ES2716243T3 - Plataformas de suministro de antígenos - Google Patents

Plataformas de suministro de antígenos Download PDF

Info

Publication number
ES2716243T3
ES2716243T3 ES11785510T ES11785510T ES2716243T3 ES 2716243 T3 ES2716243 T3 ES 2716243T3 ES 11785510 T ES11785510 T ES 11785510T ES 11785510 T ES11785510 T ES 11785510T ES 2716243 T3 ES2716243 T3 ES 2716243T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
protein
fragment
self
proteins
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES11785510T
Other languages
English (en)
Inventor
Anders Lilja
Rebecca Loomis
Michael Franti
Peter Mason
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Original Assignee
GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=45002110&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2716243(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by GlaxoSmithKline Biologicals SA filed Critical GlaxoSmithKline Biologicals SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2716243T3 publication Critical patent/ES2716243T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/90—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification
    • C07K2319/92—Fusion polypeptide containing a motif for post-translational modification containing an intein ("protein splicing")domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16111—Cytomegalovirus, e.g. human herpesvirus 5
    • C12N2710/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16711—Varicellovirus, e.g. human herpesvirus 3, Varicella Zoster, pseudorabies
    • C12N2710/16734—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/36011—Togaviridae
    • C12N2770/36111—Alphavirus, e.g. Sindbis virus, VEE, EEE, WEE, Semliki
    • C12N2770/36141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/36143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/20—Vector systems having a special element relevant for transcription transcription of more than one cistron
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2840/00—Vectors comprising a special translation-regulating system
    • C12N2840/20—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron
    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Una molécula de ARN de auto-replicación que comprende un polinucleótido que comprende: a. una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína o un fragmento de la misma de un virus del herpes; b. una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína o un fragmento de la misma de dicho virus del herpes; c. una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína o un fragmento de la misma de dicho virus del herpes; d. una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína o un fragmento de la misma de dicho virus del herpes; y e. una quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína o un fragmento de la misma de dicho virus del herpes; en la que la primera proteína o fragmento de la misma, segunda proteína o fragmento de la misma, tercera proteína o fragmento de la misma, cuarta proteína o fragmento de la misma y quinta proteína o fragmento de la misma son proteínas del virus del herpes que forman complejos pentaméricos entre sí; y en la que la primera secuencia de nucleótidos, la segunda de nucleótido, la tercera secuencia de nucleótidos, la cuarta secuencia de nucleótidos y la quinta secuencia de nucleótidos están operativamente enlazadas a uno o más elementos de control de tal forma que cuando se introduce la molécula de ARN de auto-replicación en una célula adecuada, la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas del virus del herpes o fragmentos de las mismas se producen en una cantidad suficiente para la formación de un complejo en la célula que contiene la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas o fragmentos.

