DE1247548B

DE1247548B - Verfahren zur Herstellung einer Masern-Vaccine

Info

Publication number: DE1247548B
Application number: DEB83486A
Authority: DE
Inventors: Dr Med Gisela Enders-Ruckle; Dr Med Walter Hennessen; Dr Med Rudolf Mauler
Original assignee: Behringwerke AG
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics GmbH Germany
Priority date: 1965-08-28
Filing date: 1965-08-28
Publication date: 1967-08-17
Also published as: AT281280B; BR6682416D0; DK121811B; BE686101A; CH484277A; NL6611851A; GB1161414A; DK119938B; FR5666M; FR1502631A

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

A 61k

3 9 Z₁ ρ 5

Int. CL:

Deutsche Kl.

Nummer: 1 247 548

Aktenzeichen: B 83486IV a/30 h

Anmeldetag: 28. August 1965

Auslegetag: 17. August 1967

Es ist bereits bekannt, daß Masernvirus in befruchteten Hühnereiern oder in Gewebekulturen von Hühnerembryonen gezüchtet werden kann, z. B. ist ein solches Virus der allgemein verwendete Edmonston-Stamm (vgl. E. H a a g e η, Viruskrankheiten des Menschen, 2, 12, 1127 [1965], Verlag Dr. D. Steinkopff, Darmstadt). Es ist auch bereits versucht worden, auf diese Weise erhaltenes Masernvirus anschließend an die Passagen in Hühnerembryonen oder in Gewebekulturen von Hühnerembryonen auf Affennierengewebe weiter zu züchten (vgl. J. Amer. med. Ass., 183, 1112 [1963]). Die Wirksamkeit eines nach diesem Verfahren erhaltenen Impfstoffes ist jedoch unbefriedigend. Durch eine gegebenenfalls nach der Züchtung vorzunehmende Konzentrierung der Lösung wird die verlustreiche, zeitraubende und kostspielige Methodik der bekannten Verfahren noch weiter erhöht. Außerdem ist es nicht möglich, einen so hergestellten Impfstoff durch Filtration zu sterilisieren (vgl. J. Immunol., 85, S. 295/296 [I960]).

Es wurde nun gefunden, daß man eine gegen Masern wirksame Vaccine dadurch herstellen kann, daß man Masernvirus ausschließlich in Gewebekulturen von Primaten durch fünf bis zwanzig Gewebekulturpassagen züchtet und das Gewebekulturvirus in bekannter Weise, gegebenenfalls unter Zugabe eines Adjuvans, zu einem Impfstoff verarbeitet. Das zur Herstellung der erfindungsgemäßen Vaccine erforderliche infektiöse Material kann beispielsweise aus Speichel, Blut, Urin oder Organextrakten von Masernpatienten gewonnen werden.

Als für die Züchtung der Masernviren geeignete Kulturgewebe kommen Organgewebe von Primaten, z. B. Herz, Muskulatur, Hoden, Haut, Milz, Tonsillen, Struma, Amnion, Chorion u. a., vorzugsweise Affennierengewebe oder Gewebe von menschlichen Embryonen einschließlich menschlicher diploider Zellen in Betracht. Die Herstellung der Gewebekulturen erfolgt in literaturbekannter Weise (vgl. G. P en so und D. Balducci, Tissue Cultures in Biological Research, Elsevier Publishing Company, Amsterdam-London-New York, 1963, S. 102 bis 106 und 111/112). Als Kulturflüssigkeiten kommen handelsübliche Gewebekulturlösungen wie beispielsweise Lactalbuminhydrolysatlösung, Eaglesche Lösung oder TCM 199 (Tissue Culture Medium 199) mit oder ohne Serumzusatz in Betracht (vgl. G. Peηsο und D. Balducci, Tissue Cultures in Biological Research, 1963, S. 79 bis 85 u. 97 bis 99).

