JP3602530B2 - 遺伝子操作したワクチン菌株 - Google Patents

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Description

関連出願に対するクロス・リファレンス
この出願は、1991年３月７日に出願した出願番号第07/666,056号の一部継続出願である、1991年６月11日に出願した出願番号第07/713,967号のさらなる一部継続出願であり、その出願の両方をここに参照文献として含む。また、米国特許継続出願である、1991年６月14日に出願した出願番号第715,921号、1991年７月26日に出願した出願番号第736,254号、1991年10月22日に出願した出願番号第776,867号、および1992年１月13日に出願した出願番号第820,077号についても言及し、これら全てをここに参照文献として含む。
産業上の利用分野
本発明は修飾ポックスウイルス、およびその産生方法、並びにその使用方法に関するものである。さらに詳しくは、本発明は、様々な病原体に対して保護をする安全免疫運搬体として使用する異種遺伝子の挿入と発現のための改良ベクターに関するものである。
この出願においていくつかの刊行物を参照する。請求の範囲の直前で明細書の後に、または刊行物と記載されているところに、これらの参照文献を完全に列挙する；これら刊行物のそれぞれをここに参照文献として含む。これらの刊行物は、本発明が属する従来技術に関する。
発明の背景
ワクシニアウイルスおよびさらに近年の他のポックスウイルスは、異種遺伝子の挿入と発現に用いられている。異種遺伝子の生感染ポックスウイルスへの挿入の基礎技術は、供与体プラスミド中の異種遺伝子要素を側腹に有するポックスDNA配列と救助（rescuing）ポックスウイルス中に存在する相同配列との間の組換えを含む（ピッチーニら、1987）。
具体的には、組換えポックスウイルスは従来技術において知られ、米国特許第4,769,330号、第4,772,848号、および第4,603,112号、並びに1990年６月14日に出願された継続出願第07/537,882号に記載されたワクシニアウイルスの合成組換え体の産生方法と類似した２工程で構成され、これらの開示をここに参照文献として含む。この点において、1990年６月14日に出願された米国特許継続出願第537,890号についても言及し、ここに参照文献として含む。
第一に、ウイルス、特に非ポックス源からの読取り枠に挿入されるDNA遺伝子配列は、ポックスウイルスのDNA部分に相同なDNAが挿入されるE.coliプラスミド構成中に配される。それとは別に、挿入されるDNA遺伝子配列は、プロモーターに繋げられる。プロモーター遺伝子連結は、可欠座を含有するポックスDNAの領域を側腹に有するDNA配列と相同なDNAにより両端の側腹にあるように、プラスミド構成中に位置せしめられる。生成したプラスミド構成は次いでE.coli細菌内の成長により増幅されて（クレウェル、1972）単離される（クレウェルら、1969;マニアチスら、1982）。
第二に、挿入されるDNA遺伝子配列を含有する単離プラスミドを、細胞培養、例えばニワトリ胚繊維芽細胞中にポックスウイルスとともに移入せしめる。プラスミド中の相同ポックスDNAとウイルスのゲノムとの間の組換えにより、ゲノムの可欠領域中の異種DNA配列の存在により修飾されたポックスウイルスが得られる。「異種」DNAという用語は、外因性のDNA、特に非ポックス源からのDNAを示し、これは、外因性DNAが配されるゲノムにより通常は産生されない遺伝子産生物をコードする。
遺伝子組換えは一般的に、DNAの２つの鎖の間の相同切片の交換である。あるウイルスにおいてはRNAがDNAを置換する。核酸の相同切片は、ヌクレオチド塩基の同一配列を有する核酸（DNAまたはRNA）の切片である。
遺伝子組換えは、感染宿主細胞内の新たなウイルスゲノムの複製中または製造中に自然に行なわれる。それゆえ、ウイルス遺伝子間の遺伝子組換えは、２つ以上の異なるウイルスまたは他の遺伝子構造に共感染せしめられる宿主細胞中に生じるウイルス複製周期中で行なわれる。第１のゲノムからのDNAの切片は、DNAが第１のウイルスゲノムの切片と相同である第２の共感染ウイルスのゲノムの切片を交換可能に構成する際に用いられる。
いかいながら、組換えはまた、完全には相同ではない異なるゲノム中のDNAの切片間にも行なわれる。そのような切片の１つが、例えば、相同DNAの部分中に挿入される抗原決定因子をコードする遺伝子または遺伝子マーカーの第１の切片内の存在を除いた別のゲノムの切片と相同な第１のゲノムからのものである場合、組換えがまた行なわれ、次いでその組換えの産生物は組換えウイルスゲノム中の遺伝子または遺伝子マーカーの存在により検知できる。
修飾感染ウイルスによる挿入DNA遺伝子配列の一連の発現には２つの条件が必要である。第１に、修飾ウイルスが生存可能であるように、挿入はウイルスの可欠領域中で行なわなければならない。挿入DNAの発現の第２の条件は、挿入DNAに対して適切な関係二にあるプロモーターの存在である。プロモーターは発現されるDNAは配列から上流に位置するように配されなければならない。
ワクシニアウイルスは、1980年に天然痘の世界規模での撲滅となった天然痘に対する免疫化にうまく用いられた。その歴史において、多くのワクシニアの菌株が生じた。これらの異なる菌株は、変化する免疫抗原性を示し、潜在的な複雑さとともに変化する程度に関係し、その最も重大なのは、ワクチン後の脳炎と全身性痘疱である（べーべハニ、1983）。
天然痘の撲滅に関して、異種遺伝子を発現する遺伝子操作したベクターという、ワクシニアの新たな役割が重要となった。非常に多くの非相同抗原をコードする遺伝子は、ワクシニア中に発現され、しばしば対応病原による抗原投与に対する防御免疫となってきた（タータグリアら、1990aに記載されている）。
ワクシニアベクターの遺伝子の背景は、発現された異種免疫原の保護効果に影響することが示されている。例えば、ワクシニアウイルスのイエスワクチン菌株内のエプステインバーウイルス（EBV）gp340の発現は、EBVウイルス誘発リンパ種に対するコットントップタマリンス（cottontop tamarins）を防御せず、一方ワクシニアウイルスのWR研究所菌株中の同一の遺伝子の発現は防御性であった（モルガンら、1988）。
ワクシニアウイルスベースの組換えワクチン候補の効能と安全性との間の優れたバランスが特に重要である。組換えウイルスは、ワクチン接種した動物中で棒業免疫応答を引き出すが、いかなる著しい病原特性も欠如するように免疫原を提供しなければならない。それゆえ、ベクター菌株の弱毒化は技術の現在の状態では非常に望ましい進歩である。
組織培養中のウイルス成長に可欠であり、その欠損または不活性化が様々な動物系における毒性を低減する多くのワクシニア遺伝子が同定されている。
ワクシニアウイルスチミジンキナーゼ（TK）をコードする遺伝子が、地図作成され（フルビーら、1982）、配列せしめられている（フルビーら、1983;ウィアーら、1983）。チミジンキナーゼ遺伝子の不活性化または完全な欠損は、組織培養中の様々な細胞中のワクシニアウイルスの成長を妨げない。TK-ワクシニアウイルスはまた、様々な経路により様々な宿主中の接種部位で生体内複製を行なうことができる。
２型単純ヘルペスウイルスに関して、モルモットのTK-ウイルスの膣内接種は、TK+ウイルスを接種したよりも、脊髄中で著しく低いウイルス力価となったことが示された（スタンベリーら、1985）。生体外でTK活性をコードしたヘルペスウイルスは、活性で代謝している細胞におけるウイルスの成長には重要ではないが、静止状態の細胞中のウイルスの成長には必要であったことが説明されている（ジェイミーソンら、1974）。
TK-ワクシニアの弱毒化が、大脳内経路と腹膣内経路により接種したネズミ中に示された（ブラーら、1985）。WR神経毒性研究所菌株とイエスワクチン菌株の両者に関して弱毒化が観察された。皮内経路により接種したネズミ中で、TK-組換えワクシニアは、親のTK+ワクシニアウイルスと比較して等量の抗ワクシニア中和抗体を産生し、この試験系において、TK機能の損失によりワクシニアウイルスベクターの免疫抗原性を著しくは減少しないことを示した。ネズミにTK-とTK+組換えワクシニアウイルス（WR菌株）を鼻腔内接種することに続いて、脳を含む、他の位置へのウイルスの内転移はそれほど著しくは発見されなかった（テイラーら、1991a）。
ヌクレオチドの代謝に関わる別の酵素は、リボヌクレオチドレダクターゼである。巨大サブユニットをコードする遺伝子の欠損により単純ヘルペスウイルス（HSV）中のウイルス性にコードしたリボヌクレオチドレダクターゼ活性の損失は、生体外の細胞の分裂におけるDNA合成とウイルスの成長には効果がないことが示され、ウイルスの血清欠乏細胞上の成長能力を著しく損なった（ゴールドスタインら、1988）。眼の急性HSV感染と三又神経節内の再活性化可能潜伏感染のネズミモデルを使用した場合、野生型HSVにより毒性と比較して、リボヌクレオチドレダクターゼの巨大サブユニットの欠損したHSVに関して、毒性が減少したことが示された（ジェイコブソンら、1989）。
リボヌクレオチドレダクターゼの小さなサブユニット（スラボーグら、1988）と巨大ユニット（シュミットら、1988）の両方は、ワクシニアウイルス中で同定される。ワクシニアウイルスのWR菌株中のリボヌクレオチドレダクターゼの巨大サブユニットの挿入不活性化により、ネズミの頭蓋内接種により測定されたようなウイルスの弱毒化となる（チャイルドら、1990）。
ワクシニアウイルス血球凝集素遺伝子（HA）を遺伝子地図作成し、配列した（シダ、1986）。ワクシニア憂いするのHA遺伝子は、組織培養中の成長に可欠である（イチハシら、1971）。ワクシニアウイルスのHA遺伝子を不活性化することにより、頭蓋内経路により接種した家ウサギ中の神経毒性を減少せしめ、皮内接種の部位での家ウサギの病巣をより小さくする（シダら、1988）。WR菌株中の異種遺伝子の挿入（シダら、1987）、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン菌株（グオら、1989）とリスター菌株（シダら、1988）の誘導にHA座を用いた。異種遺伝子を発現する組換えHA-ワクシニアウイルスは、免疫抗原性であり（グオら、1989;イタムラら、1990;シダら、1988;シダら、1987）、関連病原による抗原投与に対して防御性である（グオら、1989;シダら、1987）ことが示された。
牛痘（ブリントンレッド菌株）は、鶏の卵の絨毛尿膜上に赤い（出血性）痘疹を生じる。牛痘ゲノム内の自発的な欠損により、白色痘疹を生じる変位体を産生する（ピカップら、1984）。出血性機能（ｕ）は、初期遺伝子によりコードされた38kDaタンパク質まで遺伝子地図を作成した（ピカップら、1986）。セリンプロテアーゼ抑制因子に対して相同性を有するこの遺伝子は、牛痘に対する宿主炎症反応を抑制することが示され（パランボら、1989）、血液凝固の抑制因子である。
ｕ遺伝子はワクシニアウイルスのWR菌株中に存在する（コトワルら、1989b）。ｕ領域が異種遺伝子の挿入により不活性化せしめられたWRワクシニアウイルス組換え体を接種したネズミは、ｕ遺伝子が完全である同様の組換えワクシニアウイルスを接種したネズミと比較して、異種遺伝子産生物に対して高い水準で抗体を産生する（ゾーら、1990）。ｕ領域はワクシニアウイルスのコペンハーゲン菌株中に欠損可欠形状で存在する（ケーベルら、1990a、ｂに報告されている用語法による読取り枠B13とB14）。
牛痘ウイルスは、細胞質Ａ型含有ボディ（ATI）中の感染細胞内に制限される（カトウら、1959）。ATIの機能は、動物から動物への内転移中の牛痘ウイルスビリオンの防御であると考えられる（バーゴインら、1971）。牛痘ゲノムのATI領域は、ATIボディのマトリックスを形成する160kDaタンパク質をコードする（フナハシら、1988;パテルら、1987）。ゲノム中に相同領域を含有するけれどもワクシニアウイルスは一般的にATIを産生しない。ワクシニアのWR菌株において、ゲノムのATO領域は94kDaタンパク質として翻訳される（パテルら、1988）。ワクシニアウイルスのコンハーゲン菌株において、ATI領域に対応するDNA配列のほとんどは欠損し、ATI領域から上流の配列と融合した領域の残りの３′末端は読取り枠（ORF）A26Lを形成する（ゴーベルら、1990a、ｂ）。
様々な自発的で（アルテンバーガーら、1989;ドリリアンら、1981;ライら、1989;モスら、1981;パエズら、1985;パニカリら、1981）操作された（パーカスら、1991;パーカスら、1991;パーカスら、1986）欠損がワクシニアウイルスゲノムの左末端に近くに報告されている。10kb自発欠損したワクシニアウイルスのWR菌株（モスら、1981;パニカリら、1981）が、ネズミの頭蓋内接種により弱毒化されたことが示された（ブラーら、1985）。この欠損は後に17の潜在的なORFを含むことが示された（コトワルら、1988b）。欠損領域内の特異的遺伝子は、ビロキンN1Lおよび35kDaタンパク質を含有する（ゲーベルら、1990a、ｂに報告された用語法によるC3L）。N1Lの挿入不活性化は、通常のネズミと裸のネズミの両方の頭蓋内接種により毒性を低減せしめる（コトワルら、1989a）。35kDaタンパク質は、N1Lのようにワクシニアウイルス感染細胞の培地中に分泌される。このタンパク質は、補体対照タンパク質、特に補体4B結合タンパク質（C4bp）の類に対する相同性を含有する（コトワルら、1988a）。細胞C4bpのように、ワクシニア35kDaタンパク質は補体の４番目の成分と結合し、典型的な補体カスケードを抑制する（コトワルら、1990）。それゆえ、ワクシニア35kDaタンパク質は、ウイルスが宿主防御機構を避けるのを助けるのに巻き込まれると思われる。
ワクシニアゲノムの左末端は、宿主範囲遺伝子、K1L（ギラードら、1986）およびC7L（パーカスら、1990）と同定された２つの遺伝子を含有する。これらの遺伝子の両方を欠損すると、ワクシニアウイルスの様々なヒト細胞ライン上に成長する能力を低減せしめる（パーカスら、1990）。
鶏痘ウイルス（FPV）は、ポックスウイルス類のアビポックス属の基本型ウイルスである。ウイルスは、弱毒化ワクチンの使用により1920年台から良好に制御されているかきんの経済的に重要な病気を生じる。アビポックスウイルスの複製は、アビアン種に制限されており（マチュース、1982b）、人類を含む非アビアン種における生産的な感染を生じるウイルスの文献には報告されていない。この宿主制限は、ウイルスの他の種への伝染に対する固有の安全バリヤを提供し、かきんにおけるワクチンベクターとしてFPVを使用して魅力的な提案とする。
FPVは好ましくはかきん病原からの抗原を発現するベクターとして用いられている。毒性アビアンインフルエンザウイルスの血球凝集素タンパク質はFPV組換え体中で発現された（テイラーら、1988a）。組換え体の鶏と七面鳥への接種後、相同または非相同毒性インフルエンザウイルス抗原投与のいずれかに対して防御的である免疫応答が誘発された（テイラーら、1988a）。ニューカッスル病ウイルスの表面糖タンパク質を発現するFPV組換え体もまた発達せしめられた（テイラーら、1990;エドバウアーら、1990）。
弱毒化ベクターワクチンの使用は、多くの潜在的な長所を示す。ワクチンは製造するのに高価ではなく、多くのかきん病原は潜在的には１つのベクター中に含まれる。免疫原は、体液および細胞媒介応答が引き起こせるような確実な方法で免疫システムに提供される。病気剤は複製していないので、ワクチン接種の側面効果は最小限であり、病気剤の環境への連続的な再導入は除かれる。
安全性が高められた新たなワクチン菌株を提供することが現在の技術状態よりも非常に望ましい進歩であることが理解できる。例えば、ウイルスによる遺伝子の発現からのより安全なワクチンまたはより安全な産生物を提供するためである。
発明の目的
それゆえ本発明の目的は、安全性が高められた修飾組換えウイルスを提供することにあり、さらにそのような組換えウイルスを製造する方法を提供することにある。
本発明のさらなる目的は、既知の組換えポックスウイルスワクチンと比較して安全性の水準が増大した組換えポックスウイルスワクチンを提供することにある。
さらに本発明の目的は、宿主中に遺伝子産生物を発現する修飾ベクターであって、宿主中で毒性が弱毒化されるように修飾されているベクターを提供することにある。
本発明のもう一つの目的は、安全性の水準が増大した修飾ベクターまたは修飾組換えウイルスを用いて生体外の細胞培養中で遺伝子産生物を発現する方法を提供することにある。本発明のこれらと他の目的並びに利点は、以下の検討後には容易に明確となる。
発明の記載
本発明は、組換えウイルスの毒性が弱毒化され、安全性が高められるようにウイルスコード遺伝子機能が不活性化された修飾組換えウイルスに関するものである。この機能は、可欠であっても、または毒性に関連であってもよい。ウイルスは好ましくは、ポックスウイルス、特に鶏痘ウイルスおよびカナリヤポックスウイルスのようなアビポックスウイルスまたはワクシニアウイルスである。
本発明は、ワクチン接種した宿主動物中に免疫学的応答を誘発するワクチンに関し、このワクチンは組換えウイルスが毒性が弱毒化され、安全性が高められるように可欠ウイルスコード遺伝子機能が不活性化された修飾組換えウイルスおよび担体を含む。本発明によるワクチンに用いられるウイルスは好ましくは、ポックスウイルス、特に鶏痘ウイルスおよびカナリヤポックスウイルスのようなアビポックスウイルスまたはワクシニアウイルスである。
本発明は、組換えウイルスの毒性が弱毒化され安全性が高められるように可欠ウイルスコード遺伝子が不活性化された修飾組換えウイルスを含有する免疫原組成物に関するものである。修飾組換えウイルスは、ウイルスゲノムの可欠領域内に、病原から誘導された抗原タンパク質をコードする非相同DNA配列を含有する。このとき組成物は、宿主に施された場合、病原によりコードされたタンパク質に特異的な免疫応答を誘発できる。
さらに本発明は、毒性が弱毒かされ安全性が高められた修飾組換えウイルスを細胞中に導入することにより生体外の細胞培養中で遺伝子産生物を発現する方法に関するものである。
さらに本発明は、ウイルスの毒性が弱毒化されるように可欠ウイルスコード遺伝子機能が不活性化された修飾組換えウイルスに関し、この修飾組換えウイルスはさらに、ウイルスゲノムの可欠領域中に非相同源からのDNAを含有する。特に、遺伝子機能は、毒性因子をコードする読取り枠を欠損せしめることにより、または宿主制限ウイルスを自然に用いることにより不活性化せしめられる。本発明により用いられるウイルスは、好ましくは、ポックスウイルス、特に鶏痘ウイルスおよびカナリヤポックスウイルスのようなアビポックスウイルスまたはワクシニアウイルスである。好ましくは、その読取り枠は、J2R、B13R＋B14R、A26L、A56R、C7L−K1L、およびI4Lからなる群より選択される（ゲーベルら、1990a、ｂに報告された用語法による）。この点に関して、読取り枠は、チミジンキナーゼ遺伝子、出血性領域、Ａ型含有ボディ領域、血球凝集素遺伝子、宿主範囲遺伝子領域または巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼからなる。
【図面の簡単な説明】
以下の詳細な記載は、実施例として与えられたものであり、本発明を記載した特定の実施態様に制限するものではなく、添付した図面とともに理解されよう。
第１図は、チミジンキナーゼ遺伝子の欠損したプラスミドpSD460の構成方法と組換えワクシニアウイルスvP410の産生方法を模式的に示すものである。
第２図は、出血性領域の欠損したプラスミドpSD486の構成方法と組換えワクシニアウイルスvP553の産生方法を模式的に示すものである。
第３図は、ATI領域の欠損したプラスミドpSD494Δの構成方法と組換えワクシニアウイルスvP618の産生方法を模式的に示すものである。
第４図は、血球凝集素の欠損したプラスミドpSD467の構成方法と組換えワクシニアウイルスvP723の産生方法を模式的に示すものである。
第５図は、遺伝子クラスター［C7L−K1L］の欠損したプラスミドpMPCSK1Δの構成方法と組換えワクシニアウイルスvP804の産生方法を模式的に示すものである。
