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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Replikation von Influenza-Viren in Zellkultur
bei herabgesetzten Temperaturen und die Influenza-Viren, welche
durch das beschriebene Verfahren gewonnen werden können, und
Impfstoffe, welche Viren dieser Art oder ihre Bestandteile enthalten.
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Alle
Influenza-Impfstoffe, welche als zugelassene Impfstoffe zur Behandlung
von Menschen und Tieren seit den 40er Jahren bis heute verwendet
wurden, bestehen aus einem oder mehreren Virus-Stämmen, welche
in Embryos enthaltenden Hühnereiern
vervielfältigt
wurden. Diese Viren werden aus der Allantois-Flüssigkeit von infizierten Hühnereiern
gewonnen und ihre Antigene werden entweder als intakte Viruspartikel
oder als durch Detergentien und/oder Lösungsmittel aufgelöste Viruspartikel,
sogenannte Spaltimpfstoffe, oder als isolierte und definierte Virusproteine,
sogenannte Untereinheitenimpfstoffe, als Impfstoff verwendet. Bei
allen zugelassenen Impfstoffen werden die Viren durch dem Fachmann
bekannte Verfahren inaktiviert. Selbst die Replikation von lebenden,
abgeschwächten
Viren, welche in experimentellen Impfstoffen geprüft werden,
wird in Embryonen enthaltenden Hühnereiern
durchgeführt.
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Die
Verwendung von Embryonen enthaltenden Hühnereiern zur Herstellung von
Impfstoffen ist zeit-, arbeits- und kostenintensiv. Die Eier aus
von Tierärzten überwachten,
gesunden Hühnerbeständen müssen vor
der Infektion für
gewöhnlich
12 Tage inkubiert werden. Vor der Infektion müssen die Eier auf lebende Embryonen
hin ausgewählt
werden, da nur diese Eier für
eine Virus-Replikation geeignet sind. Nach der Infektion werden
die Eier für
gewöhnlich
wieder 2 bis 3 Tage inkubiert. Die zu dieser Zeit noch lebende Embryonen
werden durch Kälte
getötet
und die Allantois-Flüssigkeit
wird dann durch Aspiration aus den einzelnen Eiern gewonnen. Mittels
arbeitsintensiver Aufreinigungsverfahren werden Substanzen aus dem
Hühnerei,
welche zu unerwünschten
Nebenwirkungen des Impfstoffes führen,
von den Viren abgetrennt und die Viren werden konzentriert. Da Eier
nicht steril (pathogenfrei) sind, ist es zudem notwendig Pyrogene
und alle Pathogene zu entfernen und/oder zu inaktivieren, welche
möglicherweise
enthalten sind. Um die Virus-Ausbeute zu verbessern, wird die Replikation
von Influenza-Viren in Hühnereiern
in der Regel bei herabgesetzten Temperaturen durchgeführt (etwa
34°C). Selbst
Viren, welche Atemwegserkrankungen verursachen, können in
Zellkultur vervielfältigt
werden. Auch hier werden in einigen Fällen herabgesetzte Temperaturen
verwendet (etwa 33°C),
welche jedoch keine Auswirkung auf die Qualität des Impfstoffes, der gewonnen
werden kann, haben, sondern nur die Replikation begünstigen.
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Viren
anderer Impfstoffe wie zum Beispiel Tollwut-Viren, Mumps-, Masern- und Röteln-Viren,
Polio-Viren und FSME-Viren können
in Zellkulturen vervielfältigt
werden. Da Zellkulturen, welche aus getesteten Zellbanken stammen,
pathogenfrei sind und im Gegensatz zu Hühnereiern ein definiertes Virus-Replikationssystem
sind, welches (theoretisch) in fast unbegrenzten Mengen zur Verfügung steht,
ermöglichen
sie unter bestimmten Bedingungen die ökonomische Vervielfältigung
von Viren, sogar im Fall von Influenza-Viren. Eine ökonomische
Impfstoffherstellung wird möglicherweise
auch dadurch erreicht, dass sich die Virus-Gewinnung und -Aufreinigung
aus einem definierten und sterilen Zellkultur-Medium einfacher darstellt,
als aus der viel Protein enthaltenden Allantois-Flüssigkeit.
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Die
Gewinnung und Replikation von Influenza-Viren in Eiern führt zu einer
Selektion auf bestimmte Phänotypen,
von denen sich die Mehrheit vom klinischen Isolat unterscheidet.