Die Gewebekulturen werden in an sich bekannter Weise mit infektiösem Material, beispielsweise mit Verfahren zur Herstellung einer Masern-Vaccine

Anmelder:

Behringwerke Aktiengesellschaft, Marburg/Lahn

Als Erfinder benannt:

Dr. med. Gisela Enders-Ruckle, Stuttgart;

Dr. med. Walter Hennessen, Marburg/Lahn;

Dr. med. Rudolf Mauler,

Cappel bei Marburg/Lahn

dem Blut oder Speichel eines Masernpatienten, infiziert. Für die Züchtung können die aus der Literatur bekannten allgemeinen Vorschriften für die Vermehrung von Viren auf Gewebekulturen herangezogen werden. Es kann beispielsweise eine Passage so durchgeführt werden, daß die Gewebekulturzellen in einer solchen Menge mit Masernvirus oder infektiösem Material infiziert werden, daß das Verhältnis der Anzahl der Viruspartikeln zur Zellzahl etwa 0,01 bis 100,0, vorzugsweise 0,1 bis 10, insbesondere 1,0 beträgt und bei erhöhter Temperatur von etwa 25 bis 40° C, vorzugsweise zwischen 35 und 38° C, insbesondere bei 37° C bis zum Auftreten der für die Vermehrung des Masernvirus typischen Zellveränderungen bebrütet werden. Während dieser Zeit wird das Nährmedium etwa ein- bis dreimal, vorzugsweise zweimal, gewechselt. Nach Auftreten der für die Vermehrung des Masernvirus typischen Veränderung der Gewebekultur wird diese etwa ein- bis fünfmal, vorzugsweise dreimal, in schneller Folge einem Einfrier-Auftau-Zyklus unterworfen, um die in den Zellen eingeschlossenen Viruspartikeln freizusetzen. Die Virussuspension wird anschließend geerntet und durch Filtration oder Zentrifuge tion von Ballaststoffen befreit. Mit einer so erhaltenen Gewebekulturvirussuspension werden weitere Gewebekulturpassagen ausgeführt.

Es ist im allgemeinen ausreichend, etwa fünf bis zwanzig Gewebekulturpassagen, vorzugsweise etwa zehn bis vierzehn, insbesondere zwölf Gewebekulturpassagen auszuführen. Die Gewebekulturvirussuspension kann anschließend beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation geklärt und daraus in an sich bekannter Weise eine Masernvaccine hergestellt werden.

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3 4

Während der Durchführung der Passagen kann die einer so hergestellten Vaccine beträgt etwa 1:128

Art der Gewebekulturen beibehalten oder auch ge- bis 1: 32 768, vorzugsweise etwa 1 : 4096.

wechselt werden. So ist es beispielsweise möglich, die An Stelle von Polyoxyäthylensorbitanmonooleat

Züchtung auf menschlichem Embryonalgewebe zu ist es auch möglich, Natriumdesoxycholat oder an-

beginnen und nach Durchführung weniger Passagen 5 dere nichtionogene, oberflächenaktive Stoffe, wie

auf beispielsweise Affennierengewebekulturen über- beispielsweise andere Polyoxyäthylensorbitanmono-

zugehen. fettsäureester, z. B. das entsprechende Monostearat,

Durch die erfindiingsgemäß durchgeführte Züch- das unter dem geschützten Namen Tween 60 erhält-

tung in Organgeweben von Primaten wird ein Ma- lieh ist, Alkylphenolpolyglycoläther oder Konden-

sernvirus gewonnen, dessen Infektiositätstiter und io sationsprodukte aus Äthylenoxyd und höheren Al-

Haemagglutinationstiter höher liegen als die der Ma- koholen oder aus Äthylenoxyd und Fettsäuren, ein-

sernviren, die in fertilen Hühnereiern und/oder zusetzen.