第６図は、巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼの欠損したプラスミドpSD548の構成方法と組換えワクシニアウイルスvP886（NYVAC）の産生方法を模式的に示すものである。
第７図は、狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子をTK欠損座中に挿入したプラスミドpRW842の構成方法と組換えワクシニアウイルスvP879の産生方法を模式的に示すものである。
第８図は、EBVトリプル１プラスミド中に挿入されたEBV暗号領域の遺伝子地図である。
第９図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号214）を有する修飾合成ワクシニアウイルスH6初期／晩期プロモーターおよび合成spsAg遺伝子のDNA配列（配列認識番号213）を示すものである。
第10図は、組換えワクシニアウイルスvP856の構成方法を模式的に示すものである。
第11図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号216）を有するｕプロモーター/lpsAg遺伝子のDNA配列（配列認識番号215）を示すものである。
第12図は、組換えワクシニアウイルスvP896の構成方法を模式的に示すものである。
第13図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号217）を有するI3Lプロモーター/S12/コア遺伝子のDNA配列（配列認識番号87）を示すものである。
第14図は、組換えワクシニアウイルスvP919の構成方法を模式的に示すものである。
第15図は、予測アミノ酸配列（配列認識番号219）を有するEPV42kDaプロモーター/lpsAg遺伝子のDNA配列（配列認識番号218）を示すものである。
第16図は、C5 ORFを含有するカナリヤポックスPvu II断片のDNA配列（配列認識番号217）を示すものである。
第17図は、組換えカナリヤポックスウイルスvCP65（ALVAC−RG）の構成方法を模式的に示すものである。
第18図は、ワクシニアウイルスvP555、vP825、vP908、vP923、vP857およびvP864に挿入されるJEV暗号領域の模式図である。
第19図は、ワクシニアウイルスvP766、vP764、vP869、vP729およびvP725に挿入されるYF暗号領域の模式図である。
第20図は、ワクシニアウイルスvP867、vP962およびvP955に挿入されるDEN暗号領域の模式図である。
第21図は、F8 ORFを含有するTROVAC DNAの3661塩基対断片のヌクレオチド配列（配列認識番号221）を示すものである。
第22図は、F7 ORFを含有するTROVAC DNAの2356塩基対断片のDNA配列（配列認識番号222）を示すものである。
第23図は、EIV HA（A1/プラハ/56）のヌクレオチド配列（配列認識番号279）を示すものである。
第24図は、EIV HA（A2/フォンテンブルー/79）のヌクレオチド配列（配列認識番号284）を示すものである。
第25図は、EIV HA（A2/サフォーク/89）のヌクレオチド配列（配列認識番号300）を示すものである。
第26図は、FeLV−Ｂエンベロープ遺伝子のヌクレオチド配列（配列認識番号310）を示すものである。
第27図は、FeLV−Aqaqおよび部分的pol遺伝子のヌクレオチド配列（配列認識番号324）を示すものである。
第28図は、FHV−1CO菌株gSホモログ遺伝子のヌクレオチド配列（配列認識番号290）を示すものである。
第29図は、pURF3により表されるコンセンサスＦヌクレオチド配列（おたふくかぜ）（配列認識番号370）を示すものである。
第30図は、pUHN5により表されるコンセンサスHNヌクレオチド配列（おたふくかぜ）（配列認識番号371）を示すものである。
第31図は、ワクシニアウイルスまたはカナリアポックスウイルスベクター（NYVAC、ALVAC）もしくはHIV III Ｂ envを発現するワクシニアウイルスまたはカナリアポックスウイルス（vP911、vDP112）で免疫化した、ネズミのひ臓細胞の細胞毒性応答を示すものである。
第32図は、細胞毒性Ｔリンパ球細胞表面抗原Thy1.2およびLyt2.2に対する抗体に対してのvCP112で免疫化したネズミのひ臓からの細胞毒性作動体細胞の感度を示すものである。
第33図は、gp120のHIV III Ｂ超可変V3ループのであって、HIV MNまたはSF2のV3ループのではない細胞毒性Ｔリンパ球抗原受容体の特異性を示すものである。
第34図は、ベクター（NYVAC、ALVAC）またはワクシニアウイルス組換え体vP911またはHIV−１ envを発現するカナリヤポックス組換え体vCP12で免疫化したネズミのHIV III Ｂ gp120に対する抗体応答を示すものである（逆三角は、２回目の接種を施した時間を示す）。
第35図は、狂犬病中和抗体力価（RFFIT、IU/ml）のグラフであって、同一のワクチンまたは交互のワクチンで事前に免疫化した志願者にHDCおよびvCP65を追加抗原投与した効果（105.5TCID50）を示すものである（ワクチンは０、28および180日目に与え、抗体力価は０、７、28、35、56、173、187および208日に測定した）。
第36図は、vP908、vP555、vP923およびvP829中に含有せしめられたJEV cDNA配列を示すものである。
第37図は、０日と28日にvP908、vP923、vP866およびPBSで免疫化した豚に観察されたNEUTおよびHAI活性を示すものである（矢印は接種の日を示す）。
第38図は、PBS、vP866、vP908またはvP923で免疫化し、JEVのＢ−2358/84菌株で抗原投与した各群の個々の豚に検出したウイルス血症の時間の経過を示すものである。
第39図は、NYVACを産生するのに欠損したORFを模式的に示したものである。
発明の詳細な説明
新たなワクシニアワクチン菌株、NYVAC（vP866）を展開するために、ワクシニア旨い留守のコペンハーゲンワクチン菌株を、既知のまたは潜在的な毒性因子をコードするゲノムの６つの可欠領域を欠損せしめることにより修飾した。この配列欠損は以下に詳細に示す。ワクシニア制限断片、読取り枠およびヌクレオチド位置の全ての名称は、ゲーベルら、1990a、ｂに報告された用語法に基づくものである。
欠損座はまた、異種遺伝子の挿入の受容体座として作成された。
NYVAC中の欠損領域を以下に示す。また、短縮型および欠損領域の読取り枠の名称（ゲーベルら、1990a、ｂ）並びに下記に特性される全ての欠損を含むワクシニア組換え体（vP）の名称も記載する：
（１）チミジンキナーゼ遺伝子（TK;J2R）vP410;
（２）出血性領域（u;B13R＋B14R）vP553;
（３）Ａ型含有ボディ領域（ATI;A26L）vP618;
（４）血球凝集素遺伝子（HA;A56R）vP723;
（５）宿主範囲遺伝子領域（C7L−K1L）vP804;
（６）巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼ（I4L）vP866（NYVAC）。
DNAクローニングおよび合成
プラスミドを構成し、スクリーニングして、標準方法により成長せしめた（マニアチスら、1982;パーカスら、1985;ピッチーニら、1987）。制限エンドグルカナーゼを、MD、ゲセルスバーグ、ベセスダリサーチラボラトリーズ;MA、ビバーリー、ニューイングランドバイオラボ；およびIN、インディアナポリス、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルスから得た。E.coliポリメラーゼのクレノウ断片を、ベーリンガーハイムバイオケミカルスから得た。BAL−31エキソヌクレアーゼおよびファージT4 DNAリガーゼをニューイングランドバイオラボから得た。様々な供給者により明示された試薬を用いた。
合成オリゴデオキシリボヌクレオチドを、前述のようにバイオサーチ8750または応用バイオシステム380B DNAシンセサイザーで調製した（パーカスら、1989）。前述したように（グオら、1989）シーケナーゼを用いて（タボアら、1987）、ジデオキシ鎖終了法（サンガーら、1977）によりDNA塩基配列決定を行なった。自動パーキンエルマーセタスDNAサーマルサイクラー中で、注文合成オリゴヌクレオチドプライマーとジェネアンプDNA増幅試薬キット（CT、ノルウォーク、パーキンエルマーセタス）を用いて、配列確認のためのポリメラーゼ鎖反応（PCR）によるDNA増幅（エンゲルケら、1988）を行なった。制限エンドヌクレアーゼ切断および続いてのBAL−13エキソヌクレアーゼによる制限切断並びに合成オリゴヌクレオチドを用いた突然変異誘発（マンデッキ、1986）によりプラスミドから過剰のDNA配列を欠損せしめた。
細胞、ウイルス、および移入
ワクシニアウイルスのコペンハーゲン菌株の培養の起源と条件は以前に記載した（グオら、1989）。ニトロセルロースフィルターの現場での雑種形成、組換え、およびＢ−ガラクトシダーゼ活性のスクリーニングによる組換えウイルスの産生は以前に記載している（パニカリら、1982;パーカスら、1989）。
説明のために示した以下の実施例により、本発明および多くの利点がよりよく理解されるであろう。
実施例１−チミジンキナーゼ遺伝子（J2R）の欠損したプラスミドpSD460の構成
ここで第１図を参照する。プラスミドpSD406はpUC8中にクローンされたワクシニアHind III Ｊ（位置83359−88377）を含有している。pSD406をHind IIIとPvu IIで切断し、pUC8中にクローンされたHind III Ｊの左側からの1.7kb断片をHind/Sma Iで切断し、pSD447を形成した。pSD447はJ2Rの完全な遺伝子を含有している（位置83855−84385）。開始コドンはNla III部位内に含有され、終止コドンはSsP I部位内に含有される。第１図の矢印により転写の方向を示す。
左側フランキングアームを得るために、0.8kb Hind III/EcoR I断片をpSD447から単離し、次いでNla IIIで切断し、0.5kb Hind III/Nla III断片を単離した。アニールした合成オリゴヌクレオチドMPSYN43/MPSYN44（配列認識番号1/配列認識番号２）
Figure 0003602530
をHind III/EcoR Iで切断したpUC18ベクタープラスミド中で0.5kb Hind III/Nla III断片と連結し、プラスミドpSD449を産生した。
ワクシニア右側フランキングアームとpUCベクター配列を含有する制限断片を得るために、ワクシニア配列内のSsp I（部分的）とpUC/ワクシニア接合部でのHind IIIでpSD447を切断し、2.9kbベクター断片を単離した。このベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドMPSYN45/MPSYN46（配列認識番号3/配列認識番号４）
Figure 0003602530
と連結し、pSD459を産生した。
左側と右側フランキングアームを１つのプラスミド中に結合させるために、0.5kb Hind III/Sma I断片をpSD449から単離し、Hind III/Sma Iで切断したpSD459ベクタープラスミドと連結し、プラスミドpSD460を産生した。pSD460は、野生型親ワクシニアウイルスコペンハーゲン菌株VC−２との組換えの供与体プラスミドとして用いた。テンプレートととしてのMPSYN45（配列認識番号３）とプライマーとしての相補的20merオリゴヌクレオチドMPSYN47（配列認識番号５）（５′TTAGTTAATTAGGCGGCCGC3′）を用いたプライマー延長により32P標識プローブを合成した。組換えウイルスvP410をプラークハイブリダイゼーションにより同定した。
実施例２−出血性領域の欠損したプラスミドpSD486の構成（B13R＋B14）
ここで第２図を参照する。プラスミドpSD419はpUC8中にクローンされたワクシニアSal I Ｇ（位置160,744−173,351）を含有している。pSD422はpUC8中にクローンされた、右側への隣接ワクシニアSal I断片、Sal I Ｊ（位置173,351−182,746）を含有している。出血性領域、ｕ、B13R−B14R（位置172,549−173,552）の欠損したプラスミドを構成するために、左側フランキングアームの供給源としてpSD419を用い、右側フランキングアームの供給源としてpSD422を用いた。ｕ領域の転写方向を第２図の矢印で示す。
pSD419からの不必要な配列を除去するために、Nco I/Sma IによりpSD419の切断によりNco I部位（位置172,253）の左側までの配列を除去し、続いてE.coliポリメラーゼのクレノウ断片によるブラントエンド並びに連結を行ないプラスミドpSD476を産生した。B14Rの終止コドンでのHpa IでのpSD422の切断と右側の0.3kbのNru Iでの切断によりワクシニア右側フランキングアームを得た。この0.3kb断片を単離して、pSD476から単離した3.4kb Hinc IIベクター断片と連結し、プラスミドpSD477を産生した。pSD477のワクシニアｕ領域の部分的な欠損位置を三角形により示す。Cla I/Hpa Iでの切断により、pSD477中の残りのB13R暗号配列を除去し、生成したベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドSD22mer/SD20mer（配列認識番号6/配列認識番号７）
Figure 0003602530
と連結し、pSD479を産生した。pSD479は開始コドン（下線）と続いてBamH I部位を含有している。ｕプロモーターの制御下でB13−B14（ｕ）欠損座中にE.coliベータガラクトシダーゼを配するために、ベータガラクトシダーゼを含有する3.2kb BamH I断片をpSD479のBamH I部位中に挿入し、pSD479BGを生成した。pSD479BGは、ワクシニアウイルスvP410による組換えの供与体プラスミドとして用いた。組換えワクシニアウイルスvP533を、色素基体Ｘ−ga lの存在下でブループラークとして単離した。vP533において、B13R−B14R領域は欠損しており、ベータガラクトシダーゼにより置換されている。
vP533からベータガラクトシダーゼ配列を除去するために、ポリリンカー領域を含有するがｕ欠損接合部には開始コドンを含有しないpSD477の誘導体、プラスミドpSD486を用いた。最初に上述したpSD477からのCla I/Hpa Iベクター断片をアニールした合成オリゴヌクレオチドSD42mer/SD40mer（配列認識番号8/配列認識番号９）
Figure 0003602530
と連結し、プラスミドpSD478を産生した。次に、pSD478をEcoR Iでの断片によりpUC/ワクシニア接合でのEcoR I部位を破壞し、続いてE.coliポリメラーゼのクレノウ断片でのブラントエンド並びに連結を行ないプラスミドpSD478E-を産生した。pSD478E-をBamH IとHpa Iで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチドHEM5/HEM6（配列認識番号10/配列認識番号11）
Figure 0003602530
と連結し、プラスミドpSD486を産生した。pSD486を、組換えワクシニアウイルスvP533との組換えのための供与体プラスミドとして用い、vP553を産生し、これをＸ−galの存在下で透明プラークとして単離した。
実施例３−ATI領域（A26L）の欠損したプラスミドpMP494Δの構成
ここで第３図を参照する。pSD414はpUC8中にクローニングされたSal I Ｂを含有している。A26L領域の左側の不必要なDNA配列を除去するために、pSD414を、ワクシニア配列内のXba I（位置173,079）およびpUC/ワクシニア接合部でのHind IIIで切断し、次いでE.coliポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドして連結し、プラスミドpSD483を産生した。A26L領域の右側の不必要なDNA配列を除去するために、pSD483をEcoR I（位置140,665およびpUC/ワクシニア接合部）で切断して連結し、プラスミドpSD484を形成した。A26L暗号領域を除去するために、A26L ORFからや上流のNde I（部分的）（位置139,004）およびA26L ORFのやや下流のHpa I（位置137,889）で切断した。5.2kbベクター断片を単離して、アニールした合成オリゴヌクレオチドATI3/ATI4）（配列認識番号12/配列認識番号13）
Figure 0003602530
と連結し、A26Lから上流の領域を再構成し、上記したようにA26L ORFを、制限部位Bgl II、EcoR IおよびHpa Iを含有する短いポリリンカー領域と置換した。生成したプラスミドをpSD485と称した。pSD485のポリリンカー領域中のBgl IIおよびEcoR I部位は特有ではないので、Bgl II（位置140,136）およびpUC/ワクシニア結合部でのEcoR Iで切断により望ましくないBgl IIおよびEcoR I部位をプラスミドpSD483（上述）から除去し、続いてE.coliポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンド並びに連結した。産生したプラスミドをpSD489と称した。A26L ORFを含有するpSD489からの1.8kb Cla I（位置137,198）/EcoR V（位置139,048）断片を、pSD485からの対応0.7kbポリリンカー含有Cla I/EcoR V断片と置換してpSD492を産生した。pSD492のポリリンカー領域中のBgl IIおよびEcoR I部位は特有である。
ワクシニア11kDaプロモーターの制御下で（バートレットら、1985;パーカスら、1990）E.coliベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピラら、1983）を含有する3.3kb Bgl IIカセッテをpSD492のBgl II部位に挿入し、pSD493KBGを形成した。プラスミドpSD493KBGは救助（rescuing）ウイルスvP553との組換えに用いた。A26L欠損領域中にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルス、vP581を、Ｘ−galの存在下でブループラークとして単離した。
ワクシニア組換えウイルスvP581からのベータガラクトシダーゼを除去したプラスミドを産生するために、合成オリゴヌクレオチドMPSYN177（配列認識番号14）
Figure 0003602530
を用いた突然変異誘発（マンデッキ、1986）によりプラスミドpSD492のポリリンカー領域を欠損した。産生したプラスミド、pMP494Δにおいて、完全なA26L ORFを含有し、位置［137,889−138,937］を包含するワクシニアDNAは欠損している。pMP494Δとワクシニア組換え体、vP581を含有するベータガラクトシダーゼとの間の組換えによりワクシニア欠損変異体vP618を産生し、これはＸ−galの存在下で透明プラークとして単離した。
実施例４−血球凝集素遺伝子（A56R）の欠損したプラスミドpSD467の構成
ここで第４図を参照する。ワクシニアSal I Ｇ制限断片（位置160,744−173,351）はHind III A/B接合部（位置162,539）と交差している。pSD419はpUC8中にクローニングされたワクシニアSal I Ｇを含有している。血球凝集素（HA）遺伝子の転写方向を第４図に矢印で示す。pSD419をワクシニア配列内とpUC/ワクシニア接合部でのHind IIIで切断することにより、Hind III Ｂから誘導したワクシニア配列を除去し、続いて連結した。産生したプラスミドpSD456は、左側の0.4kbのワクシニア配列と右側の0.4kbのワクシニア配列を側腹に有するHA遺伝子、A56Rを含有している。pSD456を、A56R暗号配列から上流のRsa I（部分的；位置161,090）、および遺伝子の末端近くのEaq I（位置162,954）で切断することによりA56R暗号配列を除去した。pSD456からの3.6kb Rsa I/Eaq Iベクター断片を単離し、アニールした合成オリゴヌクレオチドMPSYN59（配列認識番号15）、MPSYN62（配列認識番号16）、MPSYN60（配列認識番号17）、およびMPSYN61（配列認識番号18）