Im Gegensatz dazu steht die Gewinnung und Replikation von Viren
in Zellkultur, bei welcher keine Passage-abhängige Selektion auftritt (Oxford,
J. S. et al., J. Gen. Virology 72 (1991), 185–189; Robertson, J. S. et al.,
J. Gen. Virology 74 (1993) 2047–2051).
Für einen
effektiven Impfstoff ist deshalb aufgrund dieses Aspektes die Virusreplikation
in Zellkultur gegenüber
der in Eiern zu bevorzugen. Es ist bekannt, dass Influenza-Viren
in Zellkulturen vervielfältigt
werden können.
Neben Hühnerembryo-Zellen
und Hamster-Zellen (BHK21-F und HKCC) wurden MDBK-Zellen und insbesondere
MDCK-Zellen als geeignete Zellen zur in vitro Replikation von Influenza-Viren
beschrieben (Kilbourne, E. D., in: Influenza (1987), Seiten 89–110, Plenum
Medical Book Company – New
York und London). Eine Voraussetzung für eine erfolgreiche Infektion
ist das Hinzugeben von Proteasen zum Infektions-Medium, bevorzugt
Trypsin oder ähnliche
Serin-Proteasen, da diese Proteasen das Vorläufer-Protein des Hämagglutinins
[HA0] extrazellulär in aktives Hämagglutinin
[HA1 und HA2] spalten.
Nur gespaltenes Hämagglutinin führt zu einer
Adsorption der Influenza-Viren auf Zellen mit anschließender Aufnahme
der Viren in die Zelle (Tobita, K. et al., Med. Microbiol. Immunol.,
162 (1975), 9–14;
Lazarowitz, S. G. & Choppin,
P. W., Virology, 68 (1975), 440–454;
Klenk, H.-D. et al., Virology 68 (1975) 426–439) und so zu einem weiteren
Replikationszyklus des Virus in der Zellkultur.
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Das
Patent
US 4 500 513 beschreibt
die Replikation von Influenza-Viren in Zellkulturen von adhärent wachsenden
Zellen. Nach der Vermehrung der Zellen wird das Nährmedium
entfernt und frisches Nährmedium wird
den Zellen hinzugefügt,
wobei die Infektion der Zellen mit Influenza-Viren gleichzeitig
oder kurz danach stattfindet. Zu einer gegebenen Zeit nach der Infektion
wird eine Protease (zum Beispiel Trypsin) hinzugefügt, um eine
optimale Virusreplikation zu erhalten. Die Viren werden geerntet,
aufgereinigt und verarbeitet, um einen inaktivierten oder abgeschwächten Impfstoff
zu ergeben. Eine ökonomische
Replikation der Influenza-Viren
als Voraussetzung zur Impfstoffherstellung kann jedoch unter Verwendung
der im erwähnten
Patent beschriebenen Verfahrensweisen nicht bewerkstelligt werden,
da der Wechsel des Mediums, die anschließende Infektion sowie die Zugabe
von Trypsin, welche später
durchgeführt
wird, eine mehrmalige Öffnung
der einzelnen Zellkulturgefäße notwendig
machen und somit sehr arbeitsintensiv ist. Weiterhin erhöht sich
die Gefahr einer Kontamination der Zellkultur durch unerwünschte Mikroorganismen
und Viren mit jeder Manipulation der Kulturgefäße. Eine stärker kosteneffektivere Alternative
ist die Vermehrung von Zellen in Fermentersystemen, die dem Fachmann
bekannt ist, wobei die Zellen adhärent auf Microträgern wachsen.
Das Serum (für
gewöhnlich
fötales
Kälberserum),
welches für
das Wachstum der Zellen auf den Microträgern notwendig ist, enthält jedoch
Trypsin-Inhibitoren, so dass sogar bei diesem Produktionsverfahren
ein Wechsel des Mediums zu serumfreiem Medium notwendig ist, um
die Spaltung des Influenza-Hämagglutinins
durch Trypsin und somit eine angemessen große Virusreplikation zu erreichen.
Somit erfordert diese Verfahrensweise ebenfalls ein mehrmaliges Öffnen der
Kulturgefäße und bringt
so die erhöhte
Gefahr der Kontamination mit sich. Im Patent
US 4500513 wird die virale Replikation
bei 34–37°C durchgeführt. Ähnlich beschreiben
Mancini & Yano [Rev
Farm Bioquim Univ S. Paulo 29 (1993), 89–95] ein Influenza-Zellkulturverfahren,
bei dem der Virus bei 35°C
vervielfältigt
wird. Diese Autoren verwendeten MDCK-Zellen, welche in mit fötalem Kälberserum
und Neomycin supplementierten Eagle-Medium gezüchtet wurden. Nach der Infektion
mit dem Influenza-Virus wurde den gezüchteten Zellen Trypsin hinzugegeben.
