CH504532A

CH504532A - Verfahren zur Züchtung pathogener Viren, Zellstamm zur Ausführung des Verfahrens und Anwendung des Verfahrens

Info

Publication number: CH504532A
Application number: CH246167A
Authority: CH
Inventors: Edwin Smith Sidney; Joseph O'reilly Kevin; Prydie John
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1966-02-18
Filing date: 1967-02-20
Publication date: 1971-03-15
Also published as: ES336810A1; DK119472B; BE694243A; FR1570435A; US3520972A; IL27418A; IT983058B; DE1617940A1; DE1617940C2; NL6702396A; JPS5341230B1; CY614A; GB1177635A

Description

Verfahren zur Züchtung pathogener Viren, Zellstamm zur Ausführung des Verfahrens und Anwendung des Verfahrens
Es ist bekannt, das Katzen infizierende Enteritis (Panlenkopenie-)Virus auf einer Gewebeprimärkultur zu züchten, die durch Trypsinisierung infizierter Katzennierenzellen erhalten wurde. Diese Methode weist jedoch den Nachteil auf, dass die Möglichkeit einer Verunreinigung mit anderen, nicht leicht entdeckbaren Viren nicht ausgeschlossen werden kann. Sodann ist die erhältliche Menge einer solchen Gewebekultur zu gewissen Zeiten des Jahres beschränkt, und sie stellt eine heterogene Zelipopulation dar, was die Züchtung des Virus zu Versuchszwecken und zur Herstellung von Impfstoffen behindert.

Weiter ist die Modifizierung und Abschwächung des Katzen infizierenden Enteritisvirus in einer Jungkatzennieren-Primärkultur undurchführbar, weil die Gefahr einer Verunreinigung mit virulentem Katzen infizierendem Enteritisvirus, welcher manchmal in den verwendeten Primärkulturen vorhanden ist, besteht.

Es ist allgemein anerkannt, Idass das Fehlen geeigneter verunreinigungsfreier Wirtzellen oder -zellstämme, welche fähig sind, als Substrat für die Züchtung interessierender pathogener Viren zu dienen, die Forschung und Entwicklungsanstrengungen zur Gewinnung von Viren, welche zur Verwendung in Impfstoffen und damit zur Bekämpfung von tierischen und menschlichen Krankheiten geeignet sind, stark gehindert hat.

Es wurde nun gefunden, dass sich Zellstämme, die Zellen enthalten, welche sich von Katzenembryos ableiten, sich hervorragend als Substrat für die Züchtung pathogener Viren, insbesondere des Katzen infizierenden Enteritisvirus, des Katzenrhinotracheitis-Virus und der Katzenpicornaviren, eignet, und dass Viren, z. B.

das Katzen infizierende Enteritisvirus, durch wiederholte Passagen über Kulturen von solchen Katzen enalrryo-Zellstärnmen abgeschwächt werden können.

In der vorliegenden Beschreibung wird der Ausdruck Katzen in seiner engeren Bedeutung verwendet, nämlich für Tiere der Gattung Felis.

Gegenstand der Erfindung ist demnach:
I. ein Verfahren zur Züchtung pathogener Viren, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen Zellstamm, welcher sich von Katzenembryos ableitende Zellen enthält, mit dem Virus infiziert und ihn dann in einem Nährmedium züchtet;
II. ein Zellstamm zur Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens, welcher dadurch gekennzeichnet ist, dass er Zellen enthält, die sich von Katzenembryos ableiten; und
III. eine Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens zur Gewinnung abgeschwächter Virenstämme, welche dadurch gekennzeichnet ist, dass man einen virulenten Stamm des Virus in Zellstämmen, welche sich von Katzenembryos ableitende Zellen enthalten, solange züchtet, bis das Virus zwar seine Infektivität verloren, seine Immunogenität jedoch noch beibehalten hat.

Das so erhaltene antigene Material kann in bekannter Weise zu Impfstoffen konfektioniert werden.