Description

DESCRIPCIÓN
Plataformas de suministro de antígenos
Antecedentes de la invención
El virus del herpes se ha difundido ampliamente y causa un amplio intervalo de enfermedades en humanos que en el peor de los casos puede conducir a morbidez y mortalidad sustancial, principalmente en individuos inmunocomprometidos (por ejemplo, en receptores de trasplante e individuos infectados con VIH). Los humanos son susceptibles a la infección a través de al menos ocho virus del herpes. El virus del herpes simple 1 (VHS-1, VHH-1), virus de Herpes simple-2 (VHS-2, VHH-2) y virus de Varicela zoster (VVZ, VHH-3) son los virus de la subfamilia alfa, citomegalovirus (CMV, VHH-5) y Roseolovirus (VHH-6 y VHH-7) son virus de la subfamilia beta, virus de Epstein-Barr (VEB, VHH-4) y el virus del herpes asociado a sarcoma de Kaposi (VHSK, VHH-8) son virus de la subfamilia gama que infectan a humanos.
La infección por CMV conduce a una morbilidad y mortalidad sustanciales en individuos inmunocomprometidos (por ejemplo, receptores de trasplantes e individuos infectados con VIH) e infección congénita que pueda resultar en defectos devastadores en el desarrollo neurológico en neonatos. Las glucoproteínas de envuelta gB, gH, gL, gM y gN del CMV representan candidatos de vacuna atractivos ya que se expresan en la superficie vírica y pueden provocar respuestas inmunes humorales neutralizantes del virus protectoras. Algunas estrategias de vacunas CMV se han dirigido a la glucoproteína de superficie principal B (gB), que puede inducir una respuesta de anticuerpo dominante. (Go y Pollard, JID 197:1631-1633 (2008)). La glucoproteína gB de CMV puede inducir una respuesta de anticuerpos neutralizantes, y una gran fracción de los anticuerpos que neutralizan la infección de los fibroblastos en suero de pacientes positivos CMV se dirige contra gB (Britt 1990). De forma similar, se ha informado que gH y gM/gN son dianas de la respuesta inmune a infección natural (Urban y col. (1996) J. Gen. Virol. 77 (Pt. 7):1537-47; Mach y col. (2000) J. Virol. 74(24):11881-92).
Los complejos de proteínas de CMV también son candidatos de vacuna atractivos porque parece que están implicados en procesos importantes en el ciclo de vida vírico. Por ejemplo, el complejo gH/gL/gO parece que tiene papeles importantes tanto en la entrada de fibroblastos como de células epiteliales/endoteliales. El modelo prevalente sugiere que el complejo gH/gL/gO media la infección de los fibroblastos. Los mutantes hCMV gO-nulos producen pequeñas placas de fibroblastos y virus a muy bajos títulos indicando el papel en la entrada (Dunn (2003), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14223-28; Hobom (2000) J. Virol. 74:7720-29). Los recientes estudios sugieren que gO no se incorpora en los viriones con gH/gL, pero puede actuar como una chaperona molecular, aumentando la exportación de gH/gL del RE al aparato Golgi y la incorporación en los viriones (Ryckman (2009) J. Virol 82:60-70). A través de experimentos de búsqueda de pulso, se ha demostrado que pequeñas cantidades de gO permanecen unidas a gH/gL durante largos períodos de tiempo pero la mayor parte de los gO se disocian y/o se degradan del complejo gH/gL/gO, ya que no se encuentran en viriones extracelulares o se secretan de la célula. Cuando gO se elimina de una cepa clínica de CMV (TR) esas partículas víricas tienen cantidades significativamente reducidas de gH/gL incorporadas en el virión. Adicionalmente, gO eliminado del virus TR también inhibe la entrada en células epiteliales y endoteliales, sugiriendo que gH/gL también se requiere para la entrada de la célula epitelial/endotelial (Wille (2010) J. Virol. 84(5):2585-96).
gH/gL del CMV también puede asociarse a UL128, UL130, y UL131A (denominado en el presente documento UL131) y formar un complejo pentamérico que se requiere para la entrada en varios tipos celulares, incluyendo células epiteliales, células endoteliales, y células dendríticas (Hahn y col. (2004) J. Virol. 78(18):10023-33; Wang y Shenk (2005) Proc. Natl. Acad. Sci USA 102(50):18153-8; Gerna y col. (2005). J. Gen. Virol. 84(Pt 6):1431-6; Ryckman y col. (2008) J. Virol. 82:60-70). En contraste, este complejo no se requiere para infección de fibroblastos. Los aislados hCMV de Laboratorio llevan mutaciones en el locus UL128-UL131, y surgen mutaciones en aislados clínicos después de solamente unos cuantos pasajes en los fibroblastos cultivados (Akter y col. (2003) J. Gen. Virol.
84(Pt 5): 1117-22). Durante la infección natural, el complejo pentamérico provoca que los anticuerpos que neutralizan la infección de las células epiteliales, las células endoteliales (y probablemente cualquier otro tipo celular en el que el complejo pentamérico media la entrada vírica) con muy alta potencia (Macagno y col. (2010) J. Virol.
84(2):1005-13). También parece que los anticuerpos de este complejo contribuyen significativamente a la capacidad del suero humano de neutralizar la infección de las células epiteliales (Genini y col. (2011) J. Clin. Virol. 52(2):113-8). El documento US 5.767.250 desvela procedimientos para fabricar ciertos complejos proteicos CMV que contienen gH y gL. Los complejos se producen mediante la introducción de un complejo de ADN que codifica gH y un montaje de ADN que codifica gL en una célula de tal forma que gH y gL se co-expresan.
El documento WO 2004/076645 describe moléculas de ADN recombinantes que codifican proteínas de CMV. De acuerdo con este documento, las combinaciones de distintas moléculas de ADN que codifican diferentes proteínas de CMV, pueden introducirse en células para provocar la co-expresión de las proteínas de CMV codificadas. Cuando gM y gN se co-expresaron en esta forma, formaron un complejo enlazado por disulfuro. Los conejos inmunizados con montajes de ADN que produjeron el complejo gM/gN o con el montaje de ADN que codificaba gB produjeron respuestas de anticuerpo neutralizante equivalentes.
Existe la necesidad de ácidos nucleicos que codifiquen dos o más proteínas del virus del herpes, de procedimientos de expresión de dos o más proteínas del virus del herpes en la misma célula y de procedimientos de inmunización que produzcan mejores respuestas inmunes.
Sumario de la invención
La invención es como se define en las reivindicaciones.
La invención se refiere a plataformas para el co-suministro de cinco proteínas de virus del herpes, tales como proteínas de citomegalovirus (CMV), a células, particularmente proteínas que forman complejos in vivo. En un aspecto, la invención proporciona una molécula de ARN de auto-replicación que comprende un polinucleótido que comprende: una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o un fragmento de la misma; una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína o un fragmento de la misma de dicho virus del herpes; una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína o fragmento de la misma de dicho virus del herpes; una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína o fragmento de la misma de dicho virus del herpes; y una quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína o fragmento de la misma de dicho virus del herpes. La primera proteína o fragmento de la misma, la segunda proteína o fragmento de la misma, la tercera proteína o fragmento de la misma, la cuarta proteína o fragmento de la misma y la quinta proteína o fragmento de la misma son proteínas del virus del herpes que forman complejos pentaméricos entre sí.
La primera secuencia de nucleótidos, la segunda de nucleótido, la tercera secuencia de nucleótidos, la cuarta secuencia de nucleótidos y la quinta secuencia de nucleótidos están operativamente enlazadas a uno o más elementos de control de tal forma que cuando se introduce la molécula de ARN de auto-replicación en una célula adecuada, la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas del virus del herpes o fragmentos de las mismas se producen en una cantidad suficiente para la formación de un complejo en la célula que contiene la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas o fragmentos. Preferentemente, la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas no son la misma proteína o fragmentos de la misma proteína y no son fragmentos unas de otras.
En un ejemplo de un montaje pentacistrónico, la primera secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un primer elemento de control, la segunda secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un segundo elemento de control, la tercera secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un tercer elemento de control, la cuarta secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a cuarto elemento de control y la quinta secuencia de nucleótidos está operativamente enlazada a un quinto elemento de control. Los elementos de control presentes en el montaje (por ejemplo, primero, segundo, tercero, cuarto y quinto elementos de control) pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en un promotor subgenómico, un IRES y un sitio 2A (por ejemplo, FMDV) vírico.
El virus del herpes puede ser VHS-1, 1, VHS-2, VVZ, VEB de tipo 1, VEB de tipo 2, CMV, VHH-6 de tipo A, VHH-6 de tipo B, VHH-7 y VHH-8. En algunas realizaciones, la molécula de ácido nucleico policistrónica recombinante (por ejemplo, ARN de auto-replicación) codifica gH o un fragmento de la misma y gL o un fragmento de la misma o cualquiera de estos virus del herpes. En realizaciones más particulares, el virus del herpes es CMV o VVZ.
Cuando la molécula de ácido nucleico policistrónica recombinante (por ejemplo, ARN de auto-replicación) codifica proteínas VVZ, las proteínas pueden seleccionarse del grupo que consiste en gB, gE, gH, gI, gL y un fragmento (por ejemplo, de al menos 10 aminoácidos) de las mismas.
Cuando la molécula de ácido nucleico policistrónica recombinante (por ejemplo, ARN de auto-replicación) codifica proteínas de CMV, la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas de CMV pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en gB, gH, gL; gO; gM, gN; UL128, UL130, UL131 y un fragmento de una cualquiera de las anteriores. Preferentemente, la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas de CMV no son la misma proteína o fragmentos de la misma proteína, ni fragmentos unas de otras. Los elementos de control pueden seleccionarse independientemente del grupo que consiste en un promotor subgenómico e IRES y un sitio 2A vírico.
En una realización preferida, la molécula de ARN de auto-replicación codifica las proteínas de CMV gH, gL, UL128, UL130 y UL131.
Las moléculas de ARN de auto-replicación pueden ser un replicón de alfavirus. En tales casos, el replicón de alfavirus puede suministrarse en forma de una partícula de replicón de alfavirus (VRP, por sus siglas en inglés). La molécula de ARN de auto-replicación también puede estar en la forma de una molécula de ARN “desnuda”.
La invención también se refiere a una molécula de ADN recombinante que codifica una molécula de ARN de autoreplicación como se describe en el presente documento. La molécula de ADN recombinante puede ser un plásmido. La molécula de ADN recombinante puede incluir un promotor de mamífero que dirige la transcripción de la molécula de ARN de auto-replicación codificada.
La invención también se refiere a composiciones que comprenden una molécula de ARN de auto-replicación de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La molécula de ARN de auto-replicación puede estar “desnuda”. La composición también puede contener un sistema de suministro de ARN tales como un liposoma, una nanopartícula polimérica, una nanoemulsión catiónica de aceite en agua o combinaciones de los mismos. Por ejemplo, la molécula de ARN de auto-replicación puede encapsularse en un liposoma.
La composición puede comprender una VRP que contiene un replicón de alfavirus de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La composición también puede comprender un adyuvante.
La invención también proporciona un procedimiento in vitro de formación de un complejo proteico, que comprende suministrar un ARN de auto-replicación o una partícula de replicón de alfavirus como se describe en el presente documento a una célula y mantener la célula en condiciones adecuadas para la expresión de dicho ARN de autoreplicación, en el que se forma un complejo proteico que contiene la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas. En otras realizaciones la invención proporciona un ARN de auto-replicación o una partícula de replicón de alfavirus como se describe en el presente documento para su uso en un procedimiento de formación de un complejo proteico, que comprende suministrar el ARN de auto-replicación o la partícula de replicón de alfavirus a una célula y mantener la célula en condiciones adecuadas para la expresión de dicho ARN de auto-replicación, en el que se forma un complejo proteico que contiene la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas. Esta realización puede usarse formar un complejo proteico de CMV en una célula in vivo.
La invención también proporciona un ARN de auto-replicación o una partícula de replicón de alfavirus como se describe en el presente documento para su uso induciendo una respuesta inmune en un individuo. Como se describe en el presente documento, un ARN de auto-replicación o una partícula de replicón de alfavirus de acuerdo con la presente invención se administran al individuo. La molécula de ARN de auto-replicación puede administrarse como una composición que contiene un sistema de suministro de ARN, tal como un liposoma. En realizaciones preferidas, la molécula de ARN de auto-replicación codifica proteínas gH, gL, UL128, UL130 y UL131 de CMV. Preferentemente, la respuesta inmune inducida comprende la producción de anticuerpos anti-CMV neutralizantes. Más preferentemente, los anticuerpos neutralizantes son independientes del complemento.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 es un esquema de CMV que identifica complejos glucoproteicos conocidos implicados en la entrada de CMV en las células diana. Las glucoproteínas de envuelta representan candidatos de vacuna atractivos ya que se expresan en la superficie vírica y pueden provocar las respuestas inmunes humorales neutralizantes del virus protectoras y de larga duración. Las glucoproteínas estructurales median estos procesos que pueden dividirse en dos clases; aquellas que se conservan en toda la familia del virus del herpes y aquellas que N.° Aquellas que están conservadas son gB, gH, gL, gM y gN. Muchas de estas glucoproteínas forman complejos entre sí (gH/gL/±gO; gH/gL/UL128/UL130/UL131; gM/gN) para facilitar la localización de la superficie vírica y para llevar a cabo sus funciones en el acoplamiento vírico, la entrada y la fusión celular.
Las Figuras 2A-2F son esquemas de montajes de CMV. Figura 2A, Esquema de los montajes gB (“gB FL”, gB de longitud completa; gB solubles “gB sol 750” y “gB sol 692”) descritos en el Ejemplo 1. Se construyeron dos versiones solubles diferentes de gB; gB sol 750 carece del dominio de extensión transmembrana y del dominio citoplasmático, gB sol 692 también carece de una región hidrófoba y es similar a gB sol descrito en Reap y col. (2007) Clin. Vacc. Immunol. 14:748-55. Figura 2B, Esquema de los vectores de replicón gB usados para producir partículas de replicación vírica (VRP, por sus siglas en inglés). Figura 2C, esquema de los montajes gH (“gH FL”, gH de longitud completa; gH soluble “gH sol”) descrito en el Ejemplo 1. Se construyó una versión soluble individual de gH que careció del dominio de extensión transmembrana. Figura 2D, Esquema de los vectores de replicón gH usados para producir VRP. Figura 2E, Esquema del montaje gL descrito en el Ejemplo 1. Figura 2F, Esquema del vector de replicón gL usado para producir VRP. En las Figuras 2B, 2D y 2F, “NSP1”, “NSP2”, “NSP3”, y “NSP4”, son proteínas no estructurales alfavirus 1-4, respectivamente, requeridas para la replicación del virus.
Las Figuras 3A y 3B muestran que ratones inmunizados con VRP gB (FL, sol 750, sol 692) o gH (FL, sol) indujeron respuestas de anticuerpo que fueron neutralizantes en presencia del complemento de cobaya. El ensayo de neutralización se realizó a través de la pre-incubación de las cepas del virus CMV TB40UL32E-GFP (que codifica la proteína fluorescente verde GFP mejorada, Sampaio y col. (2005) J. Virol. 79(5):2754-67), con suero de ratón y complemento de cobaya antes de la infección de las células epiteliales ARPE-19. Cinco días después de la infección, se determinó el número de células positivas GFP. Figura 3A, Curvas de dilución séricas de todos los sueros analizados en células ARPE-19 en presencia de complemento. Figura 3B, Títulos del 50 % de neutralización para muestras séricas. Los virus incubados con suero pre-inmunizado produjeron una baja neutralización a bajas diluciones (1:40-1:80). Los sueros gB (FL, sol 750, sol 692) tuvieron una muy fuerte actividad neutralizante con títulos del 50 % de neutralización entre 1:1800-1:2100. Todos los ratones inmunizados con gB produjeron un perfil de neutralización similar. Los sueros gH (FL, sol) tuvieron una actividad neutralizante con títulos del 50 % de neutralización alrededor de 1:160. Véase el Ejemplo 1.
La Figura 4A es una ilustración esquemática de replicones monocistrónicos que codifican la proteína fluorescente verde (GFP, por sus siglas en inglés) o la proteína fluorescente roja (mCherry) y un replicón bicistrónico que codifica GFP y mCherry. “NSP1”, “NSP2”, “NSP3”, y “NSP4”, son proteínas 1-4 no estructurales de alfavirus, respectivamente. El sistema de replicón de alfavirus policistrónico se diseñó haciendo modificaciones al sistema replicón de alfavirus existente para acomodar múltiples promotores subgenómicos que dirigen los genes de interés.
La Figura 4B son gráficas de fluorescencia que muestran el análisis FACS de células BHKV infectadas con VRP que contienen ARN mono- y bicistrónicos. Las VRP de alfavirus policistrónicas produjeron más células que expresan ambos genes de interés en cantidades aproximadamente iguales (GFP y mCherry; 72,48 %) que la co­ infección de VRP GFP VRP mCherry (26,30 %). Véase el Ejemplo 2.
La Figura 5A es una ilustración esquemática de la construcción de montajes de replicón de alfavirus policistrónico que codifica gH/gL y gH/gL/gO.
La Figura 5B muestra que gH/gL forma un complejo in vitro. Las VRP que contienen replicones que codifican gH, gL, gO, gH/gL o gH/gL/gO se produjeron en células BHKV. Las v Rp resultantes se usaron para infectar células ARPE-19 para demostrar la formación del complejo in vitro. Las células ARPE-19 infectadas con alfavirus se cosecharon y analizaron para la presencia de gH y gL. Las células ARPE-19 infectadas con VRP que codifican gH/gL produjeron complejos enlazados a disulfuro de gH/gL (véase en la ausencia de DTT, calor). gO no alteró detectablemente la asociación gH/gL. La gráfica del lado izquierdo muestra la expresión de la proteína gH. La gráfica de la derecha muestra la expresión de la proteína gL. Los marcadores de peso molecular se indican entre las transferencias. • = gH monomérico, • • = gL monomérico, < = heterodímero (gH gL), * = dímero de heterodímeros.
La Figura 5C muestra la inmunoprecipitación de complejos gH y gH/gL de células BHKV infectadas con VRP. La inmunoprecipitación se realizó usando anticuerpos IgG de ratón como un control (Carriles 2, 4, 7, y 10) o anticuerpos anti-gH de ratón (Genway) para inmunoprecipitar gH (Carriles 3, 5, 8, y 11). Las Transferencias Western se realizaron usando anticuerpos anti-gL de conejo y anticuerpos gH de conejo combinados. Los carriles 1, 6 y 9 muestran la proteína gH (banda superior ~75 kDa) y la proteína gL (banda inferior ~ 30 kDa) para referencia. Los carriles 2 y 3 son lisados infectados con gH-VRP. El carril 2 muestra que el anticuerpo de control no inmunoprecipitó gH. El carril 3 muestra que el anticuerpo anti-gH inmunoprecipitó gH. Los carriles 4 y 5 son de lisados infectados con gL-VRP solamente. No se inmunoprecipitó ninguna proteína gH. Los carriles 7 y 8 son de lisados infectados con gH/gL-VRP bicistrónica. El carril 8 muestra que gL se inmunoprecipitó usando el anticuerpo gH. (Véase el asterisco). Los carriles 10 y 11 son de lisados infectados con gH/gL/gO-VRP tricistrónicas. El carril 11 muestra que gL se inmunoprecipitó usando el anticuerpo gH. (Véase el asterisco). Los marcadores de peso molecular también se muestran (MW). Véase el Ejemplo 3.
La Figura 6 muestra que las VRP que afectan la formación del complejo gH/gL in vitro inducen potentes respuestas inmunes a CMV que son cualitativa y cuantitativamente superiores a las respuestas a VRP gB. La Figura 6A y la Figura 6B muestran curvas de dilución séricas para ratones inmunizados con VRP gH, gL, gO, gH gL, gH gL gO, gH/gL y gH/gL/gO en la neutralización de la infección TB40-UL32-EGFP de células ARPE-19 en presencia (Figura 6A) o ausencia (Figura 6B) del complemento. Se pre-incubaron diversas diluciones de suero con TB40UL32E-GFP en presencia o ausencia de complemento de cobayas y después se añadieron a células epiteliales ARPE-19. Después de 5 días de la infección con el virus, se contaron las células positivas GFP. La Figura 6C es una gráfica que muestra títulos del 50 % de neutralización obtenidos en presencia y ausencia del complemento. “3wp3”, tres semanas después de la tercera inmunización. Las VRP que expresan proteínas de CMV individuales (VRP gH, gL, gO o VRP gH, gL y gO co-administrados) no potenciaron la actividad neutralizante más allá del gH solo. En contraste, los sueros de ratones inmunizados con VRP gH/gL bicistrónicas o gH/gL/gO tricistrónicas demostraron respuestas neutralizantes potentes. Además, las respuestas de neutralización potentes fueron similares en presencia y ausencia del complemento de cobaya, mostrando que las VRP policistrónicas exitosamente indujeron una respuesta inmune independiente del complemento. Véase el Ejemplo 4.
La Figura 7 muestra que las VRP que afectan la formación del complejo gH/gL in vitro indujeron anticuerpos que neutralizaron potentemente la infección de células de fibroblasto MRC-5. La Figura 7A muestra las curvas de dilución séricas para ratones inmunizados con VRP gH, gL, gO, gH gL, gH gL gO, gH/gL y gH/gL/gO en células MRC-5 en la ausencia del complemento. Se pre-incubaron diversas diluciones de sueros con TB40GFP en presencia o ausencia del complemento de cobaya y después se añadieron a las células de fibroblasto MRC-5. Después 5 días de infección con el virus, se contaron las células positivas GFP. La Figura 7B es una gráfica que muestra títulos del 50 % de neutralización obtenidos en el modelo de células de fibroblasto MRC-5 en ausencia del complemento. “3wp3”, tres semanas después de la tercera inmunización. Las VRP que expresan proteínas de CMV individuales (VRP gH, gL, gO o VRP gH, gL y gO co-administradas) no mejoraron la actividad neutralizante más allá del gH solo. En contraste el suero de ratones inmunizados con VRP gH/gL bicistrónica o gH/gL/gO tricistrónica demostró respuestas neutralizantes extremadamente potentes. Véase el Ejemplo 4.
Las Figuras 8A y 8B son gráficas que muestran que los anticuerpos neutralizantes inducidos por el suministro de las VRP policistrónicas fueron anticuerpos de neutralización cruzada. Los sueros de ratones inmunizados con VRP gH/gL y gH/gL/gO fueron capaces de neutralizar las cepas clínicas TB40UL32E-GFP y VR1814 de CMV tanto en células epiteliales ARPE-19 (Figura 8A) como en células de fibroblasto MRC-5 (Figura 8B) en ausencia del complemento de cobaya en un ensayo de neutralización IE-1.
La Figura 9 es una gráfica que muestra que los anticuerpos neutralizantes producidos contra gH FL/gL son independientes del complemento y similares a la inmunidad natural en título. Los ratones se inmunizaron con VRP gB FL o gH FL/gL a 1x106 IU, 3 veces, con 3 semanas de separación antes del sangrado terminal. Los sueros se analizaron para su capacidad para neutralizar la infección de CMV TB40UL32E-EGFP de células ARPE-19 en presencia y ausencia de complemento de cobaya en un ensayo de neutralización. A diferencia de los anticuerpos producidos por gB, los anticuerpos producidos por gH FL/gL son independientes del complemento. Adicionalmente, los anticuerpos gH FL/gL en estos ratones vacunados fueron similares en concentración a aquellos encontrados en sujetos humanos naturalmente infectados.
La Figura 10 muestra un mapa de plásmidos para gH-SGPgL-SGPgO modificado con pVCR.
La Figura 11 muestra un mapa de plásmidos para gH-SGPgL modificado con pVCR.
La Figura 12 muestra un mapa de plásmidos para gH sol-SGPgL modificado con pVCR.
La Figura 13 muestra un mapa de plásmidos para gH sol-SGPgL-SGPgO modificado con pVCR.
Las Figuras 14A-14G muestran la secuencia de nucleótidos del plásmido que codifica la molécula de ARN de auto-replicación A160 que codifica la glucoproteína H (gH) de superficie de CMV y la glucoproteína L (gL) de superficie de CMV. Las secuencias de nucleótidos que codifican gH y gL están subrayadas.
Las Figuras 15A-15H muestran la secuencia de nucleótidos del plásmido que codifica la molécula de ARN de auto-replicación A322 que codifica las formas solubles de la glucoproteína H (gHsol) de superficie de CMV y la glucoproteína L (gL) de superficie de CMV. Las secuencias de nucleótidos que codifican gHsol y gL están subrayadas.
Las Figuras 16A-16H muestran la secuencia de nucleótidos del plásmido que codifica la molécula de ARN de auto-replicación A323 que codifica la glucoproteína B (gB) de superficie de CMV. La secuencia de nucleótidos que codifica gB está subrayada.
Las Figuras 17A y 17B son histogramas que muestran títulos del 50 % de neutralización de sueros de ratones que se inmunizaron con VRP o ARN de auto-replicación. La Figura 17A muestra títulos del 50 % de neutralización contra la cepa de CMV humana TB40UL32E-EGFP (“TB40”) en células ARPE-19 y la Figura 17B muestra títulos del 50 % de neutralización contra la cepa CMV humana 8819 en células ARPE-19.
La Figura 18 es un esquema de replicones de ARN pentacistrónicos, A526, A527, A554, A555 y A556, que codifican cinco proteínas de CMV. Los promotores subgenómicos se muestran con flechas, otros elementos de control están marcados.
La Figura 19 es un histograma de fluorescencia que muestra las células BHKV transfectadas con el replicón de ARN A527 que expresa el complejo pentamérico gH/gL/UL128/UL130/UL131. La tinción de la célula se realizó usando anticuerpos que se unen a un epítopo conformacional presente en el complejo pentamérico (Macagno (2010) J. Virol. 84(2):1005-13).
La Figura 20 es un esquema y una gráfica. El esquema muestra los replicones de ARN bicistrónicos, A160 y A531-A537, que codifican gH y gL de CMV. La gráfica muestra la actividad neutralizante del suero inmune de ratones inmunizados con VRP que contenían los replicones.
La Figura 21 es una gráfica que muestra la respuesta de anticuerpo de la proteína anti-VVZ en el suero inmune de ratones inmunizados con replicones de ARN monocistrónicos que codifican proteínas VVZ o replicones de ARN bicistrónicos que codifican gE y gl, o gH y gL VVZ. Los ratones se inmunizaron con 7 |jg de ARN formulado con un CNE (véase el Ejemplo 7).
La Figura 22 es una gráfica que muestra la respuesta del anticuerpo a la proteína anti-VVZ en suero inmune de ratones inmunizados con replicones de ARN monocistrónicos que codifican las proteínas VVZ o replicones de ARN bicistrónicos que codifican gE y gl, o gH y gL VVZ. Los ratones se inmunizaron con 1 jg de ARN formulado con un CNE (véase el Ejemplo 7).
Descripción detallada
La invención es como se define en las reivindicaciones.
La divulgación proporciona plataformas para co-suministrar proteínas de virus del herpes, tales como proteínas de citomegalovirus (CMV), a células, particularmente proteínas que forman complejos in vivo. En algunas realizaciones, estas proteínas y los complejos que forman producen anticuerpos neutralizantes potentes. La respuesta inmune producida por el co-suministro de virus del herpes (por ejemplo, CMV), particularmente aquellas que forman complejos in vivo (por ejemplo, gH/gL), puede ser superior a la respuesta inmune producida usando otros enfoques. Por ejemplo, una molécula de ARN (por ejemplo, un replicón) que codifica tanto gH como gL de CMV pueden inducir mejores concentraciones neutralizantes y/o inmunidad protectora en comparación con una molécula de ARN que codifica gB y una molécula de ARN que codifica gH, una molécula de ARN que codifica gL, o incluso una mezcla de moléculas de ARN que individualmente codifican gH o gL. Además, un replicón que codifica gH/gL/UL128/UL130/UL131 puede proporcionar respuestas superiores a las que codifican solamente gH/gL.
En un aspecto general, la divulgación se refiere a plataformas para suministrar dos o más proteínas de virus del herpes (por ejemplo, CMV) a células. Las plataformas comprenden moléculas de ácidos nucleicos policistrónicas recombinantes que contienen una primera secuencia que codifica una primera proteína de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o un fragmento de la misma, y una segunda secuencia que codifica una segunda proteína virus del herpes (por ejemplo, CMV) o un fragmento de la misma. Si se desea, una o más secuencias adicionales que codifican proteínas adicionales, por ejemplo, una tercera proteína de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o un fragmento de la misma, una cuarta proteína de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o un fragmento de la misma, una quinta proteína de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o un fragmento de la misma, etc., pueden estar presentes en la molécula de ácido nucleico policistrónico recombinante. Las secuencias que codifican proteínas de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o fragmentos de las mismas están operativamente enlazadas a uno o más elementos de control adecuados de tal forma que las proteínas de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o fragmentos de las mismas se producen a través de una células que contiene el ácido nucleico policistrónico recombinante. En los ácidos nucleicos policistrónicos descritos en el presente documento, la primera y segunda proteínas de virus del herpes codificadas o fragmentos, y una tercera, cuarta, y quinta proteínas de virus del herpes codificadas o fragmentos, si están presentes, general y preferentemente son del mismo virus de herpes. En ciertos ejemplos, todas las proteínas de virus del herpes o fragmentos codificados por un vector policistrónico son proteínas de c Mv o proteínas de VVZ.
Las moléculas de ácido nucleico policistrónicas recombinantes descritas en el presente documento proporcionan la ventaja de suministrar secuencias que codifican dos o más proteínas de virus del herpes (por ejemplo, CMV) a una célula, y dirigen la expresión de las proteínas de virus del herpes (por ejemplo, CMV) a niveles suficientes para dar como resultado la formación de un complejo proteico que contiene las dos o más proteínas de virus del herpes (por ejemplo, CMV) in vivo. Usando este enfoque, las dos o más proteínas del virus del herpes (por ejemplo, c Mv ) codificadas pueden expresarse a suficientes niveles intracelulares para la formación de los complejos proteicos (por ejemplo, gH/gL) del virus del herpes (por ejemplo, CMV). Por ejemplo, las proteínas de virus del herpes codificadas (por ejemplo, CMV) o fragmentos de las mismas pueden expresarse sustancialmente al mismo nivel, o si se desea, a diferentes niveles mediante la selección de secuencias de control de expresión apropiadas (por ejemplo, promotores, IRES, sitio 2A, etc.). Esta es una forma significativamente más eficiente para producir complejos proteicos in vivo que a través del co-suministro de dos o más moléculas de ADN individuales que codifican diferentes virus del herpes (por ejemplo, CMV) en la misma célula, que puede ser ineficiente y altamente variable. Véase, por ejemplo, el documento WO 2004/076645.
La molécula de ácido nucleico policistrónica recombinante puede estar basada en cualquier ácido nucleico deseado tales como ADN (por ejemplo, ADN plasmídico o vírico) o ARN. Cualquier ADN o a Rn adecuado puede usarse como el vector de ácido nucleico que lleva los marcos de lectura abiertos que codifican las proteínas de virus del herpes (por ejemplo, CMV) o fragmentos de las mismas. Los vectores de ácido nucleico adecuados tienen la capacidad de llevar y dirigir la expresión de más de un gen de proteína. Tales vectores de ácido nucleico se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, plásmidos, ADN obtenido de virus de ADN tales como los vectores de virus de vacuna (por ejemplo, NYVAC, véase el documento US 5.494.807) y vectores de virus de viruela (por ejemplo, vector de viruela de canario ALVAC, Sanofi Pasteur) y ARN obtenido de virus de ARN adecuados tales como un alfavirus. Si se desea, la molécula de ácido nucleico policistrónica recombinante puede modificarse, por ejemplo, contener nucleobases modificadas y/o enlaces como se describe adicionalmente en el presente documento. Preferentemente, la molécula de ácido nucleico policistrónica es una molécula de ARN.
En algunos aspectos, la molécula de ácido nucleico policistrónica recombinante es una molécula de ADN tal como ADN de plásmido. Tales moléculas de ADN pueden, por ejemplo, codificar un replicón policistrónico y contener un promotor de mamífero que dirige la transcripción del replicón. Las moléculas de ácido nucleico policistrónicas recombinantes o de este tipo pueden administrarse a un mamífero y después transcribirse in situ para producir el replicón policistrónico que expresa las proteínas del virus del herpes.
En algunos aspectos, la divulgación es una molécula de ácido nucleico policistrónica que contiene una secuencia que codifica una gH del virus del herpes o un fragmento de la misma y una gL de virus del herpes o un fragmento de la misma. Las proteínas gH y gL, o fragmentos de las mismas, pueden ser de cualquier virus del herpes deseado tales como VHS-1, VHS-2, VVZ, VEB de tipo 1, VEB de tipo 2, CMV, VHH-6 de tipo A, VHH-6 de tipo B, VHH-7, VHSK, y similares. Preferentemente, el virus del herpes es VVZ, VHS-2, VHS-1, v Eb (tipo 1 o tipo 2) o CMV. Más preferentemente, el virus del herpes es VVZ, VHS-2 o CMV. Incluso más preferentemente, el virus del herpes es CMV. Las secuencias de las proteínas gH y gL y de los ácidos nucleicos que codifican las proteínas de virus del herpes son bien conocidas en la técnica. Las secuencias ejemplares se identifican en la Tabla 1. La molécula de ácido nucleico policistrónica puede contener una primera secuencia de codificación de una proteína gH desvelada en la Tabla 1, o un fragmento de la misma, o una secuencia que es al menos aproximadamente un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, o un 99 % idéntica a la misma. La molécula de ácido nucleico policistrónica también puede contener una segunda secuencia que codifica una proteína gL desvelada en la Tabla 1, o un fragmento de la misma, o una secuencia que es al menos aproximadamente un 90 %, un 91 %, un 92 %, un 93 %, un 94 %, un 95 %, un 96 %, un 97 %, un 98 %, o un 99 % idénticas a la misma.
Figure imgf000008_0001
En esta descripción de la divulgación, para facilitar una clara descripción de los ácidos nucleicos, los componentes de secuencias particulares se denominan una “primera secuencia”, una “segunda secuencia”, etc. Ha de entenderse que la primera y la segunda secuencias pueden aparecer en cualquier orden y orientación deseados, y no se pretende ningún orden u orientación particular por las palabras “primero”, “segundo”, etc. De forma similar, los complejos proteicos se denominan a través del listado de las proteínas que están presentes en los complejos, por ejemplo, gH/gL. Esto pretende describir el complejo a través de las proteínas que están presentes en el complejo y no indican cantidades relativas de las proteínas y el orden u orientación de las secuencias que codifican las proteínas en un ácido nucleico recombinante.
Ciertas realizaciones preferidas, tales como VRP de alfavirus y ARN de auto-replicación que contiene secuencias que codifican proteínas de CMV, se describen adicionalmente en el presente documento. Se pretende que las secuencias que codifican proteínas de CMV en tales realizaciones preferidas, puedan reemplazarse con secuencias que codifican proteínas, tales como gH y gL de otros virus del herpes.
Plataformas de VRP de Alfavirus
En algunas realizaciones, las proteínas de CMV se suministran a una célula usando partículas de replicón de alfavirus (VRP) que emplean replicones policistrónicos (o vectores) como se describe más adelante. Como se usa en el presente documento, “policistrónico” incluye vectores bicistrónicos así como vectores que comprenden tres o más cistrones. Los cistrones en un vector policistrónico pueden codificar proteínas de CMV de las mismas cepas de CMV o diferentes cepas de CMV. Los cistrones pueden orientarse en cualquier orden 5' - 3'. Cualquier secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de CMV puede usarse para producir la proteína. Las secuencias ejemplares útiles para preparar los ácidos nucleicos policistrónicos que codifican dos o más proteínas de CMV o fragmentos de las mismas se describen en el presente documento.
Como se usa en el presente documento, el término “alfavirus” tiene su significado convencional en la técnica e incluye diversas especies tales como el virus de encefalitis equina venezolana (VEEV; por ejemplo, burro Trinidad, TC83CR, etc.), el Virus del bosque Semliki (SFV), el virus Sindbis, el virus del Río Ross, el virus de encefalitis equina del Oeste, el virus de encefalitis equina del Este, el virus Chikungunya, el virus S.A. AR86, el virus Everglades, el virus Mucambo, el virus del bosque Barmah, el virus Middelburg, el virus Pixuna, el virus O'nyong-nyong, el virus Getah, el virus Sagiyama, el virus Bebaru, el virus Mayaro, el virus Una, el virus Aura, el virus Whataroa, el virus Banbanki, el virus Kyzylagach, el virus Highlands J, el virus Fort Morgan, el virus Ndumu y el virus Buggy Creek. El término alfavirus también puede incluir alfavirus quiméricos (por ejemplo, como se describe por Perri y col., (2003) J. Virol. 77(19):10394-403) que contiene secuencias genómicas de más de un alfavirus.
Una “partícula de replicón de alfavirus” (VRP) o “partícula de replicón” es un replicón de alfavirus empaquetado con proteínas estructurales de alfavirus.
Un “replicón de alfavirus” (o “replicón”) es una molécula de ARN que puede dirigir su propia amplificación in vivo en una célula diana. El replicón codifica la polimerasa o polimerasas que catalizan la amplificación de ARN (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4) y contiene secuencias de ARN cis requeridas para la replicación cuando se reconocen y se utilizan por la polimerasa o polimerasas codificadas. Un replicón de alfavirus contiene típicamente los siguientes elementos ordenados: secuencias víricas 5' requeridas en cis para la replicación, secuencias que codifican proteínas no estructurales de alfavirus biológicamente activas (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4), secuencias víricas 3' requeridas en cis para la replicación, y un tracto de poliadenilato. Un replicón de alfavirus también puede contener uno o más promotores de “región de unión” subgenómicos víricos que dirigen la expresión de las secuencias de nucleótidos heterólogas, que pueden, en ciertas realizaciones, modificarse con el fin de aumentar o reducir la transfección vírica del fragmento subgenómico y de la secuencia o secuencias heterólogas a expresarse. Pueden usarse otros elementos de control, como se describe más adelante.
Los replicones de alfavirus que codifican proteínas de CMV se usan para producir VRP. Tales replicones de alfavirus comprenden secuencias que codifican al menos dos proteínas de CMV o fragmentos de las mismas. Estas secuencias están operativamente enlazadas a uno o más elementos de control, tales como un promotor subgenómico, un IREs (por ejemplo, EMCV, EV71), y un sitio 2A vírico, que pueden ser el mismo o diferentes. El suministro de componentes de estos complejos usando los vectores policistrónicos descritos en el presente documento es una forma eficiente de proporcionar secuencias de ácido nucleico que codifican dos o más proteínas de CMV en cantidades relativas deseadas; mientras que si se usan múltiples montajes alfavirus para suministrar proteínas de CMV individuales para la formación del complejo, se requeriría el co-suministro eficiente de la VRP. Cualquier combinación de elementos de control adecuados puede usarse en cualquier orden. En un ejemplo, un promotor subgenómico individual está operativamente enlazado a dos secuencias que codifican dos proteínas de CMV diferentes, y un IRES se coloca entre las dos secuencias codificantes. En otro ejemplo, dos secuencias que codifican dos proteínas diferentes de CMV están operativamente enlazadas a promotores separados. En aún otro ejemplo, las dos secuencias que codifican dos proteínas diferentes de CMV están operativamente enlazadas a un solo promotor. Las dos secuencias que codifican dos diferentes proteínas de CMV se enlazan entre sí a través de una secuencia de nucleótidos que codifica un sitio 2A vírico, y de esta forman codifican una sola cadena de aminoácidos que contiene las secuencias de aminoácido de ambas proteínas de CMV. El sitio 2A vírico en este contexto se usa para generar dos proteínas de CMV a partir de la poliproteína codificada.
Promotores subgenómicos
Los promotores subgenómicos, también conocidos como promotores de región de unión pueden usarse para regular la expresión proteica. Los promotores genómicos alfavíricos regulan la expresión de las proteínas estructurales alfavíricas. Véase Strauss y Strauss, “The alphaviruses: gene expression, replication, and evolution”, Microbiol Rev. Sep de 1994; 58(3):491-562. Un polinucleótido policistrónico puede comprender un promotor subgenómico de cualquier alfavirus. Cuando están presentes dos o más promotores subgenómicos en un polinucleótido policistrónico, los promotores pueden ser iguales o diferentes. Por ejemplo, el promotor subgenómico puede tener la secuencia CTCTCTACGGCTAACCTGAATGGA. En ciertas realizaciones, los promotores subgenómicos pueden modificarse con el fin de aumentar o reducir la transcripción vírica de las proteínas. Véase la Patente de EE.UU. N.° 6.592.874.
Sitio de entrada ribosómica interna (IRES)
En algunas realizaciones, uno o más elementos de control es un sitio de entrada ribosómica interna (IRES). Un IRES permite que se produzcan múltiples proteínas en un solo transcrito de ARNm como ribosomas que se unen a cada IRES e inician la traducción en la ausencia de una caperuza 5', que normalmente se requiere para iniciar la traducción de la proteína en células eucariotas. Por ejemplo, el IRES puede ser EV71 o EMCV.
Sitio 2A vírico
La proteína FMDV 2A es un péptido corto que sirve para separar las proteínas estructurales de FMDV de una proteína no estructural (FMDV 2B). El trabajo anterior sobre este péptido sugirió que actúa como una proteasa catalítica pero otros trabajos (por ejemplo, Donnelly y col., (2001), J.Gen.Virol. 82, 1013-1025) sugiere que esta corta secuencia y el siguiente aminoácido individual de FMDV 2B (Gly) actúan como la detención-inicio de la traducción. Independientemente del modo de acción preciso, la secuencia puede insertarse entre dos polipéptidos, y efectúa la producción de múltiples polipéptidos individuales de un solo marco de lectura abierto. En el contexto de esta divulgación, las secuencias FMDV 2A puede insertarse entre las secuencias que codifican al menos dos proteínas de CMV, permitiendo su síntesis como parte de un solo marco de lectura abierto. Por ejemplo, el marco de lectura abierto puede codificar una proteína gH y una proteína gL separadas por una secuencia que codifica un sitio 2A vírico. Un solo ARNm se transcribe entonces, durante la etapa de traducción, los péptidos gH y gL se producen de manera separada debido a la actividad del sitio 2A vírico. Cualquier secuencia vírica 2A adecuada puede usarse. Por lo general, un sitio 2A vírico comprende la secuencia consenso Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro, en donde X es cualquier aminoácido (). Por ejemplo, la secuencia del péptido de la Enfermedad de Boca-Manos-Pies del Virus 2A es DVESNPGP (). Véase Trichas y col., “Use of the viral 2A peptide for bicistronic expression in transgenic mice”, BMC Biol. 15 Sep 2008; 6:40, y Halpin y col., “Self-processing 2A-polyproteins--a system for co-ordinate expression of multiple proteins in transgenic plants”, Plant J. Feb 1999; 17(4):453-9.
En algunas realizaciones un replicón de alfavirus es un replicón quimérico, tal como el replicón quimérico VEESindbis (VCR) o un replicón TC83 de la cepa VEE (TC83R) o un replicón quimérico TC83-Sindbis (TC83CR). En algunas realizaciones un VCR contiene la señal de empaquetado y UTR 3' de un replicón Sindbis en lugar de las secuencias en nsP3 y en el extremo 3' del replicón VEE; véase Perri y col., J. Virol. 77, 10394-403, 2003. En algunas realizaciones, un TC83CR contiene la señal de empaquetado UTR 3' de un replicón Sindbis en lugar de las secuencias del nsP3 y el extremo 3' de un replicón TC83 de la cepa VEE.
Producción de VRP
Los procedimientos para preparar VRP son bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones se ensambla un alfavirus en una VRP usando una célula de empaquetado. Una “célula de empaquetado de alfavirus” (o “célula de empaquetado”) es una célula que contiene uno o más casetes de expresión proteicos estructurales de alfavirus y que produce partículas de alfavirus recombinantes después de la introducción de un replicón de alfavirus, el sistema de iniciación de vector estratificado eucariota (por ejemplo, Patente de EE.UU. 5.814.482), o la partícula de alfavirus recombinante. El uno o más casetes proteicos estructurales de alfavirus diferentes sirven como “auxiliares” proporcionando las proteínas estructurales de alfavirus. Un “casete proteico estructural de alfavirus” es un casete se expresión que codifica una o más proteínas estructurales de alfavirus y comprende al menos una y hasta cinco copias (es decir, 1, 2, 3, 4, o 5) de una secuencia de reconocimiento de replicasa de alfavirus. Los casetes de expresión de proteínas estructurales típicamente comprenden, de 5' a 3', una secuencia 5' que inicia la transcripción del ARN del alfavirus, un promotor de la región subgenómica de alfavirus opcional, una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína estructural de alfavirus, una región sin traducir 3' (que también dirige la transcripción de ArN), y un tracto poliA. Véase, por ejemplo, el documento WO 2010/019437.
En realizaciones preferidas se usan dos diferentes casetes proteicos estructurales de alfavirus (auxiliares defectuosos “de corte y empalme”) en una célula de empaquetado para minimizar los eventos de recombinación que podrían producir un virus competente de replicación. En algunas realizaciones un casete proteico estructural de alfavirus codifica la proteína cápside (C) pero ninguna de las glucoproteínas E2 y E1). En algunas realizaciones un casete proteico estructural de alfavirus codifica la proteína cápside y cualquiera de las glucoproteínas E1 o E2 (pero no ambas). En algunas realizaciones un casete proteico estructural de alfavirus codifica las glucoproteínas E2 y E1 pero no la proteína cápside. En algunas realizaciones el casete proteico estructural de alfavirus codifica la glucoproteína E1 o E2 (pero no ambas), y no la proteína cápside.
En algunas realizaciones, las VRP se producen a través de la introducción simultánea de replicones y ARN auxiliares en células de varias fuentes. Bajo estas condiciones, por ejemplo, las células BHKV (1x107) se electroporan a, por ejemplo, 220 voltios, 1000 jF, 2 pulsos manualmente con 10 |jg de ARN de replicón: 6 |jg de ARN Cap auxiliar defectuoso: 10 jg de ARN Gly auxiliar defectuoso, el sobrenadante que contiene el alfavirus se recolecta aproximadamente 24 horas después. Los replicones y/o auxiliares también pueden introducirse en formas ADN que producen ARN adecuados dentro de las células transfectadas.