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Die
vorliegende Erfindung basiert somit auf dem Ziel Verfahren bereit
zu stellen, welche eine einfache und ökonomische Replikation von
Influenza-Viren in Zellkultur möglich
machen und zu einem in hohem Maße wirksamen
Impfstoff führen.
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Dieses
Ziel wird durch Bereitstellung der in den Patentansprüchen aufgezeigten
Ausführungsformen erreicht.
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Die
Erfindung betrifft somit ein Verfahren zur Replikation von Influenza-Viren
in Zellkultur, bei dem Zellen, welche durch Influenza-Viren infiziert
werden können,
in Zellkultur gezüchtet
werden, die Zellen mit Influenza-Viren infiziert werden und nach
der Infektion zur Virusreplikation bei Temperaturen im Bereich von
30 bis 36°C
gezüchtet
werden. Vor oder während
der Infektion durch Influenza-Virus wird der Zellkultur eine Protease hinzugefügt. Weitere
Einzelheiten der Protease-Behandlung werden nachstehend angegeben.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens
wird die Züchtung
der infizierten Zellen zur Virusreplikation bei 32 bis 34°C und besonders
bevorzugt bei 33°C
durchgeführt.
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Es
wurde überraschenderweise
herausgefunden, dass durch die Replikation der Influenza-Viren in
infizierten Zellen bei herabgesetzten Temperaturen Viren gewonnen
werden, welche eine nennenswert höhere Wirksamkeit als Impfstoff
haben als die Viren, welche durch Replikation bei 37°C gewonnen
werden. Replikation bei 37°C,
die für
gewöhnlich
zur Influenza-Replikation in Zellkultur verwendete Temperatur, führt anerkanntermaßen zu vergleichsweise
hohen Virus-Ausbeuten
in kurzer Zeit. Viren, die so hergestellt wurden, haben jedoch eine
geringe Wirksamkeit als Impfstoff im Vergleich mit Viren, welche
durch das erfindungsgemäße Verfahren
hergestellt werden.
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Die
Zellen, welche im erfindungsgemäßen Verfahren
zur Replikation der Influenza-Viren verwendet werden, können im
Prinzip jede gewünschte
Art von Zellen sein, welche in Zellkultur gezüchtet werden kann und welche
durch Influenza- Viren
infiziert werden kann. Sie können
sowohl adhärent
wachsende Zellen sein, als auch Zellen, die in Suspension wachsen.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
sind die Zellen Wirbeltier-Zellen, insbesondere Vogel-Zellen und
in diesem Zusammenhang bevorzugt Hühner-Zellen, zum Beispiel Hühnerembryo-Zellen
(CEF-Zellen).
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
sind die Zellen Säuger-Zellen,
zum Beispiel Hamster-, Rinder-, Affen- oder Hunde-Zellen. Bevorzugt
werden Nieren-Zellen oder von diesen abgeleitete Zelllinien verwendet.
Beispiele für
geeignete Hamster-Zellen sind die Zelllinien mit den Namen BHK21-F
oder HKCC. Mögliche
Affen-Zellen sind zum Beispiel VERO-Zellen und mögliche Rinder-Zellen sind die
der MDBK-Zelllinie. Ein Beispiel für eine geeignete Nieren-Zelllinie
ist die Zelllinie MDCK (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2)) aus Hundenieren.
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Im
Zusammenhang der vorliegenden Erfindung wurde eine weitere Zelllinie
aus der vorstehend genannten Nieren-Zelllinie MDCK etabliert, wobei
diese weitere Zelllinie an das Wachstum in Suspension in serumfreien
Medium angepasst ist und dadurch besonders einfache und effiziente
Züchtung
und Virusreplikation ermöglicht.
Diese Zelllinie, MDCK 33016, wird besonders bevorzugt im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet. Sie wurde unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC 2219
am 7. Juni 1995 entsprechend den Anforderungen der Budapester Konvention über die
Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck der Patentierung,
bei der Deutschen Sammlung für
Mikroorganismen (DSM) in Braunschweig (Bundesrepublik Deutschland),
welche als die internationale Hinterlegungsstelle anerkannt ist,
hinterlegt.
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Zur
Züchtung
der Zellen im erfindungsgemäßen Verfahren
können
die üblichen
dem Fachmann bekannten Verfahren für die Zellkultur verwendet
werden, insbesondere jene, welche bereits für die Replikation von Influenza-Viren
in Zellkultur bekannt sind. Die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
unter Verwendung von Zellen, die in Suspension wachsen, insbesondere
jenen, welche in serumfreiem Medium gezüchtet werden können, ermöglicht eine
besonders einfache und effiziente Virusreplikation. Die Züchtung von Zellen
in Suspension kann in diesem Fall sowohl in einem Batch-Verfahren
als auch in einem Perfusionssystem, zum Beispiel in einem gerührten Gefäßfermenter,
unter Verwendung der dem Fachmann bekannten Zell-Rückhaltesysteme
wie zum Beispiel Zentrifugation, Filtration, Spin-Filter und so
weiter durchgeführt
werden.