Hühnerembryonalgewebekulturen gezüchtet worden Zur Erhöhung der immunisatorischen Wirksamsind. Sie übertreffen ebenfalls die Titer, welche für keit kann das auf diese Weise gewonnene Antigen Masernviren bestimmt wurden, die zunächst in be- 15 mit einem Adjuvans, vorzugsweise mit Aluminiumfruchteten Hühnereiern oder in Gewebekulturen hydroxyd oder Aluminiumphosphat, in einer Menge von Hühnerembryonen und dann anschließend auf von etwa 0,05 bis etwa 0,2 %, vorzugsweise etwa Affennierengewebe gezüchtet wurden. Der erfin- 0,1%, versetzt werden. Es ist auch ohne weiteres dungsgemäß erhaltene Infektiositätstiter kann bei- möglich, den erfindungsgemäß erhaltenen Impfstoff spielsweise etwa bei 10⁶·⁵ bis 10⁸·⁵ ID₅₀/ml, vor- 20 _mit anderen Vaccinen, beispielsweise einer Diphthezugsweise etwa 10⁷ bis 10⁷-⁵ ID₅₀ZmI, liegen, während rie- und/oder Poliomyelitis- und/oder Tetanus-Haemagglutinationstiter im allgemeinen Werte von vaccine zu kombinieren.

mindestens etwa 1: 128 bis 1:2048, vorzugsweise Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Veretwa 1:256, aufweist. Der z. B. vorzugsweise er- fahrens besteht darin, daß eine unter Verwendung reichte Infektiositätstiter von 10⁷ ID₅₀/ml bedeutet, 25 von Äther, der Natriumdesoxycholat oder nichtdaß die Konzentration an Viruspartikeln zehnmal ionogene, oberflächenaktive Stoffe, insbesondere so hoch ist wie die von den Virussuspensionen, Polyoxyäthylensorbitanmonooleat (Tween 80) entdie nach bisher bekannten Verfahren hergestellt hält, hergestellte Masernvaccine zu einer Kombiwurden, nationsvaccine verarbeitet werden kann, die neben