Besonders geeignet sind Zellstämme, die Zellen enthalten, welche sich von Katzenembryo-Lungenzellen ableiten; weiter eignen sich aber auch Zellstämme, welche sich von Niere, Herz, Haut, Muskeln Amnion (Placenta), Zunge, Leber und/oder Darm des Embryos oder vom ganzen Embryo oder vom ausgeweideten Embryo ableiten.

Es ist wohlbekannt, dass Zellstämme (englisch cell strains ) Zellsysteme sind, die sich von aus lebenden Organismen entfernten Zellen ableiten und die fähig sind, in vitro in einem Nährmedium gezüchtet zu werden, wobei sie im wesentlichen diploid bleiben und die Chromosomenzusammensetzung unverändert bleibt. Im Gegensatz dazu bezeichnet man die heteroploide Vernehmungsform als Zell-Linie (englisch cell line ).

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann jedes bekannte Medium verwendet werden, welches die notwendigen physikalischen und chemischen Bedingungen und die Nährstoffzusammensetzung für die Zucht oder Weiterzucht in Nebenkulturen, d. h. die Erhaltung, das individuelle Wachstum und die Vermehrung dieser Zellen, aufweist. Zweckmässig verwendet man aber Eagle's Basal-Medium (vgl. Science 122 (1959), 501 bis 504) mit etwas Rinderserum, vorzugsweise mit Tryptosephosphat-Brühe und dem doppelten des normalen Gehaltes an Aminosäuren und Vitaminen. Der pH-Wert dieses Mediums wird auf 6,8 bis 7,8 gehalten, beispielsweise mittels eines Puffers.

Die erfindungsgemässen Zellstämme stellen Wirtezellen für die Züchtung von Viren dar. Sile sind frei von Verunreinigung durch Viren und weisen einen im wesentlichen konstanten Grad an Anfälligkeit für Viren dar. Sie können, unabhängig von den jahreszeitlichen Schwankungen, welche sich bisher bei direkt von Jungkatzen erhaltenen Gewebeprimärkulturen ergaben, in jeder beliebigen Menge erzeugt werden.

Die für die Zwecke der vorliegenden Erfindung verwendeten Katzenembryos weisen vorzugsweise eine Grösse von 1 bis 4,5 cm auf. Der Embryo oder Teile von ihm werden zweckmässig unter aseptischen Bedingungen entfernt und mechanisch oder mittels eines geeigneten Enzympräparates in einer gepufferten Kochsalzlösung zerteilt. Die erhaltene Zellsuspension wird dann in die das Nährmedium enthaltenden Behälter überführt und bei einer Temperatur von 32 bis 39 "C, vorzugsweise 35 bis 37,5 CC, gezüchtet. Um die Weiterzüchtung in Nebenkulturen zu erleichtern, behandelt man die zusammengewachsenen Blätter der Zellen des Stamms vor jeder Überführung in ein neues Medium mit Trypsin und einem unschädlichen Gelatbiidner.

Bei Verwendung von Lungengewebe entnimmt man dieses zweckmässig einem etwa 5 bis 7 Wochen alten Embryo unter sterilen Bedingungen und geht im übrigen wie oben angegeben vor.

Es wurde beobachtet, dass sich die Zellen des Stammes mit einer solchen Geschwindigkeit vermehren, dass sich ihre Zahl alle 2 bis 3 Tage verdoppelt. Die erfindungsgemässen Zellstämme eignen sich als Substrat für die Züchtung einer ganzen Anzahl von Viren. Beispiele solcher Viren sind: das Katzen infizierende Enteritisvirus, das Katzenrhinotracheitisvirus, die Katzenpicornaviren und das Rinderherpesvirus. Die Picornaviren umfassen jene Katzenviren, welche den Enteroviren und Rhinoviren ähnliche Eigenschaften aufweisen, sowie auch Viren mit Eigenschaften, welche zwischen denen der Enteroviren und der Rhinoviren liegen.

