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Verfahren zur Herstellung einer Vakzine aus lebenden, abgeschwächten Masernviren
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer neuen Vakzine aus lebenden, abgeschwächten Masernviren. Die Erfindung richtet sich insbesondere auf die Herstellung einer wirksamen Vakzine zur
Bekämpfung von Masern und auf ein neues Gewebekulturverfahren zur Herstellung von Impfstoffen aus lebenden, abgeschwächten Masernviren.
Masern bilden eine der bekannten Infektionskrankheiten von Kindern. Das Virus ist sehr ansteckend und nur etwa 10/0 der empfänglichen Kinder erkranken bei Infektion nicht. Nahezu alle erwachsenen Personen haben diese Krankheit vor dem Alter von 20 Jahren gehabt. Gewöhnlich sind Masern endemisch in grossen Gemeinden, und in Intervallen von etwa 3 Jahren tritt meist eine grössere Epidemie auf.
Die Prognose für Masernpatienten ist gewöhnlich günstig, aber sekundäre Komplikationen infolge Bakterien, z. B. Mittelohrentzündung (otitis media) und Bronchopneumonie sind nicht selten. Andere, weniger oft auftretende, aber stärker angreifende Folgen sind Konvulsionen, Serummeningitis und Masernencephalitis. Das Auftreten von Masernencephalitis wurde behördlich auf einen EncephaIitisfa11 auf etwa 400 - 1000 Masernerkrankungen geschätzt.
Bis vor kurzem bestanden die einzigen prophylaktischen Massnahmen, die von den Ärzten angewendet wurden, in der Verabreichung von r - Globulin und Hyperimmun-Masernantiserum, aber die Ergebnisse waren nicht vollkommen befriedigend. Bisher gab es somit kein ausreichendes Vorbeugungsmittel für die wiederholten Masernepidemien, die das Leben sehr junger Kinder gefährdeten und andern empfänglichen Personen mit langwierigen Krankheiten und der Gefahr schädlicher Folgen drohten.
Während der frühen Vierzigerjahre wurde ein energischer Versuch gemacht, eine Masernvakzine aus Viren herzustellen, die in einer Entwicklungsstufe eines befruchteten Eies gezüchtet wurden. Die Untersucher strebten danach, ein abgeschwächte Masernvirus durch Übertragungen auf eine Reihe befruchteter Eier zu entwickeln. Es gab jedoch keinen Beweis dafür, dass das Virus sich an den Wuchs des Kükenem- bryos anpasste, und gute Reproduzierbarkeit konnte nicht erreicht werden. Bei klinische Erprobung des er- zeugtenVakzins wurden die geimpften Kinder nicht vor den epidemischen Masernviren geschützt, und ein hoher Prozentsatz der Versuchspatienten zeigte bei Infektion die Krankheitssymptome.
Erst nach den kom- biniertenversuchen zum Entwickeln einesPoliomyelitisvakzins wurde die Gewebekulturtechnik dermassen vervollkommnet, dass die Masernviren gut reproduzierbar aus In-vitro-Gewebekulturen menschlicher Zellen erhalten werden konnten.
In den letzten Jahren sind viele Berichte in bezug auf die Züchtung von Masernviren in verschiedenen Zellenkultursystemen erschienen. Enders und Peebles gebrauchten Zellenkulturen vom Nierengewebe des Menschen und des Affen. Es wurden auch Viren im menschlichen Amnion und auf Nierengeweben von Nagetieren gezüchtet. Milovanôvic u. a. ist es gelungen, Masernviren an die Entwicklungsstufen embryonaler Küken anpassen zu lassen, und Katz u. a. konnten erfolgreich durch weitere Anpassungen Masernviren in Gewebekulturen embryonaler KUken zuchten.
Obgleich viele Kriteria anwendbar sind zum Festsetzen geeigneter Gewebekultursysteme zur Her-
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Masernvakzine,dass ein solches System aus primären Zellen nicht-humanen Ursprungs bestehen müsste, u. zw. von Tieren, die nicht zur Nahrung dienen und die sehr kräftige Viren frei von fremden Infektionsüberträgernliefern können. Keines der vorerwähnten Zellenkultursysteme erfullt diese allgemein angenommenen Kriteria vollständig. Es ist z. B. bekannt, dass zahlreiche latente Viren isoliert und charakterisiert sind im Zusam- menhang mit der kommerziellenHersteJ1ung von Poliomyelitisviren und Nierenzellenkulturen von Affen.