Una célula de empaquetado puede ser una célula de mamífero o una célula distinta de mamífero, tal como un insecto (por ejemplo, SF9) o una célula aviar (por ejemplo, fibroblasto o línea celular de fibroblasto de pollo o pato primario). Véase la Patente de EE.UU. 7.445.924. Las fuentes aviares de células incluyen, pero no se limitan a, células madre embrionarias aviares tales como EB66® (VIVALIS); células de pollo, incluyendo células madre embrionarias de pollo tales como células EBx®, fibroblastos embrionarios de pollo, y células germinales embrionarias de pollo; células de pato tales como AGE1.CR y líneas celulares AGE1.CR.plX (ProBioGen) que se describen, por ejemplo, en Vaccine 27:4975-4982 (2009) y WO2005/042728); y células de ganso. En algunas realizaciones, una célula de empaquetado es un fibroblasto de pato primario o una línea celular retinal de pato, tal como AGE.CR (PROBIOGEN).
Las fuentes de mamífero de las células para la introducción de ácido nucleico simultáneo y/o células de empaquetado incluyen, pero no se limitan a, células de primate humano o no humano, incluyendo células PerC6 (PER.C6) (CRUCeLl N.V.), que se describen, por ejemplo, en WO 01/38362 y WO 02/40665, así como depositadas bajo el número de depósito ECACC 96022940); MrC-5 (ATCC CCL-171); WI-38 (ATCC CCL-75); células de pulmón de rhesus fetal (ATCC CL-160); células de riñón embrionario humano (por ejemplo, células 293, típicamente transformadas por ADN de tipo 5 de adenovirus cortado; células VERO de riñones de mono); células de caballo, vacas (por ejemplo, células MdBK), oveja, perro (por ejemplo, células MDCK de riñones de perro, ATCC CCL34 MDCK (NBL2) o MDCK 33016, número de depósito DSM ACC 2219 como se describe en wO 97/37001); gato, y roedor (por ejemplo, células de hámster tales como células BHK21-F, HKCC, o células de ovario de hámster Chino (CHO)), y pueden obtenerse una amplia diversidad de fases de desarrollo, incluyendo por ejemplo, adulto, neonatal, fetal y embrionario.
En algunas realizaciones una célula de empaquetado se transforma establemente con uno o más casete o casetes de expresión proteicos estructurales. Los casetes de expresión proteicos estructurales pueden introducirse en las células usando técnicas de ADN recombinante convencionales, incluyendo transferencias de ADN medidas por policatión de transferrina, la transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados, fusión celular mediada por liposoma, transportación intracelular de perlas de látex recubiertas con ADN, fusión de protoplasto, infección vírica, electroporación, procedimientos de “pistola génica” y DEAE o transfección mediada por fosfato de calcio. Los casetes de expresión de proteína estructural físicamente se introducen en una célula hospedadora como moléculas de ADN, pero también pueden introducirse como ADN transcrito in vitro. Cada casete de expresión puede introducirse de manera separada o sustancialmente de forma simultánea.
En algunas realizaciones, las líneas células de empaquetado de alfavirus estables se usan para producir partículas de alfavirus recombinantes. Existen células permisibles alfavirus que comprenden casetes de ADN que expresan un ARN auxiliar defectuoso establemente integrado en sus genomas. Véase, Polo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 4598-603, 1999. Los ARN auxiliares se expresan constitutivamente pero las proteínas estructuradas de alfavirus no, debido a que los genes están bajo el control de un promotor subgenómico de alfavirus (Polo y col., 1999). Después de la introducción de un replicón de alfavirus en el genoma de unas células de empaquetado por transfección o infección VRP, se producen las enzimas replicasa y se activa la expresión de la cápside y los genes de glucoproteínas en los ARN auxiliares, y se producen las VRP de salida. La introducción del replicón puede obtenerse a través de una variedad de procedimientos, incluyendo tanto transfección como infección con reservas definidas de partículas de replicón de alfavirus. Esta célula empaquetado después se incuba bajo condiciones y durante un tiempo suficiente para producir partículas de replicón de alfavirus empacadas en el sobrenadante del cultivo.
De esta forma, las células de empaquetado permiten que las VRP actúen como virus de auto-propagación. Esta tecnología permite que las VRP sean producidas en su mayor parte en la misma forma, y usando el mismo equipo, como se usa para vacunas atenuadas vivas y otros vectores víricos que tienen líneas celulares productoras disponibles, tales como vectores de adenovirus incompetentes de replicación cultivados en células que expresan los genes E1A y E1B de adenovirus.
En algunas realizaciones, se usa un proceso de dos etapas; la primera etapa comprende producir una reserva de semillas de partículas de replicón de alfavirus mediante la transfección de una célula de empaquetado con un ARN de replicón o un replicón a base de ADN de plásmido. Una reserva mucho mayor de partículas de replicón después se produce en una segunda etapa, mediante la infección de un cultivo fresco de células de empaquetado con la reserva de semillas. Esta infección puede llevarse a cabo usando varias multiplicidades de la infección (MOI, por sus siglas en inglés), incluyendo MOI=0,00001, 0,00005, 0,0001, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 3, 5, 10 o 20. En algunas realizaciones la infección se lleva a cabo a un MOI bajo (por ejemplo, menor de 1). Con el tiempo, las partículas de replicón pueden cosecharse de las células de empaquetado infectadas con la reserva de semillas. En algunas realizaciones, las partículas de replicón después pueden hacerse pasar en cultivos aún más grandes de células de empaquetado sin experiencia mediante la infección de baja multiplicidad repetida, dando como resultado preparaciones a escala comercial con el mismo título alto.
Plataformas de ARN de Auto-Replicación
Pueden producirse dos o más proteínas de CMV a través de la expresión de ácidos nucleicos recombinantes que codifican las proteínas en las células de un sujeto. Preferentemente, las moléculas de ácido nucleico recombinantes codifican dos o más proteínas de CMV, por ejemplo, son policistrónicas. Como se define anteriormente, “policistrónico” incluye bicistrónico. Los ácidos nucleicos preferidos que pueden administrarse a un sujeto para causar la producción de proteínas de CMV son moléculas de ARN de auto-replicación. Las moléculas de ARN de auto-replicación de la invención se basan en ARN genómico del virus de a Rn , pero carecen de los genes que codifican una o más proteínas estructurales. Las moléculas de ARN de auto-replicación son capaces de ser traducidas para producir proteínas no estructurales del virus de ARN y proteínas de CMV codificadas por el ARN de auto-replicación.
El ARN de auto-replicación generalmente contiene al menos uno o más genes seleccionados del grupo que consiste en replicasa vírica, proteasas víricas, helicasas víricas y otras proteínas víricas no estructurales, y también comprende secuencias de replicación activas cis de extremo 5' y 3', y una secuencia heteróloga que codifica dos o más proteínas de CMV deseadas. Un promotor subgenómico que dirige la expresión de la secuencia o secuencias heterólogas puede incluirse en el ARN de auto-replicación. Si se desea, una secuencia heteróloga puede fusionarse en la estructura en otras regiones de codificación en el ARN de auto-replicación y/o puede estar bajo el control de un sitio de entrada de ribosoma interno (IRES, por sus siglas en inglés).
Las moléculas de ARN de auto-replicación de la invención pueden diseñarse de tal forma que la molécula de ARN de auto-replicación no puede inducir la producción de partículas víricas infecciosas. Esto puede lograrse, por ejemplo, omitiendo uno o más genes víricos que codifican proteínas estructurales que son necesarias para la producción de partículas víricas en el ARN de auto-replicación. Por ejemplo, cuando la molécula de ARN de autoreplicación se basa en un virus alfa, tal como un virus Sindbis (SIN, por sus siglas en inglés), un virus del bosque Semliki y un virus de encefalitis equina Venezolano (VEE, por sus siglas en inglés), uno o más genes que codifican proteínas estructurales víricas, tales como cápside y/o glucoproteínas de envuelta, pueden omitirse. Si se desea, las moléculas de ARN de auto-replicación de la invención pueden diseñarse para inducir la producción de partículas víricas infecciosas que están atenuadas o virulentas o para producir partículas víricas que son capaces de una sola ronda de la posterior infección.
Una molécula de ARN de auto-replicación, cuando se suministra a una célula de vertebrado aún sin ninguna proteína, puede conducir a la producción de múltiples ARN hijos a través de la transcripción de sí mismo (o de una copia antisentido de sí mismo). El ARN de auto-replicación puede traducirse directamente después del suministro en la célula, y esta traducción proporciona una polimerasa de ARN dependiente de ARN, que después produce transcritos del ARN suministrado. De esta forma, el ARN suministrado conduce a la producción de múltiples ARN hijos. Estos transcritos son antisentido con relación al ARN suministrado y pueden traducirse a sí mismos para proporcionar la expresión in situ de la proteína de CMV, o pueden transcribirse para proporcionar transcritos adicionales con el mismo sentido como el ARN suministrado que se traduce para proporcionar la expresión in situ de la proteína o proteínas de CMV codificadas.
Un sistema adecuado para lograr la auto-replicación es usar un replicón de ARN a base de alfavirus, tal como un replicón de alfavirus como se describe en el presente documento. Estos replicones de estructura de cadena se traducen después del suministro en la células para producir una replicasa (o replicasa-transcriptasa). La replicasa se traduce como una poliproteína que se auto-escinde para proporcionar un complejo de replicación que crea copias de estructura de cadena - genómica de ARN suministrado de estructura de cadena . Estos transcritos de estructura de cadena - por sí mismos pueden transcribirse para dar copias adicionales del ARN progenitor de estructura de cadena y también para dar a uno o más transcritos sub-genómicos que codifican dos o más proteínas de CMV. La traducción del transcrito subgenómico de esta forma conduce a la expresión in situ de la proteína o proteínas de CMV a través de la célula infectada. Los replicones alfavirus adecuados pueden usar una replicasa de un virus Sindbis, un virus del bosque Semliki, un virus de encefalitis equina del este, un virus de encefalitis equina de Venezuela, etc.
Una molécula de ARN de auto-replicación preferida de esta forma codifica (i) una polimerasa de ARN dependiente de ARN que puede transcribir ARN de la molécula de ARN de auto-replicación y (ii) dos o más proteínas de CMV o fragmentos de las mismas. La polimerasa puede ser una replicasa de alfavirus, por ejemplo, que comprende la proteína nsP4 de alfavirus. La proteína nsP4 es el componente catalítico clave de la replicasa.
Mientras los genomas de alfavirus naturales codifican proteínas de virión estructurales además de la poliproteína de replicasa no estructural, se prefiere que una molécula de ARN de auto-replicación a base de alfavirus de la divulgación no codifique todas las proteínas estructurales de alfavirus. De esta forma el ARN de auto-replicación puede dar lugar a la producción de copias de ADN genómicas de sí misma en una célula, pero no la producción de viriones de alfavirus que contienen ARN. La incapacidad de producir estos viriones significa que, a diferencia del alfavirus de tipo silvestre, la molécula de ARN de auto-replicación no puede perpetuarse a sí misma en la forma infecciosa. Las proteínas estructurales de alfavirus que son necesarias para la perpetuación en virus de tipo silvestre están ausentes de los ARN de auto-replicación de la divulgación y su lugar se toma por el gen o genes que codifican en el producto génico deseado (proteína de CMV o un fragmento de la misma), de tal manera que el transcrito subgenómico codifica el producto génico deseado en lugar de las proteínas de virión alfavirus estructurales.
De esta forma una molécula de ARN de auto-replicación útil con la divulgación tiene dos secuencias que codifican diferentes proteínas de CMV o fragmentos de las mismas. Las secuencias que codifican las proteínas de CMV o fragmentos pueden estar en cualquier orientación deseada, y pueden estar operativamente enlazadas al mismo o separados promotores. Si se desea, las secuencias que codifican las proteínas de CMV o fragmentos pueden ser parte de un solo marco de lectura abierto. En algunas realizaciones el ARN puede tener una o más secuencias adicionales (aguas abajo) o marcos de lectura abiertos, por ejemplo que codifican otras proteínas de CMV adicionales o fragmentos de las mismas. La molécula de ARN de auto-replicación puede tener una secuencia 5' que es compatible con la replicasa codificada.
En un aspecto, la molécula de ARN de auto-replicación deriva de o se basa en un alfavirus, tales como un replicón de alfavirus como se define en el presente documento. En otros aspectos, la molécula de ARN de auto-replicación deriva de o se basa en un virus diferente de un alfavirus, preferentemente, un virus de ARN de estructura de cadena positiva, y más preferentemente un picornavirus, flavivirus, rubivirus, pestivirus, hepacivirus, calicivirus, o coronavirus. Las secuencias de alfavirus de tipo silvestre adecuadas son bien conocidas y están disponibles de los depósitos de secuencias, tal como la Colección de Cultivo de Tipo Americano, Rockville, Md. Los ejemplos representativos de alfavirus adecuados incluyen Aura (ATCC VR-368), el virus de Bebaru (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), Cabassou (ATCC VR-922), el virus Chikungunya (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), el virus de encefalomielitis equina del Este (ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Fort Morgan (ATCC VR-924), el virus Getah (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Kyzylagach (ATCC VR-927), el virus Mayaro (ATCC VR-66; ATCC VR-1277), Middleburg (ATCC VR-370), el virus Mucambo (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ndumu (ATCC VR-371), el virus Pixuna (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), el virus Ross River (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), del bosque Semliki (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), el virus Sindbis (ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Tonate (ATCC VR-925), Triniti (ATCC VR-469), Una (ATCC VR-374), encefalitis equina de Venezuela (ATCC VR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR-532), encefalomielitis de equino del Oeste (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Whataroa (ATCC VR-926), e Y-62-33 (ATCC VR-375).
Las moléculas de ARN de auto-replicación de la invención pueden contener uno o más nucleótidos modificados y por consiguiente tener estabilidad mejorada y ser resistentes a la degradación y la depuración in vivo, y otras ventajas. Sin desear quedar ligado a teoría alguna particular, se cree que las moléculas de ARN de auto-replicación que contienen nucleótidos modificados evitan o reducen la estimulación de los receptores inmunes endosómicos y citoplasmáticos cuando el ARN de auto-replicación se suministra en una célula. Esto permite que ocurra la autoreplicación, amplificación y expresión de la proteína. Esto también reduce las preocupaciones en cuanto a seguridad con relación al ADN de auto-replicación que no contiene nucleótidos modificados, porque el ARN de auto-replicación que contiene nucleótidos modificados reduce la activación del sistema inmune innato y las posteriores consecuencias indeseadas (por ejemplo, la inflamación en el sitio de inyección, irritación en el sitio de inyección, dolor y similares). También se cree que las moléculas de ARN producidas como un resultado de auto-replicación se reconocen como ácidos nucleicos foráneos a través de los receptores inmunes citoplasmáticos. De esta forma, las moléculas de ARN de auto-replicación que contienen nucleótidos modificados proporcionan la eficiente amplificación de ARN en una célula hospedadora y la expresión de las proteínas de CMV, así como efectos adyuvantes.
La secuencia de ARN puede modificarse con respecto a su uso de codón, por ejemplo, para aumentar la efectividad de la traducción y la vida media del ARN. Una cola poli A (por ejemplo, de aproximadamente 30 restos de adenosina o más) puede acoplarse al extremo 3' del ARN para aumentar su vida media. El extremo 5' del ARN puede taparse con una caperuza con un ribonucleósido modificado por la estructura m7G (5') ppp (5') N (estructura de caperuza 0) o un derivado del mismo, que puede incorporarse durante la síntesis del ADN o puede enzimáticamente modificarse después de la transcripción del ARN (mediante el uso de la enzima de Recubrimiento del Virus de Vacuna (VCE, por sus siglas en inglés) que consiste en trifosfatasa de ARNm, guanilil-transferasa y guanina-7-metitransferasa, que cataliza la construcción de estructuras de caperuza 0 N7-monometiladas). La estructura de caperuza 0 puede proporcionar estabilidad y efectividad en la traducción de la molécula de ARN. La caperuza 5' de la molécula de ARN además puede modificarse por una 2'-O-metiltransferasa que da como resultado la generación de una estructura de caperuza 1 (m7Gppp [m2 '-O] N), que puede además aumentar la eficacia de la traducción. Una estructura de sello 1 también puede aumentar la potencia in vivo.
Como se usa en el presente documento, “nucleótido modificado” se refiere a un nucleótido que contiene una o más modificaciones químicas (por ejemplo, sustituciones) en o sobre la base nitrogenosa del nucleósido (por ejemplo, citosina (C), timina (T) o uracilo (U), adenina (A) o guanina (G)). Si se desea, una molécula de a Rn de autoreplicación puede contener modificaciones químicas en o sobre la fracción de azúcar del nucleósido (por ejemplo, ribosa, desoxirribosa, ribosa modificada, desoxirribosa modificada, análogo de azúcar de seis miembros, o análogo de azúcar de cadena abierta), o el fosfato.
Las molécula de ARN de auto-replicación pueden contener al menos un nucleótido modificado, que preferentemente no es parte de la caperuza 5' (por ejemplo, además de la modificación que es parte de la caperuza 5'). Por consiguiente, la molécula de a Rn de auto-replicación puede contener un nucleótido modificado en una sola posición, puede contener un nucleótido modificado particular (por ejemplo, pseudouridina, N6-metiladenosina, 5-metilcitidina, 5-metiluridina), en dos o más posiciones, o puede contener dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más nucleótidos modificados (por ejemplo, cada uno en una o más posiciones). Preferentemente, las moléculas de ARN de auto-replicación comprenden nucleótidos modificados que contienen una modificación en o sobre la base nitrogenosa, pero no contiene fracciones de azúcar o fosfato modificadas.
En algunos ejemplos, entre el 0,001 % y 99 % o 100 % de los nucleótidos en una molécula de ARN de autoreplicación son nucleótidos modificados. Por ejemplo, 0,001 % - 25 %, 0,01 %-25 %, 0,1 %-25 %, o 1 %-25 % de los nucleótidos en una molécula de ARN de auto-replicación son nucleótidos modificados.
En otros ejemplos, entre 0,001 % y 99 % o 100 % de un nucleótido no modificado particular en una molécula de ARN de auto-replicación está reemplazado con un nucleótido modificado. Por ejemplo, aproximadamente el 1 % de los nucleótidos en la molécula de ARN de auto-replicación que contienen uridina puede modificarse, tal como a través del reemplazo de uridina con pseudouridina. En otros ejemplos, la cantidad deseada (porcentaje) de dos, tres, o cuatro nucleótidos particulares (nucleótidos que contienen uridina citidina, guanosina, o adenina) en una molécula de ARN de auto-replicación son nucleótidos modificados. Por ejemplo, 0,001 % - 25 %, 0,01 %-25 %, 0,1 %-25, o 1 %-25 % de un nucleótido particular en una molécula de ARN de auto-replicación son nucleótidos modificados. En otros ejemplos, 0,001 % - 20 %, 0,001 % - 15 %, 0,001 % - 10 %, 0,01 %-20 %, 0,01 %-15 %, 0,1 %-25, 0,01 %-10 %, 1 %-20 %, 1 %-15 %, 1 %-10 %, o aproximadamente 5 %, aproximadamente 10 %, aproximadamente 15 %, aproximadamente 20 % del nucleótido particular en una molécula de ARN de auto-replicación son nucleótidos modificados.
Se prefiere que menos del 100 % de los nucleótidos en una molécula de ARN de auto-replicación sean nucleótidos modificados. También se prefiere que menos del 10 % de un nucleótido particular en una molécula de ARN de autoreplicación sean nucleótidos modificados. De esta forma, las moléculas de ARN de auto-replicación preferidas comprenden al menos algunos nucleótidos no modificados.
Existen más de 96 modificaciones de nucleótido de existencia natural encontradas en el ARN de mamíferos. Véase, por ejemplo, Limbach y col., Nucleic Acids Research, 22(12):2183-2196 (1994). La preparación de nucleótidos y nucleótidos modificados y nucleósidos es bien conocida en la técnica, por ejemplo, de las Patentes de EE.UU. Números 4373071, 4458066, 4500707, 4668777, 4973679, 5047524, 5132418, 5153319, 5262530, 5700642, y muchos nucleósidos modificados y nucleótidos modificados están disponibles en el mercado.
Las nucleobases modificadas pueden incorporarse en nucleósidos y nucleótidos modificados y pueden estar presentes en las moléculas de ARN que incluyen: m5C (5-metilcitidina), m5U (5-metiluridina), m6A (N6-metiladenosina), s2U (2-tiouridina), Um (2'-O-metiluridina), m1A (1-metiladenosina); m2A (2-metiladenosina); Am (21- 0-metiladenosina); ms2m6A (2-metiltio-N6-metiladenosina); i6A (N6-isopenteniladenosina); ms2i6A (2-metiltio-N6isopenteniladenosina); io6A (N6-(cishidroxiisopentenil) adenosina); ms2io6A (2-metiltio-N6-(cishidroxiisopentenil) adenosina); g6A (N6-glicinilcarbamoiladenosina); t6A (N6-treonil carbamoiladenosina); ms2t6A (2-metiltio-N6-treonil carbamoiladenosina); m6t6A (N6-metil-N6-treonilcarbamoiladenosina); hn6A(N6-hidroxinorvalilcarbamoil adenosina); ms2hn6A (2-metiltio-N6-hidroxinorvalil carbamoiladenosina); Ar(p) (2'-O-ribosiladenosina (fosfato)); I (inosina); m il (1-metilinosina); m'lm (1,2'-Odimetilinosina); m3C (3-metilcitidina); Cm (2T-Ometilcitidina); s2C (2-tiocitidina); ac4C (N4-acetilcitidina); f5C (5-fonnilcitidina); m5Cm (5,2-O5 10 l5 20 25 54 dimetilcitidina); ac4Cm (N4acetil2TOmetilcitidina); k2C (lisidina); m1G (1-metilguanosina); m2G (N2-metilguanosina); m7G (7-metilguanosina); Gm (2'-O-metilguanosina); m22G (N2,N2-dimetilguanosina); m2Gm (N2,2'-O-dimetilguanosina); m22Gm (N2,N2,2'-O-trimetilguanosina); Gr(p) (2'-Oribosilguanosina (fosfato)); iW (wibutosina); o2iW (peroxiwibutosina); OHiW (hidroxiwibutosina); OHiW* (undermodified hidroxiwibutosina); imG (wiosina); mimG (metilguanosina); Q (queuosina); oQ (epoxiqueuosina); galQ (galtactosil-queuosina); manQ (mannosil-queuosina); preQo (7-ciano-7-deazaguanosina); preQi (7-aminometil-7-deazaguanosina); G* (arcaeosina); D (dihidrouridina); m5Um (5,2'-O-dimetiluridina); s4U (4-tiouridina); m5s2U (5-metil-2-tiouridina); s2Um (2-tio-2'-O-metiluridina); acp3U (3-(3-amino-3-carboxipropil)uridina); ho5U (5-hidroxiuridina); mo5U (5-metoxiuridina); cmo5U (ácido uridin 5-oxiacético); mcmo5U (éster metílico de ácido uridin 5-oxiacético); chm5U (5-(carboxihidroximetil)uridina)); mchm5U (5-(carboxihidroximetil)uridina metil éster); mcm5U (5-metoxicarbonil metiluridina); mcm5Um (S-metoxicarbonilmetil-2- O-metiluridina); mcm5s2U (5-metoxicarbonilmetil-2-tiouridina); nm5s2U (5-aminometil-2-tiouridina); mnm5U (5-metilaminometiluridina); mnm5s2U (5-metilaminometil-2-tiouridina); mnm5se2U (5-metilaminometil-2-selenouridina); ncm5U (5-carbamoilmetil uridina); ncm5Um (5-carbamoilmetil5 10 15 20 25 55 2'-O-metiluridina); cmnm5U (5-carboximetilaminometiluridina); cnmm5Um (5-carboximeti1aminometil-2-L-Ometi1uridina); cmnm5s2U (5-carboximetilaminometil-2-tiouridina); m62A (N6,N6-dimetiladenosina); Tm (2'-O-metilinosina); m4C (N4-metilcitidina); m4Cm (N4,2-O-dimetilcitidina); hm5C (5-hidroximetilcitidina); m3U (3-metiluridina); cm5U (5-carboximetiluridina); m6Am (N6,T-O-dimetiladenosina); rn62Am (N6,N6,O-2-trimetiladenosina); m2'7G (N2,7-dimetilguanosina); m2'2'7G (N2,N2,7-trimetilguanosina); m3Um (3,2T-Odimetiluridina); m5D (5-metildihidrouridina); f5Cm (5-formil-2'-O-metilcitidina); m1Gm (1,2'-O-dimetilguanosina); m'Am (1,2-O-dimetil adenosina) irinometiluridina); tm5s2U (Staurinometil-2-tiouridina)); imG-14 (4-demetil guanosina); imG2 (isoguanosina); ac6A (N6-acetiladenosina), hipoxantina, inosina, 8-oxo-adenina, sus derivados 7-sustituidos, dihidrouracilo, pseudouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-aminouracilo, 5-(C1-C6)-alquiluracilo, 5-metiluracilo, 5-(C2-C6)-alqueniluracilo, 5-(C2-C6)-alquiniluracilo, 5-(hidroximetil)uracilo, 5-clorouracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-hidroxicitosina, 5-(C1-C6 )-alquilcitosina, 5-metilcitosina, 5-(C2-C6)-alquenilcitosina, 5-(C2-C6)-alquinilcitosina, 5-clorocitosina, 5-fluorocitosina, 5-bromocitosina, N2-dimetilguanina, 7-deazaguanina, 8-azaguanina, 7-deaza-7-guanina sustituida, 7-deaza-7-(C2-C6)alquinilguanina, 7-deaza-8-guanina sustituida, 8-hidroxiguanina, 6-tioguanina, 8-oxoguanina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,4-diaminopurina, 2,6-diaminopurina, 8-azapurina, 7-deazapurina sustituida, 7-deaza-7-purina sustituida, 7-deaza-8-purina sustituida, hidrógeno (resto abásico), m5C, m5U, m6A, s2U, W, o 2'-O-metil-U. Una cualquiera o cualquier combinación de estas nucleobases modificadas puede incluirse en el ARN de auto-replicación de la invención. Muchas de estas nucleobases modificadas y sus ribonucleósidos correspondientes están disponibles de proveedores comerciales.
Si se desea, la molécula de ARN de auto-replicación puede contener enlaces de fosforoamidato, fosforotioato, y/o metilfosfonato.
Las moléculas de ARN de auto-replicación que comprenden al menos un nucleótido modificado pueden prepararse usando cualquier procedimiento adecuado. Varios procedimientos adecuados son conocidos en la técnica para producir moléculas de ARN que contienen nucleótidos modificados. Por ejemplo, una molécula de ARN de autoreplicación que contiene nucleótidos modificados puede prepararse transcribiendo (por ejemplo, transcripción in vitro) un ADN que codifica la molécula de ARN de auto-replicación usando una polimerasa de ARN dependiente de ADN adecuada, tales como ARN polimerasa del fago T7, ARN polimerasa del fago SP6, ARN polimerasa del fago T3 y similares, o mutantes de estas polimerasas que permiten la incorporación eficiente de los nucleótidos modificados en las moléculas de ARN. La reacción de transcripción contendrá nucleótidos y nucleótidos modificados, y otros componentes que soportan la actividad de la polimerasa seleccionada, tal como tampón adecuado y sales adecuadas. La incorporación de los análogos de nucleótidos en un ARN de auto-replicación puede modificarse, por ejemplo, para alterar la estabilidad de tales moléculas de ARN, para aumentar la resistencia frente a RNasas, para establecer la replicación después de la introducción en células hospedadoras apropiadas (“inefectividad” del ARN), y/o para inducir o reducir las respuestas inmunes innatas o adaptativas.
Los procedimientos sintéticos adecuados pueden usarse solos, o en combinación con uno o más otros procedimientos distintos (por ejemplo, tecnología de ADN o ARN recombinantes) para producir la molécula de ARN de auto-replicación que contiene uno o más nucleótidos modificados. Los procedimientos adecuados para la síntesis de novo son bien conocidos en la técnica y pueden adaptarse para aplicaciones particulares. Los procedimientos ejemplares incluyen, por ejemplo, síntesis química usando grupos protectores adecuados tales como CEM (Masuda y col., (2007) Nucleic Acids Symposium Series 51:3-4), el procedimiento p-cianoetil fosforoamidita (Beaucage S L y col. (1981) Tetrahedron Lett 22:1859); el procedimiento de nucleósido H-fosfonato (Garegg P y col. (1986) Tetrahedron Lett 27:4051-4; Froehler B C y col. (1986) Nucí Acid Res 14:5399-407; Garegg P y col. (1986) Tetrahedron Lett 27:4055-8; Gaffney B L y col. (1988) Tetrahedron Lett 29:2619-22). Estas químicas pueden llevarse a cabo o adaptarse para usarse con sintetizadores de ácido nucleico automatizados que están disponibles en el mercado. Los procedimientos sintéticos adecuados adicionales se describen en Uhlmann y col. (1990) Chem Rev 90:544-84, y Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1: 165. La síntesis de ácido nucleico también puede llevarse a cabo usando procedimientos recombinantes adecuados que son bien conocidos y convencionales en la técnica incluyendo clonación, procesamiento y/o la expresión de polinucleótidos y productos génicos codificados por tales polinucleótidos. La transposición de ADN a través de fragmentación aleatoria y re-ensamblaje por PCR de fragmentos génicos y polinucleótidos sintéticos son ejemplos de técnicas conocidas que pueden usarse para diseñar y modificar secuencias de polinucleótido. La mutagénesis dirigida al sitio puede usarse para alterar los ácidos nucleicos y proteínas codificadas, por ejemplo, para insertar nuevos sitios de restricción, alterar los patrones de glucosilación, cambiar la preferencia del codón, producir variantes de división, introducir mutaciones y similares. Los procedimientos adecuados para transcripción, traducción y expresión de secuencias de ácido nucleico son conocidos y convencionales en la técnica. (Véase generalmente, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Ed. Ausubel, y col., Greene Publish. Assoc. & Wiley Interscience, Ch. 13, 1988; Glover, DNA Cloning, Vol. II, IRL Press, Wash., D.C., Ch. 3, 1986; Bitter, y col., en Methods in Enzymology 153:516-544 (1987); The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Eds. Strathern y col., Cold Spring Harbor Press, Vols. I y II, 1982; y Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989).
La presencia y/o cantidad de uno o más nucleótidos modificados en una molécula de ARN de auto-replicación puede determinarse usando cualquier procedimiento adecuado. Por ejemplo, un ARN de auto-replicación puede digerirse en monofosfatos (por ejemplo, usando nucleasa P1) y desfosforilarse (por ejemplo, usando una fosfatasa adecuada tal como CIAP), y los nucleósidos resultantes analizados a través de HPLC de fase inversa (por ejemplo, usando una columna YMC Pack ODS-AQ (5 micras, 4,6 X 250 mm) y eluyendo usando un gradiente, 30 % de B (0-5 min) a 100 % de B (5 - 13 min) y a 100 % de B (13-40) min, caudal (0,7 ml/min), detección UV (longitud de onda: 260 nm), temperatura de columna (30 °C). Tampón A (20 mM de ácido acético - acetato de amonio pH 3,5), tampón B (20 mM de ácido acético - acetato de amonio pH 3,5 / metanol [90/10])).
El ARN de auto-replicación puede asociarse a un sistema de distribución. El ARN de auto-replicación puede administrarse con o sin un adyuvante.
Sistemas de Suministro de ARN
Los ARN de auto-replicación descritos en el presente documento son adecuados para el suministro en una diversidad de realizaciones, tales como el suministro de ARN desnudo o en combinación con lípidos, polímeros u otros compuestos que facilitan la entrada en las células. Las moléculas de ARN de auto-replicación pueden introducirse en células o sujetos diana usando cualquier técnica adecuada, por ejemplo, a través de inyección directa, microinyección, electroporación, lipofección, biolísticos, y similares. La molécula de ARN de auto-replicación también puede introducirse en las células mediante endocitosis mediada por el receptor. Véase por ejemplo, Patente de EE.UU. N.° 6.090.619; Wu y Wu, J. Biol. Chem., 263:14621 (1988); y Curiel y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:8850 (1991). Por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 6.083.741 describe la introducción de un ácido nucleico exógeno en células de mamífero mediante la asociación del ácido nucleico a una fracción del policatión (por ejemplo, poli-L-lisina que tiene 3-100 restos de lisina), que por sí misma se acopla a una fracción de unión del receptor de integrina (por ejemplo un péptido cíclico que tiene la secuencia Arg-Gly-Asp.
Las moléculas de ARN de auto-replicación pueden suministrarse en células a través de anfífilos. Véase por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 6.071.890. Típicamente, una molécula de ácido nucleico puede formar un complejo con el anfífilo catiónico. Las células de mamífero en contacto con el complejo pueden tomarlo fácilmente.
El ARN de auto-replicación puede suministrarse como ARN desnudo (por ejemplo, meramente como una solución acuosa de ARN) pero, para mejorar la entrada en las células y también los posteriores efectos intracelulares, el ARN de auto-replicación preferentemente se administra en combinación con un sistema de suministro, tales como un sistema de suministro de particulados o emulsión. Un gran número de sistemas de distribución son bien conocidos por el experto en la materia. Tales sistemas de distribución incluyen, por ejemplo, suministro a base de liposoma (Debs y Zhu (1993) documento WO 93/24640; Mannino y Gould-Fogerite (1988) BioTechniques 6(7): 682-691; Rose Patente de EE.UU. N.° 5.279.833; Brigham (1991) documento WO 91/06309; y Felgner y col. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7414), así como el uso de vectores víricos (por ejemplo, adenovírico (ver, por ejemplo, Berns y col. (1995) Ann. NY Acad. Sci. 772: 95-104; Ali y col. (1994) Gene Ther. 1: 367-384; y Haddada y col. (1995) Curr. Top. Microbiol. Immunol. 199 (Pt 3): 297-306 para revisión), papilomavírico, retrovírico (ver, por ejemplo, Buchscher y col. (1992) J. Virol. 66(5) 2731-2739; Johann y col. (1992) J. Virol. 66 (5): 1635-1640 (1992); Sommerfelt y col., (1990) Virol. 176:58-59; Wilson y col. (1989) J. Virol. 63:2374-2378; Miller y col., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); Wong-Staal y col., PCT/US94/05700, y Rosenburg y Fauci (1993) en Fundamental Immunology, Tercera Edición Paul (ed) Raven Press, Ltd., Nueva York y las referencias en el presente documento, y Yu y col., Gene Therapy (1994) supra.), y vectores víricos adeno-asociados (ver, West y col. (1987) Virology 160:38-47; Carter y col. (1989) Patente de EE.UU. N.° 4.797.368; Carter y col. WO 93/24641 (1993); Kotin (1994) Human Gene Therapy 5:793-801; Muzyczka (1994) J. Clin. Invst. 94:1351 y Samulski (supra) para una revisión de los vectores AAV; ver también, Lebkowski, Patente de EE.UU. N.° 5.173.414; Tratschin y col. (1985) Mol. Cell. Biol. 5(11):3251-3260; Tratschin, y col. (1984) Mol. Cell. Biol., 4:2072-2081; Hermonat y Muzyczka (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466-6470; McLaughlin y col. (1988) y Samulski y col. (1989) J. Virol., 63:03822-3828), y similares.
Tres sistemas de suministro particularmente útiles son (i) liposomas, (ii) micropartículas de polímero no tóxicas y biodegradables, y (iii) emulsiones de aceite en agua submicrométricas catiónicas.
Liposomas
Diversos lípidos anfífilos pueden formar bicapas en un entorno acuoso para encapsular un centro acuoso que contiene ARN como un liposoma. Estos lípidos pueden tener un grupo principal hidrófilo aniónico, catiónico o zwitteriónico. La formación de liposomas de fosfolípidos aniónicos data de los 60 y los lípidos formadores de liposomas catiónicos han sido estudiados desde los 90. Algunos fosfolípidos son aniónicos mientras otros son zwitteriónicos. Las clases de fosfolípidos adecuados incluyen, pero no se limitan a, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilcolinas, fosfatidilserinas, y fosfatidilgliceroles, y algunos fosfolípidos útiles se listan en la Tabla 2. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero no se limitan a, dioleoil trimetilamonio propano (DOTAP), 1,2-disteariloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (dSdmA), 1,2-dioleiloxi-N,Ndimetil-3-aminopropano (DoDmA), 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLinDMA), 1,2-dilinoleniloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DLenDMA). Los lípidos zwitteriónicos incluyen, pero no se limitan a lípidos acil zwitteriónicos y lípidos éter zwitteriónicos. Los ejemplos de lípidos zwitteriónicos son DPPC, DOPC y dodecilfosfocolina. Los lípidos pueden estar saturados o insaturados.
Los liposomas pueden formarse a partir de un solo lípido o de una mezcla de lípidos. Una mezcla puede comprender (i) una mezcla de lípidos aniónicos (ii) una mezcla de lípidos catiónicos (iii) una mezcla de lípidos zwitteriónicos (iv) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos catiónicos (v) una mezcla de lípidos aniónicos y lípidos zwitteriónicos (vi) una mezcla de lípidos zwitteriónicos y lípidos catiónicos o (vii) una mezcla de lípidos aniónicos, lípidos catiónicos y lípidos zwitteriónicos. De forma similar, una mezcla puede comprender tanto lípidos saturados como insaturados. Por ejemplo, una mezcla una mezcla puede comprender dSpC (zwitteriónico, saturado) DlinDMA (catiónico, insaturado), y/o DMPG (aniónico, saturado). Cuando se usa una mezcla de lípidos, no todos los lípidos componentes en la mezcla necesitan ser anfífilos, por ejemplo, uno o más lípidos anfífilos pueden mezclarse con colesterol.
La porción hidrófila de un lípido puede estar PEGilada (es decir, modificada por un acoplamiento covalente de un polietilenglicol). Esta modificación puede aumentar la estabilidad y prevenir la absorción no específica de los liposomas. Por ejemplo, los lípidos pueden conjugarse con PEG usando técnicas como las descritas en Heyes y col. (2005) J Controlled Release 107:276-87.
Una mezcla de DSPC, DlinDMA, PEG-DMPG y colesterol puede usarse para formar liposomas. Un aspecto separado de la divulgación es un liposoma que comprende DSPC, DlinDMA, PEG-DMG y colesterol. Este liposoma preferentemente encapsula ARN, tal como el ARN de auto-replicación, por ejemplo, que codifica un inmunógeno. Los liposomas habitualmente se dividen en tres grupos: vesículas multilaminares (MLV, por sus siglas en inglés); vesículas unilaminares pequeñas (SUV, por sus siglas en inglés); y vesículas unilaminares grandes (LUV, por sus siglas en inglés). Las MlV tienen múltiples bicapas en cada vesícula, formando varios compartimentos acuosos separados. SUV y LUV tienen una sola bicapa que encapsula un núcleo acuoso; las SUV típicamente tienen un diámetro de < 50 nm, y las LUV tienen un diámetro de >50 nm. Los liposomas útiles con la invención son idealmente LUV con un diámetro de intervalo de 50-220 nm. Para una composición que comprende una población de LUV con diferentes diámetros: (i) al menos un 80 % en número deberá tener diámetros en el intervalo de 20-220 nm, (ii) el diámetro promedio (Zav, por intensidad) de la población está idealmente en el intervalo de 40-200 nm, y/o (iii) el diámetro deberá tener un índice de polidispersidad de <0,2.
Las técnicas para preparar liposomas adecuados son bien conocidas en la técnica, por ejemplo véase Liposomes: Methods and Protocols, Volumen 1: Pharmaceutical Nanocarriers: Methods and Protocols. (ed. Weissig). Humana Press, 2009. ISBN 160327359X; Liposome Technology, volúmenes I, II y III. (ed. Gregoriadis). Informa Healthcare, 2006; y Functional Polymer Colloids and Microparticles volumen 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes). (eds. Arshady & Guyot). Citus Books, 2002. Un procedimiento útil implica el mezclado (i) de una solución etanólica de los lípidos, (ii) una solución acuosa de ácido de nucleico y (iii) tampón, seguido por el mezclado, equilibrio, dilución y purificación (Heyes y col. (2005) J Controlled Release 107:276-87).
El ARN preferentemente se encapsula dentro de unos liposomas, y así el liposoma forma una capa exterior alrededor de un núcleo que contiene el ARN acuoso. Esta encapsulación se ha encontrado que protege el ARN de la digestión por RNasa. Los liposomas pueden incluir algún ARN externo (por ejemplo, en la superficie de los liposomas) pero preferentemente, se encapsula al menos la mitad del ARN (e idealmente sustancialmente todo este).
Micropartículas poliméricas
Diversos polímeros pueden formar micropartículas para encapsular o adsorber ARN. El uso de un polímero sustancialmente no tóxico significa que un receptor puede de manera segura recibir las partículas, y el uso de un polímero biodegradable significa que las partículas pueden metabolizarse después del suministro para evitar la persistencia a largo plazo. Los polímeros útiles también son esterilizables para ayudar en la preparación de las formulaciones de clase farmacéutica.
Los polímeros no tóxicos y biodegradables adecuados incluyen, pero no se limitan a, poli(a-hidroxi ácidos), ácidos polihidroxi butíricos, polilactonas (incluyendo policaprolactonas), polidioxanonas, polivalerolactona, poliortoésteres, polianhídridos, policianoacrilatos, policarbonatos derivados de tirosina, polivinil-pirrolidinonas o poliéster amidas, y combinaciones de los mismos.
En algunas realizaciones, las micropartículas están formadas por poli(a-hidroxi ácidos), tales como poli (lactidas) (“PLA”), copolímeros de lactida y glicolida tales como poli (D,L-lactida-co-glicolida) (“PLG”), y copolímeros de D,L-lactida y caprolactona. Los polímeros PLG útiles incluyen aquellos que tienen una proporción molar de lactida/glicolida en el intervalo de, por ejemplo 20:80 a 80:20 por ejemplo 25:75, 40:60, 45:55, 55:45, 60:40, 75:25. Los polímeros PLG útiles incluyen aquellos que tienen un peso molecular entre, por ejemplo, 5.000-200.000 Da por ejemplo entre 10.000-100.000, 20.000-70.000, 40.000-50.000 Da.
Las micropartículas idealmente tienen un diámetro en el intervalo de 0,02 pm a 8 pm. Para una composición que comprende una población de micropartículas con diferentes diámetros al menos 80 % en número deberán tener diámetros en el intervalo de 0,03-7 pm.
Las técnicas para preparar micropartículas adecuadas son bien conocidas en la técnica, véase por ejemplo Functional Polymer Colloids and Microparticles volumen 4 (Microspheres, microcapsules & liposomes). (eds. Arshady & Guyot). Citus Books, 2002; Polymers in Drug Delivery. (eds. Uchegbu & Schatzlein). CRC Press, 2006. (en particular capítulo 7) y Microparticulate Systems for the Delivery of Proteins and Vaccines. (eds. Cohen & Bernstein). CRC Press, 1996. Para facilitar la absorción del ARN, una micropartícula puede incluir un agente tensioactivo catiónico y/o lipídico, por ejemplo, como se describe en O'Hagan y col. (2001) J Virology 75:9037-9043; y Singh y col. (2003) Pharmaceutical Research 20: 247-251. Una forma alternativa de fabricar micropartículas poliméricas es por moldeo y curación, por ejemplo, como se describe en el documento WO2009/132206.
Las micropartículas de la invención pueden tener un potencial zeta de entre 40-100 mV. El ARN puede adsorberse en las micropartículas, y la adsorción se facilita mediante la inclusión de materiales catiónicos (por ejemplo, lípidos catiónicos) en la micropartícula.
Emulsiones catiónicas de aceite en agua
Las emulsiones de aceite en agua se conocen por adyuvantar las vacunas de la gripe, por ejemplo, el adyuvante MF59™ en el producto FLUAD™ y el adyuvante AS03 en el producto PREPANDRIX™. El suministro de la ARN puede obtenerse con el uso de una emulsión de aceite en agua, siempre que la emulsión incluya una o más moléculas catiónicas. Por ejemplo, un lípido catiónico puede incluirse en la emulsión para proporcionar una superficie de gotículas positivamente cargadas a la cual se puede acoplar el ARN negativamente cargado.
La emulsión comprende uno o más aceites. El aceite o aceites adecuados incluyen aquellos de, por ejemplo, un animal (tal como un pez) o una fuente vegetal. El aceite idealmente es biodegradable (metabolizable) y biocompatible. Las fuentes para aceites vegetales incluyen nueces, semillas y granos. El aceite de cacahuete, el aceite de soja, el aceite de coco y el aceite de oliva, los más comúnmente disponibles, ejemplifican los aceites de nueces. El aceite de jojoba puede usarse, por ejemplo, obtenido de la judía de jojoba. Los aceites de semillas incluyen aceites del cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de semilla de girasol, aceite de semilla de sésamo y similares. En el grupo de los granos, el aceite de maíz es el más fácilmente disponible, pero el aceite de otros granos de cereal tales como de trigo, avena centeno, arroz, teff, triticale y similares también pueden usarse. Los ésteres de ácidos grasos de 6-10 carbonos de glicerol y 1,2-propandiol, a pesar de que no existen de forma natural en los aceites de semilla, pueden prepararse a través de hidrólisis, separación y esterificación de los materiales apropiados partiendo de los aceites de nuez y semilla. Las grasas y los aceites de leche de mamífero son metabolizables y por lo tanto pueden usarse. Los procedimientos para la separación, purificación, saponificación y otros medios necesarios para obtener aceites puros de fuentes animales son bien conocidos en la técnica.
La mayor parte de los peces contienen aceites metabolizables que pueden recuperarse fácilmente. Por ejemplo, el aceite de hígado bacalao, aceite de hígado de tiburón, y aceite de ballena tal como esperma de ballena ejemplifican varios de los aceites de pescado que pueden usarse en el presente documento. Un número de aceites de cadena ramificada se sintetizan bioquímicamente en unidades de isopreno de 5 carbonos y generalmente se denominan terpenoides. El escualano, el análogo saturado del escualeno, también puede usarse. Los aceites de pescado que incluyen escualeno y escualano están fácilmente disponibles de fuentes comerciales o pueden obtenerse a través de procedimientos conocidos en la técnica.
Otros aceites útiles son los tocoferoles, particularmente en combinación con escualeno. Donde la fase oleosa de una emulsión incluye tocoferol, cualquiera de los tocoferoles a, p, y, 5, £ o ^ puede usarse, pero se prefieren los atocoferoles. D-a-tocoferol y DL-a-tocoferol ambos pueden usarse. Un a-tocoferol preferido es DL-a-tocoferol. Puede usarse una combinación de aceites que comprende escualeno y tocoferol (por ejemplo, DL-a-tocoferol).
Las emulsiones preferidas comprenden escualeno, un aceite de hígado de tiburón que es un terpenoide insaturado ramificado (C30H50; [(CHa)2C[=CHCH2CH2C(CHa)]2=CHCH2-]2; 2,6,10,15,19,23-hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosahexaeno; CAS RN 7683-64-9).
El aceite en la emulsión puede comprender una combinación de aceites, por ejemplo, escualeno y al menos un aceite adicional.
El componente acuoso de la emulsión puede ser agua simple (por ejemplo, w.f.i.) o puede incluir componentes adicionales, por ejemplo, solutos. Por ejemplo, puede incluir sales para formar un tampón, por ejemplo, sales de citrato o fosfato, tales como sales de sodio. Los tampones típicos incluyen: un tampón de fosfato; un tampón Tris, un tampón borato; un tampón succinato, un tampón histidina, o un tampón citrato. Una fase acuosa regulada en su pH es preferida, y tampones típicamente se incluirán en el intervalo de 5-20 mM.