Diese außerordentlich hohe Aktivität der erfin- 30 den Masernantigenen noch Pertussiskeime enthält, dungsgemäß herstellbaren Virussuspensionen ermög- Bisher war es nicht möglich, eine derartige Komlicht es, daraus ohne vorhergehende Konzentrierung binationsvaccine herzustellen, da die Pertussiskeime eine Masernvaccine herzustellen. Man geht dabei in einer solchen Kombination praktisch unwirksam beispielsweise so vor, daß die Virussuspension in wurden. Es wurde bisher lediglich versucht, die beieiner etwa 35gewichtsprozentigen Lösung von Form- 35 den Komponenten unmittelbar vor der Impfung zu aldehyd bis zu einer Endkonzentration von etwa vermischen. Diese Maßnahme ist jedoch insbeson-1: 3000 bis 1: 6000, vorzugsweise 1:4000, versetzt dere bei einer größeren Anzahl von Impflingen für und etwa 10 bis 100 Stunden, vorzugsweise 30 bis den Impfarzt umständlich und zeitraubend. Auch bei 60 Stunden, insbesondere 50 Stunden bei einer Tem- einer nicht sachgemäß oder flüchtig vorgenommenen peratur von etwa + 20 bis + 40° C, vorzugsweise 40 Mischung der Komponenten besteht die Gefahr, daß 35 bis 38° C, insbesondere +36,5° C gehalten wird. das vorgesehene Verhältnis der beiden Komponen-Der in der Virussuspension noch vorhandene, bei der ten nicht genau eingehalten wird. Selbst bei einer Inaktivierung nicht verbrauchte Formaldehyd wird kurz vor der Impfung vorgenommenen Vermischung mit Natriumbisulfilt abgebunden, indem je 1 Mol ist es nicht ausgeschlossen, daß auch in diesem Fall Formaldehyd etwa 0,5 bis 3,0 Mol, vorzugsweise 45 eine gewisse Schädigung der Pertussiskeime auftritt, etwa 1,5 Mol Natriumbisulfit zugesetzt werden. Die in einem derartigen Kombinationsimpfstoff ent-Eine weitere sehr zweckmäßige Möglichkeit zur Her- haltene Pertussiskomponente wird in literaturstellung der Masernvaccine besteht darin, daß man bekannter Weise durch Züchtung von Pertussisbakdie Virussuspension mit Polyoxyäthylensorbitan- terien (Bordetella Pertussis) gewonnen (vgl. Federal monooleat—Äther (Zeitschrift Naturforschung, 18 b 5° Security Agency, Public Health Service, National [1963], S. 377) behandelt, indem man der wäßrigen Institutes of Health Bethesda 14, Maryland, 1^st Re-Virussuspension Polyoxyäthylensorbitanmonooleat, vision, October 31, 1952, Effective May 1, 1953 das unter dem geschützten Namen Tween 80 erhält- — MINIMUM REQUIREMENTS: Pertussis Vaclich ist, bis zu einer Konzentration von etwa 0,001 eine, Admendment 1 bis 3). Die Kombination der bis 5,0%, vorzugsweise 0,01 bis 1%, insbesondere 55 beiden Vaccinen kann beispielsweise durch ein-0,125% und anschließend Äther bis zu einer Kon- faches Vermischen erfolgen. Es ist zweckmäßig, das zentration von etwa 10 bis 50%, vorzugsweise 25 Mischungsverhältnis so einzustellen, daß in der bis 40%, insbesondere 33% zusetzt. Das so erhal- Kombinationsvaccine für die Pertussiskomponente tene Gemisch wird bei einer Temperatur von etwa etwa 10 bis 20, vorzugsweise etwa 15 Milliarden + 3 bis +40° C, vorzugsweise 15 bis 25%, insbe- 60 Keime pro Milliliter für die Masernkomponente ein sondere bei +2O⁰C etwa 2 bis 60 Minuten, vor- Haemagglutinationstiter von etwa 1:128 bis etwa zugsweise 10 bis 25 Minuten, insbesondere 15 Mi- 1: 20480, vorzugsweise etwa 1: 4096, vorliegt. Auch nuten geschüttelt. Anschließend wird die Äther- bei der aus der erfindungsgemäß erhaltenen Masernphase von der wäßrigen Phase durch Zentrifugieren vaccine hergestellten Kombinationsvaccine kann es oder Absetzenlassen im Scheidetrichter getrennt. Die 65 zweckmäßig sein, ein Adjuvans, vorzugsweise Aluwäßrige Phase enthält die Haemagglutinine und miniumhydroxyd, in einer Menge von etwa 0,05 bis wird nach Sterifiltration zur Herstellung der Masern- etwa 0,2 %, vorzugsweise etwa 0,1 %, zuzusetzen, vaccine verwendet. Der Haemagglutinationstiter Wird noch eine umfassendere Immunisierung ange-

strebt, so kann auch die Masern-Pertussis-Kombinationsvaccine mit anderen Vaccinen, wie beispielsweise Diphtherie- und/oder Poliomyelitis- und/oder Tetanusvaccinen kombiniert werden.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer Masernvaccine wird demnach mit wenigen Passagen eine Virussuspension erhalten, deren Titer so hoch ist, daß daraus ohne weitere Maßnahmen und ohne eine vorherige Konzentrierung des Gewebekulturvirus die Vaccine hergestellt werden kann. Das Verfahren stellt demnach hinsichtlich der Durchführung und der Aufarbeitung einen erheblichen Fortschritt gegenüber den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren dar, zumal es möglich ist, eine nach dem Polyoxyäthylensorbitanmonofettsäureester-Äther-Verfahren behandelte Virussuspension anschließend ohne Auftreten von Verlusten steril zu filtrieren. Weiterhin ist es zum erstenmal möglich, aus der erfindungsgemäßen Masernvaccine eine Pertussiskeime enthaltende Kombinationsvaccine herzustellen, in der die Ausgangsaktivität der Pertussiskomponente im Gegensatz zu den bisher bekannten Beobachtungen unverändert beibehalten wird.