Das Problem der Vogelleukosis im Zusammenhang mit Gewebekulturen embryonaler Küken ist allgemein bekannt.
Viele der vorerwähnten Zellenkultursysteme liefern kein kräftiges Virus, so dass noch immer ein
Bedarf an einer Gewebekultur vorliegt, die die vorerwähnten Kriteria vollkommen erfüllen kann.
Zweck der Erfindung ist, eine Masernvakzine zu schaffen, das in den empfänglichen Personen Anti- körper erzeugen kann. Weiter bezweckt die Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung einer Masernvakzine zu schaffen, wobei eine Gewebekultur benutzt ist, die frei von fremden Agentien ist. Weiter bezweckt die Erfindung, eine Masernvakzine zu bereiten, die auch frei von fremden Agentien ist. Ein weiterer
Zweck besteht darin, einen sicheren, bequem in immer gleicher Qualität herstellbaren Masernimpfstoff hoher Leistung zu erzielen. Weitere Zwecke der Erfindung werden dem Fachmann deutlich sein.
Die Erfindung wird durchgeführt in einem Verfahren, bei dem eine Vakzine lebender Masernviren durch Abschwächung eines lebenden Masernvirus erhalten wird, das auf eine Reihe von Gewebekulturen übertragen wird, bei welchem Verfahren Masernviren auf eine Reihe von Gewebekulturen von Hunde- nierenzellen, frei von fremden Agentien, übertragen werden.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung besteht in einem Verfahren zur Herstellung einer Vakzine lebender, abgeschwächter Masernviren, die Antikörper erzeugen und Immunität bei empfänglichen Per- sonen ergeben, bei welchem Verfahren Masernviren auf Gewebekulturen von Hundenierenzellen frei von fremden Agentien gezüchtet werden, worauf die lebenden Viren in einem parenteral zu verabreichenden
Mittel gesammelt und nahezu alle Zellenabfälle entfernt werden.
Es hat sich ergeben, daR der erhaltene Impfstoff ohne Schwierigkeiten lyophilisiert werden kann, und eine Prüfung der Lebensfähigkeit der getrockneten, gefrorenen Impfstoffe zeigt nach 12 Monaten Aufbewahrung nur einen kleinen Verlust an Viren bei normalerKühlschranktemperatur (d.h. 4-10 C). Zurück- gewonnene, getrocknete und gefrorene Impfstoffe haben eineLebensdauer von mindestens 90 Tagen. Vorzugsweise wird daher erfindungsgemäss ein getrockneter, gefrorener Impfstoff hergestellt.
Bei einer besonders vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung werden mindestens acht Übertragungen eines Masernvirus (vorzugsweise Edmonston Masernviruskulturen) nacheinander auf Gewebekulturen von Hundenierenzellen durchgeführt, da eine solche Anzahl von Übertragungen überraschend hohe Virusausbeuten liefert (die verwendetenEdmonston Masernviruskulturen werden gezüchtet auf 24 menschlichen Nierengeweben, 28 menschlichen Amniongeweben und 22 Kükenembryogeweben).
Obgleich die Edmonston Masernviruskultur vorzugsweise benutzt wird, da diese allgemein zur Verfügung steht, kann selbstverständlich jedes lebende Masernvirus bei dem erfindungsgemässen Verfahren verwendet werden. Das erfindungsgemässeVerfahren kann auch Masernviren verwenden, die in Kükenembryos, Affennierengeweben, Kuhnieren-oder Kuhlungengeweben, Hamsternierengeweben, Mausnierengeweben u. dgl. gezüchtet sind. Dieses Verfahren wird nunmehr an Hand des nachfolgenden Beispiels näher erläutert.
Beispiel : Fortpflanzung von Masernviren in Affennierengewebekulturen.
Behandlung einer Hundegruppe. Eine Gruppe von lagdhunden wurde zum Liefern der Gewebe für den Masernimpfstoff gepflegt. Die Tiere waren in einem Sonderraum untergebracht und wurden von fremden Tieren isoliert. Ihr Gesundheitszustand wurde im allgemeinen gut beibehalten. In Intervallen von drei Monaten wurden alle Hunde der Gruppe mit einem nicht lebenden Impfstoff vakziniert, der aus Hundekrankheit-un ansteckenden Hundeleberentzündungsviren bestand ; weiter wurde mit Leptospira geimpft, um zu vermeiden, dass die Ansteckung auf die Nierenzellenkulturen übertragen würde.