La emulsión también incluye un lípido catiónico. Preferentemente este lípido es un agente tensioactivo de tal forma puede facilitar la formación y estabilización de la emulsión. Los lípidos catiónicos útiles generalmente contienen un átomo de nitrógeno que está positivamente cargado bajo condiciones fisiológicas, por ejemplo, una amina terciaria o cuaternaria. Este nitrógeno puede estar el grupo principal hidrófilo de un agente tensioactivo anfífilo. Los lípidos catiónicos útiles incluyen, pero no se limitan a: 1,2-dioleoiloxi-3-(trimetilamonio)propano (DOTAP), 3'-[N-(N',N'-Dimetilaminoetano)-carbamoil]colesterol (DC colesterol), dimetildioctadecil-amonio (d Da por ejemplo el bromuro), 1,2-Dimiristoil-3-Trimetil-AmonioPropano (DMTAP), dipalmitoil(C16:0)trimetil amonio propano (DPTAP), distearoiltrimetilamonio propano (DSTAP). Otros lípidos catiónicos útiles son: cloruro de benzalconio (BAK), cloruro de bencetonio, cetramida (la cual contiene bromuro tetradeciltrimetilamonio y posiblemente pequeñas cantidades de bromuro de dedeciltrimetilamonio y bromuro de hexadeciltrimetil amonio), cloruro de cetilpiridinio (CPC), cloruro de cetil trimetilamonio (CTAC), N,N',N'-polioxietileno (10)-N-grasa animal-l,3-diaminopropano, bromuro de dodeciltrimetilamonio, bromuro de hexadeciltrimetil-amonio bromuro, bromuro de alquil-trimetil-amonio mixto, cloruro de bencildimetildodecilamonio, cloruro de bencildimetilhexadecil-amonio, benciltrimetilamonio metóxido, bromuro de cetildimetiletilamonio, bromuro de dimetildioctadecil amonio (DDAB), cloruro metilbenzetonio, cloruro de decametonio, cloruro de trialquil amonio metílico mixto, cloruro metil de trioctilamonio), cloruro de N,N-dimetil-N-[2 (2-metil-4-(l,l,3,3tetrametilbutil)-fenoxi]-etoxi)etil]-benzenemeta-naminp (DEBDA), sales de dialquildimetilamonio, cloruro de [l-(2,3-dioleiloxi)-propil]-N,N,N,trimetilamonio, 1,2-diacil-3-(trimetilamonio) propano (grupo acilo =dimiristoilo, dipalmitoilo, distearoilo, dioleoilo), l,2-diacil-3 (dimetilamonio)propano (grupo acilo=dimiristoilo, dipalmitoilo, distearoilo, dioleoilo), l,2-dioleoil-3-(4'-trimetil-amonio)butanoil-sn-glicerol, éster colina 3-succinil-sn-glicerol de 1,2-dioleoilo, colesteril (4'-trimetilamonio) butanoato), sales de N-alquil piridinio (por ejemplo, bromuro de cetilpiridinio y cloruro de cetilpiridinio), sales de N-alquilpiperidinio, electrolitos bolaform dicatiónicos (C12Me6; C12BU6), dialquilglicetilfosforilcolina, lisolecitina, L-a dioleoilfosfatidiletanolamina, colesterol hemisuccinato colin éster, lipopoliaminas, incluyendo pero no limitándose a dioctadecilamidoglicilesperminea (DOGS), dipalmitoil fosfatidiletanol-amidoespermina (DPPES), lipopoli-L (o D)-lisina (LPLL, LPDL), poli (L (o D)-lisina conjugada con N-glutarilfosfatidiletanolamina, didodecil glutamato éster con un grupo amino pendiente (CAGluPhCnN), ditetradecil glutamato éster con un grupo amino pendiente (Cl4GIuCnN+), derivados catiónicos de colesterol, incluyendo pero no limitándose a sal de colesteril-3 p-oxisuccinamidoetilentrimetilamonio, colesteril-3p-oxisuccinamidoetilendimetilamina, sal de colesteril-3p-carboxiamidoetilentrimetilamonio, y colesteril-3 p-carboxiamidoetilendimetilamina. Otros lípidos catiónicos útiles se describen en los documentos US 2008/0085870 y US 2008/0057080. El lípido catiónico preferentemente es biodegradable (metabolizable) y biocompatible.
Además del aceite y el lípido catiónico, una emulsión puede incluir un agente tensioactivo no iónico y/o un agente tensioactivo zwitteriónico. Tales agentes tensioactivos incluyen, pero no se limitan a: los agentes tensioactivos de ésteres de polioxietilen sorbitán (comúnmente referidos como los Tweens), especialmente polisorbato 20 y polisorbato 80; copolímeros de óxido de etileno (EO), óxido de propileno (PO), y/u óxido de butileno (BO), vendido bajo la marca comercial DOWFAX™, tales como los copolímeros de bloque EO/PO lineales; octoxinoles, que pueden variar en el número de grupos epoxi de repetición (oxi-1,2-etandiilo), con octoxinol-9 (Triton X-100, o toctilfenoxipolietoxietanol) siendo de particular interés; (octilfenoxi)polietoxietanol (IGEPAL CA-630/NP-40); fosfolípidos tales como fosfatidilcolina (lecitina); ésteres grasos de polioxietileno derivados de alcohol laurílico, cetílico, estearílico y oleílico (conocidos como agentes tensioactivos Brij) tales como el éster monolaurílico de trietilenglicol (Brij 30); polioxietilen-9-lauril éter; y ésteres de sorbitán (comúnmente conocidos como Spans), tales como trioleato de sorbitán (Span 85) y monolaureato de sorbitán. Los agentes tensioactivos preferidos para incluirse en la emulsión son polisorbato 80 (Tween 80; polioxietilen sorbitán monooleato), Span 85 (trioleato de sorbitán), lecitina y Triton X-100.
Las mezclas de estos agentes tensioactivos pueden incluirse en la emulsión, por ejemplo, mezclas de Tween 80/Span 85, o mezclas de Tween 80/Triton-X100. Una combinación del éster de polioxietilen sorbitán tal como monooleato de polioxietilen sorbitán (Tween 80) y un octoxinol tal como t-octilfenoxi-polietoxietanol (Triton X-100) también es adecuada. Otras combinaciones útiles comprenden lauret 9 más un éster de polioxietilen sorbitán y/o un octoxinol. Las mezclas útiles pueden comprender un agente tensioactivo con un valor HLB en el intervalo de 10-20 (por ejemplo, polisorbato 80, con un HLB de 15,0) y un agente tensioactivo con un valor HLB en el intervalo 1-10 (por ejemplo, trioleato de sorbitán, con un HLB de 1,8).
Las cantidades de aceite preferidas (% en volumen) en la emulsión final están entre el 2-20 % por ejemplo 5-15 %, 6-14 %, 7-13 %, 8-12 %. Un contenido de escualeno de aproximadamente 4-6 % o de aproximadamente 9-11 % es particularmente útil.
Las cantidades preferidas de agentes tensioactivos (% en peso) en la emulsión final están entre el 0,001 % y el 8 %. Por ejemplo: ésteres de polioxietilen sorbitán (tal como polisorbato 80) del 0,2 al 4 %, en particular entre el 0,4-0,6 %, entre el 0,45-0,55 %, aproximadamente el 0,5 % o entre el 1,5-2 %, entre el 1,8-2,2 %, entre el 1,9-2,1 %, aproximadamente el 2 %, o el 0,85-0,95 %, o aproximadamente el 1 %; ésteres de sorbitán (tal como trioleato de sorbitán) del 0,02 al 2 %, en particular de aproximadamente el 0,5 % o de aproximadamente el 1 %; octil- o nonilfenoxi polioxietanoles (tal como Triton X-100) del 0,001 al 0,1 %, en particular del 0,005 al 0,02 %; ésteres de polioxietileno (tal como lauret 9) del 0,1 al 8 %, preferentemente del 0,1 al 10 % y en particular del 0,1 al 1 % o de aproximadamente el 0,5 %.
Las cantidades absolutas de aceite y agente tensioactivo, y su proporción, puede variar dentro de amplios límites a pesar de que aún forman una emulsión. Un experto en la técnica puede fácilmente variar las proporciones relativas de los componentes para obtener una emulsión deseada pero una proporción en peso de entre 4:1 y 5:1 para el aceite y el agente tensioactivo es típica (aceite en exceso).
Un parámetro importante para asegurar la actividad inmunoestimuladora de una emulsión, particularmente en animales grandes, es el tamaño de gotícula de aceite (diámetro). Las emulsiones más efectivas tienen un tamaño de gotícula en el intervalo de submicrómetros. Adecuadamente los tamaños de gotícula estarán en el intervalo de 50­ 750 nm. Más habitualmente el tamaño de gotícula promedio es menor de 250 nm por ejemplo menor de 200 nm, menor de 150 nm. El tamaño de gotícula promedio útilmente está en el intervalo de 80-180 nm. Idealmente al menos el 80 % (en número) de las gotículas de aceite en la emulsión son menores de 250 nm en diámetro y preferentemente al menos el 90 %. Los aparatos para determinar el tamaño de gotícula promedio en una emulsión, y la distribución de tamaño, están disponibles en el mercado. Estos típicamente usan las técnicas de difusión de luz dinámica y/o percepción óptica de partícula individual, por ejemplo, el Accusizer™ y Nicomp™ de la serie de instrumentos disponibles de Particle Sizing Systems (Santa Barbara, EE.UU.), o los instrumentos Zetasizer™ de Malvern (RU), o los instrumentos Particle Size Distribution Analyzer de Horiba (Kyoto, Japón).
Idealmente, la distribución de los tamaños de gotícula (en número) tienen solamente un máximo, es decir, existe una única población de gotículas distribuida alrededor de un promedio (moda), en lugar tener dos máximos. Las emulsiones preferidas tienen una polidispersidad de <0,4 por ejemplo, 0,3, 0,2, o menor.
Las emulsiones adecuadas con gotículas submicrométricas y estrecha distribución de tamaño pueden obtenerse a través del uso de un microfluido. Esta técnica reduce el tamaño de gotícula de aceite promedio a través de corrientes de propulsión de componentes de entrada a través de canales geométricamente fijados a alta presión y a alta velocidad. Estas corrientes se ponen en contacto con las paredes del canal, las paredes de la cámara y entre sí. Los resultados cortantes, de impacto y de cavitación causan una reducción en el tamaño de las gotículas. Los casos repetidos de la microfluidez pueden llevarse a cabo hasta que se obtiene una emulsión con un promedio de tamaño de gotícula deseado y una distribución.
Como una alternativa a la microfluidización, los procedimientos térmicos pueden usarse para causar la inversión de fase. Estos procedimientos también proporcionar una emulsión submicrométrica con una distribución de tamaño de partícula precisa.
Las emulsiones preferidas pueden esterilizarse por fltración, es decir, sus gotículas pueden pasar a través de un filtro de 220 nm. Así como la provisión de una esterilización, este procedimiento también elimina cualquier gotícula grande en la emulsión.
En ciertas realizaciones, el lípido catiónico en la emulsión es DOTAP. La emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml de DOTAP. Por ejemplo, la emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender DOTAP a de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0.6 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,9 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,1 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,2 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,3 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,4 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,5 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,6 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 1,7 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 24 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 22 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 18 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 15 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 12 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,9 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,8 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,7 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, de aproximadamente 0,7 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 0,5 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,7 mg/ml, aproximadamente 0,8 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1,0 mg/ml, aproximadamente 1,1 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1,3 mg/ml, aproximadamente 1,4 mg/ml, aproximadamente 1,5 mg/ml, aproximadamente 1,6 mg/ml, aproximadamente 12 mg/ml, aproximadamente 18 mg/ml, aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21,8 mg/ml, aproximadamente 24 mg/ml, etc. En una realización ejemplar, la emulsión de aceite en agua catiónica comprende de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 1,6 mg/ml de DOTAP, tal como 0,8 mg/ml, 1,2 mg/ml, 1,4 mg/ml o 1,6 mg/ml.
En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es Colesterol DC. La emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender Colesterol DC de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml de Colesterol DC. Por ejemplo, la emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender Colesterol DC de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,62 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2,46 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4,92 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2,46 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 0,62 mg/ml, aproximadamente 0,15 mg/ml, aproximadamente 0,3 mg/ml, aproximadamente 0,6 mg/ml, aproximadamente 0,62 mg/ml, aproximadamente 0,9 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 2,46 mg/ml, aproximadamente 4,92 mg/ml, etc. En una realización ejemplar, la emulsión de aceite en agua catiónica comprende de aproximadamente 0,62 mg/ml a aproximadamente 4,92 mg/ml de Colesterol DC, tal como 2,46 mg/ml.
En ciertas realizaciones, el lípido catiónico es DDA. La emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml DDA. Por ejemplo, la emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender DDA de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 4 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 3 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 2 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,5 mg/ml, de aproximadamente 0,1 mg/ml a aproximadamente 1,45 mg/ml, de aproximadamente 0,2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,6 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,73 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,8 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 0,9 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,0 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 1,45 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 2,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 3,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, de aproximadamente 4,5 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml, aproximadamente 1,2 mg/ml, aproximadamente 1,45 mg/ml, etc. Alternativamente, la emulsión de aceite en agua catiónica puede comprender DDA de aproximadamente 20 mg/ml, aproximadamente 21 mg/ml, aproximadamente 21,5 mg/ml, aproximadamente 21,6 mg/ml, aproximadamente 25 mg/ml. En una realización ejemplar, la emulsión de aceite en agua catiónica comprende de aproximadamente 0,73 mg/ml a aproximadamente 1,45 mg/ml de DDA, tal como 1,45 mg/ml.
Los catéteres o dispositivos similares pueden usarse para suministrar moléculas de ARN de auto-replicación de la invención, como a Rn desnudo en combinación con un sistema de suministro, en un órgano o tejido diana. Los catéteres adecuados se describen en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. 4.186.745; 5.397.307; 5.547.472; 5.674.192; y 6.129.705.
La presente divulgación incluye el uso de sistemas de suministro adecuados, tales como liposomas, micropartículas de polímero o micropartículas de emulsión submicrométrica con ARN de auto-replicación encapsulado o adsorbido, para suministrar una molécula de ARN de auto-replicación que codifica dos o más proteínas de CMV, por ejemplo, para provocar una respuesta inmune sola, o en combinación con otra macromolécula. La invención incluye liposomas, micropartículas de emulsiones submicrométricas con moléculas de ARN de auto-replicación adsorbidas y/o encapsuladas y combinaciones de los mismos.
Las moléculas de ARN de auto-replicación asociadas a liposomas y micropartículas de emulsión submicrométrica pueden suministrarse de forma eficaz a una célula hospedadora y pueden inducir una respuesta inmune a la proteína codificada por el ARN de auto-replicación.
Las moléculas de ARN de auto-replicación policistrónicas que codifican proteínas de CMV, y las VRP producidas usando replicones de alfavirus policistrónicos, pueden usarse para formar los complejos proteicos de c Mv en una célula. Los complejos incluyen, pero no se limitan a, gB/gH/gL; gH/gL; gH/gL/gO; gM/gN; gH/gL/UL128/UL130/UL131; y UL128/UL130/UL131.
En algunos aspectos de la divulgación, las combinaciones de VRP se suministran a una célula. Las combinaciones incluyen, pero no se limitan a:
1. una VRP gH/gL y otra VRP;
2. una VRP gH/gL y una gB VRP;
3. una VRP gH/gL/gO y una gB VRP;
4. una gB VRP y una VRP gH/gL/UL128/UL130/UL131;
5. una gB VRP y una VRP UL128/UL130/UL131;
6. una gB VRP y una VRP gM/gN;
7. una gB VRP, una VRP gH/gL, y una VRP UL128/UL130/UL131;
8. una gB VRP, una VRP gH/gLgO, y una VRP UL128/UL130/UL131;
9. una gB VRP, una VRP gM/gN, una VRP gH/gL, y un VRP UL128/UL130/UL131;
10. una gB VRP, una VRP gM/gN, una VRP gH/gL/O, y un VRP UL128/UL130/UL131;
11. una VRP gH/gL y una VRP UL128/UL130/UL131; y
En algunos aspectos de la divulgación, las combinaciones de moléculas de ARN de auto-replicación se suministran a una célula. Las combinaciones incluyen, pero no se limitan a:
1. una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gH/gL y una molécula de ARN de auto-replicación que codifica otra proteína;
2. una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gH y gL y una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gB;
3. una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gH, gL y gO y una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gB;
4. una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gB y una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gH, gL, UL128, UL130 y UL131;
5. una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gB y una molécula de ARN de auto-replicación que codifica UL128, UL130 y UL131;
6. una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gB y una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gM y gN;
7. una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gB, una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gH y gL, y una molécula de ARN de auto-replicación que codifica UL128, UL130 y UL131;
8. una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gB, una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gH, gL, y gO, y una molécula de ARN de auto-replicación que codifica UL128, UL130 y UL131;
9. una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gB, una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gM y gN, una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gH y gL, y una molécula de ARN de auto-replicación que codifica UL128, UL130 y UL131;
10. una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gB, una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gM y gN, una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gH, gL y gO, y una molécula de ARN de auto-replicación que codifica UL128, UL130 y UL131;
11. una molécula de ARN de auto-replicación que codifica gH y gL, y una molécula de ARN de auto-replicación que codifica UL128, UL130 y UL131; y
Proteínas de CMV
Las proteínas de CMV adecuadas incluyen gB, gH, gL, gO, y pueden ser de cualquier cepa de CMV. Otras proteínas de CMV adecuadas incluyen UL128, UL130 y UL131, y pueden ser de cualquier cepa de CMV. Por ejemplo, las proteínas de CMV pueden ser de las cepas Merlin, AD169, VR1814, Towne, Toledo, TR, PH, TB40, o Fix de CMV.
Las proteínas de CMV ejemplares y fragmentos se describen en el presente documento. Estas proteínas y fragmentos pueden codificarse a través de cualquier secuencia de nucleótidos adecuada, incluyendo secuencias que están optimizadas o desoptimizadas en codón para la expresión en un hospedador deseado, tal como una célula de humano. Las secuencias ejemplares de proteínas de CMV y ácidos nucleicos que codifican las proteínas se proporcionan en la Tabla 2.
Tabla 2.
Figure imgf000022_0001
(continuación)
Figure imgf000023_0001
Proteínas gB CMV
Una proteína gB puede ser de longitud completa o puede omitir o más regiones de la proteína. Alternativamente, los fragmentos de una proteína gB pueden usarse. Los aminoácidos gB se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácido fB de longitud completa (gB CMV FL), que tiene 907 aminoácidos de longitud. Las regiones adecuadas de una proteína gB, que pueden excluirse de la proteína de longitud completa o incluirse como fragmentos incluyen: la secuencia de señal (aminoácidos 1-24), un dominio de tipo disintegrina gB-DLD (aminoácidos 57-146), un sitio de escisión de furina (aminoácidos 459-460), una región de repetición heptad (679-693), un dominio de diseminación de membrana (aminoácidos 751-771), y un dominio citoplasmático de los aminoácidos 771-906. En algunas realizaciones, una proteína gB incluye los aminoácidos 67-86 (Epítopo Neutralizante AD2) y/o los aminoácidos 532­ 635 (Epítopo Inmunodominante a D1). Los ejemplos específicos de fragmentos gB, incluyen “gB sol 692”, que incluye los primeros 692 aminoácidos de gB, aminoácidos de gB, ay “gB sol 750”, que incluye los primeros 750 aminoácidos de gB. La secuencia de señal, los aminoácidos 1-24, pueden estar presentes o ausentes de sol 692 gB y sol 750 gB según se desee. Opcionalmente, la proteína gB puede ser un fragmento gB de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento pueden comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, 725, 750, 775, 800, 825, 850, o 875 aminoácidos. Un fragmento gB puede iniciar en cualquier número de resto: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97 98, 99, 100, 101, 102, 103, ' 04, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117.
118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462 463, 464, 465, 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485 486, 487, 488, 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531 532, 533, 534, 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554 555, 556, 557, 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577 578, 579, 580, 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600 601, 602, 603, 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623 624, 625, 626, 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646 647, 648, 649, 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669 670, 671, 672, 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692 693, 694, 695, 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, 732, 733, 734, 735, 736, 737, 738 739, 740, 741, 742, 743, 744, 745, 746, 747, 748, 749, 750, 751, 752, 753, 754, 755, 756, 757, 758, 759, 760, 761 762, 763, 764, 765, 766, 767, 768, 769, 770, 771, 772, 773, 774, 775, 776, 777, 778, 779, 780, 781, 782, 783, 784 785, 786, 787, 788, 789, 790, 791, 792, 793, 794, 795, 796, 797, 798, 799, 800, 801, 802, 803, 804, 805, 806, 807 808, 809, 810, 811, 812, 813, 814, 815, 816, 817, 818, 819, 820, 821, 822, 823, 824, 825, 826, 827, 828, 829, 830 831, 832, 833, 834, 835, 836, 837, 838, 839, 840, 841, 842, 843, 844, 845, 846, 847, 848, 849, 850, 851, 852, 853 854, 855, 856, 857, 858, 859, 860, 861, 862, 863, 864, 865, 866, 867, 868, 869, 870, 871, 872, 873, 874, 875, 876 877, 878, 879, 881, 882, 883, 884, 886, 887, 8388, 889, 890, 891, 892, 893, 894, 895, 896 u 897.
Opcionalmente, un fragmento gB puede extenderse además en el N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos del resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento gB puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.
Proteínas gH CMV
En algunas realizaciones, una proteína gH es una proteína gH de longitud completa (CMV gH FL, por ejemplo, que es una proteína 743 aminoácidos). gH tiene un dominio de diseminación de membrana y un dominio citoplasmático que parte en la posición 716 a la posición 743. La retirada de los aminoácidos de 717 a 743 proporciona un gH soluble (por ejemplo, CMV gH sol,). En algunas realizaciones la proteína gH puede ser un fragmento gH de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 725 aminoácidos. Opcionalmente, la proteína gH puede ser un fragmento gH de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650, 675, 700, o 725 aminoácidos. Un fragmento gH puede iniciar en cualquier número de resto: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101 , 102!, 103i, 104 , 107 , 110, 111 , 112, 113, 114., 115, 116, 117, 118, 119, 120 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, 462, 463, 464, 465 466, 467, 468, 469, 470, 471, 472, 473, 474, 475, 476, 477, 478, 479, 480, 481, 482, 483, 484, 485, 486, 487, 488 489, 490, 491, 492, 493, 494, 495, 496, 497, 498, 499, 500, 501, 502, 503, 504, 505, 506, 507, 508, 509, 510, 511, 512, 513, 514, 515, 516, 517, 518, 519, 520, 521, 522, 523, 524, 525, 526, 527, 528, 529, 530, 531, 532, 533, 534 535, 536, 537, 538, 539, 540, 541, 542, 543, 544, 545, 546, 547, 548, 549, 550, 551, 552, 553, 554, 555, 556, 557 558, 559, 560, 561, 562, 563, 564, 565, 566, 567, 568, 569, 570, 571, 572, 573, 574, 575, 576, 577, 578, 579, 580 581, 582, 583, 584, 585, 586, 587, 588, 589, 590, 591, 592, 593, 594, 595, 596, 597, 598, 599, 600, 601, 602, 603 604, 605, 606, 607, 608, 609, 610, 611, 612, 613, 614, 615, 616, 617, 618, 619, 620, 621, 622, 623, 624, 625, 626 627, 628, 629, 630, 631, 632, 633, 634, 635, 636, 637, 638, 639, 640, 641, 642, 643, 644, 645, 646, 647, 648, 649 650, 651, 652, 653, 654, 655, 656, 657, 658, 659, 660, 661, 662, 663, 664, 665, 666, 667, 668, 669, 670, 671, 672 673, 674, 675, 676, 677, 678, 679, 680, 681, 682, 683, 684, 685, 686, 687, 688, 689, 690, 691, 692, 693, 694, 695 696, 697, 698, 699, 700, 701, 702, 703, 704, 705, 706, 707, 708, 709, 710, 711, 712, 713, 714, 715, 716, 717, 718, 719, 720, 721, 722, 723, 724, 725, 726, 727, 728, 729, 730, 731, o 732.
Los restos gH se enumeran de acuerdo con la secuencia de aminoácido gH de longitud completa (CMV gH FL). Opcionalmente un fragmento gH puede extenderse además en N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento gH puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.
Proteínas gL CMV
En algunas realizaciones una proteína g Les una proteína gL de longitud completa (CMV gL FL, por ejemplo, que es una proteína de 278 aminoácidos). En algunas realizaciones un fragmento gL puede usarse. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, o 250 aminoácidos. Un fragmento gL puede iniciar en cualquier número de resto: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231,232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, o 268.
Los restos gL se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácido gL de longitud completa (CMV gL FL). Opcionalmente, un fragmento gL puede extenderse además dentro de N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento gL puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.
Proteínas gO CMV
En algunas realizaciones, una proteína gO es una proteína gO de longitud completa (CMV gO FL, por ejemplo, que es una proteína de 472 aminoácidos). En algunas realizaciones la proteína gO puede ser un fragmento gO de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, o 450 aminoácidos. Un fragmento gO puede iniciar en cualquier número de resto: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226, 227, 228, 229, 230, 231, 232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241, 242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249, 250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272, 273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318, 319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341, 342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, 361, 362, 363, 364, 365, 366, 367, 368, 369, 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 377, 378, 379, 380, 381, 382, 383, 384, 385, 386, 387, 388, 389, 390, 391, 392, 393, 394, 395, 396, 397, 398, 399, 400, 401, 402, 403, 404, 405, 406, 407, 408, 409, 410, 411, 412, 413, 414, 415, 416, 417, 418, 419, 420, 421, 422, 423, 424, 425, 426, 427, 428, 429, 430, 431, 432, 433, 434, 435, 436, 437, 438, 439, 440, 441, 442, 443, 444, 445, 446, 447, 448, 449, 450, 451, 452, 453, 454, 455, 456, 457, 458, 459, 460, 461, o 462.
Los restos gO se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácido gO de longitud completa (CMV gO FL). Opcionalmente, un fragmento gO puede extenderse además dentro de N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento gO puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.
Proteínas gM CMV
En algunas realizaciones, una proteína gM es una proteína gM de longitud completa (CMV gM FL, por ejemplo, que es una proteína de 371 aminoácidos). En algunas realizaciones la proteína gM puede ser un fragmento gM de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30,
40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, o 350 aminoácidos. Un fragmento gM
puede iniciar en cualquier número de resto: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134,
135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157,
158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180,
181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201, 202, 203,
204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 211, 212, 213, 214, 215, 216, 217, 218, 219, 220, 221, 222, 223, 224, 225, 226,
227, 228, 229, 230, 231,232, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 240, 241,242, 243, 244, 245, 246, 247, 248, 249,
250, 251, 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261,262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271, 272,
273, 274, 275, 276, 277, 278, 279, 280, 281, 282, 283, 284, 285, 286, 287, 288, 289, 290, 291, 292, 293, 294, 295,
296, 297, 298, 299, 300, 301, 302, 303, 304, 305, 306, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 313, 314, 315, 316, 317, 318,
319, 320, 321, 322, 323, 324, 325, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 336, 337, 338, 339, 340, 341,
342, 343, 344, 345, 346, 347, 348, 349, 350, 351, 352, 353, 354, 355, 356, 357, 358, 359, 360, o 361.
Los restos gM se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácido gM de longitud completa (CMV gM FL).
Opcionalmente, un fragmento gM puede extenderse además dentro de N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento gM puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.
Proteínas gN CMV
En algunas realizaciones, una proteína gN es una proteína gN de longitud completa (CMV gN FL, por ejemplo, que es una proteína 135 aminoácidos). En algunas realizaciones la proteína gN puede ser un fragmento gN de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30,
40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, o 125 aminoácidos. Un fragmento gN puede iniciar en cualquier número de resto: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 3 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61,62, 63, 64, 6 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 9 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121,
122, 123, 124, o 125.
Los restos gN se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácido gN de longitud completa (CMV gN FL).
Opcionalmente, un fragmento gN puede extenderse además dentro de N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento gN puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.
Proteínas UL128 CMV
En algunas realizaciones, una proteína UL128 es una proteína UL128 de longitud completa (CMV UL128 FL, por ejemplo, que es una proteína de 171 aminoácidos). En algunas realizaciones la proteína UL128 puede ser un fragmento UL128 de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, o 150 aminoácidos. Un fragmento UL128 puede iniciar en cualquier número de resto: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57,
58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88,
89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,
115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137,
138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, o
161.
Los restos UL128 se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácido UL128 de longitud completa (CMV
UL128 FL). Opcionalmente, un fragmento UL128 puede extenderse además dentro de N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento UL128 puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.
Proteínas UL130 CMV
En algunas realizaciones, la proteína UL130 es una proteína UL130 de longitud completa (CMV UL130 FL, por ejemplo, que es una proteína 214 aminoácidos). En algunas realizaciones la proteína UL130 puede ser un fragmento UL130 de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender
10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, o 200 aminoácidos. Un fragmento UL130 puede iniciar en cualquier número de resto: 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27,
28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58,
59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,
90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111, 112, 113, 114,
115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137,
138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160,
161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 179, 180, 181, 182, 183,
184, 185, 186, 187, 188, 189, 190, 191, 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201,202, 203, o 204.
Los restos UL130 se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácido UL130 de longitud completa (CMV UL130 FL) mostrada en SEC ID NO:___. Opcionalmente, un fragmento UL130 puede extenderse además dentro de
N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, un fragmento UL130 puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.
Proteínas UL131 CMV
En algunas realizaciones, una proteína UL131 es una proteína UL131 de longitud completa (CMV UL131, por ejemplo, que es una proteína de 129 aminoácidos). En algunas realizaciones la proteína UL131 puede ser un fragmento UL131 de 10 aminoácidos o más largo. Por ejemplo, el número de aminoácidos en el fragmento puede comprender 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, o 200 aminoácidos. Un fragmento UL131 puede iniciar en cualquier número de resto: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,
23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84,
85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 111,
112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119.
Los restos UL131 se numeran de acuerdo con la secuencia de aminoácido UL131 de longitud completa (CMV UL131 FL). Opcionalmente, un fragmento UL131 puede extenderse además dentro de N-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el resto de partida del fragmento. Opcionalmente, a UL131 fragmento puede extenderse además en C-terminal en 5, 10, 20, o 30 aminoácidos desde el último resto del fragmento.
Como se indicó anteriormente, la divulgación se refiere a moléculas de ácido nucleico policistrónicas recombinantes que contiene una primera secuencia que codifica una primera proteína virus del herpes o un fragmento de la misma, y una secuencia que codifica una segunda proteína virus del herpes o un fragmento de la misma. En consecuencia, la descripción anterior de ciertas realizaciones preferidas, tales como las VRP de alfavirus, y los ARN de autoreplicación que contienen secuencias que codifican dos o más proteínas de CMV o fragmentos de las mismas, son ejemplares de la divulgación pero no limitan el alcance de la divulgación. Se apreciará que las secuencias que codifican proteínas de CMV en tales realizaciones preferidas, pueden ser reemplazadas con secuencias que codifican proteínas, tales como gH y gL o fragmentos de las mismas que son de 10 aminoácidos de longitud o más largas, desde otros virus del herpes, tales como VHH-1, VHH-2, VHH-3, VHH-4, VHH-6, VHH-7 y VHH-8. Por ejemplo, por ejemplo, las proteínas VVZ (VHH-3) adecuadas incluyen gB, gE, gH, gI, y gL, y sus fragmentos que son de 10 de aminoácidos de largo o más largas y pueden de cualquier cepa VVZ. Por ejemplo, las proteínas VVZ o fragmentos de las mismas pueden ser de las cepas pOka, Dumas, HJO, CA123, o DR de VVZ. Estas proteínas VVZ ejemplares y sus fragmentos pueden codificarse a través de cualquier secuencia de nucleótidos adecuada, incluyendo secuencias que están optimizadas en codón o desoptimizadas en codón para la expresión en un hospedero deseado, tal como una célula de humano. Las secuencias ejemplares de proteínas VVZ se proporcionan en el presente documento.
Por ejemplo, en una realización, la molécula de ácido nucleico policistrónica contiene una primera secuencia que codifica una proteína gH VVZ o un fragmento de la misma, y una segunda secuencia que codifica una proteína gL
VVZ o un fragmento de la misma.
En algunas realizaciones, cada una de las secuencias que codifica una proteína de virus del herpes o fragmento que están presentes en la molécula de ácido nucleico policistrónica está operativamente enlazada a sus propios elementos de control. Por ejemplo, cada secuencia que codifica una proteína de virus del herpes o fragmento está operativamente enlazada a su propio promotor subgenómico. De esta forma la molécula de ácido nucleico policistrónica, tal como alfavirus, puede contener dos, tres, cuatro o cinco promotores subgenómicos, cada uno de los cuales controla la expresión de una proteína virus del herpes o fragmento. Cuando este tipo de molécula de ácido nucleico policistrónica es un ARN de auto-replicación, tal replicón de alfavirus, puede empaquetarse como una VRP, o asociarse o formularse con un sistema de suministro de ARN.
PROCEDIMIENTOS Y USOS
En algunas realizaciones, las moléculas de ARN de auto-replicación o VRP se administran a un individuo para estimular una respuesta inmune. En tales realizaciones, las moléculas de ARN de auto-replicación o VRP típicamente están presentes en una composición que puede comprender un vehículo farmacéuticamente aceptable y, opcionalmente, un adyuvante. Véase, por ejemplo, los documentos U.S. 6.299.884; U.S. 7.641.911; U.S.
7.306.805; y US 2007/0207090.
La respuesta inmune puede comprender una respuesta inmune humoral, una respuesta inmune mediada por células
o ambas. En algunas realizaciones una respuesta inmune se induce contra cada proteína de CMV suministrada. Una respuesta inmune mediada por la célula puede comprender una respuesta de célula T auxiliar (Th), una respuesta de célula T citotóxica CD8+ (CTL) o ambas. En algunas realizaciones la respuesta inmune comprende una respuesta inmune humoral, y los anticuerpos son anticuerpos neutralizantes. Los anticuerpos neutralizantes bloquean la infección vírica de las células. CMV infecta las células epiteliales y también las células de fibroblasto. En algunas realizaciones la respuesta inmune reduce o previene la infección de ambos tipos celulares. Las respuestas de los anticuerpos neutralizantes pueden ser dependientes del complemento o independientes del complemento. En algunas realizaciones la respuesta del anticuerpo neutralizante es independiente del complemento. En algunas realizaciones la respuesta del anticuerpo neutralizantes es neutralizante cruzada; es decir, un anticuerpo generado contra una composición administrada que neutraliza un virus CMV de una cepa diferente de la cepa usada en la composición.
Una medición útil de la potencia del anticuerpo en la técnica es “título del 50 % de neutralización”. Para determinar el título del 50 % de neutralización, el suero de los animales inmunizados se diluye para evaluar cómo el suero diluido aún puede retener la capacidad de bloquear la entrada de 50 % de los virus en las células. Por ejemplo, una concentración de 700 significa que el suero retuvo la capacidad de neutralizar 50 % del virus después de diluirse 700 veces. De esta forma, los títulos más altos indican respuestas de anticuerpo neutralizantes más potentes. En algunas realizaciones, este título está en un intervalo que tiene un límite inferior de aproximadamente 200, aproximadamente 400, aproximadamente 600, aproximadamente 800, aproximadamente 1000, aproximadamente 1500, aproximadamente 2000, aproximadamente 2500, aproximadamente 3000, aproximadamente 3500, aproximadamente 4000, aproximadamente 4500, aproximadamente 5000, aproximadamente 5500, aproximadamente 6000, aproximadamente 6500, o aproximadamente 7000. El intervalo de 50 % del título de neutralización puede tener un límite superior de aproximadamente 400, aproximadamente 600, aproximadamente 800, aproximadamente 1000, aproximadamente 1500, aproximadamente 200, aproximadamente 2500, aproximadamente 3000, aproximadamente 3500, aproximadamente 4000, aproximadamente 4500 aproximadamente 5000, aproximadamente 5500, aproximadamente 6000, aproximadamente 6500 aproximadamente 7000, aproximadamente 8000, aproximadamente 9000, aproximadamente 10000. aproximadamente 11000, aproximadamente 12000, aproximadamente 13000, aproximadamente 14000 aproximadamente 15000, aproximadamente 16000, aproximadamente 17000, aproximadamente 18000 aproximadamente 19000, aproximadamente 20000, aproximadamente 21000, aproximadamente 22000 aproximadamente 23000, aproximadamente 24000, aproximadamente 25000, aproximadamente 26000 aproximadamente 27000, aproximadamente 28000, aproximadamente 29000, o aproximadamente 30000. Por ejemplo, el título del 50 % de neutralización puede ser de aproximadamente 3000 a aproximadamente 6500. “Aproximadamente” significa más o menos 10 % del valor mencionado. El título de neutralización puede medirse como se describe en los ejemplos específicos, a continuación.
Una respuesta inmune puede estimularse a través de la administración de VRP o ARN de auto-replicación a un individuo, típicamente un mamífero, incluyendo un humano. En algunas realizaciones la respuesta inmune inducida es una respuesta inmune protectora, es decir, la respuesta reduce el riesgo y la severidad de la infección CMV. La estimulación de una respuesta inmune protectora es particularmente deseable en algunas formaciones particularmente en riesgo de infección o enfermedad CMV. Por ejemplo, las poblaciones en riesgo incluyen pacientes con trasplante de órganos sólidos (SOP, por sus siglas en inglés), pacientes con trasplante de médula espinal, y pacientes con trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT, por sus siglas en inglés). Las VRP pueden administrarse en un pre-trasplante de donador de trasplante, o un pre- y/o post-trasplante de receptor de trasplante. Debido a la transmisión de madre a hijo es una fuente común de infantes infectados, administrando VRP o a Rn de auto-replicación a la mujer que ha quedado embaraza es particularmente útil.
Puede usarse cualquier ruta de administración adecuada. Por ejemplo, una composición puede administrarse intra­ muscularmente, intra-peritonealmente, sub-cutáneamente, o trans-dérmicamente. Algunas realizaciones se administrarán a través de una ruta intra-mucosal tal como intra-oral, intra-nasal, intra-vaginal, e intra-rectal. Las composiciones pueden administrarse de conformidad con cualquier programa adecuado.
La descripción anterior es una descripción general. Un entendimiento más completo puede obtenerse por referencia a los siguientes específicos.
Ejemplo 1
Suministro de antígenos CMV individuales usando una plataforma VRP (Ejemplo de fondo)
Cada una de las glucoproteínas de CMV gB y gH induce las respuestas neutralizantes, y gB es el antígeno dominante entre los anticuerpos en suero humano que neutraliza la infección de fibroblastos (Britt y col. (1990) J. Virol.64(3):1079-85). Los siguientes experimentos demuestran en ratones una respuesta neutralizante contra estos antígenos suministrados usando una plataforma VRP.
Cada antígeno CMV se clonó en un vector pcDNA-6His (Invitrogen) y ensayó para expresión de proteína antes de la clonación en un vector replicón de alfavirus, pVCR 2.1 SalI/XbaI derivado del plásmido descrito por Perri y col. (J. Virol 77(19)10394-10403 (2003)) produciendo los montajes mostrados en la Figura 2. pVCR 2.1 SalI/XbaI es un vector de ARN de auto-replicación que, cuando se electropora con cápside auxiliar defectuosa y ARN de glucoproteína, forma una partícula de alfavirus infecciosa.
Se usaron los vectores pVCR para producir el ARN que se electroporó en células de riñón de hámster bebe (BHKV, por sus siglas en inglés) en presencia de cápside auxiliar defectuosa y ARN de glucoproteína derivada del virus de encefalitis equina de Venezuela (VEE). Después de la electroporación, el sobrenadante que contiene las partículas de vector alfavirus (VRP, por sus siglas en inglés) secretadas se recolectó, purificó, ajustó, y utilizó para estudios de inmunización de ratón. Los ratones se inmunizaron con 1x106 unidades infecciosas (IU)/ratón en una serie de dos inmunizaciones, con tres semanas de separación. El sangrado terminal fue tres semanas después de la segunda inmunización.
VRP gB, gH y gL monocistrónicos
Se construyeron dos diferentes versiones de gB soluble: “gB sol 750” carece del dominio de extensión de transmembrana y de domino citoplasmático; y “gB sol 692” también carece de región hidrófoba (FIG. 2A) y es similar a Reap y otros montajes. También se construyó un gH soluble que carece de dominio de extensión de transmembrana y de domino citoplasmático (“gH sol 716”) (FIG. 2C). El suero de los ratones inmunizados se clasificó en varios ensayos. Los ensayos de inmunotransferencia (datos no mostrados) y de inmunofluorescencia se usaron para confirmar las respuestas de anticuerpo específicas a los antígenos. Los ensayos de neutralización se usaron para demostrar que las respuestas de anticuerpo producidas fueron capaces de neutralizar la infección por CMV.
El suero de los ratones inmunizados se examinó por inmunofluorescencia para reconocimiento de gB en células 293TR transfectadas con montajes que expresan gB-6His. Las células se sondearon con ya sea anticuerpos anti-His (“anti-6His”), un anticuerpo gB monoclonal (“anti-gB 27-156”), o se recolectaron de suero de ratón agrupado. El suero pre-inmune fue negativo en todos los casos. En las células transfectadas con montajes que expresan gB FL-6His, fijadas y permeabilizadas, la tinción anti-6His reveló un patrón de expresión de expresión de superficie con un patrón citoplasmático punteado más probablemente correspondiente a la trayectoria de tráfico endocítica/exocítica. Ambos, anti-gB 27-156 y el suero de ratón agrupado mostraron un patrón de expresión similar. El suero de los ratones inmunizados con cada uno de los VRP gB FL, VRP gB sol 750, y VRP gB sol 692 mostraron el mismo patrón de expresión.
Los ratones inmunizados con VRP gH FL y VRP gH sol 716 produjeron anticuerpos específicos para gH. El análisis de inmunofluorescencia de células 293TR transfectadas con montajes que expresan gH FL-6His detectó un fuerte reconocimiento de gH mediante anti-6His, anti-gH, y suero de ratón combinado. El suero recolectado de ratones inmunizados con VRP gL produjo una respuesta de anticuerpo específico como se determina por el análisis de inmunotransferencia e inmunofluorescencia. Los VRP gL fallaron en la producción de respuestas neutralizantes. El suero de los ratones inmunizados con VRP gB o VRP gH se analizó para la presencia de anticuerpos neutralizantes usando un ensayo de neutralización CMV. El suero a varias diluciones se pre-incubó con el virus CMV TB40UL32EGFP (“TB40-GFP,” un aislado clínico modificado para expresar GFP y después se añadió a células epiteliales ARPE-19 e incubó por 5 días. Cinco días después de la infección, las células GFP positivas se contaron. En este ensayo, las células se incubaron con suero conteniendo anticuerpos neutralizantes que tienen menos células GFP-positivas comparadas con células incubadas con el virus solo o con virus incubado con suero pre­ inmune. El suero de ratones inmunizados con VPR gB, VRP gB FL, VRP gB sol 750, o VRP gB sol 692 tuvo una fuerte actividad neutralizante en presencia de complemente de cobaya (50 % de concentración de neutralización a una dilución sérica de 1:1280-1:2560; FIG. 3). El suero de ratones inmunizados con VRP gH FL o VRP gH sol tuvo algo de actividad neutralizante que fue independiente del complemento de cobaya (FIG. 3).
Ejemplo 2
Construcción de Vectores Alfavirus Policistrónicos
CMV produce varios complejos multi-proteína durante la infección. Para determinar si un solo replicón que expresa todos los componentes de un complejo deseado puede usarse para producir el complejo CMV en un sujeto, o si los componentes del complejo podrían ser co-suministrados de múltiples vectores replicón, se diseñó una plataforma que permite la expresión controlada de múltiples proteínas de CMV.
Se modificó un vector alfavirus (pVCR 2.1 SalI/XbaI) para permitir el ensamble de múltiples promotores subgenómico (SGP, por sus siglas en inglés) y genes de interés (GOI, por sus siglas en inglés). El sitio pVCR 2.1SalI/XbaI ApaI en 11026-31 pb se cambió de GGGCCC a Gg Cg CC. Los sitios de restricción ClaI y PmlI se añadieron en la región inmediatamente en corriente abajo del primer promotor subgenómico y los sitios de inserto SalI-XbaI. La secuencia en 7727-7754 pb se cambió de ctcgatgtacttccgaggaactgatgtg a ATCGAT GTACTTCCGAGGAACT CACGTG.
Se diseñó un sistema de vector de transporte para permitir la inserción de un GOI directamente aguas abajo de un SGP usando los sitios SalI-XbaI. Se modificó pcDNA 3.1 (-)C como sigue. Se eliminaron tres sitios SalI: posiciones 1046-1051bp, 3332-3337bp y 5519-21, 1-3 pb de GTCGAC a GTCTAC. El pcDNA 3.1 (-)C se modificó para mutar un sitio Xbal en la posición 916-921 pb de TCTAGA a TCAAGA. El pcDNA 3.1 (-)C se modificó para añadir un sitio Clal y un sitio SacII en las posiciones 942-947 (ClaI) y 950-955 (SacII) pb de ctggatatctgcag a ATCGATATCCGCGG.
Una vez que se añadieron los sitios de restricción y se verificó la secuencia resultante, la región de pb 7611-7689 (ctataactctetacggctaacctgaatggactacgacatagtctagtcgaccaagcctct agacggc gcgcccaccca) se amplificó del vector alfavirus pVCR 2.1 modificado usando los siguientes iniciadores.
SGP S-X Not F Directo: 5'ATAAGAATGCGGCCGCCTATAACTCTCTACGGCTAACC3'
SGP S-X Cla R Inverso: 5'CCATCGATTGGGTGGGCGCGCCGTCTAG3' o
SGP S-X Cla F Directo: 5'CCATCGATCTATAACTCTCTACGGCTAACC3' y
SGP S-X Sac R Inverso: 5'TCCCCGCGGTGGGTGGGCGCGCCGTCTAG 3' (S SEC ID NO:____).