Zur Infektion des Zellstamms mit dem Virus kann der Stamm mit einer Kochsalzsuspension Ides Virus, der beispielsweise aus dem Exsudat eines infizierten Tieres oder auf andere Weise gewonnen wurde, vermischt werden. Im Falle des Katzen infizierenden Enteritisvirus verwendet man vorzugsweise von der Krankheit befallene Milz oder Dünndarm von Katzen und bringt dieselben in Kulturen des Katzenembryo-Zellstammes ein.

Das Virus ruft im Stamm gewöhnlich wahrnehmbare Veränderungen oder Zelldegeneration hervor.

Wenn das Virus in einer genügenden Menge vorhanden ist, wird die Kultur auf ihre immunogene Wirksamkeit und Toxizität geprüft. Nötigenfalls wird das Virus abgeschwächt, gegebenenfalls durch eine Reihe von Passagen über die erfindungsgemässen Zellstämme oder mit geeigneten chemischen oder physikalischen Mitteln inaktiviert. Das so erhaltene antigene Material kann entweder für die Gewinnung von Antikörpern für eine passive Immunisierung verwendet oder direkt als Impfstoff warmblütigen anfälligen Tieren verabreicht werden.

Beispiel 1
Zwei etwa 6 Wochen alten Katzenembryos wurde Lungengewebe entnommen. Das Gewebe wurde mittels einer 0,250/oigen Lösung von Trypsin (Nutritional Biochemicals Co. 1/300) in einer geprüften Kochsalzlösung, wie sie von Dulbecco u. Mitarb., J. exp. Med. 99 (1954), 167, beschrieben wurde, zerteilt. Die erhaltene Suspension, enthaltend 5X106 Zellen, wurde in einen 11 2-ml-Medizinalflachkolben überführt, welcher Eagle's Basal-Medium (80 Volumenteile) (vgl. H. Enge, Science 122 (1955), 504), das so modifiziert war, dass es das Doppelte der gewöhnlichen Menge an Aminosäuren und Vitaminen enthält, Tryptosephosphat-Brühe (10 Volumenteile) und Rinderserum (10 Volumenteile) als sterile Lösung enthielt.

Die so gebildeten einschichtigen Kulturen wurden in Nebenkulturen weitergezüchtet, indem jeweils der Inhalt einer Flasche im Mittel wöchentlich zweimal in 2 oder 3 Flaschen übergefiltert wurde. Die Zellen wurden zu diesem Zwecke mit einer 0,050/oigen Lösung von Natriumedetat in einer 0,10/obigen Lösung von Trypsin in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung wieder suspendiert.

Es wurde festgestellt, dass die Zellen typische Fibroblasten waren und bis zur 40. Passage im wesentlichen diploid blieben. Bis zur 100. Passage traten keine morphologischen Veränderungen auf, obschon Chromosomenanomalitäten immer üblicher wurden.

Vorräte von Zellen bis zur 20. Passage wurden im Kulturmedilum unter Zugabe von 10 0/o Dimethylsulphoxyd bei -190 "C aufbewahrt.

In einem anderen, ähnlichen Versuch wurde ein Medium verwendet, das Eagle's Basal-Medium (90 Volumenteile) und Rinderserum (10 Volumenteile) enthielt, doch wuchsen die Zellkulturen nicht gleich schnell.

Beispiel 2
Embryos (Grösse etwa 2,5 cm) wurden aus trächtigen Katzen entfernt und in kleine Teilchen zerhackt.

Das Gewebe wurde mit einer 0,250/oigen Lösung von Trypsin (Nutritional Biochemicals Co. 1/300) in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung zerteilt. Die erhaltene Suspension, enthaltend 5 X 106 Zellen, wurde in einen 112-ml-Medizinalflachkolben überführt, welcher Eagle's Basal-Medium (80 Volumenteile), das so modifiziert war, dass es das Doppelte der gewöhnlichen Menge an Aminosäuren und Vitaminen enthält, Tryptosephosphat-Brühe (10 Volumenteile) und Rinderserum (10 Volumenteile) als sterile Lösung enthielt.