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Die
Züchtung
der Zellen wird in der Regel bei einem regulierten pH-Wert durchgeführt, welcher
bevorzugt im Bereich von pH 6,6 bis pH 7,8, insbesondere im Bereich
von pH 6,8 bis pH 7,3 liegt.
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Weiterhin
kann der pO2-Wert vorteilhaft reguliert
werden und liegt dann in der Regel zwischen 25% und 95%, insbesondere
zwischen 35% und 60% (basierend auf der Luftsättigung).
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Die
Infektion der in Suspension gezüchteten
Zellen wird bevorzugt dann durchgeführt, wenn die Zellen eine Zelldichte
von etwa 8 bis 25 × 105 Zellen/ml im Batch-Verfahren oder etwa
5 bis 20 × 106 Zellen/ml im Perfusions-System erreicht
haben. Wenn adhärent
wachsende Zellen verwendet werden, hängt die optimale Zelldichte
für die
Infektion von der jeweiligen Zelllinie ab.
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Die
Infektion der Zellen mit Influenza-Viren wird bevorzugt bei einer
MOI (Multiplizität
der Infektion) von etwa 0,0001 bis 10, bevorzugt von 0,002 bis 0,5
durchgeführt.
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Die
Zugabe einer Protease, welche die Spaltung des Vorläufer-Proteins
des Hämagglutinins
[HA0] und damit die Adsorption der Viren
an die Zellen bewirkt, kann erfindungsgemäß kurz vor oder gleichzeitig
mit der Infektion der Zellen mit den Influenza-Viren durchgeführt werden.
Wenn die Zugabe gleichzeitig mit der Infektion durchgeführt wird,
kann die Protease entweder direkt der zu infizierenden Zellkultur
oder zum Beispiel als Konzentrat zusammen mit dem Virus-Inokulum
hinzugefügt
werden. Wenn ein serumhaltiges Medium zur Züchtung verwendet wird, sollte
dies vor der Zugabe der Protease entfernt werden. Die Protease ist
bevorzugt eine Serin-Protease
und besonders bevorzugt Trypsin.
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Wenn
Trypsin verwendet wird, ist die Endkonzentration im Kulturmedium
vorteilhafterweise 1 bis 200 μg/ml,
bevorzugt 5 bis 50 μg/ml
und besonders bevorzugt 5 bis 30 μg/ml.
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Nach
der Infektion wird die infizierte Zellkultur weiter gezüchtet, um
die Viren zu vervielfältigen,
insbesondere bis ein maximaler cytopathischer Effekt oder eine maximale
Menge des Virus-Antigens nachgewiesen werden kann.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
des Verfahrens wird das Ernten und die Gewinnung der vervielfältigten
Influenza-Viren 2 bis 10, bevorzugt 3 bis 7 Tage nach der Infektion
durchgeführt.
Um dies zu tun, werden zum Beispiel die Zellen oder Zellreste unter
Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren, zum Beispiel durch
Separatoren oder Filter, vom Kulturmedium getrennt. Anschließend wird
die Konzentration der im Kulturmedium vorliegenden Influenza-Viren
durch dem Fachmann bekannte Verfahren wie zum Beispiel Gradientenzentrifugation,
Filtration, Präzipitation
und ähnliches
durchgeführt.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin Influenza-Viren, welche durch ein erfindungsgemäßes Verfahren
gewonnen werden können.
Diese können
durch bekannte Verfahren formuliert werden, um einen Impfstoff zur Verabreichung
an Menschen oder Tiere zu ergeben. Wie bereits vorstehend erläutert, haben
Influenza-Viren dieser
Art eine größere Wirksamkeit
als Impfstoff als Influenza-Viren, welche durch Replikation bei
37°C in
Zellkultur gewonnen werden.
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Die
Immunogenität
oder Wirksamkeit der als Impfstoff gewonnenen Influenza-Viren kann durch
dem Fachmann bekannte Verfahren, zum Beispiel durch den gewährten Schutz
in einem Expositions-Experiment oder als Antikörpertiter von Virus neutralisierenden
Antikörpern,
bestimmt werden.