Herstellung von Zellenkulturen. Es wurden Hunde durch intravenöse Injektion von Pentobarbitainatrium (Abbott) getötet. Die Tiere wurden seziert und auf Krankheiten untersucht. Es ist auch möglich, chirurgisch Nieren gesondert zu entfernen. Die Nieren wurden sofort unter aseptischen Bedingungen entfernt, in kalte Hanks BSS Lösung ("balanced salt solution") mit 500 Einheiten Penicillin und Streptomycin und 100 Einheiten Nystatin (Mycostatin) pro ml getaucht. Sie wurden während mindestens 1 h bei 40C aufbewahrt, um die roten Blutkörperchen abzutrennen und etwaige ansteckende Oberflächenbakterien unwirksam zu machen.
Trypsinieren wurde etwa nach Bodian (Virology 2 : 575, August 1956) durchgeführt. Das Gewebe der Nierenrinde wurde in dunneScheiben geschnitten, und verschiedeneMale inHanks BSS Lösung, enthaltend
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stabilen menschlichen Amnionzellen inokuliert (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 94 : 522, März 195 7). Eine mikroskopische Untersuchung nach Spuren cytopathischer Viruswirkung wurde in dreitägigen Intervallen während 21 Tagen durchgeführt.
Es wurde ausserdem nicht neutralisiertes Virus Kolben und Rollzylindern mit primären Zellenkulturen von Nieren junger oder embryonaler Kaninchen zugesetzt.
Gleichzeitig wurdenFlüssigkeiten in nicht inokulierten Kontrollkolben mit Zellen der nachfolgenden Art gezüchtet : primäre Nierenzellen von Kaninchen, primäre Nierenzellen von Hunden und "stabile" menschliche Amnionzellen. Alle wurden mikroskopisch auf Spuren der Viruswirkung geprüft.
Es wurden Nebenkulturen von menschlichen Amnionzellen in Flüssigkeit nach 15 Tagen und in den primären Kulturen nach 30 Tagen gemacht, um den Wuchs der ansteckenden Viren zu stimulieren oder ans Licht zu bringen.
Periodisch wurden während der Züchtung Rollzylinder mit Hämatoxilin und Eosin gefärbt und nach Spuren cytopathologischer Symptome geprüft.
Die Resultate verschiedener Übertragungen von Masernviren aus der Edmonston Kultur mittels der vorstehend beschriebenen Gewebekulturtechnik sind in der Tabelle angegeben.
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<tb>
<tb>
Übertragung <SEP> von <SEP> Masernviren <SEP> (Edmonston <SEP> Kultur) <SEP> in <SEP> Hundenierenzellen
<tb> Übertragung <SEP> Nr. <SEP> Sammelvolumen <SEP> in <SEP> ml <SEP> TCID/ml
<tb> E <SEP> DK <SEP> 34 <SEP> Pos. <SEP> CPE
<tb> 22 <SEP> 1
<tb> E22DK2 <SEP> 40 <SEP> Pos. <SEP> CPE
<tb> E22DK3 <SEP> 350 <SEP> 103,5
<tb> E22DK4 <SEP> 1275 <SEP> 10 <SEP>
<tb> 22 <SEP> 4
<tb> E22DKa <SEP> 3600 <SEP> 10. <SEP>
<tb>
E <SEP> DK. <SEP> 1800 <SEP> 104,4
<tb> 22 <SEP> 6
<tb> E <SEP> DK <SEP> 900 <SEP> 4. <SEP> 6 <SEP>
<tb> E22DK8 <SEP> (a) <SEP> 1800 <SEP> 105,
<tb> (b) <SEP> 5000 <SEP> 10 <SEP>
<tb> (c) <SEP> 8000 <SEP> 105,
<tb> E22DK2 <SEP> 600 <SEP> 104,8
<tb> E22DK10 <SEP> 15000 <SEP> 104,7
<tb> E22DK11 <SEP> 200 <SEP> 105,2
<tb> E22DK12 <SEP> 400 <SEP> 106,0
<tb> E22DK13 <SEP> 800 <SEP> 10
<tb> EDK <SEP> 700 <SEP> 105,
<tb> E22DK15 <SEP> (a)8000 <SEP> 105,5
<tb> (b) <SEP> 30 <SEP> 000 <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP>
<tb>
Pos. CPE * = positiver cytopathogener Effekt
Virustitrationen wurden inHeLa-Zellen in 1/2 log Verdünnungen durchgeführt; drei Röhrchen pro Verdünnung. Ansteckungstiter auf Sammelflüssigkeiten werden durch log TCID50/ml ausgedrückt.
