie oben beschrieben wui4en, an Stelle von Rindernierenzellen
Rindertestikelzellen, Rinderlungenzellen und Muskdzellen entwickelt und mit befriedigenden
Ergebnissen für die Züchtung ron infektiösem Rhinotracheitisvirus verwendet.
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Die Erfindung liefert eine Methode zur Züchtung großer Mengen Viren
außerhalb der Rinder in höheren Nonzentrationen, als sie im kranken Tier erzeugt
werden. Außerdem liefert sie Viren, die frei von verunreinigenden Bakterien oder
anderen Viren sind, wie man sie im lebenden Tier findet.
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Die Erfindung liefert eine Methode zur Herstellung eines Virus, das
so modifiziert ist, daß es nach dem Impfen nicht mehr zur Erzeugung der Krankheit
im Vieh fähig ist. Das Virus ist jedoch noch befähigt, eine Immunität gegenüber
der infektiösen Rhinotracheitis zu ergeben.
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Das Auftreten des cytopahtogenen Effekts in den Gewebskulturrohren
nach dem Impfen mit dem Virus liefert eine Methode zur genauen Bestimmung der Konzentration
des in den C7ewebskulturflüssigkeiten erzeugten Virus.
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Identifizierung des Virus Beim 53. Gewebskulturdurchgang wurde ein
Virus material hergestellt, das in der Gewebskultur einen Titer von 10-595 hatte,
wie durch den cytopathogenen Effekt festgestellt wurde. Mit diesem Virus wurden
Serumneutralisationsversuche mit normalen und immunen
Seren von
künstlich infizierten Tieren und von Serumproben aus Tieren in mehreren Landesteilen,
die von der Krankheit genasen, durchgeführt. Gleiche Mengen von unverdünntem Serum
von jeder Probe wurden mit etwa 500 Virusdosen TC ID50 vermischt (Dosen einer 50010eigen
infektiösen Gewebskultur). Diese Gemische wurden 2 Stunden bei 35 entwickelt und
jede Serum-Virus-Mischung in Mengen von 0,2 ccm in je vier Rohren aufgegeben. Diese
wurden täglich beobachtet, die endgültige Auswertung wurde etwa 5 bis 7 Tage nach
Versuchsbeginn vorgenommen. Es wurde gefunden, daß Serumproben von normalen Tieren
diesen cytopathogenen Effekt nicht neutralisierten, obgleich das Serum der gleichen
Tiere, die experimentell mit Gewebskulturmaterial geimpft worden waren, den cytopathogenen
Effekt in den Wälzrohren neutralisierten. In ähnlicher Weise neutralisierten auch
Serumproben von Tieren, die von natürlichen Fällen von infektiöser Rhinotracheitis
genasen, diesen Effekt. Somit war bewiesen, daß der cytopathogene Effekt durch die
Vermehrung des Virus erzeugt wurde und daß das Virus die Ursache der Rhinotracheitis
beim Rindvieh war.
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Die Herstellung des Impfstoffes Eine Reihe von Wälzrohkulturen von
Rindernierengewebe oder von Flaschen mit flachen Seitenwänden, die die gleichen
Zellen enthielten, wie sie nach der oben beschriebenen Methode hergestellt wurden,
werden mit dem in der Gewebskultur gezüchteten, modifizierten Rhinotracheitisvirus
infiziert. Nach 4tägigem Entwickeln bei 35 wird die Flüssigkeit von den Zellen abgezogen,
gesammelt und 10 Minuten bei 1800 U/min zentrifugiert.
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Diese Flüssigkeit stellt den rohen Impfstoff dar. Dieser rohe Impfstoff
wird verdünnt, so daß in 1 ccm Flüssigkeit 10000 bis 100000 Dosen 50°/Oiger infektiöser
Gewebskultur (TC ID50) enthalten sind. Diese Verdünnung wird entweder in normaler
Gewebskulturflüssigkeit oder in Saccharose-Glutamat-Lösung oder in anderen geeigneten
Verdünnungsmittdn hergestellt. Dieser verdünnte Virus wird dann in Standard-Impfstoffampullen
eingefüllt und nach der üblichen Gefriertrocknungsmethode getrocknet.
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Wie oben festgestellt wurde, stammte die einzige bisherige Quelle
für den Rhinotracheitisvirus der Rinder aus Geweben und Sekreten von natürlich infizierten
Rindern. Der Virusgehalt dieses Materials war gering, und alle früher veröffentlichten
Versuche zur Züchtung dieses Virus in befruchteten Eiern, Kaninchen und Mäusen waren
erfolglos.
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Durch Anwendung der vorliegenden speziellen Verfahren, die nach den
Methoden der 1- bis 2tägigen Reihenpassagen durch Gewebskulturen arbeiten, kann
ein modifiziertes Virus in großen Mengen und in höheren Konzentrationen als bei
dem in natürlichen Quellen (Rinder) gefundenen Virus leicht entwickelt werden. Dieses
Material kann nach dieser Methode in einer Weise hergestellt werden, daß es mit
keinen anderen Rinderviren oder -bakterien oder Fremdstoffen verunreinigt ist, wie
es vorkommt, wenn es aus Tieren gewonnen wird.
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Dieser reine, in Gewebskulturen gezüchtete, modifizierte
Virus immunisiert
Rindvieh gegen infektiöse Rhinotracheitis, wenn es ihm intramuskulär oder subcutan
eingeimpft wird, ohne daß die Krankheitssymptome auftreten. Die Immunitätsreaktion,
die nach der Impfung mit dem in der Gewebskultur gezüchteten Virus auftritt, kann
mit serologischen Methoden, wobei sich spezifische Antikörper gegen die Krankheit
zeigen sowie durch intranasale Infektion der Tiere mit krankheitserregenden Rhinotracheitisviruslösungen
nachgewiesen werden.
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Unter Verwendung des in Gewebskulturen gezüchteten modifizierten
Rhinotracheitisvirus in Konzentrationen von 3200 bis 500000 infektiösen Dosen des
Virus wurde eine Anzahl empfänglicher Kälber mit je 1 ccm des, wie oben beschrieben,
hergestellten Gewebskulturimpfstoffes geimpft. Diese Tiere entwickelten eine deutliche
Antikörperreaktion oder waren gegen eine intranasale Infektion mit dem obenerwähnten
krankheitserregenden Virus gefeit.
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PATENTANSPROCHE: 1. Verfahren zur Herstellung eines nichtpathogenen
infektiösen Rinder-Rhinotracheitisvirus zur Verwendung als Impfstoff, dadurch gekennzeichnet,
daß man nacheinander eine Nährflüssigkeit, die entwicklungsfähige Rindergewebskulturzellen
mit einem pathogenen Rinder-Rhinotracheitisvirus enthält, impft, das Virus mindestens
1 Tag lang im Gewebskulturmedium entwickelt, dann das im Gewebe gezüchtete Virus
zum Impfen von weiteren Mengen Nährflüssigkeit, die entwicklungsfähige Rindergewebskulturzelien
enthalten, verwendet, die Entvicklung mindestens 1 Tag lang fortsetzt und diese
Reihen durchgänge so lange wiederholt, bis das Virus so modifiziert ist, daß es
keine pathologischen Symptome mehr hervorruft, wenn es einem normalen Rind injiziert
wird, sondern die Bildung von schützenden Antikörpern anregt.