Die so gebildeten einschichtigen Kulturen wurden in Nebenkulturen weitergezüchtet, indem jeweils der Inhalt einer Flasche im Mittel wöchentlich zweimal, später wöchentlich einmal, in 2 oder 3 Flaschen übergeführt wurde. Die Zellen wurden zu diesem Zwecke mit einer 0,05 /Oigen Lösung von Natriumedetat (Natrium N,N,N',N'tetraacetat) in einer 0,10/obigen Lösung von Trypsin in einer phosphatgepufferten Kochsalzlösung wieder suspendiert.

Es wurde festgestellt, dass die Zellen typische Fibroblasten waren und bis zur 48. Passage im wesentlichen diploid blieben. Vorräte von Zellen bis zur 20. Passage wurden im Kulturmedium unter Zugabe von 10 o/o Dimethylsulphoxyd bei -190 "C aufbewahrt.

ähnliche Versuche wurden mit Katzenembryos von etwa 1 bis 4,5 cm Grösse, mit ausgeweideten Embryos und mit folgenden Teilen des Katzenembryos durchgeführt: Niere, Herz, Herz/Lungen-Gemisch, Haut, Muskeln, Darm, Amnion (Placenta), Zunge und Leber. Aus allen diesen Geweben wurden befriedigende Zellstämme erhalten.

Beispiel 3
Es wurden zusammengewachsene Blätter des Zellstamms, wie in den Beispielen 1 oder 2 beschrieben, erhalten und mit Natriumedetat behandelt. Dann wurden die Zellen in Reagenzgläser (150X50 mm), die Deckgläser (Nr. 1 22 X 10) enthielten, abgefüllt. In jedes Reagenzglas wurden etwa 2,0 X 10 Zellen in 2 ml Medium gegeben und unter dieser Neigung von 10 bei 37 OC bebrütet.

24 bis 48 Stunden nach der Aussaat waren auf den Deckgläsern zusammengewachsene Blätter von Zellen gebildet. Das Medium enthielt Eagle's Basal-Medium, das, wie in Beispiel 1 beschrieben, modifiziert war (77,5 /o), Rinderserum (10 /o), Tryptosephosphat Brühe (10 O/o) und eine 4,40/oige Natriuihydrogencar- bonatlösung (2,5 /o).

Zu den in den obigen Medien vorliegenden Zellen wurde eine geeignete Verdünnung (0,25 ml) des Katzen infizierenden Enteritisvirus gegeben. Die Reagenzgläser wurden unter einer Neigung von 10 bei 37 C bebrütet.

Das Virus erzeugte erkennbare Veränderungen im Zellkern, wenn die Zellen mit Hämatoxylin und Erosin gefärbt wurden. Ungefähr 18 Stunden nach der Infektion nahmen die infizierten Zellkerne (etwa 1 bis 2 Oio aller Zellkerne) mehr Hämatoxylin als die nichtinfizierten Zellkerne auf. Darauf folgte in den nächsten 6 Stunden eine Vergrösserung der Kernkörperchen, ein homogenes Dunkelwerden des übrigen Zellkerninhaltes und die Entwicklung einer klaren, das oder die Kernkörperchen umgebenden Zone und einer anderen klaren Zone unmittelbar innerhalb der Kernmembran. Während der nächsten 24 Stunden schienen die infizierten Zellen zu schrumpfen und färbten sich beinahe schwarz, bevor sie sich schliesslich vom Deckglas lösten.

Ungefähr 5 bis 10 O/o aller Zellkerne zeigten die obigen Ver änderungen während den ersten zwei Tagen nach der Infektion.

Ähnliche Versuche wurden auch mit allen anderen der nach dem letzten Absatz von Beispiel 2 erhaltenen Zell stämme durchgeführt. Auf allen diesen neuen Stämmen wuchs das Virus befriedigend.

Beispiel 4
Es wurden auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise in Reagenzgläsern zusammengewachsene Blätter von aus ganzen Embryos erhaltenen Zellen hergestellt. Eine Probe von Nasen- oder Augenexsudat einer unter Katzenrhinotracheitis leidenden Katze wurde mit der in Beispiel 1 erwähnten phosphatgepufferten Kochsalzlösung (2,0 ml), die auch 200 Einheiten Penicillin und 100 ,4g Streptomycin pro ml enthielt, gemischt.