Figure 0003602530
と連結し、A56R ORFから上流のDNA配列を再構成し、上記のごとく示したようにA56R ORFをポリリンカー領域で置換した。産生したプラスミドはpSD466である。pSD466中のワクシニア欠損は、位置［161,185−162,053］を包含する。pSD466中の欠損部位を第４図に三角形で示す。
ワクシニア11kDaプロモーターの制御下で（バートレットら、1985;グオら、1989）E.coliベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピラら、1983）を含有する3.2kb Bgl II/BamH I（部分的）カセッテを、pSD466のBgl II部位に挿入し、pSD466KBGを形成した。プラスミドpSD466KBGは、救助ウイルスvP618との組換えに用いた。A56R欠損中にベーカダラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルス、vP708を、Ｘ−galの存在下でブループラークとして単離した。
供与体プラスミドpSD467を用いてベータガラクトシダーゼ配列をvP708から欠損した。pSD466をEcoR I/BamG Iで切断することにより、pUC/ワクシニア接合部からEcoR I、Sma IおよびBamH I部位を除去し、続いてE.coliポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドし、連結したことを除いては、pSD467はpSD466と同一である。vP708とpSD467との間の組換えにより、組換えワクシニア欠損変異体、vP723を産生し、これはＸ−galの存在下で透明プラークとし単離した。
実施例５−読取り枠［C7L−K1L］の欠損したプラスミドpMPCSK1Δの構成
ここで第５図を参照する。pMPCSK1Δの構成に、以下のワクシニアクローンを用いた。pSD420はpUC8中にクローニングされたSal I Ｈである。pSD435はpUC18中にクローニングされたKpn I Ｆである。pSD435をSph Iで切断し、再連結し、pSD451を形成した。pSD451において、Hind III Ｍ中のSph I部位（位置27,416）の左側のDNA配列を除去する（パーカスら、1990）。pSD409はpUC8中にクローニングされたHind III Ｍである。
ワクシニアからの［C7L−K1L］遺伝子クラスターの欠損した基体を提供するために、E.coliベータガラクトシダーゼを以下のようにワクシニアM2L欠損座（グオら、1990）中に最初に挿入した。pSD409のBgl II部位を除去するために、ワクシニア配列のBgl II（位置28,212）およびpUC/ワクシニア接合部でのBamH Iで切断し、次いで連結し、プラスミドpMP409Bを形成した。pMP409Bを特有Sph I部位（位置27,416）で切断した。合成オリゴヌクレオチドMPSYN82（配列認識番号19）
Figure 0003602530
を用いた突然変異誘発（グオら、1990;マンデッキ、1986）によりM2L暗号配列を除去した。産生したプラスミド、pMP409Dは、上記のようにM2L欠損座中に挿入された特有Bgl II部位を含有した。11kDaプロモーターの制御下で（バートレットら、1985）E.coliベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピラら、1983）を含有する3.2kb BamH I（部分的）/Bgl IIカセッテをBgl IIで切断したpMP409D中に挿入した。産生したプラスミドpMP409DBG（グオら、1990）を救助ワクシニアウイルスvP723により組換えの供与体プラスミドとして用いた。M2L欠損座中に挿入されたベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルス、vP784を、Ｘ−galの存在下でブループラークとして単離した。
ワクシニア遺伝子［C7L−K1L］の欠損したプラスミドを、Sma I、Hind IIIで切断したpUC8中に組み入れ、E.coliポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドした。ワクシニアHind III Ｃ配列からなる左側フタンキングアームを、pSD420をXba I（位置18,628）で切断することにより得て、E.coliポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドしてBgl II（位置19,706）で切断した。pSD451をBgl II（位置29,062）とEcoR V（位置29,778）で切断することにより、ワクシニアHind III Ｋ配列からなる右側フランキングアームを得た。産生したプラスミド、pMP581CKは、Hind III Ｃ中のBgl II部位（位置19,706）とHind III Ｋ中のBgl II部位（位置29,062）の間のワクシニア配列が欠損している。プラスミドpMP581CK中のワクシニア配列の欠損部位を第５図に三角形で示す。
ワクシニア欠損接合部の過剰のDNAを除去するために、プラスミドpMP581CKをワクシニア配列内のNco I部位（位置18,811;19,655）で切断し、Bal−31エキソクレアーゼで処理し、合成オリゴヌクレオチドMPSYN233（配列認識番号20）
Figure 0003602530
を用いて突然変異誘発（マンデッキ、1986）を行なった。産生したプラスミド、pMPCSK1Δは、12ワクシニア読取り枠［C7L−K1L］を包含する、ワクシニア配列位置18,805−29,108が欠損している。pMPCSK1Δとワクシニア組換え体、vP784を含有するベーダラクトシダーゼとの間の組換えによりワクシニア欠損変異体、vP804が産生し、これはＸ−galの存在下で透明プラークとして単離した。
実施例６−巨大サブユニット、リボヌクレオチドレダクターゼ（I4L）の欠損したプラスミドpSD548の構成
ここで第６図を参照する。プラスミドpSD405は、pUC8中にクローンされたワクシニアHind IIII（位置63,875−70,367）を含有している。pSD405をワクシニア配列（位置67,933）内のEcoR VおよびpUC/ワクシニア接合部でのSma Iで切断し、連結し、プラスミドpSD518を形成した。pSD518は、pSD548の構成に用いる全てのワクシニア制限断片の供給源として用いた。
ワクシニアI4L遺伝子は、位置67,371−65,059に亘り延びる。I4Lの転写方向を第６図の矢印で示した。I4L暗号配列の部分が欠損したベクタープラスミド断片を得るために、pSD518をBamH I（位置65,381）とHpa I（位置67,001）で切断し、E.coliポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。この4.8kbベクター断片を、ワクシニア11kDaプロモーターの制御下で（バートレット、1985;パーカスら、1990）E.coliベータガラクトシダーゼ遺伝子（シャピラら、1983）を含有する3.2kb Sma Iカセッテと連結し、プラスミドpSD524KBGを産生した。pSD524KBGは、ワクシニアウイルスvP804との組換えの供与体プラスミドとして用いた。I4L遺伝子の部分的欠損中にベータガラクトシダーゼを含有する組換えワクシニアウイルス、vP855を、Ｘ−galの存在下でブループラークとして単離した。
vP855からのI4L ORFの残りとベータガラクトシダーゼを欠損するためにに、欠損プラスミドpSD548を構成した。以下に示すように左側と右側のワクシニアフランキングアームをpUC8中で別々に組み立て、これを第６図に模式的に示した。
左側ワクシニアフランキングアームを受け入れるベクタープラスミドを構成するために、pUC8をBamH I/EcoR Iで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド518A1/518A2（配列認識番号21/配列認識番号22）
Figure 0003602530
と連結し、プラスミドpSD531を形成した。pSD531をRsa I（部分的）とBamH Iで切断し、2.7kbベクター断片を単離した。pSD518をBgl II（位置64,459）/Rsa I（位置64,994）で切断し、0.5kb断片を単離した。２つの断片をともに連結し、pSD537を形成した。このpSD537はI4L暗号配列の左側の完全なワクシニアフランキングアームを含有する。
右側のワクシニアフランキングアームを受け入れるベクタープラスミドを構成するために、pUC8をBamH I/EcoR Iで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチド518B1/518B2（配列認識番号23/配列認識番号24）
Figure 0003602530
と連結し、プラスミドpSD532を形成した。pSD532Rsa I（部分的）/EcoR Iで切断し、2.7kbベクター断片を単離した。pSD518を、ワクシニア配列内のRsa I（位置67,436）およびワクシニア/pUC接合部のEcoR Iで切断し、0.6kb断片を単離した。２つの断片をともに連結し、pSD538を形成した。このpSD538はI4L暗号配列の右側の完全なワクシニアフランキングアームを含有する。
pSD538からの0.6kb EcoR I/Bgl II断片として右側ワクシニアフランキングアームを単離して、EcoR I/Bgl IIで切断したpSD537ベクタープラスミド中に連結した。産生したプラスミド、pSD539において、I4L ORF（位置65,047−67,386）は、全てpUCバックグラウンドにおいて左側の0.6kbのワクシニアDNAと右側に0.6kbのワクシニアDNAを側腹に有するポリリンカー領域により置換される。ワクシニア配列内の欠損部位を第６図に三角形で示す。pSD539のpUC誘導部分中のベータガラクトシダーゼ配列と組換えワクシニアウイルスvP855内のベータガラクトシダーゼ配列との潜在的な組換えを避けるために、ワクシニアI4L欠損カセッテをpSD539から、全てのベータガラクトシダーゼ配列が除去されポリリンカー領域と置換されたpUC誘導体である、pRC11中に移入した（コリナスら、1990）。pSD539をEcoR I/Pst Iで切断し、1.2kb断片を単離した。この断片をEcoR I/Pst Iで切断したpRC11（2.35kb）中に連結し、pSD548を形成した。pSD548とワクシニア組換え体、vP855を含有するベータガラクトシダーゼとの間の組換えにより、ワクシニア欠損変異体vP866を産生し、これはＸ−galの存在下で透明プラークとして単離した。
組換えワクシニアウイルスvP866からDNAを、制限切断と、続いてアガロースゲル上の電気泳動により分析した。制限模様は予期したとうりであった。テンプレートとしてのvP866と上述した６つの欠損座を側腹に有するプライマーを用いたポリメラーゼ鎖反応（PCR）（エンゲルケら、1988）により、予期したサイズのDNA断片が産生された。欠損接合部の区域辺りのPCR産生断片の配列分析により、接合部が予期したものであることが確認された。上述したような６つの作成した欠損を含有する組換えワクシニアウイルスvP866はワクシニアワクチン菌株「NYVAC」と称した。
実施例７−狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子のNYVACへの挿入
ワクシニアH6プロモーター（テイラーら、1988a、ｂ）の制御下で遺伝子コード狂犬病糖タンパク質ＧをTK欠損プラスミドpSD513中に挿入した。pSD513は、ポリリンカー領域の存在を除いてはプラスミドpSD460（第１図）と同一である。
ここで第７図を参照する。pSD460をSma Iで切断し、プラスミドベクターをアニールした合成オリゴヌクレオチドVQ1A/VQ1B（配列認識番号25/配列認識番号26）
Figure 0003602530
と連結することによりポリリンカー領域を挿入し、ベクタープラスミドpSD513を形成した。pSD513をSma Iで切断し、ワクシニアH6プロモーターの制御下で狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子をコードする遺伝子を含有するSma I末端1.8kbカセッテと連結した（テイラーら、1988a、ｂ）。産生したプラスミドをpRW842と称する。pRW842を、NYVAC救助ウイルス（vP866）との組換えの供与体プラスミドとして用いた。狂犬病糖タンパク質Ｇ暗号配列に対する32P標識DNAプローブを用いてプラークハイブリダイゼーションにより同定した。
本発明の修飾組換えウイルスは、組換えワクチンベクターとしての利点を提供する。ベクターの毒性が弱毒化したことにより、ワクチン接種した個体のワクチン接種より手に負えない（runaway）感染の可能な機会が減少し、またワクチン接種した個体からワクチン接種していない個体への伝染または環境の汚染が減少する。
修飾組換えウイルスはまた好ましくは、細胞中の遺伝子産生物をコードし発現する異種DNAを有する修飾組換えウイルスを細胞中に導入することにより、生体外で培養した細胞中に遺伝子産生物を発現する方法に用いられる。
実施例８−ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素ノイラミニターゼ糖タンパク質と融合を発現するTROVAC−NDVの構成
毒性NDV菌株テキサスのＦおよびHN遺伝子の両方を発現する鶏痘ウイルス（FPV）ベクターを構成した。産生した組換え体はTROVAC−NDVと称した。TROVAC−NDVは組換えウイルスに感染したアビアン細胞中の確実に処理したNDV糖タンパク質を発現し、生後１日のひなに接種することにより続いての毒性NDV抗原投与に対して保護を与える。
細胞およびウイルス
NDVのテキサス菌株は短潜伏期性菌株である。ＦおよびHN遺伝子のcDNAクローンの調製は前に記載してある（テイラーら、1990;エドバウアーら、1990）。FPV選定FP−１の菌株は前に記載してある（テイラーら、1988a）。生後１日のひなのワクチン接種に有用なのは弱毒化ワクチン菌株である。親ウイルス菌株デュベッティは、鶏からの鶏痘かさぶたとしてフランスで得られた。ふ化鶏卵における約50連続の継代接種と続いての鶏繊維芽細胞の約25回の継代接種によりウイルスは弱毒化された。ウイルスに４連続のプラーク精製を施した。１つのプラーク単離体をさらに初代CEF細胞中で増幅し、TROVACと称する同種菌を作成した。TROVAC−NDVを産生する生体内組換え試験に用いられる同種ウイルスに、プラーク単離体からの初代CEF細胞中で12回継代接種を施した。
NDV−Ｆのカセッテの構成
Ｆタンパク質暗号配列の５′末端からの22ヌクレオチド以外の全てを含有する1.8kbp BamH I断片をpNDV81（テイラーら、1990）から切除し、pUC18のBamH I部位で挿入し、pCE13を形成した。pCE13をSal Iで切断し、粘着末端をE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片で充填し、Hind IIIで切断することにより、上述したワクシニアウイルスH6プロモーター（テイラーら、1988a、b;グオら、1989;パーカスら、1989）をpCE13中に挿入した。H6プロモーター配列を含有するHind III−EcoR V断片をpCE13中に挿入し、pCE38を形成した。pCE38をKpn IとNru Iで切断し、アニールしキナーゼした（kinased）オリゴヌクレオチドCE75（配列認識番号27）とCE76（配列認識番号28）を挿入することにより完全な５′末端を産生し、pCE47を産生した。
Figure 0003602530
NDV−Ｆの３′末端から非暗号配列を除去するために、pCE13からのSma IからPst I断片をpUC18のSma IとPst I部位に挿入し、pCE23を形成した。pCE23のSal I、BamH I、エキソクレアーゼIII、SIヌクレアーゼおよびEcoR Iでの配列切断により、非暗号配列を除去した。次いで、アニールし、キナーゼしたオリゴヌクレオチドCE42（配列認識番号29）およびCE42（配列認識番号30）を挿入し、pCE29を形成した。
Figure 0003602530
次いで、pCE29からのPst I−Sac I断片をpCE20のPst IとSac I部位にクローニングすることにより、NDV−Ｆ配列の３′末端を、すでにNDV−Ｆの５′末端を含有するプラスミドpCE20に挿入し、pCE32を形成した。pCE20の産生は以前にテイラーら、1990に記載されている。
pCE47中に含有されるNDV−Ｆ ５′配列とH6プロモーターをpCE32中に含有される３′NDV−Ｆ配列と配列させるために、pCE47のHind III−Pst I断片を、pCE32のHind IIIおよびPst I部位に挿入し、pCE49を形成した。次いで、pCE49からのHind III−Nru I断片まをpJCA002のHind IIIとSma I部位（上述）中にクローニングすることにより、H6プロモートしたNDV−Ｆ配列を脱ORFした（de−ORFed）F8座に転移せしめ、pCE54を形成した。pCE54をSac Iで、部分的にBamH Iで切断し、アニールしキナーゼしたオリゴヌクレオチドCE166（配列認識番号31）およびCE167（配列認識番号32）を挿入することにより、転写終止信号をpCE54に挿入し、pCE58を産生した。
Figure 0003602530
テンプレートとしてのpCE54およびプライマーとしてのオリゴヌクレオチドCE182（配列認識番号33）とCE183（配列認識番号34）によるポリメラーゼ鎖反応（PCR）を用いることにより、NDV−Ｆの完全３′末端を得た。
Figure 0003602530
PCR断片をPvu IIとHpa IIで切断し、Hpa Iと部分的にPvu IIで切断したpCE58中にクローニングした。産生したプラスミドpCE64と称した。完全H6プロモーターとpCE64からのＦ暗号配列を含有するHind III−Hpa I断片を、pRW846のHind IIIおよびHpa I部位にクローニングすることにより、翻訳終止信号を挿入し、NDV−Ｆの最終カセッテであるpCE71を産生した。プラスミドpRW846は実質的にプラスミドpJCA002（以下に記載）と等しいが、H6プロモーターおよび転写ならびに翻訳終止信号を含有する。pRW846をHind IIIとHpa Iで切断することによりH6プロモーターを除去するが、終止信号は完全に残す。
NDV−HNのカセッテの構成
プラスミドpRW802の構成はエドバウアーら、1990に記載している。このプラスミドはpUC9ベクター中にワクシニアウイルスH6プロモーターの３′末端に連絡したNDV−HN配列を含有している。ワクシニアウイルスH6プロモーターの５′末端を包含するHind III−EcoR V断片を、pRW802のHind IIIおよびEcoR V部位に挿入し、pRW830を形成した。アニールしキナーゼしたオリゴヌクレオチドCE162（配列認識番号35）およびCE163（配列認識番号36）をpRW830のEcoR I部位中に挿入することによりNDV−HNの３′末端を得て、NDV−HNの最終カセッテであるpCE59を形成した。
Figure 0003602530
FPV挿入ベクターの構成
プラスミドpRW731−15はゲノムDNAからクローニングされた10kb Pvu II−Pvu II断片を含有している。3660bp Pvu II−EcoR V断片の両鎖についてヌクレオチド配列を決定した。ここにF8として示した読取り枠の制限を決定した。プラスミドpRW761は2430bp EcoR V断片を含有するpRW731−15のサブクローンである。F8 ORFはpRW761中のXba I部位とSsp I部位との間に完全に含まれた。TROVACとの組換えに関してゲノムDNAがF8 ORFを除去する挿入プラスミドを産生するために、以下の工程を行なった。プラスミドpRW761をXba Iで完全に切断し、Sap Iで部分的に切断した。3700bp Xba I−Ssp I帯をゲルから単離して、アニールした二重鎖オリゴヌクレオチドJCA017（配列認識番号37）およびJCA018（配列認識番号38）と連結した。