Beispiel 1

Eine in bekannter Weise (G. Penso und D. BaI-ducci, Tissue Cultures in Biological Research, 1963, S. 102 bis 106 und 111/112) hergestellte Gewebekultur aus Affennieren, die 10 Mio Zellen enthält, wird mit 10 ml Blut eines Masernpatienten beimpft und 1 Stunde bei 37° C infiziert. Anschließend wird das Blut entfernt und Nährmedium (Earlesche Salzlösung und 0,5% Lactalbuminhydrolysat) zugesetzt. Die Gewebekultur wird bei 37° C gehalten. Nach 24 und 96 Stunden wird das Medium abgegossen und durch frisches ersetzt. Am 8. Tag wird die Gewebekultur einem dreimaligen Einfrier-Auftau-Zyklus £ untervorfen und die Virussuspension geerntet. Diese Virussuspension wird zur ersten Passage als 1:100 verdünnte Lösung im Nährmedium auf eine frische Affennierenzellgewebekultur gebracht und, wie vorher beschrieben, weiterbehandelt. Auf die gleiche

ίο Art und Weise werden elf weitere Passagen in Affennierengewebekulturen ausgeführt. Die auf diese Weise erhaltene Gewebekulturvirussuspension weist einen Infektiositätstiter von 10⁷·⁶⁶⁷ ID₅₀/ml auf. Der Haemagglutinationstiter beträgt 1:512. Zu 1 1 einer nach obigem Verfahren hergestellten Virussuspension werden 0,25 ml einer wäßrigen Formaldehydlösung (35gewichtsprozentig) entsprechend einer Endkonzentration von 1:4000 zugegeben, gut durchmischt und 50 Stunden bei 36,5° C gehalten.

Danach wird durch Zugabe von 1 ml einer 2O°/oigen Lösung von Na₂S₂O₅ der Formaldehyd abgebunden. Durch Zugabe von 100 ml einer Aluminiumhydroxidlösung (l°/oig) wird eine Masernvaccine erhalten, mit der gegen Maserninfektionen immunisiert werden kann.

Drei derartig hergestellte und acht nach dem Stand der Technik (J. Amer. Dis. Children, 103 [1962], S. 419) erhaltene Impfstoffe — gewonnen aus einem Masernvirusstamm, der in fertilen Hühnereiern und in Hühnerembryonalgewebekulturen gezüchtet und in Affennierengewebekulturen zur Vermehrung gebracht worden war — werden durch Impfung von jeweils zwanzig Meerschweinchen miteinander verglichen.

Tabelle I

Impfstoffe	Konzen	Mittlerer	Anti	Erfindungsgemäß	Anti
	trations-	Antikörpertiter ..	körper	hergestellte	körper
nach J. Amer. Dis. Children,	faktor	titer	Impfstoffe	titer
103 (1962), S. 419, Tabelle 1	5x	600		3220
	4x	600	Charge	5504
Lot	4x	800		4765
	5x	2000	28/23643
51	5x	2000	13/82
53	5x	800	14/82
54	5x	2000
55	5x	1200
56 bis 57
65	1250		4496
70
71

Aus Tabelle I ergibt sich, daß der erfindungsgemäß hergestellte Impfstoff eine 3,6fach bessere Wirksamkeit hinsichtlich des Antikörpertiters als die nach dem Stand der Technik hergestellten Impfstoffe besitzt.

Beispiel 2

Auf bekannte Weise gewonnene menschliche Embryonalgewebekulturen (G. Penso und D. BaI-ducci, Tissue Cultures in Biological Research, 1963, S. 102 bis 106 und 140 bis 142), die 1 Mio Zellen enthalten, werden mit 1 ml infektiösem Material (Speichel eines Masernpatienten) beimpft und 1 Stunde bei 37° C inkubiert. Anschließend wird das infektiöse Material entfernt und Nährmedium (Earlesche Salzlösung und 0,5% Lactalbuminhydrolysat und 10% Kälberserum) zugesetzt. DieGewebekultur wird bei 37° C gehalten. Nach 24 und 72 Stunden wird das Medium abgegossen und durch frisches ersetzt. Am 5. Tag wird die Gewebekultur einem zweimaligen Einfrier-Auftau-Zyklus unterworfen und