In fünf Reagenzgläsern wurde das Nährmedium von den einschichtigen Zellstämmen entfernt, durch das Exsudat/Puffer-Gemisch ersetzt und während 2 Stunden bei 37 OC bebrütet. Das Exsudat/Puffer-Gemisch wurde dann entfernt und die Zellen mit frischer steriler Pufferlösung gewaschen. Die infizierten Reagenzrohre wurden mit frischem Nährmedium (1,5 ml pro Rohr) beschickt und dann bei 37 "C bebrütet.

Danach wurden die infizierten Kulturen und die Kontrollkulturen, die statt mit dem Exsudat/Puffer-Gemisch mit steriler Kochsalzlösung hergestellt waren, täglich mikroskopisch geprüft.

Während der nächsten paar Tage blieb das Aussehen der Zellen in den Kontrollrohren normal. In den infizierten Rohren zeigten sich innert 48 Stunden Zonen mit anomalen Zellen. Diese Zonen waren unzusammenhängend über das Zellblatt verstreut und bestanden aus abgerundeten Zellen mit erhöhter Brechung.

Die Zonen der befallenen Zellen waren in den frühen Stadien deutlich von den sie umgebenden Zellen mit normalem Aussehen abgegrenzt. Mit zunehmender Infektion wurden die Zonen mit anomalen Zellen grösser und zahlreicher, bis am 4. bis 6. Tage das ganze Zellbiatt betroffen war. In den späteren Stadien der Infektion lösten sich einige Zellen vom Glas und liessen im Zellblatt klare Lücken zurück. Für das unbewaffnete Auge nahm das Zellblatt ein wolkiges Aussehen an. Verschiedene mit der Flüssigkeit und/oder den Zellen aus infizierten Rohren durchgeführte Versuche zeigten, dass das Virus das für die Zellveränderungen verantwortliche Agens war; durch andere Versuche wurde das Virus als Katzenrhinotracheitisvirus identifiziert. Noch andere Versuche ergaben, dass die infizierten Kulturen frei von anderen Mikroorganismen waren.

Das Virus konnte periodisch auf frische Rohrkulturen desselben Zellstamms übertragen werden, in welchen dann ähnliche degenerative Zellveränderungen stattfanden.

Geeignete Verdünnungsversuche ergaben weiter, dass eine Vermehrung des Virus stattgefunden hatte.

Beispiel 5
Ein weiterer Versuch wurde nach der in Beispiel 3 beschriebenen Methode, jedoch unter Verwendung eines aus Embryolunge erhaltenen Zellstammes, durchgeführt.

Es wurde dabei gefunden, dass dieses Virus auch auf diesem Zellstamm gut wächst, und es wurden ähnliche Resultate wie in Beispiel 4 erhalten.

Beispiel 6
Es wurden, wie in Beispiel 1 beschrieben, in Reagenzgläsern zusammenhängende Blätter des Zellstamms erhalten. Eine Probe des Nasen- oder Augenexsudates einer unter Katzeninfluenza leidenden Katze, die eine Quelle für Katzenpicornavirus darstellte, wurde mit der in Beispiel 1 erwähnten phophatgepufferten Kochsalzlösung (2,0 ml), die auch 200 Einheiten Penicillin und 100 ,ug Streptomycin pro ml enthielt, vermischt.

Das Nährmedium wurde von den einschichtigen Zellstämmen durch das Exsudat/Puffer-Gemi sch ersetzt und während 2 Stunden bei 37 C bebrütet. Das Exsudat/Puffer-Gemisch wurde dann entfernt und die Zellen mit frischer steriler Pufferlösung gewaschen. Der infizierte Zellstamm wurde dann in einem frischen Nährmedium (1,5 ml) bei 37 OC bebrütet.