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Die
Bestimmung der Menge des produzierten Virus oder Antigens kann zum
Beispiel durch Bestimmung der Menge des Hämagglutinins durch dem Fachmann
bekannte Verfahren durchgeführt
werden. Es ist zum Beispiel bekannt, dass gespaltenes Hämagglutinin
an Erythrocyten verschiedener Spezies, zum Beispiel Hühner-Erythrocyten,
bindet. Dies ermöglicht
eine einfache und schnelle Quantifizierung der produzierten Viren
oder des gebildeten Antigens durch entsprechende Nachweisverfahren.
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Durch
vergleichende Experimente in Tiermodellen wurde gezeigt, dass erfindungsgemäße Influenza-Viren
einen nennenswert höheren
Titer von neutralisierenden Antikörpern erzeugen als bei 37°C vervielfältigte Viren
und dadurch einen nennenswert besseren Schutz gegen eine Influenza-Virus-Infektion
gewähren. In
Experimenten mit Mäusen
als Tiermodell war zum Beispiel der Titer von neutralisierenden
Antikörpern
nach der Impfung mindestens um einen Faktor von 42 Wochen höher als
der Titer von neutralisierenden Antikörpern nach Inokulation mit
Influenza-Viren, welche bei 37°C
vervielfältigt
wurden. 4 Wochen nach der Inokulation war der Titer von neutralisierenden
Antikörpern
mindestens um den Faktor 17 höher
und in einigen Fällen
bis zu 27 Mal höher.
Wenn eine erneute Impfung durchgeführt wurde, konnte der Titer
von neutralisierenden Antikörpern
um einen Faktor von über
60 höher
sein, wenn erfindungsgemäße Influenza-Viren
im Vergleich zu Influenza-Viren, welche bei 37°C vervielfältigt wurden, verwendet wurden.
Dementsprechend kann die Überlebensrate
von Tieren in einem Expositionsexperiment bei Verwendung einer Gabe
von 1000 LD50 (50% tödliche Dosis) von 1/10 auf
mindestens 8/10, bevorzugt 9/10 und besonders bevorzugt 10/10 (100%)
gesteigert werden.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin Impfstoffe, welche Influenza-Viren
enthalten, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen werden
können.
Impfstoffe dieser Art können
optional jene Zusätze
enthalten, welche für
Impfstoffe üblich
sind, insbesondere Substanzen, welche die Immunantwort verstärken, das
heißt sogenannte
Adjuvantien, zum Beispiel Hydroxide verschiedener Metalle, Bestandteile
bakterieller Zellwände, Öle oder
Saponine und zudem übliche
pharmazeutisch zulässige
Excipienten.
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Die
Viren können
in den Impfstoffen als intakte Viruspartikel, insbesondere als lebende,
abgeschwächte
Viren, vorliegen. Zu diesem Zweck werden Virus-Konzentrate auf den gewünschten
Titer eingestellt und entweder lyophilisiert oder in flüssiger Form
stabilisiert.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
können
die erfindungsgemäßen Impfstoffe
aufgelöste, das
heißt
inaktivierte, oder intakte, aber inaktivierte Viren enthalten. Zu
diesem Zweck wird die Infektiosität der Viren durch die Verwendung
von chemischen und/oder physikalischen Verfahren (zum Beispiel durch
Detergentien oder Formaldehyde) zerstört. Der Impfstoff wird dann
auf die gewünschte
Menge von Antigen eingestellt und nach möglicher Beimischung von Adjuvantien
oder nach möglicher
Formulierung als Impfstoff, zum Beispiel als Liposomen, Mikrosphären oder
Formulierung mit verzögerter
Freisetzung, zubereitet.
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In
einer weiteren bevorzugten Ausführungsform
kann der erfindungsgemäße Impfstoff
schließlich
als Untereinheitenimpfstoff vorliegen, das heißt, dass er definierte und
isolierte Virusbestandteile, bevorzugt isolierte Proteine des Influenza-Virus, enthalten
kann. Diese Bestandteile können
durch dem Fachmann bekannte Verfahren aus den Influenza-Viren gewonnen
werden.
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Der
Unterschied, dass die erfindungsgemäßen Influenza-Viren, welche
bei niedrigeren Temperaturen hergestellt wurden, eine größere Antigenität haben
als Viren, welche nach üblichen
Verfahren wie höheren Temperaturen
hergestellt wurden, kann für
diagnostische Zwecke verwendet werden. Deshalb betrifft die vorliegende
Erfindung auch Diagnosemittel, welche erfindungsgemäße Influenza-Viren oder Bestandteile
solcher Viren enthalten und falls zweckmäßig mit in diesem Bereich üblichen
Zusätzen
und geeigneten Nachweismitteln kombiniert sind.