Es ergibt sich somit, dass das Verfahren nach der Erfindung eine Masernvakzine mit hoher Leistung liefert, deren Herstellungsverfahren sicher und leicht reproduzierbar ist. Kontrollprüfungen und Sicherheitsproben zeigten, dass die verwendeten Hundenierenzellenkulturen vollkommen frei von fremden Agentien waren, ebenso die damit hergestellte Masernvakzine. Es ist von Bedeutung, festzustellen, dass
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auch gründliche Untersuchungen keine cytopathogenen Agentien unbekannter Art bei Hundenierenzellen nachgewiesen haben. Dies kontrastiert sehr scharf mit der gut dokumentieren Abtrennung von ansteckenden Agentien z. B. bei Nierenzellen von Affen.
Die Freiheit von fremden Agentien bei dem vorliegenden Verfahren steht auch im starken Gegensatz zum Problem der Vogelleukosis in bezug auf die Herstellung eines Masernvakzins in Gewebekulturen von embryonalen Küken.
Obgleich es infolge der überraschend hohen Ausbeute an Viren im allgemeinen zu bevorzugen ist, bei dem erfindungsgemässen Verfahren nicht weniger als acht Übertragungen durchzuführen, lassen sich auch hohe Virenausbeuten durch Anwendung einer geringen Anzahl von Übertragungen erzielen, sofern die ver- wendete Masernvirussaat in einem hinreichend abgeschwächten Zustand infolge einer vorhergehenden Behandlung durch Reihenübertragungen auf andere Gewebekulturen als Hundenierenzellen ist.
Die Übertragung eines solchen abgeschwächten Masernvirus auf Hundenierenzellen hat den Vorteil, dass es auf diese Weise möglich ist, eine sichere Vakzine hoher Leistung von lebenden Masernviren frei von fremden Agentien zu erhalten. Es ist im allgemeinen nicht notwendig, mehr als etwa 15 Übertragungen auf Hundenierenzellen durchzuführen, um ein vorzügliche Masernvakzin zu erzielen. Es können jedoch mehr Übertragungen durchgeführt werden, so lange die Abschwächung nicht so stark wird, dass keine Antikörper mehr bei empfänglichen Personen gebildet werden.
Masernviren lassen sich hinreichend fortpflanzen durch eine der bekannten Gewebekulturtechniken, z. B. die Maitland Methode mit dünnen Geweben, getauchte Kulturen suspendierter Zellen, und Kulturen auf Glas gezüchtete Zellen. Im allgemeinen wird die zuletzt genannte Technik bevorzugt ; diese ist z. B. von Dulbecco und Vogt in J. Exptl. Mcd. 99 [1954], S. 167-182, beschrieben. Abarten dieses Verfahrens sind von Youngner in Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 85 [1954], S. 202, beschrieben.
Nach dem allgemeinen vorstehend beschriebenen Verfahren wurden Suspensionen von Hundenierenzellen in einem Nährmittel hergestellt und durch Zählung der Zellen standardisiert. Die Konzentration der Nierenzellen in der ursprünglichen Suspension lässt sich in einem weiten Gebiet, z. B. zwischen etwa 100 000 und 5 000 000 Zellen/ml, vorzugsweise zwischen etwa 250000 und lOOOOOOZellen/mIandern.
Es hat sich ergeben, dass eine ausreichende Fortpflanzung von Masernviren durch Inokulation des Virus in Hundenierenzellenkulturen oder durch Inokulation einer ursprünglichen Zellensuspension in ein Nährmittel mit einem Virus erzielt werden kann. Bei dem beschriebenen Verfahren wird das Masernvirus in die Zellenkulturen etwa am 5. - 7. Tag der Inkubationsperiode inokuliert, an welchem Zeitpunkt praktisch ununterbrochene Zellenflächen entstanden sind. Bei dem zweiten Fortpflanzungsverfahren werden die Masernviren in die ursprüngliche Suspension der Nierenzellen in einem Nährmittel inokuliert. Es hat sich ergeben, dass die Zellen sich gewöhnlich in ununterbrochenen Flächen bilden, bevor die Virusinfektion der Zellenvervielfachung eine Grenze setzt.
Die Zellenkulturen können mit verschiedenen Mengen infizierender Masernviren inokuliert werden.