Darauf wurde die infizierte Kultur und eine Kontrollkultur, die statt mit dem Exsudat/Puffer-Gemisch mit steriler Kochsalzlösung hergestellt war, täglich mikroskopisch geprüft. Es wurde gefunden, dass die Zelldegeneration (cythopatischer Effekt), welche nach einer Bebrütungszeit von 2 bis 7 Tagen in Erscheinung trat, der durch menschliche Picornaviren, z. B. das Poliomyelitisvirus, erzeugten nicht unähnlich war. Das Virus konnte durch eine Reihe von Passagen auf Kulturen des Zell stamms übertragen werden. Durch geeignete Verdünnungsversuche wurde gezeigt, dass eine Vermehrung des Virus im Zellstamm stattgefunden hatte. Weitere Versuche zeigten, dass die so durch wiederholte Passagen erhaltenen Kulturen frei von Verunreinigung durch andere Mikroorganismen waren.

Beispiel 7
Das Virus der Katzen infizierenden Enteritis wurde aus Milz und Dünndarm von infizierten Katzen auf dem Höhepunkt der Krankheit gewonnen und Kulturen von Katzenembryolungen-Zellstämmen eingeimpft. Zur Prüfung auf Veränderungen im Zellkern wurden die Kulturen mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Sobald Veränderungen klar erkennbar waren - drei bis fünf Tage nach Infizierung der Kulturen - wurden die infizierten Kulturen in gefrorenem Zustand bei -30 OC aufbewahrt.

Das bei -30 "C gefrorene aufbewahrte Virus wurde später aufgetaut und in nichtinfizierten Kulturen von Katzenembryo-Zellstämmen weitergezüchtet. Nach einer bestimmten Zeit, die sich nach dem Vorhandensein von Veränderungen im Innern der Zellkerne richtete, wurden die infizierten Kulturen der Zellstämme wieder in gefrorenem Zustande bei -30 "C bis zur nächsten Passage aufbewahrt.

Beim Züchten des Virus in Katzenembryo-Zellstämmen gab man das Virus gewöhnlich gleichzeitig mit den Zellen und dem Kulturmedium in das Kulturgefäss. Die mit dem Virus beimpfte Kultur von Embrionalzellstämmen wurde bei 37 OC bebrütet.

Zur Abschwächung des Virusstamms wurde dieser, wie oben beschrieben, in acht Passagen über Katzenembryolungen-Zellstämmen und dann in fünf Passagen über Stämme, die aus dem ganzen Katzenembryo erhalten worden waren, gezüchtet. Ein aliquoter Teil wurde zwei zusätzlichen Passagen über die letztgenannten Zellstämme unterworfen. Eine andere Probe wurde einer Passage über einen Zellstamm aus dem ganzen Katzenembryo und darauf zwei bis drei Passagen in Zellstämmen aus Katzenembryolunge unterworfen.

Die achte Passage des abgeschwächten Stamms des Katzen infizierenden Enteritisvirus wurde an zwei 4monatigen Jungkatzen auf ihre Harmlosigkeit geprüft.

Jeder Jungkatze wurden 1,0 ml der virusinfizierten Gewebekulturflüssigkeit und -zellen subkutan injiziert; dies entsprach 200 Gewebekulturinfektionsdosen. Keine der beiden Jungkatzen zeigte Anzeichen klinischer Krankheit, obschon die Gesamtanzahl der Leukozyten vom 3.

bis zum 9. Tag herabgesetzt war. Vom 2. bis zum 9. Tag nach der Impfung wurden Rektalabstriche gemacht. Die mit ihnen beimpften Gewebekulturen zeigten keinerlei Anzeichen für das Vorhandensein des Virus.

Am 21. Tage wurden diese zwei Jungkatzen zusammen mit zwei Kontrolltieren gleichen Alters durch orale Verabreichung von je 1,0 ml einer 100/oigen Suspension von Leber und Milz in 100/oiger Pferdeserumbrühe einem Immunitätstest unterworfen. Die Leber und Milz stammten von einem tödlich verlaufenen typischen Fall von Katzen infizierender Enteritis. Die geimpften Katzen blieben während der ganzen Testperiode klinisch normal. Die ungeimpften Kontrolltiere dagegen wurden am fünften Tage fiebrig, verloren an Körpergewicht und waren untätig und deutlich leukopen.

