DE1617756A1 - Verfahren zur Herstellung einer neuen Antivirusvaccine - Google Patents

Description

Dr. F. Zündstein - Dr. E. Assmann

Dir. R. Koenigsberger
Dipl. Phys. R. Hofebauer

Patentanwälte
München 2, Bräuhaussirafje 4/IH

SG 2T91

iiHONE-POUIJSNC S.A,, Paris / Frankreich.

Verfahren zur Herstellung einer neuen Antivirusvaecine

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Die vorliegende Erfindung betrifft, die Herstellung einer "Vaccine, die als Wirkstoff einen neu isolierten _s durch eine originelle Methode gezüchteten und durch eine geeignete Arbeitsweise inaktivierten Virus enthält.

Der zur Herstellung der Vaccine gemäss der Erfindung verwendete neue Virus ruft beim jungen Hund Pneumonie-, Hepatitis-, Nephritis™ und Encephalitisläsionen hervor.

Isolierung und Züchtung des Virus

Zellkulturen wurden durch Trypsination von Nieren hergestellt, die einem jungen Hund entnommen waren, der von Rhinitis und Bronohopneumonie befallen war. Nach zweitätiger Züchtung {Medium* 0,5 # Caseinhydrolysat, 10 % Kalbsserum in Hanks-Lösung, 100^g/ccm Penicillin und Streptomycin, Inkubation bei 37*C)

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wurde eine im wesentlichen fibroblastische kontinuierliche monoaellulare Schicht erhalten j auf welcher später in nur : einigen Kulturen Anhäufungen von lichtbrechenden Zellen in . Erscheinung traten. Diese machten einige Tage später Stellen von zellyee mit einem Durohmesser bis zu 5 mm Plata, an deren Rändern sich lichtbreehende nekrotlache Zellen befänden.

Das durch schnelles Gefrieren und Auftauen dieser Kulturen hergestellte. Oemisch Flilaslgkeit-Zellen wurde in Epithelialzellkulturen von Hieren eines gesunden Hunde Inokuliert. g_e wurde eine cytopathogene Wirkung bia zu einer Verdünnung von 10 ^J des ursprünglichen Materials reproduziert.

Die Try pa !nation von Lungen «Ine· Hunde itttu», der durch Kaiserschnitt an 50. Tag der Qeatatlon entnoaeen war_# erlaubt» die Gewinnung eines fibroblastisohen Zelletamee« der in derlei durch aufeinanderfolgende Versetzungen gezüchtet und dwah Oefrleren konserviert werden kann. Die Beimpfung dieses Zellsystems mit den vorgenannten infizierten Epithelkulturen (Flüssigkeit und Zellen) ermöglichte, die zu Beginn beobachtete oytopathogene Wirkung zu reproduzlsren und auch «Ine beträchtliche Erniedrigung des infektiösen Titera Ibt Vorlauf· einer einzigen Passage an epitheÜAlen Nl«r«ns«ll«n festzustellen. '

Der infektiöse Titer entspricht der Zahl der virulenten Einheiten Je Volumeneinheit. Man stellt ihn fest, indem man

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die Viruesitepension mit ^ev/silB einaa Faktor von 10 in oiiiaia geeigneten Medium vör&üimts dann HezeDtorsell&ul·* türen mit beKannten Volumina der erhaltenen Veraümiungen beimpft und sohliesalich diejenigen Kulturen feststellt, deren vorhandene bellen eiiis eytopathogene Wirkung nach einer bestimmten Seit der Inkubation bei einer gewählten geeigneten Temperatur aufweisen. Der infektiöao Gewebe- . kultur-Iiter 50 $> (im nachfolgenden DIOI^₀ genannt) ist die Verdünnung der Virussuspension, die bei einer auf av/ei inoculierteia Zellkulturen eytopathogene Läsionen erzeugt* Dieser l'iter wird nach der Methode von Reed und Huench, Am.J.Hyg., 9 492 (1958) berechnet.

Bie späteren Passagen in Kulturen des fibroblestischen Stammes zeigten die reiohliche Vermehrung: des oytopathogensn 3ürregere s Mt dem blosoen Auge aichtljars runde Stellen traten 24 bia Stunden naoh der Beimpfucg je nach &qv StSrlce des Inoculums auf. Während einer minimalen Zeitspanne von 8 Stunden nach der Infektion verochwand der Virus aus dem Medium: Von der 1$. Stunde ab erhöhte sieh der infektiöse Siter (©xtra- und

intrazellular) der beimpften Kulturen regelmässig, um in der

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72. Stunde den iSaximalwert von 10 'DXCE-₀ ^e ecm au erreichen. Er sank im Verlaufβ der folgenden 4 Sage beträohta-ich.