Las regiones amplificadas ser agregaron en el vector pcDNA 3.1(-)C modificado para formar los vectores de transporte (pcDNA SV) entre los sitios apropiados (NotI-ClaI o ClaI-SacII). La inserción de NotI-SGP Sal-Xba-ClaI forma el casete 2 de pcDNA SV, la inserción de ClaI-SGP Sal-Xba-SacII forma el casete 3 de pcDNA SV. Estos casetes SV se secuenciaron. El casete 2 de pcDNA SV contiene 12 pb adicionales entre el sitio XbaI y el sitio ClaI (CCACTGTGATCG) porque el sitio ClaI no se cortó en el vector del casete 2 de pcDNA SV. Por lo tanto se añadió un sitio PmlI. Para el casete 2 de pcDNA SV, se insertó el sitio PmlI a pb 1012 (CACGTG). Para el casete 3, se añadió el sitio PmlI a pb 935-940 (ACTGTG que se cambió a CACGTG.
Para cada vector policistrónico, el primer gen se insertó directamente en el vector modificado pVCR 2.1 usando los sitios SalI-XbaI. El segundo gen se ligó en el casete 2 de pcDNA SV usando SalI-XbaI y se extirpó usando NotI-PmlI, NotI-SacII o PCRed usando los iniciadores para NotI-ClaI y digirió usando NotI y ClaI. El insertó resultante SGP-SalI—GOI—Xba se ligó en el vector pVCR 2.1 modificado usando el sitio NotI-PmlI, NotI- SacII, o NotI-ClaI. El inserto NotI-ClaI se utilizó solamente un gen deseado en el montaje contuvo un sitio PmlI.
En algunos casos se ligó un tercer gen en el casete 3 de pcDNA SV usando SalI-XbaI y se extirpó usando PmlI-SacII o PCRed usando los iniciadores para ClaI-SacII y digirió usando ClaI y SacII. El inserto resultante SGP-SalI—GOI—XbaI se ligó en el pVCR 2.1 modificado usando PmlI-SacII o ClaI-SacII.
La digestión de SalI-XbaI se utilizó para validar la construcción del ADN del vector policistrónico. Después de la digestión con SalI-XbaI, se realizó la electroforesis en gel de agarosa para confirmar la presencia de los GOI. El ADN del vector policistrónico después se linearizó con PmeI durante la noche, purificó usando el kit de purificación PCR de Qiagen, y utilizó como plantilla para fabricar ARN usando el kit Ambion mMessage mMachine. La calidad del ARN se verificó corriendo una alícuota de muestra en el gel de agarosa de ARN.
Expresión de un Vector Policistrónico
Las proteínas fluorescentes GFP (proteína fluorescente verde) y mCherry (proteína fluorescente roja) se usaron como GOI para evaluar la capacidad del vector policistrónico para expresar dos proteínas. Se preparó un vector bicistrónico en donde GFP se expresaría usando un primer promotor y mCherry se expresaría de un segundo promotor subgenómico (FIG. 4A). Los polinucleótidos que contienen secuencias de codificación para estas proteínas se insertaron usando los sitios SalI-XbaI. El primer polinucleótido (GFP) se insertó directamente en un vector replicón de alfavirus modificado. El segundo polinucleótido (mCherry) se insertó primero en un vector de transporte que contiene un promotor subgenómico directamente en corriente abajo de la secuencia de codificación. Se aisló un fragmento que contiene ambos, el segundo promotor subgenómico y el segundo polinucleótido y se ligó en el vector replicón de alfavirus modificado conteniendo el primer polinucleótido, proporcionando un replicón de alfavirus con múltiples promotores subgenómicos.
Las VRP se produjeron en células BHKV por electroporación de ARN replicón con ARN auxiliares defectuosos para Cap y Gly. Las VRP se cosecharon 24 horas después de la electroporación y se usaron para infectar células BHKV a una multiplicidad de infección (MOI) de 20 unidades infecciosas (IU, por sus siglas en inglés) por célula.
El experimento ensayó cuatro grupos de VRP: una VRP que expresa solamente GFP; una VRP que expresa mCherry; una VRP que expresa solamente GFP y una VRP que expresa solamente mCherry, ambos a MOI de 20 IU/célula; y una VRP que contiene el vector bicistrónico GFP(1)—SGPmCherry(2). Las células BHKV infectadas con VPR se examinaron 24 horas después de la infección para determinar el porcentaje de colocación. Casi todas las células fueron positivas para GFP o mCherry cuando se infectaron individualmente. Las células infectadas con dos VRP separadas aparecieron ya sea verdes o rojas. Muy pocas células fueron amarillas, indicando que pocas células expresaron GFP y mCherry a niveles iguales y que un hubo un bajo nivel de co-infección. Estos datos se confirmaron usando el análisis FACS (FIG. 4B).
En contraste, las células infectadas con alfavirus conteniendo el vector bicistrónico GFP(1)—SGPmCherry(2) todas fueron amarillas, lo que indica una aproximadamente igual expresión de GFP y mCherry. Este estudio demuestra que múltiples proteínas pueden expresarse exitosamente de un solo vector replicón de alfavirus policistrónico.
Ejemplo 3
Producción de Complejos CMV
Este ejemplo demuestra que los complejos proteicos CMV pueden formarse en una célula después del suministro de los componentes del complejo de un vector replicón de alfavirus policistrónico.
Complejos gH/gL y gH/gL/gO
Los replicones alfavirus gH/gL y gH/gL/gO policistrónicos se construyeron como se describe anteriormente (mostrado esquemáticamente en la FIG. 5A). Las VRP conteniendo replicones de codificación gH, gL, gO, gH/gL y gH/gL/gO se produjeron en células BHKV como se describe anteriormente y se usaron para infectar células BHKV para demostrar la formación del complejo in vitro. Las células ARPE-19 infectadas con VRP produjeron complejos enlazados a disulfuro de gH/gL. gO no alteró detectablemente la asociación de gH/gL (FIG. 5B).
Los estudios de inmunofluorescencia se condujeron para evaluar la localización de gH y gL suministrados solos y cuando se suministraron usando un alfavirus policistrónico para buscar la relocalización de las proteínas cuando se co-expresan. La localización de gH no parece que cambie en presencia o ausencia de gL, o gL/gO. La localización de gL cambia en presencia de gH y gH/gO.
Finalmente, la asociación gH/gL se examinó a través de inmunoprecipitación. Se utilizó un anticuerpo gH comercial (Genway) para investigar a asociación de gH y gL. En todos los casos, el anticuerpo gH eficientemente inmunoprecipitó gH (FIG. 5C). Cundo gH no estuvo presente, gL no se inmunoprecipitó. Cuando gL se expresó en presencia de gH o gH/gO, hubo una asociación de gL con gH (FIG. 5C).
La relocalización de gL en presencia de gH y la asociación de gH/gL (con o sin gO) indica que todos los componentes de los replicones alfavirus policistrónicos se expresaron y asociaron para formar un complejo.
Ejemplo 4
Las VTP que efectúan la formación del complejo gH/gL in vitro inducen una potente respuesta inmune para CMV que es cualitativa y cuantitativamente superior a la respuesta inmune producida para VRP gB. (Ejemplo de fondo). Este ejemplo demuestra la inducción de robustas respuestas inmunes a complejos formados mediante el suministro de VRP gH/gL policistrónicos o VRP gH/gL/gO comparado con las respuestas inmunes obtenidas usando el suministro de componentes individuales VRP o VRP de componente individual administrados en combinación o para respuestas producidas por VPR gB.
Los ratones se infectaron tres veces con VRP administrados con 3 semanas de separación (106IU por ratón; 5 ratones BalbC /grupo). El suero recolectado de las inmunizaciones con VRP individuales y policistrónicos se clasificó para anticuerpos neutralizantes usando un ensayo neutralizante CMV cono se describe anteriormente. El título de neutralización se midió como sigue. Se pre-incubaron varias diluciones de suero con TB40-UL32-EGFP en presencia o ausencia de complemento de cobaya y después se agregaron a células epiteliales ARPE-19 o células de fibroblasto MRC-5 e incubaron por 5 días. Después de 5 días de la infección con el virus, se contaron las células GFP-positivas. Los resultados para las células ARPE-19 se muestran en la FIG. 6A, FIG. 6B, y FIG. 6C. Los resultados para las células MRC-5 se muestran en la FIG. 7A y FIG. 7B.
El suero de ratones inmunizados con VRP gH FL tuvieron una baja actividad neutralizante independiente del complemento (FIG. 6A y FIG. 6B). No se observó ninguna actividad neutralizante usando suero de ratones inmunizados con solamente gL o gO en presencia o ausencia de complemento de cobaya. (FIG. 6C). El suero combinado de la inmunización con varias proteínas gB CMV (gB FL, gB sol 750, y gB sol 692) demostró una fuerte actividad neutralizante en presencia de complemento de cobaya, con una concentración de neutralización de 50 % a una dilución sérica de 1:1280. Sin embargo, no hubo una actividad neutralizante en la ausencia del complemento de cobaya en células ARPE-19 para el suero gB combinado. Las VRP que expresan proteínas de CMV individuales (VRP gH- o gL- o coadministración de VRP gH-, gL-, y gO- a 106 IU/ratón/VRP) no mejoran la actividad neutralizante más allá de gH solo.
En contraste, el suero de ratones inmunizados con VRP gH/gL bicistrónico o VRP gH/gL/gO tricistrónico (1x106 IU/ratón) demostró robustas respuestas neutralizantes. Además, las respuestas fueron similares en presencia y ausencia del complemento de cobaya, mostrando que las VPR policistrónicas indujeron exitosamente una respuesta inmune independiente del complemento. (FIG. 6C.) El título de neutralización de 50 % fue 1:3500-6400+ de dilución sérica en células ARPE-19 con el virus CMV TB40-GFP. El título es aproximadamente 3-4 veces una concentración mayor que el título de 50 % de neutralización dependiente del complemento para suero combinado gB.
Los resultados en las células de fibroblasto MRC-5 fueron similares a los de las células ARPE-19 (FIGS. 7A y 7B). El suero de ratones inmunizados con VRP gH/gL bicistrónico o gH/gL/gO tricistrónico demostraron una fuerte actividad neutralizante comparados con suero de ratones inmunizados con VRP que codifican gH solo, gL solo, o gO solo y el suero de ratones inmunizados mediante la coadministración de los VRP gH y VRP gL, o la co-administración de los VRP gH, VRP gL y VRP gO. Estos resultados demuestran que la administración de las VRP policistrónicas indujo una respuesta inmune que proporciona una buena neutralización independiente del complemento de infección CMV de células de fibroblasto. Para evaluar el alcance y la potencia del suero inmune gH/gL frente a diferentes cepas de CMV, se hizo una comparación de la capacidad del suero para bloquear infección de fibroblastos y células epiteliales con seis diferentes cepas de CMV. La Figura 8 muestra que el suero gH/gL potencialmente neutraliza la infección de ambos tipos de célula con un amplio intervalo de cepas.
Estos datos también demuestran una fuerte actividad neutralizante para suero de ratones inmunizados con las VRP policistrónicas pero no con combinaciones mixtas de VRP que expresan solamente una proteína. Esto muestra los replicones policistrónicos que codifican los componentes de un complejo proteico en un solo replicón dan como resultado una eficiente producción del complejo in situ. Además, debido a que se usaron proteínas de CMV de la cepa Merlin para estimular estas respuestas, los datos in vitro obtenidos usando la el virus CMV de la cepa TB40 demuestran que los anticuerpos neutralizantes inducidos por el suministro de VRP policistrónicas con anticuerpos neutralizantes cruzados.
Ejemplo 5 (Ejemplo de fondo)
Síntesis de ARN
El ADN de plásmido que codifica replicones de alfavirus (ver Figs. 14 - 16) sirvió como una plantilla para la síntesis de ARN in vitro. Los replicones alfavirus contienen los elementos genéticos requeridos para la replicación de ARN pero carecen de aquellos productos génicos de codificación necesarios para el ensamble de la partícula; los genes estructurales del genoma alfavirus se reemplazan por secuencias que codifican una proteína heteróloga. Después del suministro de los replicones a células eucariotas, el ARN de estructura de cadena positivo ser traduce para producir cuatro proteínas no estructurales, que juntas replican el ARN genómico y transcriben abundantes ARNm subgenómicos que codifican el producto génico heterólogo o el gen de interés (GOI). Debido a la falta de expresión de las proteínas estructurales alfavirus, los replicones son incapaces de inducir la generación de partículas infecciosas. Un promotor bacteriófago (T7 o SP6) en corriente arriba del ADNc alfavirus facilita la síntesis del replicón de ARN in vitro y la ribozima del virus delta de hepatitis (HDV) inmediatamente en corriente abajo de la cola poli(A) genera el extremo 3' correcto a través de su actividad de auto-división.
Con el fin de permitir la formación de un complejo proteico antigénico, la expresión de los componentes individuales en tal complejo en la misma célula es de gran importancia. En teoría, esto puede lograrse mediante la cotransfección de las células con los genes que codifican los componentes individuales. Sin embargo, en el caso de ARN no víricos o de replicón de alfavirus suministrados con VRP, esta estrategia se obstaculiza por el ineficiente co­ suministro de múltiples ARN a la misma célula o, alternativamente, por el ineficiente lanzamiento de múltiples ARN de auto-replicación en una célula individual. Una forma potencialmente más eficiente para facilitar la co-expresión de los componentes de un complejo proteico es suministrar los genes respectivos como parte de la misma molécula de ARN de auto-replicación. En este punto, se modificaron los montajes de replicón de alfavirus que codifican múltiples genes de interés. Cada GOI fue precedido por su propio promotor subgenómico que se reconoce por la maquinaria de transcripción de alfavirus. Por lo tanto, se sintetizan múltiples especies de ARN mensajero subgenómico en una célula individual permitiendo el ensamble de complejos proteicos multi-componente.
Después de la linearización del ADN de plásmido en corriente debajo de la ribozima HDV con una endonucleasa de restricción adecuada, los transcritos que se corrieron se sintetizaron in vitro usando polimerasa de ARN dependiente de ADN derivada del bacteriófago T7. Las transcripciones se realizaron por 2 horas a 37 °C en presencia de 7.5 mM de cada uno de los trifosfatos de nucleósido (ATP, CTP, GTP y UTP) siguiendo las instrucciones provistas por el fabricante (Ambion, Austin, TX). Después de la transcripción, el ADN de plantilla se digirió con TURBO DNase (Ambion, Austin, TX). El ARN de replicón se precipitó con LiCl y reconstituyó en agua sin nucleasa. El ARN sin cubrir se selló después de la transcripción con Enzima de Cubierta de Vacuna (VCE, por sus siglas en inglés) usando el Sistema de Sellado ScriptCap m7G (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI) como se describe en el manual del usuario. El ARN sellado después de la transcripción se precipitó con LiCl y reconstituyó en agua sin nucleasa. La concentración de las muestras de ADN se determinó mediante la medición de la densidad óptica a 260 nm. La integridad de los transcritos in vitro se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizado.
Formulación de Nanopartículas Lípidas (LNP)
Se sintetizó 1,2-dilinoleiloxi-N,N-dimetil-3-aminopropano (DlinDMA) usando un procedimiento previamente publicado [Heyes, J., Palmer, L., Bremner, K., MacLachlan, I. Cationic lipid saturation influences intracellular delivery of encapsulated nucleic acids. Journal of Controlled Release, 107: 276-287 (2005)]. La 1,2-Diastearoil-sn-glicero-3-fosfocholina (DSPC) se compró de Genzyme. El colesterol se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Lois, MO). El 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-[metoxi(polietilenglicol)-2000] (sal de amonio) (PEG DMG 2000), se obtuvo de Avanti Polar Lipids.
Los LNP (RV01(14)) se formularon usando el siguiente procedimiento. Lote de 150 |jg, (fibras huecas PES y sin mustang): Se prepararon soluciones de reserva de lípido fresco en etanol. Se pesaron 37 mg de DlinDMA, 11,8 mg de DSPC, 27,8 mg de Colesterol y 8,07 mg de PEG DMG 2000 y disolvieron en 7,55 ml de etanol. La solución de reserva frescamente preparada se balanceó ligeramente a 37 °C durante aproximadamente 15 min para formar una mezcla homogénea. Después, se agregaron 453 j l de la reserva a 1,547 ml de etanol para hacer una solución de reserva de lípido operativa de 2 ml. Esta cantidad de lípidos se utilizó para formar las LNP con 150 jg de ARN a una proporción de 8:1 de N:P (Nitrógeno a Fosfato). El nitrógeno protonable en DlinDMA (el lípido catiónico) y los fosfatos en el ARN se usaron para este cálculo. Cada jg de la molécula de ARN de auto-replicación se asume que contiene 3 nmoles de fosfato aniónico, cada jg de DlinDMA se asume que contiene 1,6 nmoles de nitrógeno catiónico. También se preparó una solución de trabajo de 2 ml de ARN de una solución de reserva de ~ 1 jg /jl en 100 mM de tampón de citrato (pH 6) (Teknova). Se enjuagaron tres frascos de 20 ml (con barras de agitación) con Solución RNase Away (Molecular BioProducts) y lavaron con mucha agua MilliQ antes de uso para descontaminar los frascos de RNases. Uno de los frascos se utilizó para la solución de trabajo de ARN y las otras para recolectar las mezclas de lípido y ARN (como se describe más adelante). Las soluciones de trabajo de lípido y ARN se calentaron a 37 °C por 10 min antes de cargarse en jeringas luer-lok de 3cc (BD Medical). Se cargaron 2 ml de tampón de citrato (pH 6) en otra jeringa de 3 cc. Las jeringas con el ARN y los lípidos se conectaron a un mezclador T (empalme ID PEEK™ 500 jm ) usando tubería FEP ([etileno-propileno fluorinado] 2mm ID x 3mm OD, Idex Health Science, Oak Harbor, WA). La conexión de salida del mezclador T también fue una tubería FEP (2mm ID x 3mm). La tercera jeringa con el tampón de citrato se conectó a una pieza de tubería separada (2mm ID x 3mm DO). Todas las jeringas después se condujeron a una caudal de 7 ml/min usando una bomba de jeringa (de kdScientific, modelo N.° KDS-220). Las conexiones de salida del tubo se colocaron para recolectar las mezclas en un frasco de vidrio de 20 ml (con agitación). La barra de agitación se removió y la solución el etanol/solución acuosa se dejó equilibrar a temperatura ambiente por 1 h. Después la mezcla se cargó en una jeringa de 5 cc (BD Medical), que se adaptó a una pieza de la tubería FEP (2mm ID x 3mm OD) y en otra jeringa de 5 cc con igual longitud a la tubería FEP, se cargó un volumen igual de 100 mM de tampón de citrato (pH 6). Las dos jeringas se condujeron a una caudal de 7 ml/min usando una bomba de jeringa y se recolectó la mezcla final en un frasco de vidrio de 20 ml (con agitación). Después, las LNP se concentraron a 2 ml y se dializaron contra 10-15 volúmenes de 1X de PBS (de Teknova) usando el sistema de Filtración de Flujo Tangencial (TFF, por sus siglas en inglés) antes de recuperar el producto final. El sistema TFF y las membranas de filtración de fibra hueca se compraron de Spectrum Labs y se usaron de acuerdo con las instrucciones de fabricante. Se usaron membranas de filtración de fibra hueca número de parte P-C1-100E-100-01N) de polietersulfona (PES) (con un corte de tamaño de poro de 100 kD y 20 cm2 de área de superficie. Para los experimentos in vitro e in vivo, las formulaciones se diluyeron a la concentración de ARN requerida con 1X de PBS (de Teknova).
Tamaño de Partícula
El tamaño de partícula se midió usando un Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Worcestershire, UK) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los tamaños de partícula se reportaron como el promedio Z con el índice de polidispersidad (pdi). Los liposomas se diluyeron en 1X de PBS antes de la medición.
Eficiencia de la Encapsulación y Concentración de ARN
El porcentaje de ARN encapsulado y la concentración del ARN se determinaron mediante el kit del reactivo de ARN Quant-iT RiboGreen (Invitrogen). Se siguieron las instrucciones del fabricante en el ensayo. El estándar de ARN ribosómico provisto en el kit se utilizó para generar una curva estándar. Los LNP ya sea obtenidos del procedimiento 1 o de los procedimientos 2-5 se diluyeron diez veces o cien veces respectivamente en 1X de tampón TE (del kit), antes de la adición del colorante. De forma separada, las LNP se diluyeron diez o cien veces en 1X de tampón con 0,5 % de Triton X (Sigma-Aldrich), antes de la adición del colorante. A continuación se añadió una cantidad de colorante a cada solución y después se cargaron ~180 j l de cada solución después dela adición del colorante por duplicado en una placa de cultivo tisular de 96 cavidades (obtenida de VWR, catálogo # 353072). La fluorescencia (Ex 485 nm, Em 528 nm) se leyó en un lector de microplacas (de BioTek Instruments, Inc.).
Se utilizó Triton X para alterar las LNP, proporcionando una lectura de fluorescencia correspondiente a la cantidad de ARN total y la muestra sin Triton X proporcionó la fluorescencia correspondiente al ARN sin encapsulara. El % de encapsulación de ARN se determinó como sigue: Encapsulación de ARN LNP (%) = [(Ft-Fi)/Ft] X 100, en donde Ft es la intensidad fluorescente de las LNP con la adición de triton X y Fi es la intensidad fluorescente de la solución LNP sin la adición del detergente. Estos valores (Ft y Fi) se obtuvieron después de la sustracción de la intensidad fluorescente en blanco (1X de tampón TE). La concentración del ARN encapsulado se obtuvo comparando Ft-Fi con la curva estándar generada. Todas las formulaciones LNP se dosificaron in vivo con base en la dosis encapsulada.
Partículas de Replicón vírico (VRP)
Para comparar las vacunas de ARN con procedimientos con vectores de ARN tradicionales para obtener la expresión in vivo de los genes o antígenos reporteros, se usaron partículas de replicón vírico (VRP), producidas en células BHK a través de los procedimientos descritos por Perri y col. (J. Virol 77(19):10394-10403 (2003)), codificando para la expresión de los mismos antígenos como los montajes de ARN correspondientes. En este sistema, el antígeno consistió de replicones quiméricos alfavirus (VCR) derivados del genoma del virus de encefalitis equina de Venezuela (VEEV) modificado para contener las secuencias 3' terminal (3' UTR) del virus Sindbis virus y una señal empacada del virus Sindbis (PS) (ver Fig. 2 de Perri y col.). Los replicones se empacaron en VRP electroporándolos en células de riñón de hámster bebe (BHK) junto con ARN auxiliares defectuosos que codifican la cápside del virus Sindbis y genes de glucoproteína (ver Fig. 2 de Perri y col.). Las VRP después se cosecharon y purificaron parcialmente por ultracentrifugación en un cojín de sacarosa y se concentraron en un concentrador Amicon. La reserva VRP resultante se tituló mediante procedimientos estándar e inoculó en animales en fluido de cultivo u otros tampones isotónicos. Una quimera de partícula de replicón de alfavirus derivada de encefalitis equina venezolana y virus sindbis es un vector de suministro de vacunas a base de gen muy potente. J. Virol. 77, 10394­ 10403.
Estudios de Inmunogenicidad Murinos
Se inmunizaron grupos de 10 ratones hembra BALB/c con de 8-10 semanas de edad y pesando aproximadamente 20 g con 1x106 IU (VRP) o 1.0 |jg (ARN) en el día 0, 21 y 42 con sangrados tomados 3 semanas después de la 2a y 3a semanas después de la 3a vacunación. Todos los animales se inyectaron en el cuádriceps en las dos patas traseras, cada una obteniendo un volumen equivalente (50 j l por sitio).
Ensayo de Micro-Neutralización
Se ensayaron muestras séricas para la presencia de anticuerpos neutralizantes mediante una prueba de neutralización por reducción. Las diluciones seriales dobles de suero HI (en DMEM con 10 % HI de FBS) se agregaron a un volumen igual de CMV (cepa TB40 o aislado clínico 8819) previamente titulados para dar aproximadamente 200 IU/50 ml. Las cepas VR1814, Towne, AD169 y los aislados clínicos 8822 también se usaron. Las mezclas de suero/virus se incubaron por 2 horas a 37 °C y 5 % de CO2, para dejar que ocurriera la neutralización del virus, y después se inocularon 50 ml de esta mezcla (con aproximadamente 200 IU) en cavidades por duplicado de células ARPE-19 en placas de 96 medias cavidades. Las placas se incubaron por 40-44 horas. A menos que se indique lo contrario, el número de sitios infectados positivos se determinó por inmunotinción con un anticuerpo monoclonal IE1 CMV conjugado con AlexaFluor 488 seguido por el conteo automático. El título de neutralización se define como el recíproco de la dilución sérica produciendo un 50 % de reducción en el número de sitios de virus positivos por cavidad, con relación a los controles (sin suero).
Inmunogenicidad de VRP gH/gL y ARN formulado con LNP
El replicón A323 que expresa la glucoproteína B de superficie (gB) de CMV, el replicón A160 que expresa el complejo de membrana de las glucoproteínas H y L de longitud completa (gH/gL) y el replicón A322 que expresa el complejo de membrana de la forma soluble de las glucoproteínas H y L (gHsol/gL) de usaron para este experimento. A ratones BALB/c, 10 animales por grupo, se les dieron vacunaciones intramusculares bilaterales (50 j l por pata) en los días 0, 21 y 42 con VRP que expresan gB (1x106 IU), VRP que expresan gH/gL (1x106 IU), VRP que expresan gHsol/gL (1x106 IU) y PBS como los controles. Los tres grupos de prueba recibieron ARN de auto-replicación (A160, A322 o A323) formulado en LNP (RV01(14). El suero se recolectó para análisis inmunológico en los días 39 (3wp2) y 63 (3wp3).
Resultados
La clasificación y el porcentaje de ARN encapsulado en las formulaciones RV01(14) hechas para el experimento se muestran en la Tabla 3.
Figure imgf000034_0001
El 50 % de títulos neutralizantes para el suero terminal (día 63, tres semanas después de la vacunación final) se muestran en la Tabla 4.
Figure imgf000034_0002
Figure imgf000035_0002
ARN que expresa una forma de longitud completa o presunta forma soluble del complejo HCMV gH/gL produce altas concentraciones de anticuerpo neutralizante, como se ensaya en células epiteliales usando dos diferentes cepas HCMV. Estas concentraciones promedio de los ARN gH/gL no son al menos tan altas como la concentración promedio para los VRP gH/gL correspondientes (véase la FIG. 17).
Ejemplo 6 Proteínas de CMV que Codifican Ácidos Nucleicos Bicistrónicos y Pentacistrónicos
Se prepararon replicones alfavirus bicistrónicos y pentacistrónicos adicionales que expresan complejos de glucoproteína de citomegalovirus humano (HCMV), y se muestran esquemáticamente en las FIGS. 18 y 20. Los replicones alfavirus se basaron en el virus de encefalitis equina venezolano (VEE). Los replicones se empacaron en partículas de replicones víricos (VRP), encapsularon en nanopartículas de lípidos (LNP), o formularon con una nanoemulsión catiónica (CNE). La expresión de las proteínas HCMV codificadas y los complejos proteicos de cada uno de los replicones se confirmó por inmunotransferencia, co-inmunoprecipitación, y citometría de flujo. La citometría de flujo se utilizó para verificar la expresión del complejo pentamérico gH/gL/UL128/UL130/UL131 de replicones pentaméricos que codifican los componentes de la proteína del complejo, usando anticuerpos monoclonales humanos específicos para los epítopos conformacionales presentes en el complejo pentamérico (Macagno y col. (2010), J. Virol. 84(2):1005-13). La FiG. 19 muestra que estos anticuerpos se unen a células BHKV transfectadas con el ARN replicón que expresa el complejo pentamérico HCMV gH/gL/UL128/UL130/UL131 (A527). Se obtuvieron resultados similares cuando las células se infectaron con VRP hechas del mismo montaje replicón. Esto muestra que los replicones designados para expresar el complejo pentamérico ciertamente expresan el antígeno deseado y no el subproducto potencial gH/gL.
Las VRP, el ARN encapsulado en las LNP, y el ARN formulado con CNE se usaron para inmunizar ratones Balb/c por inyecciones intramusculares en los cuádriceps traseros. Los ratones se inmunizaron tres veces, con 3 semanas de separación, y las muestras séricas se recolectaron antes de cada inmunización también con tres semanas de diferencia después de la tercera y la final inmunización. El suero se evaluó en ensayos de micro-neutralización para medir la potencia de la respuesta del anticuerpo neutralizante que se produjo por las vacunaciones. Los títulos se expresaron como 50 % de título de neutralización.
Se evaluó la inmunogenicidad de un número de diferentes configuraciones de un casete de expresión bicistrónico para un complejo soluble HCMV gH/gL en VRP. La FIG. 20 muestra que las VRP que expresan el complejo gH/gL de longitud completa, anclado a membrana, produjo potentes anticuerpos neutralizantes a concentraciones ligeramente más altas que el complejo soluble (gHsol/gL) expresado de un casete de expresión bicistrónico similar. Cambiando el orden de los genes que codifican gHsol y gL o reemplazando uno de los promotores subgenómicos con un IRES o sitio FMDV 2A no mejora sustancialmente la inmunogenicidad.
El alcance y la potencia de la actividad neutralizante de HCMV en suero de ratones inmunizados con VRP VEE/SIN que expresan gH/gL se evaluaron usando el suero para bloquear la infección de fibroblastos y células epiteliales con diferentes cepas de HCMV. La Tabla 5 muestra gH/gL inmuniza el suero ampliamente y lo neutraliza potencialmente frente a seis diferentes cepas de HCMV en ambos tipos celulares en la ausencia del complemento. La adición del complemento tuvo un efecto ligeramente negativo en la potencia de la neutralización del suero.
Figure imgf000035_0001
Se evaluó la inmunogenicidad de ARN encapsulados en LNP que codifican el complejo pentamérico (A526 y A527) comparada con el ARN encapsulado con lNp (A160) y las v Rp (gH-SGPgL modificado con pVCR) que expresan gH/gL. La Tabla 6 shows que los replicones que expresan el complejo pentamérico produjeron potencialmente más anticuerpos neutralizantes que replicones que expresan gH/gL.
Figure imgf000036_0001
El replicón ARN a base de VEE pentacistrónico que provocó los títulos más altos de anticuerpos neutralizantes (A527) se empaquetó como VRP y la inmunogenicidad de las VRP se comparó con las VRP que expresan gH/gL y replicones encapsulados LNP que expresan gH/gL y el complejo pentamérico. La Tabla 7 muestra que las VRP que expresan el complejo pentamérico produjeron títulos más altos de anticuerpos neutralizantes que las VRP que expresan gH/gL. Además, 106 unidades infecciosas de VRP son al menos tan potentes como 1 |jg de ARN encapsulado en LNP cuando las VRP y el ARN codifican los mismos complejos proteicos.
Figure imgf000036_0002
El alcance y la potencia de la actividad neutralizante de HCMV en suero de ratones inmunizados con ARN con base en VEE que codifica el complejo pentamérico (A527) se evaluó usando el suero para bloquear la infección de los fibroblastos y las células epiteliales con diferentes cepas de HCMV. La Tabla 8 muestra que suero inmune antigH/gL/UL128/UL130/UL131 amplia y potencialmente neutralizó la infección de las células epiteliales. Este efecto fue independiente del complemento. En contraste, el suero tuvo un efecto reducido o no detectable en la infección de los fibroblastos. Estos resultados fueron lo que se esperaba para suero inmune que contiene en su mayor parte anticuerpos específicos para el complejo pentamérico gH/gL/UL128/UL130/UL131, porque el complejo pentamérico no se requiere para la infección de los fibroblastos y, en consecuencia, los anticuerpos para UL128, UL130, y UL131 no bloquean la infección de los fibroblastos (Adler y col. (2006), J. Gen. Virol. 87(Pt.9):2451-60; Wang y Shenk (2005), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102(50):18153-8). De esta forma, estos datos demuestran que los replicones pentaméricos que codifican el complejo pentamérico gH/gL/UL128/UL130/UL131pentameric específicamente producen anticuerpos para para el complejo in vivo.
Figure imgf000036_0003
Figure imgf000037_0001
Para ver si los replicones bicistrónicos y pentacistrónicos que expresan los complejos gH/gL y pentamérico producirían anticuerpos neutralizantes en diferentes formulaciones, se inmunizaron ratas de algodón con replicones bicistrónicos o pentacistrónicos mezclados con una nanoemulsión catiónica (CNE, por sus siglas en inglés). La Tabla 9 muestra que los replicones en CNE produjeron concentraciones de anticuerpos neutralizantes comparables a los mismos replicones encapsulados en lNp .
Figure imgf000037_0002
Ejemplo 7. Replicones que codifican proteínas VVZ
Los ácidos nucleicos que codifican proteínas VVZ se clonaron en un vector replicón VEE para producir replicones monocistrónicos que codifican gB, gH, gL, gE, y gI, y para producir replicones bicistrónicos que codifican gH/gL o gE/gI. En los replicones bicistrónicos, la expresión de cada marco de lectura abierto VVZ se condujo por medio de un promotor subgenómico separado.
Para preparar el ARN replicón, el plásmido que codifica el replicón se linearizó por digestión con PmeI, y el plásmido linearizado se extrajo con fenol/cloroformo/isoamil alcohol, se precipitó en acetato de sodio/etanol y volvió a suspender en 20 pl de agua sin RNasa.
El ARN se preparó por transcripción in vitro de 1 pg de ADN linearizado usando el kit MEGAscript T7 (AMBION# AM1333). Después se determinó una reacción de 2o pl de acuerdo con las instrucciones del fabricante sin análogo de tapa y se incubó por 2 horas 32 °C. Se añadió TURBO DNase (1 pl) y la mezcla se incubó por 30 minutos a 32 °C. Se añadió la solución de agua sin RNasa (30 pl) y acetato de amonio (30 pl). La solución se mezcló y enfrió durante al menos 30 min a -20 °C. Después la solución se centrifugó a máxima velocidad por 25 minutos a 4 °C. El sobrenadante se descartó, y los gránulos se enjuagaron con 70 % de etanol, y se nuevo se centrifugaron a máxima velocidad durante 10 minutos a 4 °C. Los gránulos se secaron con aire y se volvieron a suspender en 50 pl de agua sin RNasa. La concentración del ARN se midió y la calidad se verificó en un gel desnaturalizado.
El ARN se tapó usando el Sistema de Sellado ScriptCap m7G (Epicentre #SCCE0625). La reacción se escaló combinando el ARN y el agua sin RNasa. El ARN después se desnaturalizó por 5-10 minutos a 65 °C. El ARN desnaturalizado se transfirió rápidamente a hielo y se agregaron los siguientes reactivos en el siguiente orden: Tampón de sellado ScriptCap, 10 mM GTP, 2 mM de SAM recién preparado, inhibidor RNasa ScriptGuard, y Enzima de Sellado ScriptCap. La mezcla se incubó por 60 minutos a 37 °C. La reacción se detuvo mediante la adición de agua sin RNasa y 7,5 M de LiCl, mezclando bien y almacenando la mezcla durante al menos 30 min a -20 °C. Después, la mezcla se centrifugó a velocidad máxima durante 25 minutos a 4 °C, los gránulos se enjuagaron con 70 % de etanol, se volvieron a centrifugar a máxima velocidad por 10 minutos a 4 °C y los gránulos se secaron con aire. Los gránulos se volvieron a suspender en agua sin RNasa. La concentración del ARN se midió y la calidad se verificó en un gel desnaturalizado.
Transfección del ARN
Las células (células BHK-V) se sembraron en placas de 6 cavidades llevadas a una confluencia de 90-95 % en el momento de la transfección. Para cada transfección se diluyeron 3 pg de ARN en 50 ml de medio OPTIMEM en un primer tubo. Se añadió lipofectamina 2000 a un segundo tubo con 50 ml de medio OPTIMEM. El primero y segundo tubos se combinaron y mantuvieron por 20 minutos a temperatura ambiente. El medio de cultivo en placas de 6 cavidades se reemplazó con medio fresco, el complejo de ARN-Lipofectamina se colocó en las células, y se mezcló haciendo oscilar ligeramente la placa. Las placas se incubaron por 24 horas a 37 °C en una incubadora con CO2. La expresión de las proteínas VVZ en las células transferidas se evaluó por Transferencia Western e inmunofluorescencia. Para los Transferencias Western, los lisados de células transfectadas se separaron por electroforesis (5 pg de proteína total/carril) y se tiñeron. Se utilizó una suspensión vírica aclarada (7 pg de proteína total/carril) derivada de la cepa de la vacuna OKA/Merck como un control positivo. Las tinciones se sondearon usando anticuerpos disponibles en el mercado (dilución 1:1000) que se unen a las proteínas VVZ.
Para inmunofluorescencia, las células transfectadas se cosecharon y sembraron en una placa de 96 cavidades, y se llevó a cabo la tinción intracelular usando mAbs de ratón disponibles en el mercado (intervalo de dilución 1:100 1:400). Los granulados de célula se fijaron y permeabilizaron con soluciones Citofix-Citoperm. Se utilizó un reactivo secundario, F(ab')2 de anti-ratón de cabra marcado con Alexa488 (1:400 de dilución final).
La expresión de gE y gI de proteínas VVZ se detectó en células transfectadas con montajes monocistrónicos (gE o gI), y la expresión de ambas gE y gI se detectó en células transfectadas con un montaje bicistrónico gE/gI en Transferencias Western usando anticuerpos de ratón disponibles en el mercado, 13B1 para gE y 8C4 para gI. La expresión de gB de la proteína VVZ se detectó en células transfectadas con un montaje monocistrónico que codifica gB, por inmunofluorescencia usando el anticuerpo 10G6 comercialmente disponible. La expresión del complejo gH/gL de la proteína VVZ se detectó por inmunofluorescencia en células transfectadas con gH monocistrónico y gL monocistrónico, o con un montaje gH/gL bicistrónico. El complejo gH/gL se detectó usando el anticuerpo SG3 comercialmente disponible.
Estudios de inmunogenicidad murinos
Se inmunizaron grupos de ocho ratones BALB/c hembra de 6-8 semanas de edad y con un peso de aproximadamente 20 g intramuscularmente con 7,0 o 1,0 |jg de ARN replicón formulado con CNE o LNP (RV01) en el día 0, 21 y 42. Las muestras de sangre se tomaron de los animales inmunizados 3 semanas después de la 2a inmunización y 3 semanas después de la 3a inmunización. Los grupos se muestran en la Tabla 10.
Figure imgf000038_0001
Respuesta inmune a antígenos VVZ
Las muestras séricas se ensayaron para la presencia de anticuerpos para gB, por tinción intracelular de células MCR-5 transfectadas con replicón VVZ. Las células MRC-5 se mantuvieron en Medio Eagle Modificado de Dulbecco con 10 % de suero de bovino fetal. La vacuna de la cepa VVZ (obtenida de ATCC) se utilizó para infectar el cultivo de la célula MRC-5 culture y se usaron células enteras infectadas para el sub-pasaje del virus. La proporción entre las células infectadas y no infectadas fue 1:10. Treinta horas después de la infección las células se dispersaron con tripsina para sembrarlas en una placa de 96 cavidades para llevar a cabo la tinción intracelular con combinaciones de suero de ratones (intervalo de dilución 1:200 a 1:800) obtenido después de la inmunización. Los mAbs comerciales se usaron como controles para cuantificar el nivel de infección. Los granulados de células se fijaron y permeabilizaron con soluciones Citofix-Citoperm. Se utilizó un reactivo secundario, F(ab')2 anti-ratón de cabra marcado con Alexa488 (dilución final 1:400).
Se usaron los anticuerpos comerciales para gB (10G6), gH (SG3), y gE (13B1 (SBA) y 8612 (Millipore)) como controles positivos, y cada una de las células MRC-5 infectadas teñidas intracelularmente. El suero inmune obtenido 3 semanas después de la tercera inmunización con ya sea 1 o 7 |jg de ARN formulado con CNE o LNP se diluyó 1/200, 1/400 y 1/800 y utilizó para teñir intracelularmente las células MRC-5 infectadas. Los resultados se muestran en la FIG. 21 (Estudio 1, grupos 1, 5, 7, 9, 11, 13 y 15, formulación CNE) y FIG. 22 (Estudio 2, grupos 1-7, formulación LNP).
Ensayo de Neutralización
El suero de cada ratón inmunizado se diluyó en serie en aumentos dobles partiendo de 1:20 en medio de cultivo estándar, y se añadió a un volumen igual de suspensión VVZ en presencia de complemento de cobaya. Después de 1 hora de incubación a 37 °C, se añadió la línea de células epiteliales humanas A549. Las células infectadas pueden medirse después de una semana del cultivo contando las placas formadas en el cultivo bajo el microscopio. Del número de placas se calculó el % de inhibición en cada dilución sérica. Se hizo una gráfica de cada muestra sérica graficando el valor del % de inhibición contra la escala logarítmica del factor de dilución. Posteriormente se trazó una línea aproximada de la relación entre el factor de dilución y el % de inhibición. Después se determinó el 50 % del título de neutralización como el factor de dilución en donde la línea cruzó el valor del 50 % de inhibición.
La Tabla 11 muestra que el suero obtenido de ratones inmunizados con gE monocistrónico, gE/gI bicistrónico, y gH/gL bicistrónico contenían títulos robustos del anticuerpo neutralizante.
Figure imgf000039_0001
REFERENCIAS
Britt WJ, Alford CA. Cytomegalovirus. In Fields BN, Knipe DM, Howley PM (ed.). Fields Virology, 3a edición, Philadelphia, PA: Lippincott/Raven; 1996. p.2493-523.
Chee MS, Bankier AT, Beck S, Bohni R, Brown CM, Cerny R, Horsnell T, Hutchinson CA, Kouzarides T, Martignetti JA, Preddie E, Satchwell SC, Tomlinson P, Weston KM y Barrell BG. 1990. Analysis of the proteincoding content of the sequence of human cytomegalovirus strain AD169. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 154:125-70.
Davison AJ, Dolan A, Akter P, Addison C, Dargan DJ, Alcendor DJ, McGeoch DJ y Hayward GS. 2003. The human cytomegalovirus genome revisited: comparison with the chimpanzee cytomegalovirus genome. J. Gen. Virol. 84:17-28. (Erratum, 84:1053).
Crumpacker CS y Wadhwa S. 2005. Cytomegalovirus, p 1786-1800. In G.L. Mandell, J.E. Bennett, y R. Dolin (ed.), Principles y practice of infectious diseases, vol 2. Elsevier, Philadelphia, PA.
Pomeroy C y Englund JA. 1987. Cyotmegalovirus: epidemiology y infection control. Am J Infect Control 15: 107119.
Murphy E, Yu D, Grimwood J, Schmutz J, Dickson M, Jarvis MA, Nelson JA, Myers RM y Shenk TE. 2003. Coding potential of laboratory and clinical strains of cytomegalovirus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:14976-81. Mocarski ES y Tan Courcelle C. 2001. Cytomegalovirus and their replication, p. 2629-73. In DM Knipe y PM Howley (ed.) Fields Virology, 4a edición, vol. 2. Lippincott Williams y Wilkins, Philadelphia, PA.
Compton T. 2004. Receptors y immune sensors: the complex entry path of human cytomegalovirus. Trends Cell. Bio. 14(1): 5-8.
Britt WJ y Alford CA. 2004. Human cytomegalovirus virion proteins. Hum. Immunol. 65:395-402.
Varnum SM, Streblow DN, Monroe ME, Smith P, Auberry KJ, Pasa-Tolic L, Wang D, Camp II DG, Rodland K, Wiley, Britt W, Shenk T, Smith RD y Nelson JA. 2004. Identification of proteins in human cytomegalovirus (HCMV) particles: the HCMV proteome. J. Virol. 78:10960-66. (Erratum, 78:13395).
Ljungman P, Griffiths P y Paya C. 2002. Definitions of cytomegalovirus infection and disease in transplant recipients. Clin. Infect. Dis. 34:1094-97.
Rubin R. 2002. Clinical approach to infection in the compromised host, p. 573-679. In R. Rubin and LS Young (ed), Infection in the organ transplant recipient. Kluwer Academic Press, New York, NY.
Stagno S y Britt WJ. 2005. Cytomegalovirus, p. 389-424. In JS Remington and JO Klein (ed), Infectious diseases of the fetus and newborn infant, 6htt edición. Wb Saunders, Phliadelphia, PA.
Britt WJ, Vugler L, Butfiloski EJ y Stephens EB. 1990. Cell surface expression of human cytomegalovirus (HCMV) gp55-116 (gB): use of HCMV-vaccinia recombinant virus infected cells in analysis of the human neutralizing antibody response. J. Virol. 64:1079-85.
Reap EA, Dryga SA, Morris J, Rivers B, Norberg PK, Olmsted RA y Chulay JD. 2007. Cellular and Humoral Immune Responses to Alphavirus Replicon Vaccines expressing Cytomegalovirus pp65, IL1 y gB proteins. Clin. Vacc. Immunol. 14:748-55.
Balasuriya UBR, Heidner HW, Hedges JF, Williams JC, Davis NL, Johnston RE y MacLachlan NJ. 2000. Expression of the two major envelope proteins of equine arteritis virus as a heterodimer is necessary for induction of anticuerpos neutralizantes in ratones inmunizados with recombinant Venezuelan equine encephalitis virus replicon particles. J. Virol. 74:10623-30.
Dunn W, Chou C, Li H, Hai R, Patterson D, Stoic V, Zhu H y Liu F. 2003. Functional profiling of a human cytomegalovirus genome. Proc. Natl. Acad. Sci USA 100:14223-28.
Hobom U, Brune W, Messerle M, Hahn G y Kosinowski UH. 2000. Fast screening procedures for random transposon llibraries of cloned virus del herpes genomes: mutational analysis of human cytomegalovirus envelope glycoprotein genes. J. Virol. 74:7720-29.
Ryckman BJ, Chase MC y Johnson DC. 2009. HCMV TR strain glycoprotein O acts as a chaperone promoting gH/gL incorporation into virions, but is not present in virions. J. Virol.
Wille PT, Knoche AJ, Nelson JA, Jarvis MA y Johnson JC. 2009. An HCMV gO-null mutant fails to incorporate gH/gL into the virion envelope and is unable to enter fibroblastos, epithelial, y endothelial cells. J. Virol.
Shimamura M, Mach M y Britt WJ. 2006. Human Cytomegalovirus infection elicits a glycoprotein M (gM)/gN-specific virus-neutralizing antibody response. J. Virol. 80:4591-4600.
Cha TA, Tom E, Kemble GW, Duke GM, Mocarski ES y Spaete RR. 1996. Human cytomegalovirus clinical isolates carry at least 19 genes not found in laboratory strains. J. Virol. 70:78-83.
Wang D y Shenk T. 2005. Human cytomegalovirus virion protein complex required for epithelial y endothelial cell tropism. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102:18153-58.
Adler B, Scrivano L, Ruzcics Z, Rupp B, Sinzger C y Kosinowski U. 2006. Role of human cytomegalovirus UL131A in cell type-specific virus entry and release. J. Gen. Virol. 87:2451-60.
Ryckman BJ, Rainish BL, Chase MC, Borton JA, Nelson JA, Jarvis JA y Johnson DC. 2008. Characterization of the human cytomegalovirus gH/gL/UL128-UL131 complex that mediates entry into epithelial y endothelial cells. J. Virol. 82: 60-70.
SECUENCIAS
Figure imgf000041_0001
Figure imgf000042_0001
Figure imgf000043_0001
Figure imgf000044_0001
Figure imgf000045_0001
Figure imgf000046_0001
Figure imgf000047_0001
g c a g g c g a
E
A
c t c g a g a g
c
Figure imgf000048_0001
g
Figure imgf000049_0001
Figure imgf000050_0001
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001
Figure imgf000053_0001
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000055_0001
Figure imgf000056_0001
Figure imgf000057_0001
Figure imgf000058_0001
Figure imgf000059_0001
Figure imgf000060_0001
Figure imgf000061_0001
Figure imgf000062_0001
Figure imgf000063_0001
Figure imgf000064_0001
Figure imgf000065_0001
Figure imgf000066_0001
Figure imgf000067_0001
Figure imgf000068_0001
Figure imgf000069_0001
Figure imgf000070_0001
Figure imgf000071_0001
Figure imgf000072_0001
Figure imgf000073_0001
Figure imgf000074_0001
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
Figure imgf000077_0001
Figure imgf000078_0001
Figure imgf000079_0001
Figure imgf000080_0001
Figure imgf000081_0001
Figure imgf000082_0001
Figure imgf000083_0001
Figure imgf000084_0001
Figure imgf000085_0001
Figure imgf000086_0001
Figure imgf000087_0001
Figure imgf000088_0001
Figure imgf000089_0001
Figure imgf000090_0001
Figure imgf000091_0001
Figure imgf000092_0001
Figure imgf000093_0001
Figure imgf000094_0001
Figure imgf000095_0001
Figure imgf000096_0001
Figure imgf000097_0001
Figure imgf000098_0001
Figure imgf000099_0001
Figure imgf000100_0001
Figure imgf000101_0001
Figure imgf000102_0001
Figure imgf000103_0001
Figure imgf000104_0001
Figure imgf000105_0001
Figure imgf000106_0001
Figure imgf000107_0001
Figure imgf000108_0001
Figure imgf000109_0001
Figure imgf000110_0001
Figure imgf000111_0001
Figure imgf000112_0001
Figure imgf000113_0001
Figure imgf000114_0001
Figure imgf000115_0001
Figure imgf000116_0001
Figure imgf000117_0001
Figure imgf000118_0001
Figure imgf000119_0001
Figure imgf000120_0001
Figure imgf000121_0001
Figure imgf000122_0001
Figure imgf000123_0001
Figure imgf000124_0001
Figure imgf000125_0001
Figure imgf000126_0001
Figure imgf000127_0001
Figure imgf000128_0001
Figure imgf000129_0001
Figure imgf000130_0001
Figure imgf000131_0001
Figure imgf000132_0001
Figure imgf000133_0001
Figure imgf000134_0001
Figure imgf000135_0001
Figure imgf000136_0001
Figure imgf000137_0001
Figure imgf000138_0001
Figure imgf000139_0001
Figure imgf000140_0001
Figure imgf000141_0001
Figure imgf000142_0001
Figure imgf000143_0001
Figure imgf000144_0001
Figure imgf000145_0001
Figure imgf000146_0001
Figure imgf000147_0001
Figure imgf000148_0001
Figure imgf000149_0001
Figure imgf000150_0001
Figure imgf000151_0001
Figure imgf000152_0001
Figure imgf000153_0001
Figure imgf000154_0001
Figure imgf000155_0001
Figure imgf000156_0001
Figure imgf000157_0001
Figure imgf000158_0001
Figure imgf000159_0001