Figure 0003602530
この連結により産生したプラスミドをpJCA002と称した。
NDV ＦとHNの二重挿入ベクターの構成
E.coli DNAポリメラーゼが充填されたpCE59からのHind III断片をpCE71のHpa I部位にクローニングすることにより、H6プロモートしたNDV−HN配列をH6プロモートしたNDV−Ｆカセッテに挿入し、pCE80を形成した。プラスミドpCE80をNde Iで完全に切断し、Bgl IIで部分的に切断して、H6プロモーターによりドライブされF8フランキングアームに連結したNDV ＦおよびHN遺伝子を含有するNee I−Bgl II4760bp断片を産生した。pRW731−15からの4900bp Pvu II−Hind II断片をpBSSK＋Sma IおよびHind II部位に挿入することによりプラスミドpJCA021を得た。次いでプラスミドpJCA021をNde IとBgk IIで切断し、pCE80の4760bpNde I−Bgl II断片に連結し、pJCA024を形成した。それゆえ、プラスミドpJCA024はFPVフランキングアーム間に隣接する３′末端と反対の配位に挿入されたNDV−ＦおよびHN遺伝子を含有している。両方の遺伝子をワクシニアウイルスH6プロモーターに連結する。NDV−Ｆ配列に隣接した右側フランキングアームは2350bpのFPV配列からなる。NDV−HN配列に隣接した左側フランキングアームは1700bpのFPV配列からなる。
TROVAC−NDVの発達
前述したリン酸カルシウム沈殿法を用いてTROVAC感染初代CEF細胞中にプラスミドpJCA024を移入した（パニカリら、1982;ピッチーニら、1987）。特異的NDV−ＦおよびHN放射線標識プローブに関するハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、これらのプラークに、純粋な固体群となるまで５回のプラーク精製を行なった。１つの典型的なプラークを増幅せしめ、産生したTROVAC組換え体をTROVAC−NDV（vFP96）と称した。
蛍光抗体法
多クローン性抗NDV血清と、単特異的試薬として、NDV−ＦまたはNDV−HNを発現するワクシニアウイルス組換え体に対して家ウサギ中で産生された血清を用いて、間接蛍光免疫法を記載したように行なった（テイラーら、1990）。
イムノプレシピテーション
CN、ストース、SPAFAS社から得た多クローン性抗NDV血清を用いて記載したようにイムノプレシピテーション反応を行なった。
株ウイルスを現場でのプラークハイブリダイゼーションによりスクリーニングしてF8 ORFが欠損していることを確認した。サザンブロットハイブリダイゼーションにより、NDV遺伝子のTROVACゲノム中への正確な挿入とF8 ORFの欠損もまた確認した。
NDV感染細胞において、Ｆ糖タンパク質を、カルボキシル末端に近い疎水性膜内外領域により膜中に固定し、これは前駆体、F0の、２つのジスルフィド連結ポリペプチドF1およびF2中への後翻訳開裂を必要とする。F0の開裂は、所定のNDV菌株の病原性を決定するのに重要であり（ホンマおよびオーウチ、1973;ナガイら、1976;ナガイら、1980）、開裂部位でのアミノ酸配列はそれゆえウイルスの毒性を決定するのに重要である。FPV中に挿入され、組換え体vFP29を形成するNDV−Ｆ配列中の開裂部位でのアミノ酸は、毒性NDV菌株（チャクバーら、1986;エスピオンら、1987;リーら、1988;マックギネスおよびモリソン、1986;トヤダら、1987）に必要条件であることが分かった配列に一致する配列Arg−Arg−Gln−Arg−Arg（配列認識番号39）（テイラーら、1990）。NDVの毒性菌株に感染した細胞中に合成されたHN糖タンパク質は74kDaの未開裂糖タンパク質である。アルスターおよびクイーンズランドのようなきわめて無毒性の菌株は、活性化に開裂を必要とするHN前駆体（HNo）をコードする（ガーテンら、1980）。
TROVAC−NDV中のＦおよびHN遺伝子の発現を分析して、遺伝子産生物が自発的に処理され存在することを確認した。多クローン性抗NDV鶏血清を用いた間接蛍光抗体法により、免疫半の失せてタンパク質が感染細胞表面に存在したことが確認できた。両方のタンパク質が血漿膜上に存在することを確定するために、ＦまたはHN糖タンパク質のいずれかを発現するワクシニア組換え体に対する単特異的家ウサギ血清を産生した。これらの血清を用いた間接蛍光抗体法により、両方のタンパク質が表面に存在することを確認した。
親および組換えウイルスに感染したCEF細胞の（35S）メチオニン標識溶解産物を用いてイムノプレシピテーション実験を行なった。F1とF2の糖溶解産物形状のみかけの分子量の測定値はそれぞれ54.7と10.3kDaである（チャンバースら、1986）。多クローン性抗NDV血清を用いたイムノプレシピテーション実験において、適切なサイズの融解特異的産生物をNDV−Ｆ単一組換え体vFP29（テイラーら、1990）およびTROVAC−NDV二重組換え体vFP96から欠損せしめた。また適切なサイズのHN糖タンパク質を、NDV−HNタンパク質組換え体VFP−47（エドバウアーら、1990）およびTROVAC−NDVから欠損せしめた。どのNDV特異的産生物も、未感染および親TROVAC感染CEF細胞から欠損されなかった。
CEF細胞において、ＦおよびHN糖タンパク質は、NDV免疫血清により認識される感染細胞表面に適切に存在する。イムノプレシピテーション分析により、F0タンパク質が毒性菌株中に必要とされるF1およびF2成分に関して確実に開裂せしめられることが示された。同様に、HN糖タンパク質も組換え体TROVAC−NDVに感染したCEF細胞中で確実に処理された。
以前の報告によると（テイラーら、1990;エドバウアーら、1990;ボースネルら、1990a、ｂ、c;オガワら、1990）、HNまたはＦのいずれかのみの発現はNDV抗原投与に対する防御免疫を誘発するのに十分であることが分かっている。しかしながら、他のパラミクソウイルスへの作業により、両方のタンパク質への抗体には十分な防御免疫を必要とすることが示されている。Ｆ糖タンパク質に対してではなくHN糖タンパク質に対する抗体の存在下で組織培養中にSV5ウイルスが拡散することが示されている（マーツら、1980）。加えて、死菌麻疹ウイルスワクチンを伴うワクチンの失敗は、融解成分の不活性化によるものであることが示唆されている（ノルビーら、1975）。両方のNDV糖タンパク質がウイルス中和抗体（アベリーら、1979）を誘発することが示され、両方の糖タンパク質が個々に鶏痘ベクター中に発現される場合に防御免疫応答を誘発することができるので、最も有効なNDVワクチンは両方の糖タンパク質を発現するべきである。
実施例９−NYVAC−MV組換え発現麻疹融解および血球凝集素糖タンパク質の構成
麻疹ウイルスMV（エドモンストン菌株）のHAおよびＦタンパク質をコードする配列のcDNAコピーをNYVAC中に挿入してNYVAC−MVと称する二重組換え体を産生した。この組換え体は、感染細胞の表面上に両方の糖タンパク質を確実に発現した。イムノプレシピテーション分析は、両方のＦおよびHN糖タンパク質の正確な加工を示した。この組換え体はまた融合細胞の形成も誘発することが示された。
細胞およびウイルス
NYVAC−MVの産生に使用した救助ウイルスは、NYVACと称するワクシニアウイルスの修飾コペンハーゲン菌株であった。全てのウイルスを成長せしめ、ベロ細胞単層上で滴定した。
プラスミドの構成
プラスミドpSPM2LHA（テイラーら、1991c）は、前述したワクシニアウイルスH6プロモーター（テイラーら、1988a、b;グオら、1989;パーカスら、1989）と正確なAG対ATGの配置に連結された完全な麻疹HA遺伝子を含有している。３′側の26bpを欠如したHA遺伝子と正確なATG:ATG配置に融解したH6プロモーターの３′側の24bpを含有する1.8kpb EcoR V/Sma I断片をpSPM2LHAから単離した。この断片を、pSPMHHA11の1.8kbp EcoR V/Sma I断片（テイラーら、1991c）を置換するのに用い、pRW803を産生した。プラスミドpRW803は、完全麻疹HA遺伝子に正確に連結した完全H6プロモーターを含有している。
麻疹HA遺伝子に関する以前の構成を確認するに当たって、コドン18（CCC）の配列を公表した配列と比較して欠損せしめた（アルハチブら、1986）。オリゴヌクレオチドRW117（配列認識番号40）
Figure 0003602530
を用いたクンケル法（クンケル、1985）によりCCC配列をオリゴヌクレオチド突然変異誘発で置換した。一本鎖テンプレートを、pIBI25中のpRW803からのH6/HAカセッテを含有するプラスミドpRW819から誘導した（CT、ニューヘブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）。コドン18でのプロリン残留物をコードする挿入された（CCC）を含有する突然変異誘発したプラスミドをpRW820と称した。pRW820のHind IIIおよびXba I部位の間の配列を、ヌクレオチド配列分析により確認した。Hind III部位はH6プロモーターの５′へりに位置し、一方Xba I部位はHA遺伝子の開始コドンから230bp下流に位置する。Xba I（上述）から下流のHA暗号配列を含有し、終止コドンを含むpRW803からの1.6kbp Xba I/EcoR I断片を用い、等量のpRW820の断片を置換してpRW837を産生した。Hind IIIおよびEcoR Iで切断し、2mM cNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いたブラントエンドを行ない、pSD513のSma I部位に挿入することによりpRW837内に含有された突然変異誘発した発現カセッテを誘導し、pRW843を産生した。ポリリンカー配列を添加することによりプラスミドpSD460からプラスミドpSD513を誘導した。プラスミドpSD460は、ワクシニアウイルスからのチミジンキナーゼ遺伝子を欠損できるように誘導した。
HA挿入プラスミド中に麻疹ウイルスＦ遺伝子を挿入するために、pSPHMF7上で操作を行なった。プラスミドpSDHMF7（テイラーら、1991c）は、以前に記載したワクシニアウイルスH6プロモーターに近位の麻疹Ｆ遺伝子３′を含有している。ATG配置のための完全なATGを達成し、プロモーターの３′末端と麻疹ウイルスＦ遺伝子のATGとの間の介在配列を除去するために、オリゴヌクレオチドSPMAD（配列認識番号41）
Figure 0003602530
を用いてオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を行なった。産生したプラスミドをpSPMF75M20と称した。
H6プロモーターと正確なATG:ATG配置に連結した麻疹Ｆ遺伝子を含有するプラスミドpSDMF75M20をNru IおよびEag Iで切断した。H6プロモーターの３′側の27bpと完全な融解遺伝子を含有する、産生した1.7kbp鈍端断片を単離し、Nru IとXba Iで切断し、鈍端とした中間プラスミドpRW823に挿入した。産生したプラスミドpRW841は、pIBI5プラスミドベクター中の麻疹Ｆ遺伝子に連結したH6プロモーターを含有している（CT、ニューハンブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）。Sma Iで切断することにより、H6/麻疹ＦカセッテをpRW841から切除して産生した1.8kb断片をpRW843（麻疹HA遺伝子を含有する）に挿入した。プラスミドpRW843を、最初にNot Iで切断し、2mM cNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片で鈍端とした。それゆえ、産生したプラスミド、pRW857は、尾対尾の配置に連結した麻疹ウイルスＦおよびHA遺伝子を含有する。両方の遺伝子はワクシニアウイルスH6プロモーターに連結している。
NYVAC−MVの展開
前述したリン酸カルシウム沈殿法（パニカリら、1982;ピッチーニら、1987）を用いて、プラスミドpRW857をNYVAC感染ベロ細胞に移入した。特異的MV ＦおよびHA放射線標識プローブに関して現場でのプラークハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な固体群となるまで、６回のプラーク精製を行なった。１つの代表的なプラークを増幅し、産生した組換え体をNYVAC−MVと称した（vP913）。
蛍光抗体法
前述したように間接蛍光抗体法を行なった（テイラーら、1990）。使用した単特異的試薬は、家ウサギに麻疹ＦまたはHA遺伝子のいずれかを発現するカナリヤポックス組換え体を接種することにより産生した血清であった。
イムノプレシピテーション
モルモット抗麻疹血清（MD、ウォーカースビル、ウィタッカーM.A.バイオプロダクツ）を用いて前述したようにイムノプレシピテーション反応を行なった。
細胞融解実験
60mmの皿中のベロ細胞単層に、細胞当たり1pfuの多重度で親または組換えウイルスを接種した。37℃で１時間の吸収後、接種物を取り出し、重るい媒体を配置し、皿を37℃で一晩接種した。20時間後の感染で、皿を試験した。
麻疹ＦおよびHA遺伝子の両方の発現産生物が感染細胞表面上に存在することを確定するために、麻疹ＦまたはHA遺伝子のいずれかを発現するカナリアポックス組換え体に対して家ウサギ中に産生した単特異的血清を用いて間接蛍光抗体法を行なった。その結果により、両方の単特異的血清に関して強い表面蛍光によって示されたように、ＦおよびHA遺伝子産生物の両方が感染細胞表面上に発現されたことが分かった。親NYVAC菌株を接種した細胞のいずれの細胞にもバックグラウンドの染色はなく、また単特異的血清をHAまたはＦ遺伝子のいずれかを発現するワクシニア単一組換え体に対して試験した場合にも交差反応染色は見られなかった。
NYVAC−MVにより発現されたタンパク質が、麻疹ウイルス特異的血清と免疫活性であり、感染細胞中で確実に加工されたことを確定するために、イムノプレシピテーション分析を行なった。ベロ細胞単層を、35Sメチオニンの存在下で親または組換えウイルスの10pfu/細胞の多重度で接種した。イムノプレシピテーション分析は、約76kDaのHA糖タンパク質およびそれぞれ分子量が44kDaおよび33kDaの開裂融解産生物F1とF2を示した。麻疹特異的産生物は、未感染細胞または親NYVACウイルスに感染したベロ細胞中には全く検出されなかった。
MV細胞病理学の特性は、周辺の感染または未感染細胞と感染細胞の融解と続いての融合細胞の中心への核の移動により生じた融合細胞の形成である（ノービーら、1982）。これはパラミクソウイルスに関して、HA特異的ウイルス中和抗体の存在により生じ得るウイルスの拡散の重要な方法であることが示された（マーツら、1980）。ワクシニアウイルス中で発現されたMVタンパク質が機能的に活性であることを確認するために、ベロ細胞単層にNYVACとNYVAC−MVを接種し、細胞病理効果を観察した。強い細胞融解活性が、感染から約18時間後にNYVAC−MV感染ベロ細胞中で明確であった。親NYVACに感染した細胞中には細胞融解活性は見られなかった。
実施例10−仮性狂犬病の糖タンパク質を発現するNYV
AC組換え体の構成
RPV gp II、gp III、およびgp50糖タンパク質を、個々または組合せのいずれかで発現するワクシニアウイルス組換え体が有効なワクチン候補であること、すなわち、生PRVの毒性抗原投与から豚を保護することが示された。NYVACベクターが豚の細胞培養中で生産的に複製できないこと、および既知の潜在的な毒性遺伝子の欠損によるベクター固有の安全性を考慮して、PRV gp II、gp III、およびgp50を単体または様々な組合せで含有するNYVACベースの組換え体を産生した。これらの組換え体は、豚に安全であり、環境への伝染を減少または著しく制限したPRVに対して効果的なワクチン候補を提供するために産生した。
ウイルスおよび細胞
NYVACの操作と分子クローニングを標準技術により行なった（ピッチーニら、1987;マニチアスら、1982）。NYVACおよびNYVACベースの組換え体の培養は以前に記載した（ピッチーニら、1987）。
PRV gp II、gp III、およびgp50遺伝子のクローニング
PRVの成長、PRVゲノムDNAの抽出、およびPRV gp II、gp III、およびgp50遺伝子の同定は以前に記載した。
仮性狂犬病ウイルス（PRV）遺伝子のNYVAC（vP866）へのクローニングおよび発現
人および豚宿主範囲遺伝子（C7LおよびK1L）を法含有する領域が欠如したNYVAC欠損変異体、vP866は、PRV遺伝子を挿入するのに用いたベースベクターであった。このベクターはまた、ワクシニアウイルスtk遺伝子、血球凝集素遺伝子、出血性遺伝子、リボヌクレオチドレダクターゼ（巨大サブユニット）遺伝子、およびＡ型含有遺伝子が欠如している。重要なことは、vP866は、人または豚肝臓（LLC−PK1）細胞については少しも効果的には複製しない。単純ヘルペスウイルスgB（ロビンソンら、1987）、gC（ロビンソンら、1986b）、およびgD（ワッソンおよびワッソン、1984）にそれぞれ相同なPRV遺伝子gp II、gp III、およびgp50を下記に概略示したようにvP866に挿入した。
PRV gp II遺伝子をvP866の血球凝集素座に挿入
PRV gp II遺伝子をコードするDNA配列はPRVゲノムのBmaH I断片にある（メッテンライターら、1986）。
pBR322のBamH I部位に挿入されたPRV BamH I断片１に含有する、pPR9.25と称するプラスミドをNco Iで切断した。産生した制限断片を9.8％のアガロースゲル上で分画し、ジェネクリーン（CA、ラジョラ、バイオ101社）を用いて6.2kb Nco I DNA断片を精製し、続いてCiAPで処理したpBR328（IN、インディアナポリス、ベーリンガーマンハイムバイオケミカルス）のNco I部位に挿入した。精製したプラスミド、pPR2.15をSph Iで切断し、アガロースゲル上で分画した。2.7kbと1.8kb断片を精製して、pUC18のSph I部位に挿入し、pPR1およびpPR2をそれぞれ産生した。
pPR1からの1060bp PRV Sph I/Nhe I断片をアガロースゲルから単離して、アニールしたオリゴヌクレオチドMRSYN1（配列認識番号42）
Figure 0003602530
およびMRSYN2（配列認識番号43）
Figure 0003602530
によりpIBI25のBamH I/Sph I部位に挿入し、pPR6を産生した。pPR6をHind IIIおよびApa Iで切断した。Apa I部位は、PRV gp IIのATG開始コドンから32bp下流に位置する。この3920bp断片をアニールしたオリゴヌクレオチドMRSYN3（配列認識番号44）
Figure 0003602530
およびMRSYN4（配列認識番号45）
Figure 0003602530
と連結し、pPR9を産生した。これらのアニールしたオリゴヌクレオチドは、EcoR V部位からATGを通じてPRV gp II暗号配列に続くワクシニアウイルスH6プロモーターを特定するDNA配列を提供する。プラスミドpPR9をBamH IとNhe Iで切断し、子牛の腸のアルカリ性ホスファターゼ（CiAP）で処理し、アニールしたオリゴヌクレオチドMRSYN7（配列認識番号46）
Figure 0003602530
およびMRSYN8（配列認識番号47）
Figure 0003602530
並びにpPR1から得た1640bp Sph I/Nhe I断片と連結し、プラスミドpPR12を産生した。
pPR2からの1030bp Hind II/Sph I断片をアガロースゲルから単離し、Hinc II/Sph I pUC18ベクターに挿入した。産生したプラスミド、pPR10をHind IIIとNae Iで切断し、CiAPで処理した。Nae I部位は終止コドン（TAG）の44bp上流である。アニールしたオリゴヌクレオチドMRSYN9（配列認識番号48）