Die Propagation dieses oytopathogenen Erreger β in Serie in dem fibre elastischen ZellatässBi ermöglichte die Untersuchung seiner biologischen Haupteigenoch&ften.

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Biologische Eigenschaften

*a) Sie serologischen Priüfenggn konnten zeigen, dass dieser neue Virus keine Antigenverwandtaobaft nii einerseits den Virus der Hundestaupe und andererseits dem Virus der Hepatitis infeotioea oanis (Hundehepatitis) hat.

Das Serum eines Hundes, der experimentell intranasal alt einer Viruskultur inokuliert worden war₉ neutralisiert bei der Verdünnung 1/64 200 DIOXe₀ &*^e homologen Virus in Züchtungen von Iiungenfibroblasten, Dagegen hat dieses gleiche Serum keine neutralisierende Wirkung in ovq auf den Virus der Hundestaupe (dem embryonierten Ei adaptierter Stamm, geimpft auf die Chorio-Allantoid-Membran). Se neutralisiert auch nicht die oytopathogene Wirkung des Virus der Huadehepatitis tür Jttbroblaeten. der Lunge eines Hundefötus. Andererseits übt ein von einem gegen den Virus der Hundestaupe immunisierten Xaninohen etaramendes Serum, das bei der Verdünnung 1/32, 10* DICf-Q des homologen Virus in ovo neutralisiert, in Kulturen von Pibroblasten von Lungen von Hundefötus keinerlei neutralisierende Wirkung gegenüber 4em neuen Virus aus.

Dagegen wurde die oytopathogene Wirkung von 10* MCTc₀ ^*¹* oben besohriebensn neu isolierten Virus durch eine Verdünnung 1/64 des Serums eines Hundes der S*&gle-Rasse neutralisiert, der gegen den von Carmichael, Squire und Srook [Amer. J. Res. 26, 803(1965)] isolierten Stamm von Hundeherpesvirue immunisiert war. Andererseits hat das Serum eines gegen den neuen

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Virus immunisierten Kaninchens^ bei der Verdünnung 1/64_; die cytopathogene Wirkung von sowohl dem homologen Virus als auch dem Ton Carmichäel u. Mitarb, isolierten^ Hündeherpesvirus auf die Fibrqblasten von Lungen von Hundefötus neutralisiert . Man kann daher auf eine enge Antigenverwandtsehaft zwischendiesen beiden Virensehliessen.

b) Wirkung von

Bei einer Kbnzentratioii voa 60^g/ecm inhifoiei^t 5~JTod-2^ödesoxyuridin die cytopathogene Wirkung des; neuen Virus voll ständig. Bei einer Konzentration vorit 3^ pg/icöift hemmt es sie nur 2h Stunden. Bei niedrigeren I^nzeöfcrationen tt^ ■; 2⁸ -desoxyuridin keine Hsßimwirkung aus»

Obg:leich die bereits beschriebenen ^riren mit Desoxy^ibönucleinsäure (Vaccinaj, menschlicher HerpesvirUs) im allgemeinen durch Konzentrationen von 5-Jod-2*-desoxyuridin^ unterliälb 50 ^g/ccm inhibiert werden> legt die Tatsache _s dass der xvm beschriebene Virus gegenüber der Hemmwirkung dieses Antingtaböliten empfindlich ist?, doch nahe> dass es sich um einen Virus mit Desoxyribcttucleinsäure handelt j, was mitr der obeti,gemachten Feststellung seiner Äi^i^mrerweradtschaft mit dem Hundeherpesvimis übereinstimOTfr,

Heratellung der Vaooine :':■■"';■■ .'■': -... ./;v ^:: ; ■'' '■:■ ^-)./"^:::_^ . ■■ ' Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung der Vaooine

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besteht darin« eine Zellkultur mit dem oben beschriebenen Virusmittel zu beimpfen, das Zttchtungsmedium zu inkubieren und dann die Viruseuspension zu gewinnen und zu inaktivieren.