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Una molécula de ARN de auto-replicación que comprende un polinucleótido que comprende:
a. una primera secuencia de nucleótidos que codifica una primera proteína o un fragmento de la misma de un virus del herpes;
b. una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una segunda proteína o un fragmento de la misma de dicho virus del herpes;
c. una tercera secuencia de nucleótidos que codifica una tercera proteína o un fragmento de la misma de dicho virus del herpes;
d. una cuarta secuencia de nucleótidos que codifica una cuarta proteína o un fragmento de la misma de dicho virus del herpes; y
e. una quinta secuencia de nucleótidos que codifica una quinta proteína o un fragmento de la misma de dicho virus del herpes;
en la que la primera proteína o fragmento de la misma, segunda proteína o fragmento de la misma, tercera proteína o fragmento de la misma, cuarta proteína o fragmento de la misma y quinta proteína o fragmento de la misma son proteínas del virus del herpes que forman complejos pentaméricos entre sí; y
en la que la primera secuencia de nucleótidos, la segunda de nucleótido, la tercera secuencia de nucleótidos, la cuarta secuencia de nucleótidos y la quinta secuencia de nucleótidos están operativamente enlazadas a uno o más elementos de control de tal forma que cuando se introduce la molécula de ARN de auto-replicación en una célula adecuada, la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas del virus del herpes o fragmentos de las mismas se producen en una cantidad suficiente para la formación de un complejo en la célula que contiene la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas o fragmentos.
2. La molécula de ARN de auto-replicación de la reivindicación 1, con la condición de que la primera proteína, la segunda proteína, la tercera proteína, la cuarta proteína y la quinta proteína no son la misma proteína o fragmentos de la misma proteína, ni un fragmento unas de otras.
3. La molécula de ARN de auto-replicación de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que el virus del herpes es citomegalovirus (CMV) o el virus de varicela zoster (VVZ).
4. La molécula de ARN de auto-replicación de la reivindicación 3, en la que el virus del herpes es CMV y:
a. la primera proteína o fragmento, la segunda proteína o fragmento, la tercera proteína o fragmento, la cuarta proteína o fragmento y la quinta proteína o fragmento se seleccionan independientemente del grupo que consiste en gB, gH, gL; gO; gM; gN; UL128, UL130, UL131 y un fragmento de uno cualquiera de los anteriores; o b. la primera proteína o fragmento es gH o un fragmento de la misma y la segunda proteína o fragmento es gL o un fragmento de la misma, la tercera proteína o fragmento es UL128 o un fragmento de la misma, la cuarta proteína o fragmento es UL130 o un fragmento de la misma y la quinta proteína o fragmento es UL131 o un fragmento de la misma.
5. La molécula de ARN de auto-replicación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que la molécula de ARN de auto-replicación es un replicón de alfavirus.
6. Una partícula de replicón de alfavirus que comprende el replicón de alfavirus de la reivindicación 5.
7. Una composición que comprende la partícula de replicón de alfavirus de la reivindicación 6, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. Una composición que comprende el ARN de auto-replicación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y un vehículo farmacéuticamente aceptable, opcionalmente que comprende además un sistema de suministro de ARN.
9. Un procedimiento in v itro para formar un complejo proteico, que comprende suministrar el ARN de autoreplicación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la partícula de replicón de alfavirus de la reivindicación 6 a una célula, y mantener la célula en condiciones adecuadas para la expresión de dicho ARN de auto-replicación, en el que se forma un complejo proteico que contiene la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas, o fragmentos de las mismas.
10. El ARN de auto-replicación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la partícula de replicón de alfavirus de la reivindicación 6, para su uso en un procedimiento de formación de un complejo proteico, que comprende suministrar el ARN de auto-replicación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la partícula de replicón de alfavirus de la reivindicación 6 a una célula, y mantener la célula en condiciones adecuadas para la expresión de dicho ARN de auto-replicación, en el que se forma un complejo proteico que contiene la primera, la segunda, la tercera, la cuarta y la quinta proteínas, o fragmentos de las mismas.
11. Una molécula de ADN recombinante que codifica la molécula de ARN de auto-replicación de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
12. El ARN de auto-replicación de cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o la partícula de replicón de alfavirus de la reivindicación 6 o una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 7-8 para su uso en la inducción de una respuesta inmune en un individuo.
ES11785510T 2010-10-11 2011-10-11 Plataformas de suministro de antígenos Active ES2716243T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US39196010P 2010-10-11 2010-10-11
PCT/US2011/055834 WO2012051211A2 (en) 2010-10-11 2011-10-11 Antigen delivery platforms