Figure 0003602530
およびMRSYN10（配列認識番号49）
Figure 0003602530
をpPR10からの3720bp Nae I/Hind III断片と連結し、プラスミドpPR11を産生した。pPR2からの770bp Sph I/Hinc II断片をアガロースゲルから精製し、BamH I/Sph Iリン酸化リンカーMRSYN7（配列認識番号46）およびMRSYN8（配列認識番号47）を用いてCiAP処理したpPR11のBamH I/Hinc II部位に挿入し、pPR13を産生した。EcoR IおよびSph Iで切断したプラスミドpPR12を、MRSYN19（配列認識番号50）
Figure 0003602530
およびMRSYN20（配列認識番号51）
Figure 0003602530
を用いてpPR13からの990bp Hind III/Sph I断片と連結し、プラスミドpPR15を産生した。プラスミド、pPR15をHind III/EcoR Vで切断し、2780bp断片を産生した。この断片を、Xma IIIおよびEcoR Vで切断したpTP15（グオら、1989）に挿入し、pPR18を産生した。pPR18において、pRVgp IIをHA欠損プラスミド中のワクシニアウイルスH6プロモーターと連結する。救助ウイルスとしてvP866による生体外組換え実験にpPR18を用いてvP881を産生した。
PRV gp III遺伝子をNYVACのTK座に挿入
PRV gp III遺伝子をコードする配列がPRVゲノムのBamH I2および９断片に遺伝子地図を作成する（ロビンスら、1986b）。プラスミドpPR9.9およびpPR7.35は、それぞれpBR322のBamH I部位に挿入されるPRV BamH I断片２および９を含有する。PRV gp III遺伝子の５′末端を含有するSph I/BamH I断片をpPR9.9から単離した。gp III遺伝子の残りを含有するNco I/BamH I断片をpPR7.35から単離した。完全なPRV gp III遺伝子は、これら２つの断片をpIBI25に連結することにより組み立て、pPR17を産生した。
PRV gp III遺伝子を、Hind III Ｂ領域に位置する初期ワクシニアウイルス出血性プロモーターの制御下で発現されるように操作した（ゲーベルら、1990a、ｂ）。部位定方向突然変異誘発を用いて、PRV gp III中の配列CGC（塩基192−194）をATGに変化せしめることによりNsi I部位を導入し、配列GTCACGTをTTCTAGA（塩基1632−1638）に変化せしめることによりXba I部位を導入した。突然変異誘発反応を行なうために、ヘルパーファージR408（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）を用いることにより一本鎖DNAをプラスミドpPR17から産生した。MRSYN5（配列認識番号52）
Figure 0003602530
およびMRSYN6（配列認識番号53）
Figure 0003602530
並びにE.coli dur- ung-菌株CJ236（CT、ニューハブン、バイオテクノロジー社）を用いて部位定方向突然変異誘発を行なった。クンケルの実験記録（1985）にしたがって突然変異誘発を行なった。これらの突然変異誘発により、プラスミドpPR28が産生した。
プラスミドpPR28をNsi IおよびXba Iで切断して、マング豆ヌクレアーゼで処理した。1440bp断片を精製して、マング豆ヌクレアーゼと子牛腸あるか理性ホスファターゼで処理し多後にpSD478VCで切断したBa III/Hpa Iに挿入した。産生したプラスミドをpPR24と称した。
プラスミドpPR24をSnaB1とDra Iで切断し、ｕプロモーターとPRV gp III遺伝子をがゆうする1500bp鈍端断片を離生した。この断片をpSD513VCで切断したSma Iに連結し、pPRVIIIVCTKを産生した。救助ウイルスとしてのvP866およびpPRVIIIVCTKに関して、生体外組換え実験を行なってvP883を産生した。vP883において、ゲノムに関して、120bpワクシニアｕプロモーター要素の制御下で右から左の方向にそうにゅうしたPRV gp III遺伝子によりワクシニアtk暗号配列を置き換えた。
PRV gp50遺伝子をNYVACのATI座へ挿入
PRV糖タンパク質gp50の遺伝子をコードするDNAはPRVゲノムのBamH I断片７に位置している（ペトロフスキスら、1986a、ｂ）。プラスミドpPR7.1はpBR322のBanH I部位に挿入されたPRV BamH I断片７を含有している。完全なgp50遺伝子を含有するpPR7.1のStu I/Nde Iサブ断片はpIBI25にサブクローニングされてプラスミド＃856を産生した。
初期／中間ワクシニアプロモーター、I3Lの制御下でPRV gp50の暗号配列を配した（シュミットおよびスタネンベルグ、1988;ボスおよびスタネンベルグ、1988）。このプロモーター要素は、以前にワクシニア組換え体中の異種遺伝子を発現するのに用いた（パーカスら、1985;バッチャーら、1989）。合成オリゴヌクレオチドP50PPBAM（配列認識番号54）
Figure 0003602530
およびP50PPATG（配列認識番号55）
Figure 0003602530
並びにテンプレートとしてのコペンハーゲンHind III Ｉ領域のサブクローンであるpMPIVCを用いるPCR（ササキら、1988）により、I3L読取り枠から上流のプロモーター配列に対応するDNA（シュミットおよびスタネンベルグ、1988）を誘導した。産生した126bp断片をBamH Iで切断し、プロモーター配列の５′末端でのBamH I粘着末端を産生した。３′末端は鈍端のままであった。
PRV gp50暗号領域をプラスミド＃856から切除した。プラスミド＃856を、ATGから7bp上流を切断し、３′懸垂となるNsi Iで最初に切断した。３′懸垂を、2mM dNTPの存在下でT4 DNAポリメラーゼで鈍端とした。産生したDNAを部分的にBgl IIで切断し、PRV gp50遺伝子を含有する1.3kbブラント/Bgl II断片を単離した。
126bp I3Lプロモーター断片（BamH I/ブラント）および1.3kb gp50遺伝子含有断片（ブラント/Bgl II）をBamH Iで切断したpBS−SK（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結した。産生したプラスミドをpBSPRV50I3と称した。PRV gp50遺伝子を連結したI3Lプロモーターを含有する発現カセッテをBamH I/部分的Sma I切断により切除した。I3Lプロモーター/PRV gp50遺伝子を含有する1.4kb断片を単離して、2mM dNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。
I3Lプロモーター/PRV gp50遺伝子を含有する1.4kb鈍端断片をATI挿入プラスミドpSD541に挿入した。ATI領域のフランキングアームを、テンプレートとしてのコペンハーゲンHind III Ａ領域のサブクローンを用いたPCRにより産生した。オリゴヌクレオチドMPSYN267（配列認識番号56）
Figure 0003602530
およびMPSYN268（配列認識番号57）
Figure 0003602530
を用いてATI欠損の右側に420bpワクシニアアームを誘導した。合成オリゴヌクレオチドMPSYN269（配列認識番号58）
Figure 0003602530
およびMPSYN270（配列認識番号59）
Figure 0003602530
を用いて欠損の左側に420bpワクシニアアームを誘導した。左右のアームPCRによりともに融解して、Bgl II、Sma I、およびXho Iの制限部位を特定するポリリンカー領域により分離した。PCR産生断片をHind IIIおよびEcoR Iで切断して粘着末端を産生し、Hind IIIおよびEcoR Iで切断したpUC8に連結してpSD541を産生した。
I3L/PRV gp50遺伝子を含有するpSD541プラスミドをpATIgp50と称した。このプラスミドを生体外組換え実験に用いてvP900を産生した。vP900はATI遺伝子の位置にPRV gp50遺伝子を含有している。
NYVAC内の二重および三重PRV組換え体の産生
生体外組換え実験を行なって、多重PRV遺伝子を含有するNYVACベース組換え体を産生した。供与体プラスミド、pATIP50を用いた生体外組換え実験を、vP881、vP883、およびvP915に行なって、それぞれvP912、vP916、およびvP925を産生した（表１）。実験は救助ウイルスとしてのvP883およびプラスミドpPR18に関して行なってvP915を産生した（表１）。
NYVAC/PRV組換え体感染細胞からのイムノプレシピテーション
ベロ細胞について、細胞当たり10pfuのm.o.i.で、個々の組換えウイルス、NYVA親ウイルスを感染せしめるか、または疑似（mock）感染せしめた。１時間の吸収期間の後、接種物を除去して、感染細胞を35Sメチオニン（20uCi/ml）を含有するメチオニン不含有媒体で重るいした。全ての試料を感染８時間後に収穫した。ヒツジ抗g II血清で分析した試料に関して、遠心分離により細胞を収穫し、RIPA緩衝液（１％NP−40、１％Na−デオキシクロレート、0.1％SDS、0.01Mメチオニン、5mM EDTA、5mM ２−メルカプト−エタノール、1m/ml BSA、および100u/mlアプロチニン）で分離した。ヒツジ抗gp IIIで分析した試料およびgp50に特異的な単クローンを1X緩衝液Ａ（１％NP40、10mMトリス（pH7.4）150mM NaCl、1mM EDTA、0.0％Naアジド、0.2mg/ml PMSF）中に溶解せしめた。全ての血清をvP866感染ベロ細胞で前吸着し、全ての溶解産物を通常の血清（ヒツジまたはネズミ）および第２の抗体に連結したタンパク質Ａセファロースで前吸着した。
感染細胞からの溶解産物を、ヒツジ抗gp II血清を用いたPRV gp II発現に関して分析した。この主要抗血清を、家ウサギ抗ヒツジIgG（ベーリンガーマンハイム）に接合したタンパク質Ａセファロースで培養した。４℃での一晩の培養後、試料を１×RIPA緩衝液で４回、LiCl−尿素（0.2M LiCl、2M尿素、10mMトリス、pH8.0）で２回洗浄した。マイクロ遠心分離により沈殿物を収穫した。2Xラエムリの緩衝液（125mMトリス（pH6.8）、４％（SDS）、20％グリセロール、10％ ２−メルカプト−エタノール）を添加し、５分間沸騰せしめることにより、免疫複合体から沈殿したタンパク質を分離した。タンパク質を10％のドレイファスゲルシステム（ドレイフィスら、1984）上で分画し、固定し、フルオログラフィーのために1M Na−サリチル酸塩で処理した。
ヒツジ抗gp II血清を用いたPRV gp II発現に関して溶解産物を分析した。この主要抗血清を家ウサギ抗ヒツジIgGに接合したタンパク質Ａセファロース（ベーリンガーマンハイム）で培養した。４℃での一晩の培養後、試料を1X緩衝液Ａで４回、LiCl−尿素緩衝液で２回洗浄した。沈殿物を処理し、上述したようにフルオログラフィーにより分析した。
溶解産物を、単クローン性抗体、22M4（フランス、リヨン、ローンメリオクスにより供給された）を用いたPRV gp50発現に関して分析した。この主要抗体を、山羊抗ネズミIgGおよびIgM（ベーリンガーマンハイム）に接合したタンパク質Ａセファロースで培養した。沈殿物を回収し、上述したようにPRV gp IIIイムノプレシピテーションに関して分析した。
NYVAC−PRV組換え体に感染した細胞中のPRV糖タンパク質の発現
PRV gp II、gp III、およびgp50産生物は、PRV感染細胞中の膜構造に関連した典型的な糖タンパク質である。抗gp II、抗gp IIIおよび抗gp50特異的体クローン性抗体および続いてのフルオロセイン接合ヒツジ抗ネズミIgGを用いて、組み得たい感染ベロ細胞の表面上のPRV糖タンパク質発現を分析した。gp II、gp III、またはgp50の表面発現はいずれも、疑似感染細胞またはNYVAC（vP866）親ウイルスに感染した細胞の表面には検知できなかった。PRV gp II発現がvP881、vP912、およびvP925感染細胞の表面に観察された。PRV gp III表面発現が、vP883、vP915、vP916、およびvP925感染細胞中に観察された。PRV gp50表面発現が、vP900、vP912、vP916、およびvP925感染細胞中に観察された。要約すると、特定のPRV糖タンパク質の表面発現は、適切なPRV遺伝子を含有するNYVAC−PRV組換え体に感染した細胞中のみに検知可能であった。
NYVAC/PRV組換え体に感染した細胞からのPRV糖タンパク質のイムノプレシピテーション
NYVAC/PRV組換え体に感染したベロ細胞中の発現PRV gp II、gp III、およびgp50糖タンパク質の確実性をイムノプレシピテーションにより分析した。PRV gp II遺伝子産生物は、PRV感染細胞中でコードされた主要糖タンパク質の１つである。熟成タンパク質は、ジスルヒド結合により連結した糖タンパク質の複合体からなる（ハンペルら、1984;ルーカスら、1985）。還元条件下で、３つの種がこの複合体から分解した。これら３つの種（II a−ｃ）は、SDS−ポリアクリルアミドゲル上で、それぞれ120kDa、74−67kDa、および58kDaの適切なサイズで移動した（ハンプルら、1984）。
抗PRVgp II特異的血清を用いたイムノプレシピテーション分析において、どのPRV特異的タンパク質種も、疑似感染細胞またはNYVAC（vP866）親細胞に感染した細胞からは沈殿しなかった。PRV gp IIもまた、NYVAC/PRV組換え体vP916、vP883、およびvP900を含有する非gp IIに感染した細胞中では検知できなかった。PRV gp IIがPRV gp II遺伝子をハーバーする全てのNYVAC/PRV組換え体中で発現されたことが明確である。これらはvP925、vP912、vP915、およびvP881である。組換え体を含有するPRV gp IIに感染したベロ細胞からの溶解産物は、適切な発現に調和し、gp IIをgp II a（120kDa）、gp II b（74−67kDa）、およびg II c（58kDa）に加工するタンパク質種を含有した。45kDaと10kDaの２つの追加のタンパク質種をgp II血清により特異的に沈殿せしめた。これらのタンパク質種は、組換え感染細胞中の晩期にPRV gp IIの変型のタンパク質分解工程により現れるように思われる。
PRV gp III産生質は、もう１つの主要PRV糖タンパク質である。gp IIIは、92kDaの明確な分子量で移動する他のウイルスタンパク質とは複合体をなさない単量体単位として存在する（ハンプルら、1984;ロビンスら、1986b）。gp IIIに特異的な抗血清を用いたNYVAC−PRV組換え体感染細胞からのイムノプレシピテーション分析において、抗gp III特異的タンパク質種は、疑似感染細胞、非組換え体感染細胞、またはgp IIIを含有しないNYVAC/PRV組換え体（それぞれ、vP912、vP881、およびvP900）に感染した細胞からの溶解産物中には全く存在しなかった。vP925、vP915、vP916、およびvP883感染細胞からの溶解産物は全て92kDa PRV gp III遺伝子産生物を含有した。
熟成PRV gp50遺伝子産生物は、約50から60kDa（ペトロフスキスら、1986a;ワッセンら、1984）であり、そのほとんどはＯ連結炭化水素を含有しそうである（ペトロフスキスら、1986b）。PRV gp50遺伝子産生物に特異的な抗血清を用いた、NYVAC/PRV組換え体に感染した細胞の溶解産物からのイムノプレシピテーションにおいて、gp50は、疑似感染細胞、非組換え体感染細胞、またはgp50遺伝子を含有しない組換え体（それぞれ、vP915、vP881、およびvP883）に感染した細胞からの溶解産物中には全く存在しなかった。PRV gp50遺伝子を含有する組換えNYVACウイルス（それぞれ、vP925、vP912、vP916、およびvP900）に感染した細胞からの溶解産物は全て、抗PRV gp50血清により特異的に沈殿した50−60kDaタンパク質種を発現した。
Figure 0003602530
実施例11−エプステイン−バーウイルスのgp340、gBおよびgH遺伝子を発現するNYVAC組換え体の構成
EBV gp340、gB、およびgH遺伝子を含有するNYVAC供与体プラスミドを構成した。この供与体プラスミドを用いて２つの組換え体、vP941およびvP944を産生した。
制限酵素は、ベセスダリサーチラボラトリーズ社（MD、ゲイサースブルグ）、ニューイングランドバイオラボ社（MA、ビバーリー）、またはベーリンガーマンハイム（IN、インディアナポリス）から得た。T4 DNAリガーゼおよびDNAポリメラーゼＩクレノウ断片を、ニューイングランドバイオラボ社から得た。クローニング、スクリーニングおよびプラスミド精製の少しの修飾には、標準組換えDNA技術を用いた（マニアチスら、1982）。アルカリ性変性二本鎖プラスミドテンプレートに標準ジデオキソ鎖−終止反応（サンガー、1977）を用いて核酸配列を確認した。M13mp18ファージ、pIBI24およびpIBI25プラスミドをCT、インターナショナルバイオテクノロジー社から得た。
細胞系およびウイルス菌株
救助ウイルスとしてNYVACを用いて組換え体を産生した。５−10％の新生子牛血清を補給したタカのMEM媒体中のベロ（ATCC CCL81）細胞（VI、マクリーン、フローラボラトリーズ）において、全てのワクシニアウイルス株を産生した。
オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発
突然変異誘発反応に用いたウラシル置換一本鎖DNAテンプレートはCJ236転換細胞からのものであった。変異は、クンケルらの（1987）プロトコールを用いて行なわれた。標準化学物質を用いて様々なオリゴヌクレオチドを合成した（CA、サンラファエル、バイオリサーチ8700;CA、フォスターシティー、アプライドバイオシステム380B）。
ワクシニアウイルス組換え体の構成
救助ワクシニアウイルスに感染した組織培養細胞への組換え供与体プラスミドの移入および現場でのニトロセルロースフィルター上のハイブリダイゼーションによる組換え体の同定の工程は前述したようなものであった（パニカリら、1982;ピッチーニら、1987）。
EBV遺伝子gp340、gB、およびgHのワクシニア組換え体における修飾および発現
gp340遺伝子は、完全EBV配列の読取り枠BLLF1aに対応する（ベアーら、1984）。gp220遺伝子は、内部スプライシングイベント（読取り枠BLLF1b）によりgp340 mRNAから由来する。gp340およびgp220遺伝子を、Dr.ペリコーデット（Centre de Recherche sur le Cancer−IRSG,7 rue Guy Mocquent,94802 Villejuif,France）により提供されたcDNAクローン（それぞれ、プラスミドpMLPgp340、pMLPgp220）から単離した。
pMLPgp220の2100bp Xma I/Cla I断片をXma I/Cla I M13 mp18に挿入し、産生したプラスミドをmp18gp220と称した。オリゴヌクレオチドCM4およびCM5を用いた生体外突然変異誘発により、gp220遺伝子の５′および３′端を、ワクシニアH6プロモーターの制御下で発現に関して修飾した。修飾gp220遺伝子を含有するプラスミドをmp18gp220（４＋５）と称した。CM4（配列認識番号60）およびCM5（配列認識番号61）のヌクレオチド組成は以下のとうりであった。
Figure 0003602530
mp18gp220（４＋５）の2300bp Nar I/EcoR V断片を、Nar I/EcoR VプラスミドSP131Not I中にクローニングした。SP131Not Iは、前に定義したように完全なH6ワクシニアプロモーターを含有している（テイラーら、1988a、ｂ）。産生したプラスミドをSD131gp220と称した。