Zn der Praxis wird die Zellkultur aus fibroblaAtlsohen Zellen von Lungen von HundefUten, durch Trypsin aufgeschlossen und in Suspension in einem geeigneten Kulturmedium, vorgenommen.

Die Kulturen von ffibroblasten von Longen von Hundeföten haben gegenüber den Kulturen von Nierenzellen von Hunden, die im allgemeinen für die Propagation von Hundeviren, die zur Herstellung von Vaceinen bestirnt sind, verwendet werden, den Vorteil, kein Virus in latentem Zustand au enthalten sowie sioh flir die Subkultur in Serie bis zu einer gewissen Anzahl von Passagen und zum Gefrieren bei verschiedenen Passagestufen zu eignen. Als Zttchtungsmedium verwendet man vorzugsweise das Medium nach Eagle [Soienoe 130. 432 (1959)}, das mit Kaibsearum in einer Konzentration von 10 Jf und antibiotischen Substanzen zur Vermeidung der Proliferation von Bakterien versetzt ist« Man arbeitet so, daß man eine monozellulare Schicht in einem geeigneten ßefäS {Rohr oder Kolben) durch Inkubation während 2 oder 3 Segen bei 37⁰C erhält. Man beimpft dann diese Kulturen mit einer Virübvorclünnung, die so gewählt ist, daS eine maximale oytopatbogene Wirkung nach 2- oder 3-tägiger Inkubation bei 37⁰C erhalten wird. Man erntet dann die Virussuspension, wcbei

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man den Virus aus den Zellen durch Zerbersten derselben (beispielsweise durch Einfrieren und anschliessendes rasches Auftauen} freisetzt und anschliessend die Zellreste durch Zentrifugieren oder Filtrieren entfernt. Man titriert die so erhaltene Virussuspension nach der oben beschriebenen Methode von Reed und Muench. Der infektiöse Titer eines guten Präparats liegt in der Grössenordnung von 10 DlCTj-n «5^{e ccm} ·

Anschliessend inaktiviert man die Virussuspension. Es können sich*nicht alle üblichen Mittel zur Inaktivierung eignens Insbesondere Formaldehyd verändert, obgleich er die Infektionswirkung des Virus aufhebt, dessen immunisierende^Wirkung,

Vorzugsweise wird die Inaktivierung durch Zugabe von ß-Propiolacton (0 .,2 bis 5 mg/cem) und Inkubation während 50 Minuten bis 6 Stunden bei 37⁰C vorgenommen. Das so erhaltene Produkt sollte frei von einer cytopathogenen Wirkung für die Zellkulturen, die Rezeptoren für den intakten Virus sind, sein.

Die Bestrahlung, einer infektiösen Suspension des Virus mit ultravioletten Strahlen ermöglicht ebenfalls, seine pathogene Wirkung unter völliger Beibehaltung seiner immunisierenden Eigenschaften aufzuhebenc

Zur Verwendung in der Veterinärmedizin kann man dem inaktivierten Virus, der Wirksubstanz der Vaccine, ein öliges Adjuvans

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{mineralisches oder pflanzliches Öl) £«seteen oder die inaktivierten Virusteilchen an einem geeigneten uö18sliehen fra"-ger, wie beispielsweise ÄlumitUunihydroxyd,- adsoft>i©rsn. Die, so hergestellte Vaeeine kann zur Immunisierung von, jungen Hunden gegen gewisse syndrome des Respirationstrakts verwendet wenden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne sie zu beschränken»

Man entnimmt -etwa an dem 50-stefi Tag der Gsstation durch Kaiserschnltt einen HtmdefÖtuSc Man siimntit die Lungen heraus= Die se Lungen werde» rcifc einer Sehers fein zerschnitten und der Einwirkung von 30 ßcm einer. i^ßUDg mit eiiieni Gehalt von 0.,25. Trypsin i 5-SOO während 3 Stunden bei Jf⁰C ausgesetzt -. Die Zellen werden durch Zentrifugieren gesammelt und wieder in Medium nach Eag:le jjscienoe IJO, 432 (1959)], dem 10 $ Kalbserum, 100 pg/ocm Penicillin und Streptomycin und $0 μ| Nystatin zugesetzt sind.,· so suspendiert, dass eine Konzentration von TO·⁵-Zellen je ecm erhalten..Vfird.