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2716243T3 true ES2716243T3 (es) 2019-06-11

Family

ID=45002110

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18212078T Active ES2945135T3 (es) 2010-10-11 2011-10-11 Plataformas de suministro de antígenos
ES11785510T Active ES2716243T3 (es) 2010-10-11 2011-10-11 Plataformas de suministro de antígenos

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES18212078T Active ES2945135T3 (es) 2010-10-11 2011-10-11 Plataformas de suministro de antígenos

Country Status (15)

Country Link
US (5) US20140030292A1 (es)
EP (4) EP3520813B1 (es)
JP (3) JP2013544504A (es)
KR (2) KR102162111B1 (es)
CN (1) CN103269713B (es)
AU (2) AU2011316707A1 (es)
BR (1) BR112013008700B8 (es)
CA (1) CA2814386C (es)
CL (1) CL2013000984A1 (es)
ES (2) ES2945135T3 (es)
MX (1) MX363307B (es)
RU (1) RU2597974C2 (es)
TR (1) TR201903651T4 (es)
WO (1) WO2012051211A2 (es)
ZA (1) ZA201302548B (es)

Families Citing this family (69)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8580276B2 (en) 2009-06-05 2013-11-12 City Of Hope Genetically stable recombinant modified vaccinia ankara (rMVA) vaccines and methods of preparation thereof
JP5940064B2 (ja) 2010-07-06 2016-06-29 ノバルティス アーゲー 低用量のｒｎａを用いた大型哺乳動物の免疫化
RS54489B1 (sr) 2010-07-06 2016-06-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lipozomi sa lipidima koji imaju poboljšanu pka vrednost za oslobađanje rnk
HUE047796T2 (hu) 2010-07-06 2020-05-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNS bevitele több immunútvonal bekapcsolására
WO2012018628A1 (en) 2010-07-26 2012-02-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods for inducing an immune response via buccal and/or sublingual administration of a vaccine
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
SMT202200311T1 (it) 2010-08-31 2022-09-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomi pegilati per somministrare rna codificante un immunogene
DK4108671T3 (da) 2010-10-01 2025-01-06 Modernatx Inc Modificerede nukleosider, nukleotider og nukleinsyrer samt anvendelser deraf
EP3520813B1 (en) 2010-10-11 2023-04-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Antigen delivery platforms
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
EP3854413A1 (en) * 2011-07-06 2021-07-28 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic combination compositions and uses thereof
AU2012322704B2 (en) * 2011-10-11 2017-09-07 Novartis Ag Recombinant self-replicating polycistronic RNA molecules
KR20140102759A (ko) 2011-12-16 2014-08-22 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
EP2834259A4 (en) 2012-04-02 2016-08-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES
US9254311B2 (en) 2012-04-02 2016-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of proteins
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
GB2513768B (en) 2012-07-06 2015-04-15 Novartis Ag Complexes of cytomegalovirus proteins and nucleic acids encoding such proteins
ES2719720T3 (es) 2012-07-27 2019-07-12 Hope City Una vacuna de MVA para la administración de un complejo de UL128 y para prevenir la infección por CMV
WO2014028429A2 (en) 2012-08-14 2014-02-20 Moderna Therapeutics, Inc. Enzymes and polymerases for the synthesis of rna
US9597380B2 (en) 2012-11-26 2017-03-21 Modernatx, Inc. Terminally modified RNA
CN109045294A (zh) * 2013-01-10 2018-12-21 思齐乐 流感病毒免疫原性组合物及其应用
US9974850B2 (en) 2013-01-25 2018-05-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunogenic compositions and uses thereof
WO2014159813A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Moderna Therapeutics, Inc. Long-lived polynucleotide molecules
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
US10023626B2 (en) 2013-09-30 2018-07-17 Modernatx, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
RU2021109685A (ru) 2014-04-23 2021-04-13 МОДЕРНАТиЭкс, ИНК. Вакцины на основе нуклеиновых кислот
WO2015170287A1 (en) * 2014-05-08 2015-11-12 Redvax Gmbh Means and methods for treating cmv
EP3015475A1 (en) * 2014-10-31 2016-05-04 Novartis AG Mammalian cells expressing cytomegalovirus antigens
EP3048114A1 (en) 2015-01-22 2016-07-27 Novartis AG Cytomegalovirus antigens and uses thereof
EP3347045A4 (en) 2015-09-10 2019-08-28 City of Hope MVA-GH / GL-PC VACCINATED ANTIBODIES FOR NEUTRALIZING THE INFECTIOSITY OF HUMAN CYTOMEGALOVIRUS AND METHOD THEREFOR
AU2016336344A1 (en) 2015-10-05 2018-04-19 Modernatx, Inc. Methods for therapeutic administration of messenger ribonucleic acid drugs
JP6925688B2 (ja) * 2015-10-22 2021-08-25 モデルナティーエックス， インコーポレイテッド 水痘帯状疱疹ウイルス（ｖｚｖ）のための核酸ワクチン
CA3002922A1 (en) * 2015-10-22 2017-04-27 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
BR112018008090A2 (pt) * 2015-10-22 2018-11-13 Modernatx Inc vacina de vírus do herpes simplex.
WO2017123652A1 (en) 2016-01-11 2017-07-20 Verndari, Inc. Microneedle compositions and methods of using same
US10611800B2 (en) 2016-03-11 2020-04-07 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
WO2017162266A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Rna replicon for versatile and efficient gene expression
WO2017162265A1 (en) 2016-03-21 2017-09-28 Biontech Rna Pharmaceuticals Gmbh Trans-replicating rna
CA3041307A1 (en) * 2016-10-21 2018-04-26 Giuseppe Ciaramella Human cytomegalovirus vaccine
US12491261B2 (en) 2016-10-26 2025-12-09 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle formulations
CA3050914A1 (en) * 2017-01-27 2018-08-02 The Henry M. Jackson Foundation For The Advancement Of Military Medicine, Inc. Vaccine compositions of herpesvirus envelope protein combinations to induce immune response
US11045540B2 (en) * 2017-03-15 2021-06-29 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (VZV) vaccine
US11752206B2 (en) 2017-03-15 2023-09-12 Modernatx, Inc. Herpes simplex virus vaccine
US20200054737A1 (en) * 2017-04-26 2020-02-20 Modema TX, Inc. Herpes simplex virus vaccine
WO2019014569A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 City Of Hope EXPRESSION SYSTEM FOR EXPRESSING GLYCOPROTEIN COMPLEXES OF HERPESVIRUS
WO2019036008A1 (en) 2017-08-16 2019-02-21 Acuitas Therapeutics, Inc. LIPIDS FOR USE IN LIPID NANOPARTICULAR FORMULATIONS
AU2018331874B2 (en) * 2017-09-13 2022-06-02 Sanofi Pasteur Human cytomegalovirus immunogenic composition
CN112512569A (zh) 2018-05-11 2021-03-16 希望之城 表达多个巨细胞病毒(cmv)抗原的mva载体及其用途
JP2021523712A (ja) 2018-05-11 2021-09-09 シティ・オブ・ホープＣｉｔｙ ｏｆ Ｈｏｐｅ 安定性が改善された遺伝子組み換え組換えワクシニアアンカラ（ｒｍｖａ）ワクチン及びその調製方法
MX2020013284A (es) 2018-06-08 2021-02-22 Vakzine Projekt Man Gmbh Vacuna basada en particulas virales.
US20210363543A1 (en) * 2018-10-30 2021-11-25 Nantbio, Inc. Self Replicating RNA System
US11629172B2 (en) 2018-12-21 2023-04-18 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus gB polypeptide
US12070495B2 (en) 2019-03-15 2024-08-27 Modernatx, Inc. HIV RNA vaccines
EP4004018A1 (en) 2019-07-24 2022-06-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Modified human cytomegalovirus proteins
WO2021138447A1 (en) 2019-12-31 2021-07-08 Elixirgen Therapeutics, Inc. Temperature-based transient delivery of nucleic acids and proteins to cells and tissues
CN115768892A (zh) 2020-03-09 2023-03-07 戴纳瓦克斯技术公司 包含tlr9激动剂的带状疱疹疫苗
EP4149538A1 (en) * 2020-05-11 2023-03-22 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Sars-cov-2 vaccines
US20230234992A1 (en) 2020-06-05 2023-07-27 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified betacoronavirus spike proteins
US11857622B2 (en) 2020-06-21 2024-01-02 Pfizer Inc. Human cytomegalovirus GB polypeptide
DK4182297T3 (da) 2020-07-16 2025-12-01 Acuitas Therapeutics Inc Kationiske lipider til brug i lipid-nanopartikler
US11406703B2 (en) 2020-08-25 2022-08-09 Modernatx, Inc. Human cytomegalovirus vaccine
WO2022236008A1 (en) * 2021-05-07 2022-11-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions for transport, storage, and delivery of adeno-associated viral vector and other molecules
CA3240127A1 (en) * 2021-12-07 2023-06-15 Zihao Wang Rna formulations and lipids
WO2023114943A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Acuitas Therapeutics, Inc. Lipids for use in lipid nanoparticle formulations
WO2023144665A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Glaxosmithkline Biologicals Sa Modified human cytomegalovirus proteins
CN120265278A (zh) * 2022-12-07 2025-07-04 嘉晨西海(杭州)生物技术有限公司 自我复制rna疫苗和使用方法
GB202400648D0 (en) * 2024-01-17 2024-02-28 Uea Enterprises Ltd Protein replacement therapy
CN118240844B (zh) * 2024-05-27 2024-12-13 北京悦康科创医药科技股份有限公司 带状疱疹mRNA疫苗及其制备方法和应用