Anzahl Leukozyten (X 105) (geometrisches Mittel) Tage 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Nach Impfung 8,8 11,2 9,7 6,8 4,5 6,0 6,1 5,8 6,7 10,1 > < X 103 10' Nach Testbeginn geimpfte Jungkatzen 19,3 10,1 10,7 9,3 8,2 8,4 12,3 8,4 12,1 X X 10' ungeimpfte Jungkatzen 10,6 11,7 4,9 6,6 4,6 3,8 4,3 5,3 6,5 X X 103
Den Tieren wurde vor der Impfung und vor und während des Immunitätstestes Blut entnommen und das Serum auf neutralisierende Antikörper untersucht.

Neutralisierende Antikörper des Serums
Tier vor der vor dem während des
Nummer Impfung Immunitäts- Immunitäts test testes Geimpft
233 < 2* 640 640
234 < 2 640 2560 Ungeimpft
235 NT** 2 640
236 NT 2 640 * Reziproker Wert der Serumverdünnung ** Nicht untersucht
Die 15. Passage dieses abgeschwächten Stamms des Katzen infizierenden Enteritisvirus wurde an Jungkatzen auf Harmlosigkeit und Antigenizität und an ungeimpften Tieren bezüglich Infektivität geprüft. Das Virus wurde im Katzenembryo-Zellstamm gezüchtet und die Jungkatzen subkutan mit 1,0 ml Impfstoff geimpft. Der Versuch wurde in zwei Teilen, A und B, durchgeführt.

A. Zuerst wurde eine 4 Monate alte Jungkatze mit 1,6 X 105 Gewebekulturinfektionsdosen geimpft. Das Tier blieb gesund und zeigte keinerlei Anzeichen von Leukopenie oder Fieber, und es wurde während der ersten 15 Tage des Versuchs im Kot kein Virus festgestellt. Zwei 4 Monate alte Jungkatzen und eine 3 Monate alte Jungkatze wurden in Berührung mit den geimpften Tieren gehalten. Keine dieser Jungkatzen zeigte Anzeichen von schlechter Gesundheit, Leukopenie oder Fieber.

B. Im zweiten Teil des Versuchs wurden sechs 6 bis 7 Monate alte Katzen mit 1,6X103 Gewebekulturinfektionsdosen des Virus geimpft. Auch diese Katzen blieben gesund.

Den für diesen Versuch verwendeten Tieren wurde unmittelbar vor der Impfung und drei Wochen später Blut entnommen. Die Seren wurden auf neutralisierende Antikörper untersucht.

Neutralisierender Antikörper
3 Wochen vor der nach der Katze Nummer Impfung Impfung A. Geirupft
238 < 10 1000 Nicht geimpft in Berührung
237 < 10 < 5
239 < 10 < 5
240 < 10 < 5
241 < 10 < 5
243 < 10 < 5
244 < 10 < 5 B. Geirupft
223 < 5 100
224 < 5 1000
225 < 5 1000
226 < 5 1000
228 < 5 1000
229 < 5 1000
230 < 5 10 000
Bei einem anderen Versuch wurden drei 3 Monate alte Jungkatzen subkutan geimpft mit 1,0 ml des Virus aus der 18. Passage über einen Katzenembryolungen Zellstamm. Die Virusmenge entsprach 1,6 X 105 Gewebekulturinfektionsdosen. Diese Jungkatzen sowie zwei mit ihnen in Berührung gehaltene, gleichaltrige, ungeimpfte Jungkatzen blieben gesund und zeigten keinerlei Anzeichen von Leukopenie oder Fieber.