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Die
Beispiele veranschaulichen die Erfindung.
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Beispiel 1
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Replikation von Influenza-Viren
in MDCK-Zellen bei 33°C
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MDCK-Zellen
(ATCC CCL 34) wurden in Zellkulturflaschen (Eagle-MEM (EMEM) unter
Verwendung von 2% FKS, Inkubation bei 37°C über 4 Tage) vermehrt. Der sich
ergebende dichte Zellrasen wurde von der Gefäßwand unter Verwendung von
Trypsin-Lösung
abgelöst,
die Zellen wurden gewonnen und das Zell-Konzentrat wurde in serumhaltigem
Medium resuspendiert. Die Zellen wurden in einer Zelldichte von
5 × 105 Zellen/ml in Roller-Flaschen inokuliert
(200 ml/Flasche) und bei 37°C
und 4 UpM inkubiert. Nach 2 Tagen wurden die Zellen mit Influenza-Viren infiziert.
Um dies zu tun, wurde das Medium über dem dichten Zellrasen entfernt und
durch serumfreies EMEM ersetzt. Influenza-Virus A/PR/8/34 mit einer
MOI (Multiplizität
der Infektion) von 0,1 und Trypsin in einer Endkonzentration von
25 μg/ml
wurden dem Medium hinzugefügt.
In beiden Fällen wurden
zwei Roller-Falschen
bei 37°C
oder bei 33°C
inkubiert. Die Virusreplikation wurde als Menge des Antigens (gemessen
als Hämagglutinin-Einheiten)
und als Infektiosität
(gemessen im CCID50-Versuch) bestimmt und
ist in Tabelle 1 gezeigt.
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Tabelle
1 Replikation
von Influenza A/PR/8/34 in Rollerflaschen (MDCK-Zelllinie) nach
Inkubation bei 37°C
und 33°C, gemessen
als Antigengehalt (HA-Einheiten und Infektiosität (CCID
50))
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Die
angezeigten Verhältnisse
bedeuten, dass eine 1 : X-Verdünnung
der Virusernte noch hämagglutinierende
Eigenschaften hat. Die hämagglutinierenden
Eigenschaften können
zum Beispiel, wie in Mayer et al., Virologische Arbeitsmethoden,
Band 1 (1974), Seiten 260–261
oder in Grist, Diagnostic Methods in Clinical Virology, Seiten 72–75 beschrieben,
bestimmt werden.
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Die
Bestimmung der CCID50-Werte kann zum Beispiel
gemäß dem Verfahren,
welches in Paul, Zell- und Gewebekultur (1980) S. 395 beschrieben
ist, durchgeführt
werden.
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Beispiel 2
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Herstellung einer Zelllinie,
welche an das Wachstum in Suspension angepasst ist und durch Influenza-Viren infiziert
werden kann
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Eine
Zelllinie, welche geeignet ist in Suspensionskultur zu wachsen und
durch Influenza-Viren infiziert werden kann, wurde ausgehend von
MDCK-Zellen (ATCC CCL34 MDCK (NBL-2), welche mittels nur weniger Passagen
oder über
einige Monate im Labor vermehrt worden waren, selektioniert. Diese
Selektionierung wurde durch Vermehrung der Zellen in Roller-Flaschen,
welche mit 16 UpM (anstatt etwa 3 UpM, wie es für Roller-Flaschen mit adhärent wachsenden
Zellen üblich
ist) gedreht wurden, durchgeführt.
Nach einigen Passagen der im Medium suspendiert vorliegenden Zellen,
wurden Zellstämme
gewonnen, die in Suspension wachsen. Diese Zellstämme wurden
mit Influenza-Viren infiziert und jene Stämme wurden ausgewählt, welche
den größten Virus-Ertrag
herstellten. Eine Steigerung im Anteil der in Suspension wachsenden
Zellen in den ersten Passagen bei 16 UpM wird über 1 bis 3 Passagen durch
die Zugabe von dem Fachmann bekannten Selektionssystemen wie Hypoxanthin,
Aminopterin und Thymidin oder Alanosin und Adenin, einzeln oder
in Kombination, erreicht. Die Selektion von in Suspension wachsenden
Zellen ist auch in anderen, dem Fachmann bekannten, bewegten Zellkultur-Systemen
wie gerührten
Flaschen möglich.
Ein Beispiel für
Zellen, welche an das Wachstum in Suspension angepasst sind und
mit Influenza-Viren infiziert werden können, ist die Zelllinie MDCK
33016 (DSM ACC2219).