In 600 ecm Roux-Kolben werden ,-je Kolben 80 ecm dieser Suspension eingebracht. Sie werden mit Gummistöpseln verschlossen und in horizontaler Lage bei J57°C intoabiert. Nach 2 Tagen erhält man eine geschlossene monocellulare Schicht von Fibro~ blRsten, haftend .andern Glas« Man glesst die überstehende" ®:ii$ ab und beimpft Jede Kultur' ini-t^J 8'_ ecm einer'VirÜB-

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suspension mit 10^ PICIJc₀ Je ecm. Nach 1-stühdlger Inkubation bei 37°C zur Ermögliohüng derAbsorption des Virus sn den Zellen bringt man in jeden Kolben 72 com Medium nach Emgla, das mit den gleichen Substanzen wie zuvor versetzt ist, ein. Man inkubiert die Kolben in horizontaler Lage 2 Tag* bei Jl⁹C. Die mikroskopische Prüfung der Zellen eeigt dünn eine Bshr ausgeprägte, cytopathogene Wirkung des Virus» Das OsBisoh von tiberstehender Flüssigkeit und Zelltn iwird nach lißfrieren und raschem Auftauen der Kolben geaainmeltr Man zentrifugiert die Suspension bei 5000 UpM während 15 Minuten bei 4 ⁹Q und gewinnt die Überstehende Piüssiglceit, die die virulente Suspension darstellt. Der infektiöse Tit«r dieser Suspension, bestimmt an Kulturen von Pibroblaetan voa Lungen von Hund«-

. : ■ & o -- ■- · ;. föten, beträgt 10 * DICT₅₀ J© oem» Dieser Soapension setzt man 1 mg/ccm an 0-Proplolaoton- zu und inicublert 2 Stunden bei j57°C- Mit dieser !"einen sad vsrdUhntan Suspension werden KuI-

■ . . fit*?*· ''.' ■-■ ·..■'""'"■■■'■' ""■■" -. " ■ : ■,^:- "-■-■-■■: ^: ■■■■'■.- ■türen von Plbroblaeten von Lungen von Hundeföten beimpft, die bei 27^eC inkubiert uiid unter dam Mikroskop 7 Tag· lang jaden Tag geprüft werden. Es wird keine eyfcopathogen» Wirkung festgestellt. Die Infektionßwirkung dee Virus ist somit durch die »Behandlung mit dem S-Propiol&oton veilst&ödig aufgfhobsa. Man bewahrt den äo inaictiYiertsn Virus tasi Λ*δ in Tsreohlossentn Flaschen unttsr Auasöhluss von Licht auf.

Beispiel 2

Die Vaccine.kann auch durch Inooulleren des Virus in Kulturen

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von Flbroblasten von Lungen von HundefÖten, die durch aufeinanderfolgendes Versetzen der oben beschriebenen ursprünglichen Kultur hergestellt sind, erhalten werden,

Man bringt in einen 600 com Roux-Kolben 80 ecm siner Suspension von fibrobliistisöhen Zellen von Lungen von Hundefö"ten ein» die durch Trypsinafcion (Zugabe von 20 com einer Lösung mit 0,25 # Trypsin 1 ι '200 Je Kolben) einer vorhergehenden Kultur dieser gleichen, in einem analogen Kolben vermehrten ZeIlen> erhalten ist,

■ Nach Inkubation unter den gleichen'Bedingungen wie in Beispiel 1 werden die so erhaltenen Kulturen v/le in dem vorhergehenden Baispiel mit dem Virus beimpft» Man erhält eine virulente

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Suspension mit 10 ^iJ DXGT^₀ te com. Diese Suspension wird mit 3 mg/öom fan ß-Proplolaston versetzt und 2 Stunden bei yf°G inkubiert .,Man stellt wie- oben die Aufhebung'der* Infektionsv/irkung des Virus fest und bewahrt die Suspension In der glel- chen Weise auf.