pMLPgp340の2360bp Sca I/Xho I断片を、Sca I/Xho I SP131gp220プラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドをSP131gp340と称した。
SP131gp340の280bp Not I/Not I断片を、Sma I切断ワクシニア供与体プラスミドpSD486中にクローニングした。産生したプラスミドを486H6340と称した。EBV gB遺伝子は、完全EBV配列の読取り枠BALF4に対応する（ベアーら、1984）。3500bp EcoR I/Xmn I断片を、EBV BamH I Ａ断片から単離して、Hinc II/EcoR IプラスミドpIBI25中にクローニングした。産生したプラスミドをp25gBと称した。
生体外突然変異誘発により、オリゴヌクレオチドEBVM5（配列認識番号62）およびEBVM3（配列認識番号63）を用いて、ワクシニアH6プロモーターの制御下でEBV gB遺伝子を発現に適用した。EBVM5（配列認識番号62）およびEBVM3（配列認識番号63）のヌクレオチド組成は以下のとうりである。
Figure 0003602530
産生したプラスミドをp25gB（５＋３）と称した。
p25gb（５＋３）の2600bp EcoR V/EcoR I断片を、EcoR V/EcoR I Sp131プラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドをSP131gBと称した。
EBV gH遺伝子は、完全EBV配列のBXLF2読取り枠に対応する（ベアーら、1984）。完全BXLF2読取り枠は、２つのBamH I EBV断片、BamH I ＸおよびBamH I Ｔに含有される。EBV BamH I Ｔ断片の830bp Sma I/BamH I断片をSma I/BamH I pIBI24プラスミド中にクローニングすることにより、完全BXLF2読取り枠を再構成した。産生したプラスミドを24gH5と称した。EBX BamH I Ｘ断片の1850bp BamH I/Hind III断片を、BamH I/Hind III 24gH5プラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドを24gHと称した。
オリゴヌクレオチドHM5、HM4、およびHM3を用いた生体外突然変異誘発により、EBV gH遺伝子を修飾して、ワクシニアB13R出血性プロモーターの制御下で発現した（ゲーベルら、1990a、ｂ）。オリゴヌクレオチドHM4を用いて、ワクシニア初期転写終止信号に対応する配列を修飾した。HM5（配列認識番号64）、HM4（配列認識番号65）、およびHM3（配列認識番号66）のヌクレオチド組成は以下のとうりである。
Figure 0003602530
修飾gHを含有する産生したプラスミドを24gH（５＋４＋３）と称した。
ワクシニア出血性プロモーターは、他のポックスプロモーターと比較して強力なプロモーターであるとは思われない。42kDaエントモポックスプロモーターの制御下でEBV gH遺伝子を配した。これは、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）、特異的オリゴヌクレオチド42gH（配列認識番号67）およびBAMgH（配列認識番号68）並びにテンプレートとしてのプラスミド24gH（５＋４＋３）を用いることにより行なわれた。
Figure 0003602530
（最初のＡ残留物は、gH暗号配列の位置292に対応する）
PCR反応は、サーマルサイクラー（CT、ノルウォーク、パーキンエルマーセタス）中において、94℃で１分間、42℃で1.5分間、および72℃で３分間の36サイクルを行ない、最後に72℃で５分間の延長工程を行なった。PCR産生物を精製し、BamH Iで切断し、24gH（５＋４＋３）の4550bp Sma I/BamH I断片中にクローニングした。産生したプラスミドを24BXLF2.42Kと称した。
EBV gp340、gB、およびgH遺伝子のワクシニア供与体プラスミドpSD542への挿入およびvP941とvP944の単離
ワクシニア供与体プラスミドpS542は、延長ポリリンカー領域を有するpSD460の誘導体であり、異種遺伝子をワクシニアTK座に組換えるのに用いる。486H6340プラスミドの2820bp BamH I/Bgl II断片を、BamH I/Bgl II pSD542プラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドを542.340と称した。
24BXF2.42の2150bp Sma I/Bgl II断片を、Sma I/Bgl II542.340プラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドを542.340gHと称した。
SP131gBプラスミドの2700bp Hind III/Hind III断片を、Bgl II542.340gHプラスミド中にクローニングした。産生したプラスミドをEBVトリプル１と称した。EBVトリプル１中に挿入されたEBV暗号領域の遺伝地図を第８図に示す。第８図の矢印により、転写方向を示す。
EBVトリプル１プラスミドをNot Iにより切断し、NYVACまたは３つのHBV遺伝子を含有するNYVACベースのワクシニア組換え体に感染したベロ細胞中に移入せしめた。対応する組換えワクシニアウイルスvP944およびvP941を単離した。
実施例12−２型単純ヘルペスウイルスのgB、gCおよびgD遺伝子を発現するNYVAC組換え体の構成
HSV2 gB、gCおよびgD遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスを構成した。
細胞およびウイルス
HSV ２（菌株Ｇ）をベロ細胞（ATCC CCL81）中で増殖せしめ、サクロース勾配上の遠心分離により精製した（ポウエルら、1975）。
ワクシニアウイルス（コペンハーゲン）およびそれから誘導された組換え体を前述したようにベロ細胞（ATCC CCL81）中で増殖せしめた（パニカリら、1982;グオら、1989）。
HSV2 gB遺伝子の単離
HSV2 gB遺伝子を含有する12kb Bgl II断片を、HSV2ゲノムDNAから単離し、pSD48pUC19のBamH I部位に挿入した。産生したプラスミドをpJ4と称した。
次いでgB遺伝子をワクシニアウイルスのフランキングアーム間にクローニングした。これは、pJ4の2,700bp Sst II−Sac I（部分的）断片をpMP409DVCのSst II−Sac I断片中にクローニングすることにより達成された（グオら、1989）。これはM2L遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間にgB遺伝子を配した。この操作により産生されたプラスミドをpGB1と称した。
次いでインフレーム（in−frame）終止コドンをgB遺伝子の３′末端に加えた。これは、オリゴヌクレオチド、GBL3（配列認識番号69）５′−CTAATAG−３′およびGBL4（配列認識番号70）５′−GATCCTATTAGAGCT−３′をpGB1の6,300bp BamH I−Sac I（部分的）断片中にクローニングすることにより達成された。この操作により産生したプラスミドをpGB2と称した。
次いでワクシニアウイルスH6プロモーター（テイラーら、1988a;パーカスら、1989）をgB遺伝子の上流にクローニングした。これは、H6プロモーターを含有する、pBLVH14の370bp Bgl II断片（ポーテテレら、1991）をpGB2のBgl II中にクローニングすることにより達成された。この操作により産生したプラスミドをpGB3と称する。
次いでH6プロモーターの開始コドンをgB遺伝子の開始コドンと配列せしめた。これは、オリゴヌクレオチド、GBL1（配列認識番号71）
Figure 0003602530
およびGBL1（配列認識番号72）
Figure 0003602530
をpGB3の6,300bp Sst II−EcoR V（部分的）断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpGB5と称した。
次いでH6プロモートしたgB遺伝子を異なるワクシニアウイルス供与体プラスミド中にクローニングした。これは、H6プロモートしたgB遺伝子を含有する、pGB5の2,800bp Bgl II−BamH I断片をpSD513VCVQのBgl II部位中にクローニングすることにより行なった。（pSD513VCVQは、チミジンキナーゼ（tk）遺伝子がポリリンカー領域により置換されたワクシニアウイルスHind III Ｊ断片のサブクローンである。）これにより、H6プロモートしたgB遺伝子をtk遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間に配した。この操作により産生したプラスミドをpGB6と称した。
HSV2 gC遺伝子の単離
HSV2 gC遺伝子を含有する、2,900bp Sal I断片を、HSV2ゲノムDNAから単離し、pIBI25のSal I部位に挿入した。産生したプラスミドをpGC3と称した。
次いでgC遺伝子をワクシニアウイルスフランキングアーム間にクローニングした。これは、pGC3の2,900bp Xho I−BamH I断片をpGC2のXHo I−BamH I部位にクローニングすることにより達成された。H6プロモーターを含有する、pBLVH14の370bp Bgl II破片（ポーテテレら、1991）を、pSD486のBgl II部位にクローニングすることによりpGC2を産生した（第２図）。これにより、ｕ遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間にgC遺伝子を配した。この操作により産生したプラスミドをpGC5と称した。
次いでH6プロモーターの開始コドンをgC遺伝子の開始コドンと配列せしめた。これは、オリゴヌクレオチド、GCL1（配列認識番号73）
Figure 0003602530
およびGCL2（配列認識番号74）
Figure 0003602530
を、pGC5の5,400bp Nru I−Sfi I断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpGC10と称した。
次いでpGC10から、外来の３′−非暗号配列を除去した。これは、pGC10の4,900bp Sal I−Sma I（部分的）断片が満たされたE.coli DNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を再び環状とすることにより行なわれた。この操作により産生したプラスミドをpGC11と称した。
次いでさらに３′−非暗号配列をpGC11から除去した。これは、オリゴヌクレオチド、GCL3 ５′−CTAGGGCC−３′をpGC11の4,900bp Xba I−Apa I（部分的）断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpGC12と称した。
HSV2 gD遺伝子の単離
HSV2 gD遺伝子を含有する、7.5kb Xba I断片を、HSV2ゲノムDNAから単離し、pIBI25のXba I部位に挿入した。産生したプラスミドをpGD1と称した。
次いでgD遺伝子をH6プロモーターの下流とワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。これは、pGD1の1,500bp Dra I−Pst I断片をpTP15の3,700bp Sma I−Pst I断片中にクローニングすることにより行なった（グオら、1989）。これにより、gD遺伝子をH6プロモーターの下流とHA遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間に配した。この操作により産生したプラスミドをpGD2と称した。
次いでH6プロモーターの開始コドンをgD遺伝子の開始コドンと配列せしめた。これは、オリゴヌクレオチド、GDL1（配列認識番号75）
Figure 0003602530
およびGDL2（配列認識番号76）
Figure 0003602530
を、pGD2の5,100bp EcoR V−Aha II（部分的）断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpGD5と称した。
次いで外来の３′−非暗号配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、GDL3（配列認識番号77）
Figure 0003602530
およびGDL4（配列認識番号78）
Figure 0003602530
をpGD5の4,800bp Nae I−Pst I断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpGD7と称した。
次いで追加の配列をH6プロモーターの上流に加えた。これは、pGB6の150bp Bgl II−EcoR V断片（上記参照）をpGD7の4,800bp Bgl I−EcoR V断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpGD8と称した。
HSV2 gB、gCおよびgD遺伝子を含有するワクシニアウイルス供与体プラスミドの構成
gCおよびgD遺伝子を含有するプラスミドを構成した。これは、H6プロモートしたgC遺伝子を含有する、1,850bp Pst I断片を、pGD8のPst I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpGCD1と称した。
次いでgB、gCおよびgD遺伝子を含有するプラスミドを構成した。これは、H6プロモートしたgB遺伝子を含有する、pGB6の2,800bp Bgl II−BamH I断片を、pGCD1の6,800bp BamH I（部分的）断片中にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpGBCD1と称した。
次いで外来のDNAを除去した。これは、H6プロモートしたgB、gCおよびgD遺伝子を含有する、jpGBCD1の6,000bp Hind III−BamH I（部分的）断片が満たされたE.coli DNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）を、pMP831のSma I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpGBCDC1と称した。
次いでH6プロモートしたgB、gCおよびgD遺伝子をワクシニアウイルスフランキングアーム間にクローニングした。これは、オリゴヌクレオチド、HSVL1（配列認識番号79）５′−TCGATCTAGA−３′およびHSVL2（配列認識番号80）５′−AGCTTCTAGA−３′、並びにH6プロモートしたgB、gCおよびgD遺伝子を含有する、pGBCDC1の5,700bp Hind III−BamH I（部分的）断片を、pSD541の3,600bp Xho I−Bgl II断片中にクローニングすることにより行なった。これにより、H6プロモートしたgB、gCおよびgD遺伝子を、AT I遺伝子を側腹に有するワクシニアウイルス配列間に配した。この操作により産生されたプラスミドをpGBCD4と称した。
vP914の構成
HSV2 gB、gCおよびgD遺伝子を含有する、ワクシニアウイルス組換え体、vP914を構成した。ワクシニアウイルス組換え体を構成するのに用いた工程は以前に記載している（パニカリら、1982;グオら、1989;グオら1990）。pGBCD4をvP866（NYVAC）感染細胞中に移入することにより、ワクシニアウイルス組換え体、vP914を産生した。この組換え体のHSB2遺伝子は、ワクシニアウイルスH6プロモーターの転写制御下にある。
vP914感染細胞の蛍光抗体法およびイムノプレシピテーション
前述したように、蛍光抗体法およびイムノプレシピテーションを行なった（グオら、1989）。HSV2に対する家ウサギ抗血清をダコ社（コード番号B116）から得た。HSV2 gB（H233）およびHSV2 gD（HD1）に対する単クローン性抗体（メイグニアら、1987）を、B.メイグニア（フランス、リヨン、インスティテュートメリオクス）から得た。
HSV2感染細胞において、gB、gCおよびgD（他のHSV2糖タンパク質と同様に）は細胞表面上に表現される。HSV2 gB（H233）およびHSV2 gD（HD1）に特異的な単クローン性抗体を使用した、vP914感染細胞に関する蛍光抗体法により、これらの細胞中で産生されたHSV2 gBおよびgD糖タンパク質はまた細胞表面に発現されることが示された。
HSV2感染細胞において、gB、gCおよびgDは、それぞれ約117kDa、63kDaおよび51kDaの分子量を有する（マースデンら、1987;マースデンら、1984;ツウェイグら、1983）。vP914感染細胞のgB特異的単クローン性抗体（H233）によるイムノプレシピテーションにより、約117kDa、110kDaおよび100kDaの分子量を有する３つの主要なタンパク質、並びに他の少量のタンパク質が沈殿した。gD特異的単クローン性抗体（HD1）によるイムノプレシピテーションにより、約51kDaの分子量を有する主要なタンパク質および約55kDaと46kDaの分子量を有する少量のタンパク質が沈殿した。加えて、vP914感染細胞のHSV2に対する多クローン性抗血清によるイムノプレシピテーションにより、gCに同様の63kDaの分子量を有するタンパク質（85kDaタンパク質と同様）およびサイズでgBとgDに対応するタンパク質が沈殿した。それゆえ、vP914に感染した細胞は、gB、gCおよびgDと同一の分子量を有するHSV2タンパク質を発現するように思われた。
実施例13−Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子を発現するNYVAC組換え体の構成
DNAクローニングおよび合成
プラスミドを構成し、スクリーニングし、標準方法により成長せしめた（マニアチスら、1982;パーカスら、1985;ピッチーニら、1987）。制限エンドヌクレアーゼを、ベセスダリサーチラボラトリーズ（MD、ゲイサースブルグ）、ニューイングランドバイオラボ（MA、ビバーリー）、およびベーリンガーマンハイムバイオケミカルス（IN、インディアナポリス）から得た。T4 DNAリガーゼをニューイングランドバイオラボから得た。T4ポリヌクレオチドキナーゼをベセスダリサーチラボラトリーズから得た。プラスミドpGEM−3Zをプロメガ（WI、マジソン）から得た。pBR322中にクローニングされたHBVゲノムを含有するプラスミドpTHBVの起源は以前に記載されている（パオレッティら、1984）。
合成オリゴブオキシリボヌクレオチドを、前述したようにバイオサーチ8750またはアプライドバイオシステム380B DNAシンセサイザーにより調製した（パーカスら、1989）。前述したように（グオら、1989）、シーケナーゼ（タバーおよびリチャードソン、1987）を用いたジデオキシ鎖終止法（サンガーら、1977）により、DNA塩基配列決定を行なった。自動パーキンエルマーセタスDNAサーマルサイクラー中で注文合成オリゴヌクレオチドプライマーおよびジェネアンプDNA増幅試薬キット（CT、ノルウォーク、パーキンエルマーセタス）を用いて、クローニングと配列確認（エンゲルケら、1988）のためのポリメラーゼ鎖反応（PCR）によるDNA増幅を行なった。
ウイルスおよび移入
ワクシニアウイルスのNYVAC菌株およびその中間祖先、vP804（第５図）を用いた。組換えウイルスの産生と加工は前述したようなものである（パニカリら、1982）。
イムノプレシピテーション