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Beispiel 3
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Replikation von Influenza-Viren
in MDCK 33016-Zellen bei 33°C
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Die
in Suspension wachsende Zelllinie MDCK 33016 (DSM ACC 2219) wurde
bei 37°C
in Iscove-Medium mit einer Teilungsrate von zweimal wöchentlich
1 : 8 bis 1 : 12 in einer Roller-Flasche, welche mit 16 UpM rotierte,
vermehrt. 4 Tage nach dem Transfer wurde eine Zelldichte von annähernd 7,0 × 105 Zellen/ml erreicht. Gleichzeitig mit der
Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur mit dem Influenza-Stamm A/PR/8/34 (MOI
= 0,1) wurde die Zellkultur mit Trypsin behandelt (25 μg/ml Endkonzentration),
weiter bei 37°C
oder 33°C
inkubiert und die Virusreplikation über 3 Tage bestimmt (Tab. II).
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Tabelle
II Replikation
von Influenza A/PR/8/34, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten) in Roller-Flaschen (MDCK-Zelllinie
MDCK 33016) nach Infektion einer Zellkultur ohne Wechsel des Mediums
bei einer Inkubationstemperatur von 37°C oder 33°C
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Beispiel 4
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Replikation verschiedener
Influenza-Stämme
in MDCK 33016-Zellen (DSM ACC 2219) bei 33°C
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Die
Zelllinie MDCK 33016 (DSM ACC 2219) wurde bei 37°C in Iscove-Medium mit einer
Teilungsrate von zweimal wöchentlich
1 : 8 bis 1: 12 in einer Roller-Flasche, welche mit 16 UpM rotierte,
vermehrt. 4 Tage nach dem Transfer wurde eine Zelldichte von 7,0 × 10
5 bis 10 × 10
5 Zellen/ml
erreicht. Gleichzeitig mit der Infektion der nun 4 Tage alten Zellkultur
mit verschiedenen Influenza-Stämmen
(MOI ≈ 0,1),
wurde die Zellkultur mit Trypsin (Endkonzentration 25 μg/ml) behandelt
und weiter bei 33°C
inkubiert und die Virusreplikation am 5 Tag nach der Infektion bestimmt
(Tabelle III). Tabelle
III Replikation
von Influenza-Stämmen
in Roller-Flaschen (Zelllinie MDCK 33016) nach Infektion einer Zellkultur ohne
Wechsel des Mediums, gemessen als Antigengehalt (HA-Einheiten)
Influenza-Stamm | HA-Gehalt
5 Tage nach Infektion HA-Gehalt |
A/Singapore | 1
: 1024 |
A/Sichuan | 1
: 256 |
A/Shanghai | 1
: 256 |
A/Guizhou | 1
: 128 |
A/Beijing | 1
: 512 |
B/Beijing | 1
: 256 |
B/Yamagata | 1
: 512 |
A/PR/8/34 | 1
: 1024 |
A/Equi
1/Prague | 1
: 512 |
A/Equi
2/Miami | 1
: 256 |
A/Equi
2 Fontainebleau | 1
: 128 |
A/Swine/Ghent | 1
: 512 |
A/Swine/Iowa | 1
: 1024 |
A/Swine/Arnsberg | 1
: 512 |
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Beispiel 5
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Herstellung
eines experimentellen Influenza-Impfstoffes
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Nach
Inokulation in Mäusen
führen
human-pathogene Influenza-Viren für gewöhnlich nicht zu deren Infektion
mit pathologischen Vorgängen,
so dass Schutz-Versuche
mit Mäusen
experimentell schwer aufzubauen sind. Der Influenza-Virusstamm A/PR/8/34
ist jedoch an Mäuse
angepasst und verursacht nach intranasaler Verabreichung eine dosisabhängige Sterblichkeit
in Mäusen.
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Ein
experimenteller Impfstoff wurde aus dem Influenza-Virus A/PR/8/34
aus Beispiel 3 (A/PR/8 vervielfältigt
bei 37°C
oder 33°C)
hergestellt. Die Influenza-Viren im Zellkulturmedium wurden von
den Zellen und Zellfragmenten durch Zentrifugation bei niedriger
Geschwindigkeit (2000 g, 20 min, 4°C) abgetrennt und durch Zentrifugation
in einem Saccharose-Gradienten (linearer Saccharose-Gradient von
10 bis 50% (Gewichtsanteil), 30000 g, 2 h, 4°C) aufgereinigt. Die das Influenza-Virus
enthaltende Bande wurde gewonnen, 1 : 10 mit PBS pH 7,2 verdünnt und
bei 20000 UpM sedimentiert und das Präzipitat wurde in PBS aufgenommen
(Volumen: 50% des ursprünglichen
Zellkulturmediums). Die Influenza-Viren wurden mit Formaldehyd inaktiviert (zweimalige
Zugabe von 0,025% einer Formaldehydlösung von 35% Stärke in einem
Abstand von 24 h, Inkubation bei 20°C mit Rühren).