Zu 10 Volumina der Suspension des inaktlviertsn Virus, die nach der einen oder "der- anderen der beiden obigen Arbeitsweisen erhalten ist, setzt man aseptisch 9 Volumina leichtes Mineralöl (Bayol P) und 1 Volumen Mannitoleat (Arlaoel) 'zu... Das Gemisch wird mit Hilfe einer Diäpergiervarrichtung Ult2»a-Turrax emulgiert. Man füllt die so erhaltene stabile und homogene

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Emulsion^ in sterile Ämpullett von 5 ecm ;iii äliifei* iifenge von 3 ecm je. Ampulle ab* IJie Ainpiillfen werden ^erschlossen und bei k°C untei⁵ Ausschluss v&h Licht aufbewährt,

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Die Inoeulatiorisverstiohes ntit ,06m B^öfetakti^ieiPfciBiH Vltias 5.nträpeiitioaeälein oöei? itifci*anaäaleHi Wege bei >fcwä- > Mochen alfc; habsrt gezeigt j 4ässs inän foei döjv.tifee^le- . ..-. benden Ti ereii isi Serura 1 Motmt tmm der Iiirektiott feiweii Mit!« ; itöppergehalt von 1/64- bis 1/128 feststellen könHfee» (toer Äiitifeörpergehalt ist durch die fflä^ciniäle Vesä-ünnUftg dtes. Serüöis, die die cytopathogene Wiricuiig veil SOO JDICTk₀ des Virus- in Kulturen von Fifeoblafefceij ;^οη^ Lußgea ton li i

siert, ausgeärücltt.; Die iKtiWGnifse peimpÄng di mit -\(y Ms "0 DlCTp^ ail Mrus _;(iB einem ^luinen %<m 1 führte weder zur Morbidität neröii sur flortalitätj und, der körpörgehalt dieser Tiere blieb unverändert * Man liään daher den Schluss .ziehen*, dass ein Se^utn-Äntikörpergehialt TOa 1/^4 bis 1/128 zur Gewährleistunjg eiiiei- zufriedenstellenden jinimip.itMt ausreicht, ■ ■ ._r

Die Prüfung der immunisierenden Wijricqng der oben beschriebenen Vacoine ^iurde daiher durch Untersuchung ihres Vermögens, die _j: Bildung von neutralisierenden Antikörpern^.beim erwachsenen^ Hund

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Drei ausgewachsene Hunde wurden aufgrund des Fehlens von den virüsneutralisierenden Antikörpern in ihrem Seruin^i?äus- ' gewählt. Der erste erhielt eine intramuskuläre Injektion mit einer Ampulle von Vaccine , die wie in Beispiel' 2 ηβΐ*^^1?ϊί gestellt war, was 3 ecm mit 3 mg/ccnt . ß-Propiolacton inaktivierter Vaccine, die in dem beschriebenen öligen AdJuvans emulgiert ist, entspricht. Der zweite Hund erhielt eine intramuskuläre Injektion mit einer Ampulle,von Vaccine, die wie in Beispiel 2, Jedoch aus gemäss Beispiel 1 hergestellter Vaccine hergestellt war, was 3 ecm mit 1 mg/ccm ß-Fropiolacton inaktivierter und ebenfalls in dem gleichen Adjuvans emulgierter Vaeeine entspricht. Der dritte Hund erhielt eine intramuskuläre injektion von 3 ecm Adjurans allein.

10 Tage später wurden, diese Injektionen mit den gleichen Mengen und nach der gleichen experimentellen Arbeitsweise wiederholt .

Die Tiere wurden gesondert in Käfigen gehalten, und ihr Gesundheltszuetand wurde regelmässig überprüft. Es wurden keine Krankhe-ltssymptome im Verlaufe der Zeitspanne von einem Monat nach der Verabreiehung der letzten Injektion festgestellt,

32 Tage nach dieser letzten Immunisierung wurde Jedem Hund Blut abgenommen/, und das Serum wurde abgetrennt. Der Gehalt an in dem Serum der Hunde vorhandenen, den Virus neutralisierenden Antikörpern wurde nach der oben beschriebenen Methode

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Claims (1)

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   t, dless feiltur^esa mit ^toem Ifirus, der iaa vitro igezöcfatateß Mierenzeltea @i**&is ~v&n lUaiMltis Broac'laöpiiewJiionie befallenen jaingen !Hiaaties isolier-t de_s beimpft;₉ '«Si« -so toeimpfteß .Kuitiaren fels -Kar AnstoiMua elaaer· maximalen eyt©jjafcliogeissn Wiriciaag i*fecrblerfc ₃ täeia ge ibi!L(äete«a Tiinas düröii Zei-toe^sten der 2I®iiLa«i in PreMaelt deren Restbestaniteile man en'tfemn't» iin<a die Infektl-©tasiil"£*- teung der so eriialteaaiön ¥irössuspei3sl0iß <taa?ok chemiselie -öder

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