ベロ細胞を、細胞当たり10pfuのm.o.i.で、組換えワクシニアウイルス、NYVAC親ウイルス（vP866）に感染せしめたか、または疑似感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を除去して、感染細胞を35Sメチオニン（20uCi/ml）を含有するメチオニン不含有媒体で重るいした。全ての試料を感染８時間後に収穫した。試料を、トリトンを含有する３×緩衝液Ａおよび50ulのアプロチニン（MO、セントルイス、シグマケミカル社、＃A6279）を含有するDOC（３％NP−40、３％トリトン、３％DOC、30mM トリスpH7.4、450mM NaCl、3mM EDTA、0.03％NaAzide、0.6mg/ml PMSF）中に溶解せしめた。全ての溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに連結した通常の家ウサギ血清に対して前浄化した。
HBVコア抗原とHBV S2ペプチド（aa120−153）に対して生じた家ウサギ抗血清をR.ニューラスから得た（ニューヨーク血液センターのリンドスレーF.キンボールリサーチインスティテュート）。抗S2抗血清をvP866感染ベロ細胞で前吸着せしめた。電気泳動と続いてのオートラジオグラフィーのために、HBVタンパク質を、抗コアまたは抗S2抗血清を用いてイムノプレシピテーションを行ない、２×ラエムリ試料緩衝液（ラエムリ、1970）中で再懸濁せしめた。
血清学
家ウサギおよびモルモットに、皮内、皮下または筋肉内の経路により、２つずつ108pfuの組換えワクシニアウイルスvP919を接種せしめた。最初の接種から６週間後、同じ経路と接種量で家ウサギに追加抗原投与した。最初の接種から７週間後、同じ経路と接種量でモルモットに追加抗原投与した。12匹のネズミの群に、皮内、皮下または筋肉内の経路により、107pfuの組換えワクシニアウイルスvP919を接種せしめた。最初の接種から７週間後、同じ経路と接種量でネズミに追加抗原投与した。１週間ごとに血清を採取した。ネズミの各群からの毎週の出血を集積した。AUSABラジオイムノアッセイキット（IL、北シカゴ、アボット）を用いて全ての血清をHBV表面抗原に対する抗体に関して分析した。標準技術を利用したCORABコンペティティブラジオイムノアッセイキット（アボット）を用いてHBVコア抗原に対する抗体に関して分析した。
vP919の構成
ワクシニア組換え体vP919は、NYVACワクシニアウイルスベクターに挿入されたＢ型肝炎からの３つの遺伝子を含有している。この遺伝子は、ウイルスの３つの異なった部位に個々に挿入された。３つのHBV遺伝子は以下のタンパク質産生物をコードする：（１）HBV Ｍタンパク質、（ここではスモールプレＳ抗原、またはspsAgと称した）、（２）HBV Ｌタンパク質（ここではラージプレＳ抗原、またはlspAgと称した）、（３）コア抗原のアミノ末端に連結した完全なプレＳ領域（S1＋S2）からなる融解タンパク質、（ここではS12/コアと称した）。
ワクシニアウイルスは、単一ワクシニアゲノム中に連続して挿入された同一の非相同DNA配列の多重コピーを保持しない（パニカリら、1982）。spsAgの暗号配列はlpsAgの暗号配列内に含有されるので、単一ワクシニアゲノムへの両方の遺伝子の挿入によりゲノムが不安定となると思われる。同様に、ハイブリッドS12/コア遺伝子中に存在するS1＋S2 DNA領域lpsAgの等量のS1＋S2領域との組換えを経る。潜在的な問題は２つの方法で防いだ。（１）３つの遺伝子は、必須遺伝子を含有するワクシニアDNAの大きな領域により互いに離れたワクシニアゲノム中の３つの異なる座に挿入した。それゆえ、HBV遺伝子間のいかなる組換えによっても、生存可能なワクシニア後代を産生しない不完全なワクシニアゲノムとなる。（２）spsAg遺伝子とS12/コアハイブリッド遺伝子のS1＋S2領域をコードするDNAを、lpsAgをコードする原生HBV遺伝子と互いとのDNA相同性を最小限とする異なるコドンの用法で化学的に合成した。lpsAgをコードする原生HBV遺伝子とspsAgをコードする合成遺伝子は、ayw亜型である；融解S12/コア遺伝子のS1＋S2領域をadw2亜型に対応するように合成した（バレンズエラら、1979）。
ポックスウイルスプロモーターの制御下で３つのここのHBV遺伝子を含有するカセッテを、異なるワクシニア供与体プラスミド中で組み立てて続いて以下に記載するようにワクシニアウイルスに挿入した。
HBV spsAgをコードする遺伝子の合成型を、以下の変更によるワクシニアに好ましいコドンを用いて合成した。（１）sAg（HBV Ｓタンパク質）のアミノ酸19から21に生じたT5NT初期転写終止TTTTTCTをTTCTTTCに変更し、他のT5NT終止信号を産生しないようにコドンの用法を調整した（ユエンら、1987）。（２）潜在的な変型翻訳産生物を避けるために、いずれの方向にもフレームATG開始コドンからの産生を防ぐようにコドンの用法を調整した。合成spsAg遺伝子を、修飾ワクシニアウイルスH6初期／晩期プロモーターに正確に連結した（パーカスら、1989）。プロモーターと遺伝子の完全な配列を第９図に示す。アミノ酸配列は、プラスミドpTHBV中に配列に基づき、これはS2領域の２つのアミノ酸位置：ガリバート、aa 31 thr;aa 36 leu;pTHBV、aa 31 ala;aa 36 proで発表されているayw配列とは異なる（ガリバートら、1979）。
プラスミドpGJ15は、ワクシニアAT I挿入座にH6プロモーター／合成spsAg遺伝子を含有している（パーカスら、1990）。pGEM−3Z中の合成spsAg遺伝子の部分を組み立て、組み立てた遺伝子を、AT I欠損座に合成H6プロモーターを含有するpSD492の誘導体である、挿入プラスミドpMP494Hに運搬することによりpGJ15を構成した。
ここで第10図を参照する。合成HBV spsAgを３つの部分で組み立てた。プラスミドpGJ5、pGJ3、およびpGJ7を、以下のようにそれぞれ相補オリゴヌクレオチドの６、５、および８対からそれぞれ産生した。標準化学物質により合成した相補オリゴヌクレオチド対を、標準条件下で、65℃に加熱し、アニーリンクに効果のあるように室温までゆっくりと冷却することによりキナーゼした。各断片からなるアニールした対のアリコートを、適切に切断したpGEM−3Z（プロメガ）と組み合わせ、標準条件下で連結した。Sph IおよびXba I制限部位により制限された断片SX（黒塗りの四角で示す）を、プラスミドpGJ5を産生するそれらの酵素で切断したpGEM−3Zベクタープラスミドと連結した。ベクタープラスミド配列を開いた領域で示す。同様に、断片XB（斜線）とBH（横線）を、それぞれXba IとBamH I、またはBamH IとHind IIIのいずれかで切断したプラスミドpGEM−3Z中で組み立て、プラスミドpGJ3およびpGJ7を産生した。各プラスミド中の挿入の完全性を、DNA配列の決定により確認した。
SX、XBおよびBH遺伝子断片を側腹に有する適切な制限酵素でプラスミドpGJ5、pGJ3およびpGJ7を切断することにより合成HBV遺伝子断片を単離し、続いてSph IとHind IIIで切断したpGEM−3Zに連結し、連続HBV合成spsAg配列を含有するプラスミドpGH9を産生した。開始メチオニンから最初のコドンより9bp下流のEcoR I部位で合成pspAgに付加されたH6プロモーターの３′28bp（斜線）を含有するオリゴヌクレオチドH6LINK（配列認識番号81）
Figure 0003602530
およびH6LINK2（配列認識番号82）
Figure 0003602530
を、Kpn I（pGEM−3Zから誘導された多重クローニング領域内の５′からSph I部位）とEcoR Iで切断したpGJ9と連結し、プラスミドpGJ12を産生した。Nru I/Hpa I断片をpGH12から単離して、同様に切断したpMP494Hに連結し、プラスミドpGJ15を産生した。pMP494Hは、AT I欠損領域にワクシニアH6プロモーターを含有するAT I挿入プラスミドである。pGJ15は、AT I座を囲うワクシニア配列（点領域）によりフランクされたH6プロモータードリブンHBV合成spsAg遺伝子を含有している。
ワクシニア組換え体vP804との組換えの供与体プラスミドとしてpGJ15を用いて組換え体ワクシニアウイルスvP856を産生した。vp804は、TK、HA、ｕおよび［C7L−K1L］のNYVAC欠損を含有する。組換えウイルスvP856は、AT I領域を置換したHBV合成spsAg遺伝子を挿入した上述欠損を含有する。以下に記載するI4L領域中に挿入を含有する後代ウイルス組換え体は、欠損に関してNYVACと等量である（TK、HA、AT I、I4L、ｕ、［C7L−K1L］）。
HBV lpsAgをコードする遺伝子をプラスミドpTHBVから誘導した。上述したS2領域のアミノ酸変化に加えて、pTHBVは、S1領域の１つのアミノ酸位置での発表されたayw亜型とは異なる：ガリバートら、、1979、aa 90 ser;pTHBV aa90 thr。上述したsAg中の初期翻訳終止信号を、TTTTTCTからTTCTTCTに変更した。105bp 牛痘ｕプロモーターの制御下で、完全なlpsAg遺伝子を配した（ピカップら、1986）。ｕプロモーター/lpsAg遺伝子カセッテを第11図に示す。
プラスミドpMP550ulpsは、ワクシニアI4L欠損座にｕプロモーター/lpsAg遺伝子を含有している。pMP550ulpsの構成を第12図に模式的に示す。pMP550ulps中のI4L欠損は、NYVAC中のI4L欠損と等量である。
ここで第12図の（Ａ）を参照する。合成オリゴヌクレオチドプライマーMPSYN322（配列認識番号83）、MPSYN323（配列認識番号84）およびテンプレートプラスミドpBScowを使用するPCRにより、HBV lpsAg遺伝子の５′末端を牛痘ｕプロモーター（矢印で示した方向）に加え、pMPuS1を産生した。（黒い四角がｕプロモーターを示し、線の四角がHBV配列を示す。）pSD550は、I4L欠損領域のワクシニア挿入プラスミドである。（三角形は欠損の部位を示し、四角はワクシニア配列を示す。）ｕプロモーター/HBV接合部を含有するSnaB I/BamH I断片を単離し、Sma I/BamH Iで切断したpSD550に挿入して、pMP550uを産生した。
ここで第12図（Ｂ）を参照する。完全HBV lpsAgを含有する1.1kb Dra I断片をpTHBVから単離し、pUC8中に挿入し、pMP8Sを形成した。翻訳開始コドンおよび終止コドンを示す。（＊）はT5NT転写終止信号の部位を示す（ユエンら、1987）。示したようにPCR突然変異誘発により転写終止信号をpMP8Sから除去し、pMP8STを産生した。lpsAgのバルクを含有する1.1kb BamH I（部分的）断片をpMP8STから単離して、BamH Iで切断したプラスミドpMP550uに挿入し、pMP550ulpsを産生した。pMP550ulpsはワクシニア組換え体vP856との組換えに用いて、vP896を産生した。合成オリゴヌクレオチド配列は以下のとおりである：
MPSYN322（配列認識番号83）
Figure 0003602530
MPSYN323（配列認識番号84）
Figure 0003602530
MPSYN330（配列認識番号85）
Figure 0003602530
MPSYN331（配列認識番号86）
Figure 0003602530
MPSYN322（配列認識番号83）のHBV開始コドンに下線を引き、MPSYN331（配列認識番号86）の変異した塩基にも下線を引き、制限部位を表示した。
上述したように救助ウイルスvP856により組換えの供与体プラスミドとしてpMP550ulpsを用いて組換えウイルスvP896を産生した。vP896は、NYVACのバックグラウンド（TK、HA、AT I、I4L、ｕ、［C7L−K1L］が欠損）にHBV spsAgおよびHBV lpsAgの両方の遺伝子を含有している。多価HBVワクシニア組換え体との比較目的のためにHBV lpsAg遺伝子のみを含有する組換え体を産生するために、vP866（NYVAC）との組換えにpMP550ulpsを用いて、組換えウイルスvP897を産生した。
ワクシニアウイルスに挿入された３番目のGBV遺伝子は融解タンパク質をコードする。HBV S1およびS2領域を特定する合成DNAを、HBVコア抗原を特定する遺伝子の５′末端にクローニングした。adw亜型のS1＋S2領域をコードし（バレンズエラら、1979）、aa位置12のmet（ayw亜型の位置１に等しい）により開始するように合成DNAを設計した（ガリバートら、1979）。S1＋S2の合計翻訳領域は163コドンである。多価HBVワクシニア組換えウイルス中のHBV遺伝子の中で望ましくない分子内組換えを防ぐために、pTHBV中に存在する原生aywS1＋S2領域を有する合成S1＋S2領域、並びにpGJ15中の合成S2領域のDNA相同性を最小限にするためにコドンの用法を調整した。
コア抗原をコードする全縁遺伝子をpTHBVから得た。pTHBVによりコードされたコア抗原のアミノ酸配列は発表されたayw配列と一致する（ガリバートら、1979）。ワクシニアI3L初期／中間プロモーターの制御下でS12/コアをコードする肝炎融解遺伝子を配した（フォスら、1988;ゲーベルら、1990b位置64,973−65,074）。I3Lプロモーター/S12/コア遺伝子カセッテの全縁配列を第13図に示す（配列認識番号87）。
プラスミドpMP544I3S12Cは、HA欠損座にI3Lプロモーター/S1＋S2/コア遺伝子を含有している（グオら、1989）。pMP544I3S12Cの構成を第14図に模式的に示す。
ここで第14図を参照する。プラスミドpMPCA−Ｂは、pUC9のSma I部位に挿入されたpTHBVからの1kb Hha I断片を含有している。pMP9CA−Ｂは、HBVコア抗原、並びに遺伝子の上流と下流のフランキングHBV DNAの全縁暗号配列を含有している。pMP9CA−Ｂを、遺伝子の３′末端から30bp上流のBgl II（部分的）およびHBV/pUC接合部でのポリリンカー領域のEcoR Iで切断した。HBV遺伝子のバルクを含有する3.4kbベクター断片を単離し、アニールした合成オリゴヌクレオチドMPSYN275（配列認識番号88）
Figure 0003602530
およびMPSYN276（配列認識番号89）
Figure 0003602530
と連結し、pMP9CA−Ｃを産生した。制限部位を表示し、翻訳終止コドンに下線を引き、初期ワクシニア転写ターミネーターには上に線を引いた。
pMP9CA−Ｃは、HBVコア抗原の全縁暗号配列を含有し、上述したように遺伝子のバルクの供給源として用いた。
以下に示すように、合成オリゴヌクレオチド、MPSYN290からMPSYN308（配列認識番号90）−（配列認識番号99）を用いて上述したような５つの二本鎖セクションＡからＥにおいて合成S1＋S2領域を組み立てた。オリゴヌクレオチドは、４から8bpの粘着末端とともに、46merから71merのサイズに亘った。セクション内の内部位置にあるオリゴヌクレオチドの５′末端は、セクションをアニールする前にキナーゼした。セクションＡからＥを構成するのに用いた合成オリゴヌクレオチドの配列を以下に示す。暗号鎖のみを示す。関連制限部位を示す。S1（セクションＡ）、S2（セクションＣ）およびコア（セクションＥ）の開始コドンに下線を引いた。
Figure 0003602530
Figure 0003602530
テンプレートとして、Hind III Ｉのサブクローンである、pMP1、およびPCRプライマーとして合成オリゴヌクレオチドMPSYN310（配列認識番号100）、MPSYN311（配列認識番号101）を用いて、ワクシニアI3Lプロモーターを合成した。制限部位を示す。
Figure 0003602530
I3プロモーター/HBV S1＋S2/コア発現カセッテを上述した中間プラスミドクローンを用いて段階でpUC8とpUC9において組み立て、pMP9I3S12コアを産生した。関連する場合のみに制限部位を示す。プラスミドpMP9I3S12コアをSma Iで切断し、全縁プロモーター／遺伝子カセッテを含有する1.2kb断片を単離した。ワクシニアHA欠損プラスミドpSD544をSma Iで切断し、1.2kb断片と連結してプラスミドpMP544I3S12Cを産生した。
pMP544I3S12Cを、上述したワクシニア組換え体vP896との組換えの供与体プラスミドとして用いて、組換えワクシニアウイルスvP919を産生した。vP919は、NYVACバックグラウンド中に全て３つのHBV挿入物:spsAg、lpsAgおよびS12コア融解を含有する。vP919中の全てのHBV挿入物の配列は、テンプレートとしてvP919を用いたポリメラーゼ鎖反応（PCR）と、続いてのPCR産生物質のジデオキシ配列決定により確認した。加えて、上述したようにvP804との組換えにおいて、pMP544I3S12Cを用いて、HBV S12/コア融解のみを含有する組換えワクシニアウイルスvP858を産生した。また組換えワクシニアウイルスvP856との組換えにpMP544I3S12Cを用いて組換えワクシニアウイルスvP891を産生した。vP891は、２つのHBV遺伝子挿入物、spsAgおよびS12/コアを含有している。
vP919によるHBVタンパク質の発現
三重HBV組換え体により合成された様々なHBVタンパク質をアッセイするために、vP91に感染した代謝標識した溶解産物および一重と二重HBV遺伝子挿入物を含有する適切なワクシニア組換え体に、イムノプレシピテーションを施し、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動と続いてのラジオオートグラフィーにより分析した。未感染細胞と、vP866（NYVAC）、vP856（spsAg）、vP896（spsAg＋lpsAg）またはvP919（spsAg、lpsAg、S12/コア）に感染した細胞におけるタンパク質を家ウサギ抗S2抗血清を用いてイムノプレシピテーションした。さらに未感染細胞と、vP919（spsAg、lpsAg、S12/コア）、vP858（S12/コア）またはvP866（NYVAC）に感染した細胞におけるタンパク質を家ウサギ抗コア抗血清を用いてイムノプレシピテーションした。抗S2血清は、spsAgの遺伝子を含有するワクシニア単一組換え体vP856からの33kDaの主要タンパク質を沈殿せしめた。これは、HBV spsAgの単独にグリコシル化した形状に予期したサイズに対応する。spsAgの二重にグリコシル化した形状に予期されるサイズに対応するタンパク質36kDaは少量沈殿した。抗S2血清は、spsAgとlpsAgの遺伝子を含有するワクシニア二重組換え体vP896からの同一のタンパク質を沈殿せしめる。加えて、lpsAgの予期したサイズに良好に対応する（39kDa未グリコシル化および42kDaグリコシル化）38と41kDaの２つの大きなタンパク質が沈殿する。vP856とvP896からの抗S2血清により沈殿した全てのタンパク質はまた、ワクシニアHBV三重組換え体vP919からも沈殿する。
HBV S12/コア融解タンパク質の予期したサイズは38kDaである。家ウサギ抗コア抗血清は、予期したサイズのタンパク質、並びに、HBV融解遺伝子S12/コアを含有するワクシニア単独組換え体である、vP858からの様々な小さなタンパク質を沈殿せしめた。抗コア血清によりvP858から沈殿した最も豊富なタンパク質は、27kDaのサイズを有した。これは、融解タンパク質遺伝子が２番目の（S2）ATGまで開始する場合に予期される翻訳産生物にサイズで対応する。vP858から沈殿した29kDaタンパク質は、27kDaタンパク質のグリコシル化された形状である。コアタンパク質のみの翻訳産生物にサイズで対応する20kDaの小さなタンパク質もまた、少量vP858から沈殿した。３つのHBV遺伝子全て（spsAg、lpsAgおよびS12/コア融解）を含有するワクシニア組換え体vP919は、抗コア抗血清によるイムノプレシピテーションによりvP858に観察された模様と同一の模様を与えた。抗コア抗血清によりvP858とvP919から沈殿した27kDaおよび29kDaタンパク質もまた予期したように、抗S2抗血清によりvP919から沈殿した。
vP919に対する抗体応答