Bei den geimpften Jungkatzen wurden unmittelbar vor der Impfung und 11 und 22 Tage später Serumproben genommen. Den ungeimpften, mit ihnen in Berührung stehenden Jungkatzen wurde zur gleichen Zeit Blut entnommen. Alle Serien wurden auf neutralisierende Antikörper untersucht.

vor der nach der Impfung Katze Nummer Impfung 11 Tage 22 Tage
Geimpfte Tiere
247 < 10 100 > 10 000
250 < 10 10 > 10 000
252 < 10 > 10 000 > 10 000 Ungeimpfte, in Berührung stehende Tiere
251 < 10 10 < 10
254 < 10 10 < 10
Aus diesen Versuchen ist zu schliessen, dass dieser Stamm des Katzen infizierenden Enteritis-(Panleukopenie-)Virus, welcher in Katzenembryo-Zellstämmen gezüchtet und weitergezüchtet wurde, antigen ist, in Katzen die Produktion von homologen neutralisierenden Antikörpern stimuliert und nicht von geimpften Jungkatzen auf empfängliche Jungkatzen, die mit ihnen in Berührung stehen, übertragen wird.

Beispiel 8
Roux-Kolben, die je 12 bis 15 X 106 Zellen in 100 ml der in Beispiel 7 beschriebenen Kulturmedien enthielten, wurden während 24 Stunden bei 37 OC bebrütet. Die zusammengewachsenen Zellblätter wurden einmal mit auf 37 OC vorgewärmter phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und mit 10 ml einer unverdünnten Suspension des Katzen infizierenden Enteritisvirus, die aus der 15. bis 18. Passage, wie in Beispiel 7 beschrieben, gewonnen worden war und 1,6 X 106 Gewebekulturinfektionsdosen entsprach, geimpft.

10 ml des Mediums S. M. 199 (vgl. Morgan u. Mitarb., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 73 (1950), 6), die auch 0,5 ml einer 4,50/oigen Natriumhydrogencarbonat-Lösung mit den üblichen Mengen Penicillin und Streptomycin enthielten, wurden zu den Kulturen zugegeben und das Gemisch während 72 Stunden bei 37 OC bebrütet.

Die Kultur wurde dann schnell gefroren und dreimal aufgetaut und wie in Beispiel 7 beschrieben geprüft, wobei befriedigende Resultate erhalten wurden.

Nötigenfalls kann die gefrorene und aufgetaute Zubereitung erneut gefroren und bei -65 C aufbewahrt werden.

Claims

PATENTANSPRÜCHE

I. Verfahren zur Züchtung pathogener Viren, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Zellstamm, welcher sich von Katzenembryos ableitende Zellen enthält, mit dem Virus infiziert und ihn dann in einem Nährmedium züchtet.

II. Zellstamm zur Ausführung des Verfahrens nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass er Zellen enthält, die sich von Katzenembryos ableiten.

III. Anwendung des Verfahrens nach Patentanspruch I zur Gewinnung abgeschwächter Virenstämme, dadurch gekennzeichnet, dass man einen virulenten Stamm des Virus in Zellstämmen, welche sich von Katzenembryos ableitende Zellen enthalten, solange züchtet, bis das Virus zwar seine Infektivität verloren, seine Immunogenität jedoch noch beibehalten hat.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass das zu züchtende Virus der Katzen infizierende Enteritisvirus ist.

2. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, Idass das zu züchtende Virus das Katzenrhinotracheitisvirus ist.

3. Verfahren nach Patentanspruch I, dadurch gekennzeichnet, dass das zu züchtende Virus das Katzenpicornavirus ist.

4. Zellstamm nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass er Zellen enthält, welche sich von Katzenembryolungen-Zellen ableiten.

5. Zellstamm nach Patentanspruch II, dadurch gekennzeichnet, dass er Zellen enthält, welche sich von Niere, Herz, Haut, Muskeln, Amnion, Zunge, Leber und/oder Darm des Embryos oder vom ganzen Embryo oder vom ausgeweideten Embryo ableiten.

6. Anwendung nach Patentanspruch III zur Gewinnung von abgeschwächten Stämmen des Katzen infizierenden Enteritisvirus.