die Virussuspension geerntet. Die Virussuspension wird als 1: 10 in Nährmedium verdünnte Lösung auf eine frische Gewebekultur aus menschlichem embryonalem Gewebe übertragen und wie beschrieben weitergezüchtet. Mit dem daraus gewonnenen Gewebekulturvirus werden, indem dieses 1: 100 in Nährmedium verdünnt und auf Gewebekulturen von Affennieren gebracht wird, entsprechend Beispiel 1 zwölf Passagen in Affennierengewebekulturen ausgeführt. Der Infektiositätstiter der auf diese Weise gewonnenen Gewebekulturvirussuspension beträgt 108 oo iD_s0/mI. Der Haemagglutinationstiter beträgt 1:2048. Die so erhaltene Virussuspension wird mit Polyoxyäthylensorbitanmonooleat—Äther (Zeitschrift Naturforschung, 18b, S. 377 [1963]) behandelt, indem zu 1 1 Virussuspension 1,25 ml einer 5"/oigen Polyoxyäthylensorbitanmonooleat - Lösung gegeben werden und 5 Minuten durchmischt wird. Anschließend werden 330 ml peroxydfreier Äther zugegeben und 15 Minuten bei +20⁰C kräftig ge- zo schüttelt. Die Äther-Wasser-Emulsion wird bei Zentrifugieren (15 Minuten, 5000Xg) in eine wäßrige und in eine Ätherphase getrennt. Die wäßrige Phase wird durch eine Membranfilterschicht Nr. 1120 sterilfiltriert. Durch Zugabe von 100 ml einer l°/oigen Aluminiumhydroxidsuspension wird eine Masernvaccine erhalten, mit der gegen Maserninfektionen immunisiert werden kann. Der Haemagglutinationstiter dieser Masernvaccine beträgt 1:16 384.

Fünf derartig hergestellte Impfstoffe und acht nach dem Stand der Technik (J. Amer. Dis. Children, 103 [1962], S. 418) erhaltene Impfstoffe — gewonnen aus einem Masernvirusstamm, der in fertilen Hühnereiern und in Hühnerembryonalgewebekulturen gezüchtet und in Affennierengewebekulturen zur Vermehrung gebracht worden war — werden durch Impfung von je zwanzig Meerschweinchen miteinander verglichen. Aus Tabelle II ist ersichtlich, daß mit den erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffen eine 6,9fache bessere Wirksamkeit hinsichtlich des Antikörpertiters als mit dem nach dem Stand der Technik hergestellten Impfstoff erreicht wird.

Tabelle II

Impfstoffe	, S. 419, Tabelle 1	Anti-	Erfindungsgemaß	Anti
	Konzen	korper-	hergestellte	körper
nach J. Amer. Dis. Children,	trations	titer	Impfstoffe	titer
103 (1962	taktor	600		7608
	5x	600	Charge	6922
Lot	4x	800		9600
	4x	2000	18/82	9800
51	5x	2000	99/206	9750
53	3X	800	96/206/2
54	5x	2000	102/206
55	5x	1200	96/206/1
56 bis 57	5x
65		1250		8736
70	Antikörpertiter
71
Mittlerer

Mit einem nach Tabelle II hergestellten Impfstoff werden im Abstand von vier Wochen 20 Kinder zweimal geimpft. 3 Wochen nach der zweiten Injektion wird bei allen Impflingen Antikörperbildung festgestellt und ein Durchschnitt von 1 : 140 errechnet. Nach der dritten, 4 Wochen nach der zweiten Impfstoffapplikation vorgenommenen Injektion steigt der Antikörpertiter auf 1: 1000. Der nach dem Stand der Technik (J. Amer. Dis. Children, 103 [1962], S. 419) hergestellte Impfstoff ergibt vergleichbare Antikörper erst nach 5facher Konzentrierung der Ausgangssuspension.

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung einer Vaccine gegen Masern, dadurch gekennzeichnet, daß man von Menschen gewonnene Masernviren ausschließlich in Gewebekulturen von Primaten durch fünf bis zwanzig Gewebekulturpassagen züchtet und das Gewebekulturvirus in an sich bekannter Weise, gegebenenfalls unter Zugabe eines Adjuvans, zu einem Impfstoff verarbeitet.