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10
NMRI-Mäuse
mit einem Gewicht von 18 bis 20 g wurden jeweils durch subkutane
Injektion mit je 0,3 ml des inaktivierten, experimentellen Impfstoffes
an Tag 0 und Tag 28 inokuliert. 2 und 4 Wochen nach der Inokulation
und ebenfalls 1 und 2 Wochen nach der erneuten Impfung wurde den
Tieren Blut abgenommen, um den Titer von neutralisierenden Antikörpern gegen
A/PR/8/34 zu bestimmen. Um die Schutzrate zu bestimmen, wurden die
Mäuse 2
Wochen nach der erneuten Impfung (6 Wochen nach dem Beginn des Versuchs) durch
intranasale Verabreichung von 1000 LD50 (50%
tödliche
Dosis) exponiert. Die Ergebnisse des Versuchs sind in Tabelle IV
zusammengestellt.
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Tabelle
IV Wirksamkeit
von experimentellen Impfstoffen: Für den Impfstoff A wurde der
Influenza-Virus A/PR/8/34 bei 37°C
vervielfältigt
und für
den Impfstoff B bei 33°C.
Die Titer von neutralisierenden Antikörpern gegen A/PR/8 und auch
die Schutzrate nach Exposition der Mäuse wurden untersucht.
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Die
Experimente bestätigen,
dass Influenza-Viren, welche bei 37°C in Zellkultur mit einer hohen
Antigen-Ausbeute (HA-Titer) vervielfältigt worden sind, nur niedrige
Titer von neutralisierenden Antikörpern in der Maus erzeugen
und kaum Schutz verleihen, während
Influenza-Viren, welche bei 33°C
in Zellkultur mit einer ebenfalls hohen Antigen-Ausbeute (HA-Titer)
vervielfältigt
worden sind, sehr hohe Titer von neutralisierenden Antikörpern in
der Maus erzeugten und zu einem sehr guten Schutz führten.
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Beispiel 6
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Replikation von Influenza-Viren
in MDCK-Zellen bei 33°C
und Wirksamkeit des gewonnenen Impfstoffes
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Die
Zelllinie MDCK (ATCC CL34) wurde bei 37°C in einer Zellkultur-Flasche
in Eagle-MEM (EMEM) mit 2% FKS mit einer zweimal wöchentlichen
Teilungsrate von 1 : 8 bis 1 : 12 vervielfältigt. 4 Tage nach der Transformation
ergab sich ein dichter Zellrasen. Nach dem Wechsel des Mediums zu
serumfreiem EMEM wurde die Zellkultur mit Influenza B/Beijing (MOI
= 0,1) infiziert, Trypsin wurde dem Medium in einer Endkonzentration
von 25 μg/ml
hinzugefügt
und die infizierten Zellkulturflaschen wurden entweder bei 37°C oder bei
33°C inkubiert.
4 Tage nach der Infektion war der HA-Gehalt in beiden experimentellen
Chargen 256 HA-Einheiten. Nach
Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit zur Entfernung der
Zellen/Zellreste, wurden die Viren im Überstand mit Formaldehy inaktiviert
(zweimalige Zugabe von 0,025% einer Formaldehydlösung von 35% Stärke in einem
Abstand von 24 h, Inkubation bei 20°C mit Rühren). In jedem der experimentellen
Abschnitte war das hinzugefügte
Adjuvans Aluminium-Hydroxid (10% Endkonzentration einer Al(OH)3-Lösung
mit einer Stärke
von 2%). Unter Verwendung dieser experimentellen Impfstoffe wurden
in jedem Fall 3 Meerschweinchen (400 bis 500 g) je experimentellem
Abschnitt einer intraplantaren Impfung mit 0,2 ml und 4 Wochen danach
einer erneuten Impfung mit dem selben Impfstoff unterzogen. Um die
Wirksamkeit des Impfstoffes zu untersuchen, wurden Blutproben 2,
4 und 6 Wochen nach der Inokulation entnommen und im Hämagglutinations-Hemmtest
und im Serum-Neutralisationstest untersucht (vgl. Tabelle V).
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Tabelle
V Wirksamkeit
von experimentellen Impfstoffen aus Influenza B/Beijing nach Replikation
des Virus bei 37°C
oder 33°C
in Zellkultur: die serologischen Parameter Hämagglutinations-Hemmung und
neutralisierende Antikörper wurden
untersucht (Durchschnittswerte von 3 Meerschweinchen)