Bei Verwendung niedriger Konzentrationen an inokuliertem Virus kann die Inkubationsperiode verlängert werden, und die erzielbaren, maximalen Virustiter können herabgesetzt werden. Umgekehrt bringt die
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rentiter mit sich. Die Inokulation von Hundenierenzellenkulturen z. B. mit einem Virus-Zellenverhältnis von 1 : 200. d. h. ITCID (durchschnittliche Infektionsdosis für eine Gewebekultur) am Virus für je
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oberen Grenze von etwa 1 : 10 und einer unteren Grenze von etwa 1 : 20000. Ein bevorzugtes Verhältnis ist etwa 1 : 100-1 : 1000.
Der pH-Wert der ursprünglichen Zellensuspension ist vorzugsweise neutral oder leicht alkalisch, da die metabolischenProdukte der Zellen Säuren bilden und das Medium, obgleich gepuffert, langsam einen niedrigeren pu-Wert annimmt. Das Nährmittel wird vorzugsweise hinreichend oft (z. B. mit Intervallen von 3 bis 4 Tagen) erneuert, um einen nach der sauren Seite verschobenen pH-Wert zu verhüten, in welchem Falle der Zellenwucbs und die Funktion der Zellen beeinträchtigt werden könnten.
Obgleich jeder vollständigeNährboden für die Gewebekultur, z. B. das Medium 199 (Morgan, Morten und Parker : Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 73 [1950], S. 1-8), Eagle Medium (Eagle Science 122 [1955], S. 501), das Medium NCTC 107 (Evans u. a. Cancer Research 16 [1956], S. 77) u. dgl., zur Erhaltung der
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FortpflanzungZellenkulturen bei einer Temperatur von etwa 25 bis 40 C, vorzugsweise bei etwa 32-380C. während etwa 5 - 12 Tagen aufzubewahren, bevor gesammelt wird.
Bei dem Verfahren nach der Erfindung werden die Viren dadurch geerntet, dass das Nährmedium, das vorzugsweise ein Säugetierserum, wie vorstehend erwähnt, enthält, durch ein parenteral absorbierbares Mittel, z. B. das Medium 199, Eagle Medium und das Medium NCTC 107 u. dgl. ersetzt wird. Es wird einleuchten, dass das Serum nicht denjenigen Medien zugesetzt wird, die als parenteral absorbierbares Mittel benutzt werden sollen. Die aus den infizierten Zellen ausgelösten Virusteilchen werden in einem parenteral absorbierbaren Mittel gesammelt, das darauf aus dem System entfernt und für eine nächstfolgende Ernte durch einen frischen Träger ersetzt wird. Die Ernten können mit Intervallen von 8 oder 12 h oder täglich durchgeführt werden, bis die Kulturen keine lebenden Zellen mehr enthalten.
Es hat sich ergeben, dass das Gewebekulturmedium 199 besonders gute Ernten ergibt, aber jedes andere Nährmedium kann benutzt werden, das sich zur Injektion an Personen eignet. Nach dem Sammeln kann etwaiger Zellenabfall aus dem Träger entfernt werden, z. B. durch Zentrifugieren oder Filtrieren oder auf sonstige beliebige Art. Es sind z. B. rostfreie Stahlfilter mit einer maximalen Öffnungsgrösse von 5 bis 10 geeignet.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die Gewebekulturflüssigkeiten von infi- zierten Hundenierenzellenkulturen in Behältern von etwa 100 1 gesammelt und aufbewahrt. Diese ungereinigte SammeHfüssigkeit wird unter positivemDruck durch Filter aus gesintertem Stahl geführt. Im allgemeinen werden Filter aus gesintertem, rostfreiem Stahl bevorzugt. Es wird vorzugsweise auch positiver Druck angewendet, obgleich zum Filtrieren auch negativer Druck benutzt werden kann. Durch diese Filtriertechnik wird der Zellenabfall günstig aus der Gewebekultur entfernt, und es hat sich überraschender-
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Vakzins erhöht wird, das ohne Verwendung von Stahlfiltern erhalten wird.
PA TE NT ANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung einer Vakzine aus lebenden Masernviren durch Abschwächung eines lebenden Masernvirus mittels einer Anzahl von Übertragungen dieses Virus auf Gewebekulturen, dadurch gekennzeichnet, dass das Masernvirus in Reihenfolge auf Gewebekulturen von Hundenierenzellen übertragen wird, die frei von fremden, cytopathogenen Agentien sind.