Family Cites Families (281)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4186745A (en) 1976-07-30 1980-02-05 Kauzlarich James J Porous catheters
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US5132418A (en) 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4668777A (en) 1981-03-27 1987-05-26 University Patents, Inc. Phosphoramidite nucleoside compounds
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US4373071A (en) 1981-04-30 1983-02-08 City Of Hope Research Institute Solid-phase synthesis of polynucleotides
US6090406A (en) 1984-04-12 2000-07-18 The Liposome Company, Inc. Potentiation of immune responses with liposomal adjuvants
US4797368A (en) 1985-03-15 1989-01-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adeno-associated virus as eukaryotic expression vector
US5153319A (en) 1986-03-31 1992-10-06 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4853228A (en) 1987-07-28 1989-08-01 Micro-Pak, Inc. Method of manufacturing unilamellar lipid vesicles
US5262530A (en) 1988-12-21 1993-11-16 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US5047524A (en) 1988-12-21 1991-09-10 Applied Biosystems, Inc. Automated system for polynucleotide synthesis and purification
US6867195B1 (en) 1989-03-21 2005-03-15 Vical Incorporated Lipid-mediated polynucleotide administration to reduce likelihood of subject's becoming infected
ATE240401T1 (de) 1989-03-21 2003-05-15 Vical Inc Expression von exogenen polynukleotidsequenzen in wirbeltieren
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
AU625013B2 (en) 1989-11-03 1992-06-25 Vanderbilt University Method of in vivo delivery of functioning foreign genes
US5674192A (en) 1990-12-28 1997-10-07 Boston Scientific Corporation Drug delivery
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
JP3602530B2 (ja) 1991-03-07 2004-12-15 ヴァイロジェネティクス コーポレイション 遺伝子操作したワクチン菌株
FR2676072B1 (fr) * 1991-05-03 1994-11-18 Transgene Sa Vecteur de delivrance d'arn.
US5750390A (en) 1992-08-26 1998-05-12 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of diseases caused by expression of the bcl-2 gene
US5693535A (en) 1992-05-14 1997-12-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. HIV targeted ribozymes
US5587308A (en) 1992-06-02 1996-12-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Modified adeno-associated virus vector capable of expression from a novel promoter
CA2134773A1 (en) 1992-06-04 1993-12-09 Robert J. Debs Methods and compositions for in vivo gene therapy
WO1994002595A1 (en) 1992-07-17 1994-02-03 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Method and reagent for treatment of animal diseases
US5474914A (en) 1992-07-29 1995-12-12 Chiron Corporation Method of producing secreted CMV glycoprotein H
US20020102273A1 (en) 1995-08-08 2002-08-01 Robert B. Grieve Use of alphavirus expression vectors to produce parasite anitgens
JPH09500013A (ja) 1993-06-01 1997-01-07 ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド カチオン性脂質による遺伝子免疫
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
US5397307A (en) 1993-12-07 1995-03-14 Schneider (Usa) Inc. Drug delivery PTCA catheter and method for drug delivery
JP3403233B2 (ja) 1994-01-20 2003-05-06 テルモ株式会社 バルーンカテーテル
IL112820A0 (en) * 1994-03-07 1995-05-26 Merck & Co Inc Coordinate in vivo gene expression
AU2215995A (en) 1994-04-07 1995-10-30 Akzo Nobel N.V. Freeze-dried compositions comprising rna
US5993850A (en) 1994-09-13 1999-11-30 Skyepharma Inc. Preparation of multivesicular liposomes for controlled release of encapsulated biologically active substances
US5885613A (en) 1994-09-30 1999-03-23 The University Of British Columbia Bilayer stabilizing components and their use in forming programmable fusogenic liposomes
DE69536153D1 (de) 1994-11-17 2011-05-05 Ich Productions Ltd Internalisierung von dna, unter verwendung von konjugaten des poly-l-lysins und eines peptidligands des integrin-rezeptors
AU4594996A (en) 1994-11-30 1996-06-19 Chiron Viagene, Inc. Recombinant alphavirus vectors
JPH11504802A (ja) * 1994-11-30 1999-05-11 カイロン コーポレイション 組換えアルファウイルスベクター
US6071890A (en) 1994-12-09 2000-06-06 Genzyme Corporation Organ-specific targeting of cationic amphiphile/DNA complexes for gene therapy
US5965434A (en) 1994-12-29 1999-10-12 Wolff; Jon A. Amphipathic PH sensitive compounds and delivery systems for delivering biologically active compounds
US5664701A (en) 1995-01-25 1997-09-09 Uniplast, Inc. Glue gun system with removable cartridges
US5700642A (en) 1995-05-22 1997-12-23 Sri International Oligonucleotide sizing using immobilized cleavable primers
US5792462A (en) 1995-05-23 1998-08-11 University Of North Carolina At Chapel Hill Alphavirus RNA replicon systems
US5981501A (en) 1995-06-07 1999-11-09 Inex Pharmaceuticals Corp. Methods for encapsulating plasmids in lipid bilayers
US7422902B1 (en) 1995-06-07 2008-09-09 The University Of British Columbia Lipid-nucleic acid particles prepared via a hydrophobic lipid-nucleic acid complex intermediate and use for gene transfer
US6264957B1 (en) 1995-09-27 2001-07-24 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Product of infectious respiratory syncytial virus from cloned nucleotide sequences
JP2000503527A (ja) * 1995-11-28 2000-03-28 ザ ジョンズ ホプキンズ ユニヴァーシティ スクール オヴ メディシン 条件付き複製ウイルスベクターおよびその用途
DE69716240T2 (de) 1996-02-12 2003-06-26 Ml Lab Plc London Neue methode zur impfung sowie impfstoffe dafür, die eine epitopkodierende nukleinsäure und ein epitopenthaltende peptid beinhalten
DE19605548A1 (de) 1996-02-15 1997-09-04 Boehringer Ingelheim Int Zusammensetzung für die Transfektion höherer eukaryotischer Zellen
DE19612967A1 (de) 1996-04-01 1997-10-02 Behringwerke Ag Verfahren zur Vermehrung von Influenzaviren in Zellkultur, sowie die durch das Verfahren erhältlichen Influenzaviren
US6451592B1 (en) 1996-04-05 2002-09-17 Chiron Corporation Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis
JP2001503735A (ja) 1996-07-03 2001-03-21 ユニバーシティ オブ ピッツバーグ 親水性活性試薬のためのエマルジョン処方物
CN1138533C (zh) 1996-09-13 2004-02-18 利普森有限公司 脂质体
US7384923B2 (en) 1999-05-14 2008-06-10 Lipoxen Technologies Limited Liposomes
US6395302B1 (en) 1996-11-19 2002-05-28 Octoplus B.V. Method for the preparation of microspheres which contain colloidal systems
WO1998051278A2 (en) 1997-05-14 1998-11-19 Inex Pharmaceuticals Corporation High efficiency encapsulation of charged therapeutic agents in lipid vesicles
US6048546A (en) 1997-07-31 2000-04-11 Sandia Corporation Immobilized lipid-bilayer materials
US6060308A (en) 1997-09-04 2000-05-09 Connaught Laboratories Limited RNA respiratory syncytial virus vaccines
US6090619A (en) 1997-09-08 2000-07-18 University Of Florida Materials and methods for intracellular delivery of biologically active molecules
US6129705A (en) 1997-10-01 2000-10-10 Medtronic Ave, Inc. Drug delivery and gene therapy delivery system
CA2311395C (en) 1997-11-28 2006-11-28 Replikun Biotech Pty Ltd Flavivirus expression and delivery system
US6009406A (en) 1997-12-05 1999-12-28 Square D Company Methodology and computer-based tools for re-engineering a custom-engineered product line
GB9726555D0 (en) 1997-12-16 1998-02-11 Smithkline Beecham Plc Vaccine
WO1999055310A1 (en) 1998-04-27 1999-11-04 Altus Biologics Inc. Stabilized protein crystals, formulations containing them and methods of making them
US6432925B1 (en) 1998-04-16 2002-08-13 John Wayne Cancer Institute RNA cancer vaccine and methods for its use
CA2336554A1 (en) 1998-06-29 2000-01-06 U.S. Medical Research Institute Of Infectious Diseases Marburg virus vaccines
WO2000003683A2 (en) 1998-07-20 2000-01-27 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal encapsulated nucleic acid-complexes
CA2360347C (en) * 1998-12-31 2013-05-07 Chiron Corporation Improved expression of hiv polypeptides and production of virus-like particles
US6492169B1 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
ATE289630T1 (de) 1999-09-09 2005-03-15 Curevac Gmbh Transfer von mrnas unter verwendung von polykationischen verbindungen
JP2004500047A (ja) 1999-10-20 2004-01-08 ザ　ジョンズ　ホプキンス　ユニバーシティー　スクール　オブ　メディシン キメラ免疫原性組成物およびこれらをコードする核酸
US8541008B2 (en) 1999-11-19 2013-09-24 Los Angeles Biomedical Research Institute At Harbor-Ucla Medical Center Pharmaceutical compositions and methods to vaccinate against candidiasis
EP1103610A1 (en) 1999-11-26 2001-05-30 Introgene B.V. Production of vaccines from immortalised mammalian cell lines
US20030212022A1 (en) 2001-03-23 2003-11-13 Jean-Marie Vogel Compositions and methods for gene therapy
AU2001253323A1 (en) 2000-04-18 2001-10-30 Human Genome Sciences, Inc. Extracellular matrix polynucleotides, polypeptides, and antibodies
JP2003535832A (ja) 2000-06-09 2003-12-02 ブリカス，テニ ポリヌクレオチドおよび薬物の標的化リポソームへのカプセル化
ATE440861T1 (de) 2000-07-03 2009-09-15 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunisierung gegen chlamydia pneumoniae
WO2002009645A2 (en) 2000-08-01 2002-02-07 The Johns Hopkins University Intercellular transport protein linked to an antigen as a molecular vaccine
US20040142474A1 (en) 2000-09-14 2004-07-22 Expression Genetics, Inc. Novel cationic lipopolymer as a biocompatible gene delivery agent
MXPA03002640A (es) 2000-09-28 2003-06-19 Chiron Corp Microparticulas para la distribucion de acidos nucleicos heterologos.
US7939087B2 (en) 2000-10-27 2011-05-10 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Nucleic acids and proteins from Streptococcus groups A & B
US7445924B2 (en) 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
WO2002079239A2 (en) 2001-01-31 2002-10-10 U.S. Army Medical Research Institute Of Infectious Diseases Chimeric filovirus glycoprotein
WO2002061113A2 (en) 2001-02-01 2002-08-08 The Johns Hopkins University Nucleic acid derived vaccine that encodes an antigen linked to a polypeptide that promotes antigen presentation
US20030040498A1 (en) 2001-03-14 2003-02-27 Ansardi David Calvert Oncolytic RNA replicons
AU2002306736A1 (en) 2001-03-16 2002-10-03 Johns Hopkins University A replication-defective alphavirus vaccine linking antigen with an immunogenicity-potentiating polypeptide and a method of delivery the same
WO2002088318A2 (en) 2001-04-30 2002-11-07 Targeted Genetics Corporation Lipid-comprising drug delivery complexes and methods for their production
US7514099B2 (en) 2005-02-14 2009-04-07 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
US20030077251A1 (en) 2001-05-23 2003-04-24 Nicolas Escriou Replicons derived from positive strand RNA virus genomes useful for the production of heterologous proteins
EP2842964A1 (de) 2001-06-05 2015-03-04 Curevac GmbH Virtuelles Verfahren zur Ermittlung einer modifzierten mRNA-Sequenz
US20050175629A1 (en) 2001-08-31 2005-08-11 Giuseppe Del Giudice Helicobacter pylori vaccination
WO2003023026A1 (en) 2001-09-06 2003-03-20 Alphavax, Inc. Alphavirus replicon vector systems
US20050163832A1 (en) 2002-02-13 2005-07-28 Vladimir Torchilin Intracellular delivery of therapeutic agents
DE10207177A1 (de) 2002-02-19 2003-09-04 Novosom Ag Fakultativ kationische Lipide
US6861410B1 (en) 2002-03-21 2005-03-01 Chiron Corporation Immunological adjuvant compositions
DE60328481D1 (de) 2002-05-14 2009-09-03 Novartis Vaccines & Diagnostic Schleimhautapplizierter impfstoff, der das adjuvanz chitosan und menigokokkenantigene enthält
DE60334618D1 (de) 2002-06-28 2010-12-02 Protiva Biotherapeutics Inc Verfahren und vorrichtung zur herstellung von liposomen
AU2003244855A1 (en) 2002-07-05 2004-01-23 Lipoxen Technologies Limited Method to enhance an immune response of nucleic acid vaccination
EP1530585A2 (en) 2002-08-22 2005-05-18 Cytos Biotechnology AG Inducible alphaviral/orip based gene expression system
AU2003267785C1 (en) 2002-09-13 2009-12-24 Replicor, Inc. Non-sequence complementary antiviral oligonucleotides
JP4991108B2 (ja) * 2002-12-13 2012-08-01 アルファバックス，インコーポレイティド 多抗原性アルファウイルス・レプリコン粒子及び方法
PT2311848E (pt) 2002-12-23 2013-10-03 Vical Inc Vacinas à base de polinucleótido optimizadas por codão contra a infecção do citomegalovírus humano
US8338583B2 (en) 2003-02-04 2012-12-25 Bar-Ilan University Snornai-small nucleolar RNA degradation by RNA interference in trypanosomatids
US20040228842A1 (en) * 2003-02-27 2004-11-18 Shan Lu Compositions and methods for cytomegalovirus treatment
CN1791678A (zh) 2003-03-20 2006-06-21 阿尔法瓦克斯公司 改进的甲病毒复制子和辅助构建体
CA2520386A1 (en) 2003-03-27 2004-10-14 Children's Hospital, Inc. Nontypeable haemophilus influenzae virulence factors
US7731967B2 (en) 2003-04-30 2010-06-08 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Compositions for inducing immune responses
KR20060063788A (ko) 2003-05-30 2006-06-12 니뽄 신야쿠 가부시키가이샤 올리고 핵산 담지 복합체, 이 복합체를 함유하는 의약조성물
WO2005002619A2 (en) 2003-06-26 2005-01-13 Chiron Corporation Immunogenic compositions for chlamydia trachomatis
PT1651666E (pt) * 2003-07-11 2009-08-28 Alphavax Inc Vacinas de citomegalovírus à base de alfavírus
US7368537B2 (en) 2003-07-15 2008-05-06 Id Biomedical Corporation Of Quebec Subunit vaccine against respiratory syncytial virus infection
CN101291653B (zh) 2003-07-16 2012-06-27 普洛体维生物治疗公司 脂质包封的干扰rna
PT1648500E (pt) 2003-07-31 2014-10-10 Novartis Vaccines & Diagnostic Composições imunogénicas para estreptococos piogenes
EP1512393A1 (de) 2003-09-08 2005-03-09 BOEHRINGER INGELHEIM PHARMA GMBH &amp; CO. KG Verfahren zur Herstellung von homogenen Liposomen und Lipoplexen
EP1528101A1 (en) 2003-11-03 2005-05-04 ProBioGen AG Immortalized avian cell lines for virus production
US20050208020A1 (en) 2003-11-12 2005-09-22 Doolan Denise L Enhancement of vaccine-induced immune responses and protection by heterologous boosting with alphavirus replicon vaccines
US7303881B2 (en) 2004-04-30 2007-12-04 Pds Biotechnology Corporation Antigen delivery compositions and methods of use
GB0410866D0 (en) 2004-05-14 2004-06-16 Chiron Srl Haemophilius influenzae
AU2005245956B2 (en) 2004-05-18 2011-05-19 Alphavax, Inc. TC-83-derived alphavirus vectors, particles and methods
JP5331340B2 (ja) 2004-05-18 2013-10-30 バイカル インコーポレイテッド インフルエンザウィルスワクチン組成物、及びその使用方法
GB0411428D0 (en) 2004-05-21 2004-06-23 Got A Gene Ab Vectors
JP4896021B2 (ja) 2004-05-21 2012-03-14 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド 呼吸器系病原体ワクチンのためのアルファウイルスベクター
EP1781593B1 (en) 2004-06-07 2011-12-14 Protiva Biotherapeutics Inc. Cationic lipids and methods of use
EP1766035B1 (en) 2004-06-07 2011-12-07 Protiva Biotherapeutics Inc. Lipid encapsulated interfering rna
US7862829B2 (en) 2004-07-09 2011-01-04 University Of North Carolina At Chapel Hill Viral adjuvants
US20060051405A1 (en) 2004-07-19 2006-03-09 Protiva Biotherapeutics, Inc. Compositions for the delivery of therapeutic agents and uses thereof
EP1794183A2 (en) 2004-10-01 2007-06-13 Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. Hepatitis c virus replication system
WO2006053646A2 (en) 2004-11-19 2006-05-26 Novosom Ag Improvements in or relating to pharmaceutical compositions for local administration
GB2421025A (en) 2004-12-09 2006-06-14 Oxxon Therapeutics Ltd HSV vaccination vectors
US7404969B2 (en) 2005-02-14 2008-07-29 Sirna Therapeutics, Inc. Lipid nanoparticle based compositions and methods for the delivery of biologically active molecules
SI1858920T1 (sl) 2005-02-18 2016-07-29 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Proteini in nukleinske kisline iz escherichia coli, povezane z meningitisom/sepso
NZ580974A (en) 2005-02-18 2011-05-27 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunogens from uropathogenic escherichia coli
AU2006219717B2 (en) 2005-03-02 2009-05-21 The Secretary Of State For Defence Pharmaceutical composition
GB0504436D0 (en) 2005-03-03 2005-04-06 Glaxosmithkline Biolog Sa Vaccine
BRPI0609460A2 (pt) 2005-03-30 2010-04-13 Novartis Vaccines & Diagnostics Inc haemophilus influenzae tipo b
EP1877088B1 (en) * 2005-04-11 2014-12-17 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES Vaccine against pandemic strains of influenza viruses
US7618393B2 (en) 2005-05-03 2009-11-17 Pharmajet, Inc. Needle-less injector and method of fluid delivery
CA2608278A1 (en) 2005-05-12 2006-12-28 Guido Grandi Immunogenic compositions for chlamydia trachomatis
US8703095B2 (en) 2005-07-07 2014-04-22 Sanofi Pasteur S.A. Immuno-adjuvant emulsion
EP1909758A1 (en) 2005-08-02 2008-04-16 I.D.M. Immuno-Designed Molecules Process for the preparation of liposomal formulations
US7951384B2 (en) 2005-08-05 2011-05-31 University Of Massachusetts Virus-like particles as vaccines for paramyxovirus
RS63964B1 (sr) 2005-08-23 2023-03-31 Univ Pennsylvania Rnk koja sadrži modifikovane nukleozide i postupci za njenu upotrebu
EP1764089A1 (en) 2005-09-15 2007-03-21 Novosom AG Serum stable liposomes comprising amphoter II lipid mixtures
WO2007107304A2 (en) 2006-03-17 2007-09-27 Novosom Ag An efficient method for loading amphoteric liposomes with nucleic acid active substances
DE102005046490A1 (de) 2005-09-28 2007-03-29 Johannes-Gutenberg-Universität Mainz Modifikationen von RNA, die zu einer erhöhten Transkriptstabilität und Translationseffizienz führen
WO2007041270A1 (en) 2005-09-29 2007-04-12 Elan Pharmaceuticals, Inc. Pyrimidinyl amide compounds which inhibit leukocyte adhesion mediated by vla-4
JP2009511636A (ja) 2005-10-18 2009-03-19 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス， インコーポレイテッド アルファウイルスレプリコン粒子による粘膜免疫および全身免疫
JP2007112768A (ja) 2005-10-24 2007-05-10 Kyoto Univ 肝指向性リポソーム組成物
AU2006307602A1 (en) 2005-10-25 2007-05-03 Novartis Vaccines And Diagnostics Srl Compositions comprising Yersinia pestis antigens
JP5215865B2 (ja) 2005-11-22 2013-06-19 ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス インコーポレイテッド ノロウイルス抗原およびサポウイルス抗原
ES2564241T3 (es) 2005-12-02 2016-03-21 Glaxosmithkline Biologicals Sa Nanopartículas para su uso en composiciones inmunogénicas
EP3031469B1 (en) * 2006-06-07 2023-08-23 The Trustees Of Princeton University Cytomegalovirus surface protein complex for use in vaccines and as a drug target
US7915399B2 (en) 2006-06-09 2011-03-29 Protiva Biotherapeutics, Inc. Modified siRNA molecules and uses thereof
DK2035581T3 (da) 2006-06-21 2012-10-08 Scripps Research Inst Dna-sammensætning mod tumorstromaantigen fap og fremgangsmåder til anvendelse deraf
CN105063064B (zh) * 2006-07-28 2024-09-24 宾夕法尼亚大学托管会 改进的疫苗及其使用方法
EP2586790A3 (en) 2006-08-16 2013-08-14 Novartis AG Immunogens from uropathogenic Escherichia coli
WO2008033966A2 (en) 2006-09-12 2008-03-20 Alphavax, Inc. Alphavirus replicon particles matched to protein antigens as immunological adjuvants
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
JP2010519203A (ja) 2007-02-16 2010-06-03 メルク・シャープ・エンド・ドーム・コーポレイション 生物活性分子の活性を強化するための組成物及び方法
WO2008109806A2 (en) 2007-03-08 2008-09-12 Massachusetts Institute Of Technology Electrostatic coating of particles for drug delivery
US8877206B2 (en) 2007-03-22 2014-11-04 Pds Biotechnology Corporation Stimulation of an immune response by cationic lipids
AP3018A (en) 2007-03-29 2014-10-31 Alnylam Pharmaceuticals Inc Compositions and methods for inhibiting expressionof a gene from the ebola
US8748591B2 (en) 2007-04-17 2014-06-10 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Chimeric sindbis-western equine encephalitis virus and uses thereof
LT2494993T (lt) 2007-05-04 2018-12-27 Marina Biotech, Inc. Aminorūgščių lipidai ir jų panaudojimas
EP2152890A1 (en) * 2007-05-23 2010-02-17 MannKind Corporation Multicistronic vectors and methods for their design
DE102007029471A1 (de) 2007-06-20 2008-12-24 Novosom Ag Neue fakultativ kationische Sterole
NZ582495A (en) * 2007-06-21 2012-05-25 Alphavax Inc Promoterless cassettes for expression of alphavirus structural proteins
US8202518B2 (en) 2007-07-04 2012-06-19 Ribovax Biotechnologies S.A. Antibodies against human cytomegalovirus (HCMV)
GB0714963D0 (en) 2007-08-01 2007-09-12 Novartis Ag Compositions comprising antigens
US20110177155A1 (en) 2007-08-21 2011-07-21 Immune Disease Institute, Inc. Methods of delivery of agents to leukocytes and endothelial cells
GB0717187D0 (en) 2007-09-04 2007-10-17 Novartis Ag Compositions comprising yersinia pestis antigens
CA2704153A1 (en) 2007-09-26 2009-04-02 Vanderbilt University Vaccine for rsv and mpv
EP2042193A1 (en) 2007-09-28 2009-04-01 Biomay AG RNA Vaccines
AU2008338803B2 (en) 2007-11-26 2015-02-05 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Methods of generating alphavirus particles
EP2067749A1 (en) 2007-11-29 2009-06-10 Total Petrochemicals France Process for purification of an aqueous phase containing polyaromatics
WO2009074861A2 (en) 2007-12-10 2009-06-18 Powderject Research Limited Improved vaccine
EP2224912B1 (en) 2008-01-02 2016-05-11 TEKMIRA Pharmaceuticals Corporation Improved compositions and methods for the delivery of nucleic acids
US20110165223A1 (en) 2008-01-02 2011-07-07 The Johns Hopkins University Antitumor Immunization by Liposomal Delivery of Vaccine to the Spleen
ITMI20081249A1 (it) 2008-07-09 2010-01-09 Novartis Vaccines & Diagnostic Immunogeni di escherichia coli con solubilità migliorata.
EP2268659A2 (en) 2008-03-06 2011-01-05 Novartis AG Mutant forms of chlamydia htra
CA2721333C (en) 2008-04-15 2020-12-01 Protiva Biotherapeutics, Inc. Novel lipid formulations for nucleic acid delivery
WO2009127230A1 (en) 2008-04-16 2009-10-22 Curevac Gmbh MODIFIED (m)RNA FOR SUPPRESSING OR AVOIDING AN IMMUNOSTIMULATORY RESPONSE AND IMMUNOSUPPRESSIVE COMPOSITION
WO2009132131A1 (en) 2008-04-22 2009-10-29 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Amino lipid based improved lipid formulation
WO2009132206A1 (en) 2008-04-25 2009-10-29 Liquidia Technologies, Inc. Compositions and methods for intracellular delivery and release of cargo
US20100040650A1 (en) 2008-05-30 2010-02-18 Crowe Jr James E Virus-Like paramyxovirus particles and vaccines
EP2130912A1 (en) 2008-06-04 2009-12-09 Institut für Viruskrankeiten und Immunprophylaxe Pestivirus replicons providing an RNA-based viral vector system
EP2310494A1 (en) * 2008-06-25 2011-04-20 ProBioGen AG Cell line for propagation of highly attenuated alphaviruses
US9421251B2 (en) 2008-06-25 2016-08-23 Novartis Ag Rapid responses to delayed booster immunisations
JP2010025644A (ja) 2008-07-16 2010-02-04 Kochi Univ Of Technology 硝酸イオンの呈色試薬並びにこれを用いた硝酸イオンの検出及び定量方法
JP5475774B2 (ja) * 2008-07-16 2014-04-16 インスティテュート フォー リサーチ イン バイオメディシン ヒトサイトメガロウイルス中和抗体およびその使用
US8124093B2 (en) 2008-07-16 2012-02-28 Institute For Research In Biomedicine Human cytomegalovirus neutralizing antibodies and use thereof
EP2328614A1 (en) 2008-08-06 2011-06-08 Novartis AG Microparticles for use in immunogenic compositions
CL2008002322A1 (es) 2008-08-07 2009-06-05 Univ Concepcion Formulacion farmaceutica veterinaria que comprende un sistema vectorial viral constituido por una particula recombinante de arn que codifica una cu/zn superoxido dismutasa de la bacteria patogena de bovinos brucella abortus, y al menos un alfavirus arn perteneciente a la familia del virus semliki forest (sfv), util como vacuna.
KR101661746B1 (ko) 2008-08-13 2016-09-30 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 캐리어 나노입자, 그리고 관련된 조성물, 방법 및 시스템
US20110201119A1 (en) 2008-08-15 2011-08-18 Weiguo Zhai Alphavirus packaging cell lines
WO2010036948A2 (en) 2008-09-26 2010-04-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health & Human Services Dna prime/inactivated vaccine boost immunization to influenza virus
JP5777519B2 (ja) 2008-10-09 2015-09-09 テクミラ ファーマシューティカルズ コーポレイション 改良されたアミノ脂質および核酸の送達方法
WO2010053572A2 (en) 2008-11-07 2010-05-14 Massachusetts Institute Of Technology Aminoalcohol lipidoids and uses thereof
DK2355851T3 (en) 2008-11-10 2018-06-25 Arbutus Biopharma Corp Newly known lipids and compositions for release of therapeutic agents
EP2367844A4 (en) 2008-11-18 2012-08-01 Ligocyte Pharmaceuticals Inc RSV-F VLP AND MANUFACTURING METHOD AND METHOD OF USE THEREOF
US20120101148A1 (en) 2009-01-29 2012-04-26 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. lipid formulation
WO2010119343A2 (en) 2009-04-14 2010-10-21 Novartis Ag Compositions for immunising against staphylococcus aureus
CA3045126A1 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Arbutus Biopharma Corporation Methods of delivering oligonucleotides to immune cells
CA2764609C (en) 2009-06-10 2018-10-02 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Improved cationic lipid of formula i
JP5766188B2 (ja) 2009-07-01 2015-08-19 プロチバ バイオセラピューティクス インコーポレイティッド 固形腫瘍に治療剤を送達するための脂質製剤
WO2011001780A1 (ja) 2009-07-02 2011-01-06 コニカミノルタホールディングス株式会社 特定分散剤を含有する外水相を利用する二段階乳化法によるリポソームの製造方法、ならびに当該リポソームの製造方法を用いるリポソーム分散液またはその乾燥粉末の製造方法およびそれにより製造されるリポソーム分散液またはその乾燥粉末
WO2011005799A2 (en) 2009-07-06 2011-01-13 Novartis Ag Self replicating rna molecules and uses thereof
PL3178490T3 (pl) 2009-07-15 2022-08-01 Glaxosmithkline Biologicals S.A. Kompozycje białka f rsv i sposoby ich wytwarzania
US9642903B2 (en) 2009-07-16 2017-05-09 Lior Carmon Antigen specific multi epitope-based anti-infective vaccines
BR112012002291A2 (pt) 2009-07-31 2016-11-29 Ethris Gmbh "polirribonucleotídeo com uma sequência que codifica uma proteína ou fragmento de proteína, implante, e, processo para a seleção de sequências de nucleotídeos"
TWI445708B (zh) 2009-09-02 2014-07-21 Irm Llc 作為ｔｌｒ活性調節劑之化合物及組合物
SG178954A1 (en) 2009-09-02 2012-04-27 Novartis Ag Immunogenic compositions including tlr activity modulators
US20110070260A1 (en) 2009-09-09 2011-03-24 Baric Ralph S Multivalent Immunogenic Compositions Against Noroviruses and Methods of Use
EP2496700B1 (en) 2009-11-04 2017-03-01 The University Of British Columbia Nucleic acid-containing lipid particles and related methods
US20110112353A1 (en) 2009-11-09 2011-05-12 Circulite, Inc. Bifurcated outflow cannulae
ME03091B (me) 2009-12-01 2019-01-20 Translate Bio Inc Isporuka irnk za povećanje ekspresije proteina i enzima u humanim genetskim oboljenjima
SI3112467T1 (en) 2009-12-07 2018-06-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Rna preparations comprising purified modified rna for reprogramming cells
CA2783372C (en) 2009-12-07 2019-07-16 Muthiah Manoharan Compositions for nucleic acid delivery
AU2010330814B2 (en) 2009-12-18 2017-01-12 Acuitas Therapeutics Inc. Methods and compositions for delivery of nucleic acids
WO2011076807A2 (en) 2009-12-23 2011-06-30 Novartis Ag Lipids, lipid compositions, and methods of using them
JP5988435B2 (ja) 2010-01-24 2016-09-07 ノバルティス アーゲー 放射線照射された生分解性微粒子
US20130195961A1 (en) 2010-03-09 2013-08-01 Kejian Yang Novel mucosal vaccination approach for herpes simplex virus type-2
EP2556151A1 (en) 2010-04-07 2013-02-13 Novartis AG Method for generating a parvovirus b19 virus-like particle
CN103154242B (zh) 2010-07-06 2015-09-30 诺华股份有限公司 诺如病毒衍生的免疫原性组合物和方法
NZ606591A (en) 2010-07-06 2015-02-27 Novartis Ag Cationic oil-in-water emulsions
HUE047796T2 (hu) 2010-07-06 2020-05-28 Glaxosmithkline Biologicals Sa RNS bevitele több immunútvonal bekapcsolására
US9192661B2 (en) 2010-07-06 2015-11-24 Novartis Ag Delivery of self-replicating RNA using biodegradable polymer particles
DK2590676T3 (en) * 2010-07-06 2016-10-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Virionlignende feed particles to self-replicating RNA molecules
JP5940064B2 (ja) 2010-07-06 2016-06-29 ノバルティス アーゲー 低用量のｒｎａを用いた大型哺乳動物の免疫化
US9770463B2 (en) 2010-07-06 2017-09-26 Glaxosmithkline Biologicals Sa Delivery of RNA to different cell types
RS54489B1 (sr) 2010-07-06 2016-06-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Lipozomi sa lipidima koji imaju poboljšanu pka vrednost za oslobađanje rnk
US8898852B2 (en) 2010-08-04 2014-12-02 Honeywell International Inc. Air burst to clear detection window
US8822663B2 (en) 2010-08-06 2014-09-02 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
HRP20221048T1 (hr) 2010-08-31 2022-11-11 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mali liposomi za isporuku rna koja kodira imunogen
SMT202200311T1 (it) 2010-08-31 2022-09-14 Glaxosmithkline Biologicals Sa Liposomi pegilati per somministrare rna codificante un immunogene
BR112013004865A2 (pt) 2010-08-31 2016-06-07 Novartis Ag lípidos adequados para entrega lipossomal de codificadores de proteínas rna
EP2614072A4 (en) * 2010-09-09 2014-03-19 Univ Virginia Commonwealth VACCINE AGAINST THE HUMAN CYTOMEGALOVIRUS
DK4108671T3 (da) 2010-10-01 2025-01-06 Modernatx Inc Modificerede nukleosider, nukleotider og nukleinsyrer samt anvendelser deraf
EP3520813B1 (en) 2010-10-11 2023-04-19 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Antigen delivery platforms
PH12013500764A1 (en) 2010-10-25 2015-09-23 Stepan Co Quaternized fatty amines, amidoamines, and their derivatives from natural oil metathesis
US9405700B2 (en) 2010-11-04 2016-08-02 Sonics, Inc. Methods and apparatus for virtualization in an integrated circuit
PL2667892T3 (pl) 2011-01-26 2019-09-30 Glaxosmithkline Biologicals Sa Schemat szczepień przeciwko rsv
WO2012106377A2 (en) 2011-01-31 2012-08-09 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Nucleic acid molecules encoding novel herpes antigens, vaccine comprising the same, and methods of use thereof
WO2012116714A1 (en) 2011-03-02 2012-09-07 Curevac Gmbh Vaccination in elderly patients
JP2014511687A (ja) 2011-03-31 2014-05-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッド 工学操作された核酸の送達および製剤
ES2651143T3 (es) 2011-05-13 2018-01-24 Glaxosmithkline Biologicals Sa Antígenos de F de prefusión del VRS
CA2835428A1 (en) 2011-05-17 2012-11-22 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof for non-human vertebrates
EP3998064A1 (en) 2011-06-08 2022-05-18 Translate Bio, Inc. Cleavable lipids
EP3456316A1 (en) 2011-07-06 2019-03-20 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Cationic oil-in-water emulsions
EP3508219A1 (en) 2011-07-06 2019-07-10 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Self-replicating rna prime - protein boost vaccines
EP3854413A1 (en) 2011-07-06 2021-07-28 GlaxoSmithKline Biologicals SA Immunogenic combination compositions and uses thereof
US20140141070A1 (en) 2011-07-06 2014-05-22 Andrew Geall Liposomes having useful n:p ratio for delivery of rna molecules
CN103781470A (zh) 2011-07-06 2014-05-07 诺华股份有限公司 包含核酸的水包油乳液
US20140255472A1 (en) * 2011-08-31 2014-09-11 Andrew Geall Pegylated liposomes for delivery of immunogen-encoding rna
EP3384938A1 (en) 2011-09-12 2018-10-10 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
JP6113737B2 (ja) 2011-10-03 2017-04-12 モデルナティエックス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａＴＸ，Ｉｎｃ． 修飾型のヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸、ならびにそれらの使用方法
AU2012322704B2 (en) 2011-10-11 2017-09-07 Novartis Ag Recombinant self-replicating polycistronic RNA molecules
US20140348863A1 (en) 2011-10-12 2014-11-27 Alessia Bianchi Cmv antigens and uses thereof
WO2013130161A1 (en) 2011-12-14 2013-09-06 modeRNA Therapeutics Methods of responding to a biothreat
KR20140102759A (ko) 2011-12-16 2014-08-22 모더나 세라퓨틱스, 인코포레이티드 변형된 뉴클레오사이드, 뉴클레오타이드 및 핵산 조성물
CA2859691A1 (en) 2011-12-21 2013-06-27 Moderna Therapeutics, Inc. Methods of increasing the viability or longevity of an organ or organ explant
EP2834259A4 (en) 2012-04-02 2016-08-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES
HK1206612A1 (en) 2012-04-02 2016-01-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of secreted proteins
US9597380B2 (en) 2012-11-26 2017-03-21 Modernatx, Inc. Terminally modified RNA
CN109045294A (zh) 2013-01-10 2018-12-21 思齐乐 流感病毒免疫原性组合物及其应用
US9504747B2 (en) 2013-03-08 2016-11-29 Novartis Ag Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
US10258698B2 (en) 2013-03-14 2019-04-16 Modernatx, Inc. Formulation and delivery of modified nucleoside, nucleotide, and nucleic acid compositions
WO2014160243A1 (en) 2013-03-14 2014-10-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Purification and purity assessment of rna molecules synthesized with modified nucleosides
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
EP3623361B1 (en) 2013-12-19 2021-08-18 Novartis AG Lipids and lipid compositions for the delivery of active agents
EP3350157B1 (en) 2015-09-17 2022-01-05 Modernatx, Inc. Compounds and compositions for intracellular delivery of therapeutic agents
RS63986B1 (sr) 2015-10-28 2023-03-31 Acuitas Therapeutics Inc Novi lipidi i lipidne formulacije nanočestica za isporuku nukleinskih kiselina
CN110114058B (zh) 2016-11-10 2023-05-26 川斯勒佰尔公司 用于递送mrna的改进的基于ice的脂质纳米颗粒制剂
US11045540B2 (en) 2017-03-15 2021-06-29 Modernatx, Inc. Varicella zoster virus (VZV) vaccine
MX2021005969A (es) 2018-11-21 2021-09-14 Translate Bio Inc Tratamiento de la fibrosis quística mediante el suministro de arnm que codifica cftr nebulizado.
EP4021407A1 (en) 2019-08-30 2022-07-06 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Jet mixing lipid nanoparticle manufacturing process
WO2022137133A1 (en) 2020-12-22 2022-06-30 Curevac Ag Rna vaccine against sars-cov-2 variants

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012051211A2 (en) 2012-04-19
EP3520813B1 (en) 2023-04-19
CN103269713B (zh) 2016-01-20
EP3520813A1 (en) 2019-08-07
US11639370B2 (en) 2023-05-02
CA2814386A1 (en) 2012-04-19
BR112013008700B1 (pt) 2021-03-02
CA2814386C (en) 2019-08-20
KR102162111B1 (ko) 2020-10-07
US20140030292A1 (en) 2014-01-30
ZA201302548B (en) 2014-09-25
US20220213149A1 (en) 2022-07-07
EP4098324A1 (en) 2022-12-07
AU2016238966B2 (en) 2018-08-16
BR112013008700B8 (pt) 2022-10-04
WO2012051211A3 (en) 2012-06-07
CN103269713A (zh) 2013-08-28
MX363307B (es) 2019-03-20
MX2013003939A (es) 2013-10-17
CL2013000984A1 (es) 2013-10-11
KR20130117781A (ko) 2013-10-28
AU2011316707A1 (en) 2013-05-09
EP4098325A1 (en) 2022-12-07
AU2016238966A1 (en) 2016-11-03
RU2597974C2 (ru) 2016-09-20
KR20200119880A (ko) 2020-10-20
RU2013121582A (ru) 2014-11-20
TR201903651T4 (tr) 2019-04-22
KR102266691B1 (ko) 2021-06-23
JP2016096827A (ja) 2016-05-30
ES2945135T3 (es) 2023-06-28
US20250206785A1 (en) 2025-06-26
EP2627351A2 (en) 2013-08-21
BR112013008700A2 (pt) 2016-06-21
US11078237B2 (en) 2021-08-03
US20220119455A1 (en) 2022-04-21
JP2017205126A (ja) 2017-11-24
JP2013544504A (ja) 2013-12-19
EP2627351B1 (en) 2018-12-26
US20190144507A1 (en) 2019-05-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20250206785A1 (en) Antigen delivery platforms
JP6305925B2 (ja) 組換え自己複製ポリシストロニックｒｎａ分子
US11813323B2 (en) RSV immunization regimen
ES2656050T3 (es) Composiciones de combinación inmunogénica y usos de las mismas
US20150140068A1 (en) Immunogenic compositions and uses thereof
US20110300205A1 (en) Self replicating rna molecules and uses thereof
HK40084954A (en) Antigen delivery platforms
HK40085588A (en) Antigen delivery platforms
WO2024194756A1 (en) Modulating the innate immunity of rna