vP919により産生されたHBVタンパク質に対する血清学的応答を試験するために、ウイルスを家ウサギ、モルモットおよびネズミに接種した。家ウサギとモルモットには皮内、皮下および筋内経路により、108pfuで２セットの組換えワクシニアウイルスvP919を接種した。最初の接種から６週間後、家ウサギに同一経路と摂取量でもう一度追加抗原投与した。最初の接種から７週間後、モルモットに同一経路と摂取量でもう一度追加抗原投与した。12匹のネズミの群に皮内、皮下および筋内経路により、107pfuで組換えワクシニアウイルスvP919を接種した。最初の接種から７週間後、ネズミに同一経路と摂取量でもう一度追加抗原投与した。血清を１週間ごとに採取した。ネズミの群のそれぞれから１週間の出血を集積した。AUSABラジオイムノアッセイキット（アボット）を用いてHBV表面抗原に対する抗体について、全ての血清を分析した。CORAB比較ラジンイムノアッセイキット（アボット）を用いてHBVコア抗原に対する抗体に関して、全ての血清を分析した。標準技術を用いてアッセイを行なった。これらの分析の結果を表２（家ウサギ）、３（モルモット）および４（ネズミ）に示す。
表２に示した結果を要約すると、６匹の家ウサギは全て、１度のvP919の接種の後に抗コア抗体応答を示した。６匹のうち５匹の家ウサギにおいて、抗コア抗体応答は、vP919の２度の接種により追加抗原投与された。６匹のうち４匹の家ウサギは、１度のvP919の接種の後に抗sAg応答を示した。これらの４匹の家ウサギと追加の１匹のウサギは、２度の接種の後に抗sAg応答の増大を示した。
表３に示した結果を要約すると、１匹のモルモットは、最初のvP919の接種後に抗コア応答を示し、７週間後の追加抗原投与後には合計３匹のモルモットが抗コア応答を示した。３匹のうち１匹が８週間後に抗sAg抗体応答を示した。
表４の結果を要約すると、ネズミの３つの群は全てvP919の接種後様々な時期に抗コア抗体応答を示、３つの群のうち２つの群が抗sAg応答を示した。
AUSRIAアッセイ
HBV含有ポックスウイルス組換え体に感染した細胞からの微粒子HBV表面抗体の発現を、市販されているAUSRIA II−125キット（IL、ノースシカゴ、アボットラボラトリーズ）を用いてアッセイした。２×106のベロ細胞を含有する皿に、2pfu/細胞で３重に組換えワクシニアウイルスで感染せしめた。24時間後、培養培地を除去し、細胞を2mlのPBSで洗浄し、洗浄物を培地と組合せ、1000rpmで10分間遠心分離した。上澄みを培地分画と称した。2mlのPVSを皿に加え、細胞を削り取り、上記からの細胞ペレットと組み合わせることにより細胞分画を調製した。培地と細胞分画の両方の最終容積をPBSで4mlに調節した。細胞分画をアッセイの前に２分間音波処理した。細胞分画と培地分画を、AUSRIAキットを用いて1:5に希釈したHBV表面抗体の存在下でアッセイした。キットにより供給された負の対照の2.1倍のカットオフ値より低い試料を負であると考えた。全ての皿からの細胞分画と培値分画の出力ウイルスをベロ細胞上で滴定した。結果を表５に示す。
EPV42kDaプロモーターの制御下でHBV lpsAgを発現するワクシニア組換え体の構成
ワクシニア組換えvP919は、感染後の初期に機能する３つの異なるポックスウイルスプロモーターの制御下で３つの異なるHBV遺伝子を含有している。同一のワクシニアバックグラウンドで感染後初期に異種遺伝子を発現する様々なポックスウイルスプロモーターの相対強度を比較するために、試験遺伝子として狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子を用いて、サンドイッチELISAアッセイを行なった。この試験システムを用いると、ワクシニアH6プロモーターおよびワクシニアI3Lプロモーターは、牛痘ｕプロモーターよりも強いプロモーターであることが分かった。vP919において、H6プロモーターはHBV spsAgの発現を指示し、I3LプロモーターはHBV S12/コア融解の発現を指示し、ＵプロモーターはHBVlpsAgの発現を指示する。lpsAgの共発現は粒子の形成とsAgまたはspsAgの分泌を妨害することが示されたので、相対的に弱いｕプロモーターはHBV lpsAgの発現のために故意に選択される（オウら、1987;チェンら、1986;マックラクランら、1987;チサリら、1986）。
HBV遺伝子を発現する組換えワクシニアウイルスによりsAgまたはspsAgを含有する粒子の生体外での産生を測定するためにAUSRIAラジオイムノアッセイキットを用いた。予備実験により、AUSRIA反応性粒子の形成と分泌はvP856（spsAgを含有）、vP896（spsAg＋lpsAgを含有）およびvP919（spsAg＋lpsAg＋S12/コアを含有）中に生じたことが示された。vP896およびvP919において、AUSRIA反応性粒子の相対水準は、vP856に観察された水準よりも低かった。
AUSRIA反応性粒子の形成と分泌が高水準のlpsAg発現の存在下で観察されることを決定するために、エトモポックス（EPV）42kDaプロモーターの制御下でlpsAgを配した。上述した比較ELISA試験により、ワクシニア組換えウイルス中のEPV 42kDaプロモーターは、ワクシニアH6プロモーターまたはワクシニアI3Lプロモーターに観察された水準と等しい水準で異種遺伝子の発現を指示した。
プラスミドpMP550ulpsは、ワクシニアI4L欠損座に牛痘ｕプロモーターの制御下でlpsAg遺伝子を含有している（第12図）。プラスミドpMP550ulps中に存在する牛痘ｕプロモーターを以下のようにしてEPV 42kDaプロモーターにより置換した：相補オリゴヌクレオチドMPSYN371−374を内部５′末端でキナーゼして（MPSYN372;MPSYN373）、アニールして、EcoR I/BamH Iで切断したpUC8中にクローニングし、プラスミドpMP371/374を形成した。MPSYN371（配列認識番号102）、MPSYN373（配列認識番号103）、MPSYN372（配列認識番号104）、およびMPSYN374（配列認識番号105）
Figure 0003602530
は、HBV S1領域（ATG下線）からBamH I部位の後に31bp EPV 42kDaプロモーター要素を含有している。DNA配列の確認に続いて、挿入物をBamH I/Bgl IIでの切断によりpMP371/374から単離し、以下のようにpMP550ulps中の対応ｕプロモーター/HBV配列を置換するのに用いた:pMP550ulpsをBamH I（部分的）/Bgl IIで切断し、適切な5kbベクター断片を単離して、pMP371/374からのBamH I/Bgl II断片と連結した。産生したプラスミド、pMP550E31lpsにおいて、HBV lpsAgは、EPV 42kDaプロモーターの制御下にある。EPV42kDaプロモーター/lpsAg遺伝子カセッテの全縁配列を第15図に示す。
spsAg遺伝子を含有するワクシニア組換え体vP856に関する供与体プラスミドとしてpMP550E31lpsを用いて、二重HBV組換えワクシニアウイルスvP932を産生した。S12/コア融解を含有する供与体プラスミドpMP544I3S12Cに関する救助ウイルスとしてvP932を用いて、三重HBV組換えワクシニアウイルスvP975を産生した。EPV 42kDaプロモーター/lpsAgのみを含有するワクシニア組換え体を産生するために、vP866に関する供与体プラスミドとしてpMP550E31lpsを用いて組換えワクシニアウイルスvP930を産生した。
組換えワクシニアウイルスによる生体外HBV表面抗原の分泌
ベロ細胞を含有する皿を、NYVAC（vP866）またはHBV spsAgおよび／またはHBV lpsAgを発現する組換えワクシニアウイルスを三重に感染せしめた。感染細胞に関連するHBV表面抗原粒子の相対量を、AUSRIA II−125キットを用いて培地に分泌された量と比較した（表５）。培地中のHBV表面抗原の存在は、ウイルス感染度の99.8％以上が細胞関連にとどまっていたので、感染細胞の溶解によるものではなかった。細胞ペレットと培地の容積は、直接の比較のために等しくした。spsAGを発現する組換えワクシニアウイルスvP856に感染した細胞において、AUSRIA反応性表面抗原の42％が培地に分泌された。比較的弱いｕプロモーター（vP896）の制御下でのlpsAgの共発現は、細胞関連AUSRIA反応性材料の量を著しくは変化せしめなかったが、分泌した材料の相対量を合計の24％まで減少せしめた。比較的強いEPV 42kDaプロモーター（vP932）の制御下でのlpsAgの共発現は、分泌された材料の相対量を合計の６％まで低下せしめた。vP896に関しては、vP932中のspsAgによるlpsAgの共発現は、AUSRIA反応性細胞関連材料の量を低下せしめなかった。興味をひくことに、EPV42kDaプロモーター（vP930）の制御下でlpsAgのみの発現は、アッセイのためのバックグラウンドより著しく高い細胞関連AUSRIA反応性材料の水準の産生となり、一方でｕプロモーター（vP897）の制御下でのlpsAgの発現はそうならなかった。これは、内部（S2またはＳ）開始コドンでの開始によるvp930感染細胞中に産生された高水準のspsAgまたはsAgによるようである。
Figure 0003602530
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実施例14−Ｂ型肝炎ウイルスおよびエプステイン−バーウイルスを発現するNYVAC組換え体の構成
エプステイン−バーウイルス（EBV）およびＢ型肝炎ウイルス（HBV）は、アフリカを含む類似の地理的区域に亘る地方特有のものであるので、両方の病原の免疫原を発言する組換えワクシニアウイルスを産生することが好ましい。この目的に関して、NYVACバックグラウンドで３つのEBV遺伝子と３つのHBV遺伝子を含有する組換えワクシニアウイルス、vP941を産生した。
HBVタンパク質のイムノプレシピテーション
HBVタンパク質のイムノプレシピテーションと代謝標識付けは、実施例13のvP919に記載したものに以下の変更を行なったものであった。組換えワクシニアウイルス、親NYVACウイルス（vP866）による感染および疑似感染を、ベロ細胞ではなくRK−13細胞に行なった。抗S2と抗コア抗血清の両方に、vP866感染RK−13細胞を吸着せしめた。
組換えワクシニアウイルスvP914の産生
ワクシニアウイルス組換え体EBVトリプレットvP944を産生するのに用いた３つのEBV遺伝子を含有する供与体プラスミドであるプラスミドEBVトリプル１を、救助ウイルスとして、ワクシニアウイルス組換え体HBVトリプレットである、vP919による組換えに用いた。産生したウイルス、vP941を、32P標識EBV DNAにより同定した。vP944のように、vP941は、エントモポックスウイルス42kDaプロモーターの制御下でEBV遺伝子を、ワクシニアH6プロモーターの制御下でgBを、そしてワクシニアH6プロモーターの制御下でgp340を含有し、全てをワクシニアTK欠損座に挿入した。vP919のように、vP941は、AT I欠損座に挿入されたワクシニアH6プロモーターの制御下で合成HBV spsAgを、I4L欠損座に挿入された牛痘ｕプロモーターの制御下でHBV lpsAgを、そしてHA欠損座に挿入されたI3Lプロモーターの制御下でHBV S12/コア融解を含有した。組換えワクシニアウイルスvP941のゲノムの完全性は、DNAの制限分析により確認された。
vP941によりHBVタンパク質の発現
６組のHBV/EBVワクシニア組換え体vP941により合成された様々なHBVタンパク質をアッセイするために、vP941に感染したRK−13細胞中で合成された代謝的標識タンパク質および適切な単一、二重および三重のHBV組換え体に、イムノプレシテーションを行なった。未感染細胞と、vP866（NYVAC）、vP856（spsAg）、vP896（spsAg＋lpsAg）、vP919（spsAg＋lpsAg＋S12/コア）、またはvP941に感染した細胞中のタンパク質を、家ウサギ抗S2抗血清を用いてイムノプレシピテーションを行なった。さらに未感染細胞およびさらにvP941、vP919、vP858（S12/コア）、またはvP866に感染した細胞中のタンパク質を、抗コア抗血清を用いてイムノプレシピテーションを行なった。
抗S2血清により、spsAgの遺伝子を含有するワクシニア単一組換え体vP856から33kDaと36kDaの２つのタンパク質が沈殿する。これらはHBV pspAgの単一と二重にグリコシル化された形状の予期サイズに対応している。抗S2血清により、spsAgとlpsAgの遺伝子を含有するワクシニア二重組換え体vP896が沈殿する。加えて、lpsAgの単一グリコシル化形状に対応する42kDaのタンパク質が、45kDaと48kDaの大きなタンパク質と同様に沈殿する。lpsAgの未グリコシル化形状に対応する39kDaのタンパク質は、グリコシル化形状と比較して少量で沈殿する。抗S2血清によりvP856とvP896から沈殿した全てのタンパク質はまた、HBV三重組換え体vP919およびHBV/EBV6重vP941から沈殿する。ラジオオートグラムにおいて、HBVタンパク質は、ワクシニア組換え体に感染したRK−13細胞からの抗S2によりイムノプレシピテーションせしめられる。HBVタンパク質が、同一のワクシニア組換え体（vP856、vP896およびvP919）に感染したベロ細胞からイムノプレシピテーションせしめられる場合、同一のタンパク質が観察されたが、異なる相対量であった。一般的に、これらの組換えワクシニアウイルスにより発現されたspsAgとlpsAgの両者は、ベロ細胞中よりもRK−13細胞中でより完全にグリコシル化せしめられているように思われる。
vP858に感染したベロ細胞に見られるように、vP858に感染したRK−13細胞から抗コア血清により沈殿せしめられた最も豊富なタンパク質は、27kDaのサイズを有する。これは、S12/コア融解遺伝子が第２の（S2）ATGで始まる場合に予期される翻訳産生物のサイズに対応する。ベロ細胞のvP858感染後に観察された状況とは異なって、抗コア血清によるイムノプレシピテーション後のRK−13細胞のvP858感染は、完全S12/コア翻訳産生物に予期される38kDaのサイズに対応する可視帯とはならない。HBV単一組換え体vP858から抗コア血清により沈殿せしめられた全てのタンパク質はまた、HBV三重組換え体vP919とHBV/EBV6重vP941からも沈殿せしめられる。
実施例15−狂犬病ウイルス糖タンパク質Ｇを発現するALVACの構成
この実施例は、ALVAC−RG（vCP65）と称するカナリヤポックス狂犬病組換え体の開発およびその安全性並びに効果を記載するものである。
細胞およびウイルス
親カナリヤポックスウイルス（レントシュラー菌株）はカナリヤのワクチン菌株である。ワクチン菌株を野生型単離体から得て、ニワトリ胚繊維芽細胞の200連続以上の継代により弱毒化した。マスターウイルス種子についてアガーで４連続のプラーク精製を行ない、１つのプラーククローンを、株ウイルスが後に生体外組換え試験の親ウイルスとして用いられる５連続の追加の継代により増幅せしめた。プラーク精製カナリヤポックス単離体をALVACと称する。
カナリヤポックス挿入ベクターの構成
880bpのカナリヤポックスPvu II断片をpUC9のPvu II部位の間にクローニングしてpRW764.5を形成した。この断片の配列を第16図の位置1372と2251の間に示す。C5と称する読取り枠の制限を規定した。読取り枠は、断片内の位置166で開始し、位置487で終止することを決定した。読取り枠を妨害することなく、C5欠損を行なった。位置167から位置455の塩基を、配列（配列認識番号106）GCTTCCCGGGAATTCTAGCTAGCTAGTTTと置換した。この置換配列は、Hind III、Sma IおよびEcoR I挿入部位を含有し、この後にワクシニアウイルスRNAポリメラーゼにより認識される翻訳停止および転写終止信号が続く（ユエンら、1987）。C5 ORFの欠損を以下に記載するように行なった。プラスミドpRW764.5を部分的にRsa Iで切断し、線状産生物を単離した。Rsa I線状断片をBgk IIで再切断し、今では位置156から位置462までのRsa IからBgl IIが欠損したpRW764.5断片を単離して、以下の合成オリゴヌクレオチドのベクターとして用いた：
RW145（配列認識番号107）
Figure 0003602530
RW146（配列認識番号108）
Figure 0003602530
オリゴヌクレオチドRW145およびRW146をアニールして、上述したpRW764.5Rsa IおよびBgl IIベクターに挿入した。産生したプラスミドをpRW831と称する。
狂犬病のＧ遺伝子を含有する挿入ベクターの構成
pRW838の構成を以下に説明する。狂犬病ＧのATGを有するH6プロモーターの翻訳開始コドンと重複するオリゴヌクレオチドＡからＥをpRW737としてpUC9中クローニングした。オリゴヌクレオチドＡからＥは、Nru Iで始まり、Bgl IIが後に続く狂犬病ＧのHind III部位までのH6プロモーターを含有する。オリゴヌクレオチドＡからＥ（配列認識番号109）から（配列認識番号113）の配列を以下に示す：
Figure 0003602530
アニールしたオリゴヌクレオチドＡからＥのダニアグラムは以下のとおりである：
Figure 0003602530
オリゴヌクレオチドＡからＥをキナーゼして、アニールし（５分間95℃で加熱し、次いで室温まで冷却せしめる）、pUC9のPvu II部位の間に挿入した。産生したプラスミド、pRW737をHind IIIおよびBgl IIで切断し、ptg155PROの1.6kbp Hind III−Bgl II断片のベクター（キニーら、1984）として用い、pRW739を産生した。ptg155PRO Hind III部位は、狂犬病Ｇ翻訳開始コドンの86bp下流にある。Bgl IIはptg155PRO中の狂犬病Ｇ翻訳停止コドンの下流にある。pRW739を部分的にNru Iで切断し、Bgl IIで完全に切断し、前述したH6プロモーターの３′未満（テイラーら、1988a、b;グオら、1989;パーカスら、1989）から全縁狂犬病Ｇ遺伝子を含有する1.7kbp Nru I−Bgl II断片をpRW824のNru I部位とBamH I部位の間に挿入した。産生したプラスミドをpRW832と称する。pRW824への挿入は、Nru IのH6プロモーター５′を加えた。Sma Iが後に続くBamH IのpRW824配列は:GGATCCCCGGGである。pRW824は、ワクシニアウイルスH6プロモーターに正確に連結した非関連遺伝子を含有する。Nru IとBamH Iによる切断は完全にこの非関連遺伝子を切除した。H6プロモートした狂犬病Ｇを含有する1.8kbp pRW832Sma I断片をpRW831のSma Iに挿入して、プラスミドpRW838を形成した。
ALVAC−RGの開発
前述したリン酸カルシウム沈殿法を用いて、プラスミドpRW838をALVAC感染初代CEF細胞に移入した（パニカリら、1982;ピッチーニら、1987）。特異的狂犬病Ｇプローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な固体群となるまで６連続のプラーク精製を行なった。次いで１つの典型的なプラークを増幅し、産生したALVAC組換え体をALVAC−RG（vCP65）と称した。続いて突然変異しない狂犬病Ｇ遺伝子のALVACゲノムへの正確な挿入を配列分析により確認した。
蛍光抗体法
熟成狂犬病ウイルス粒子のアッセンブリの最終段階中に、糖タンパク質成分はゴルジ体から血漿膜に運搬され、そこで、細胞膜の外面のタンパク質のバルクと細胞質中に延びるカルボキシ末端により蓄積する。ALVAC−RG中で発現された狂犬病糖タンパク質が正確に存在することを確認するために、ALVACまたはALVAC−RGに感染した初代CEF細胞に、蛍光抗体法を行なった。前述したように（テイラーら、1990）狂犬病Ｇ単クローン性抗体を用いて蛍光抗体法を行なった。強い表面蛍光がALVAC−RGに感染したCEF細胞に検出されたが、親ALVACには検出されなかった。
イムノプレシピテーション
初代CEF細胞、ベロ細胞（アフリカ緑猿肝臓細胞ATCC＃CCL81の系統）およびMRC−５細胞（通常の人の胎児の肺組織ATCC＃CCL17Iから誘導した繊維芽細胞状細胞形状）の前形成単層に、放射線標識した35メチオニンの存在下で親ウイルスALVACおよび組換えウイルスALVAC−RGを細胞あたり10pfuで接種し、前述したように処理した（テイラーら、1990）。イムノプレシピテーション反応を、狂犬病Ｇ特異的単クローン性抗体を用いて行なった。約67kDaの分子量を有する狂犬病特異的糖タンパク質の効果的な発現を組換えALVAC−RGに関して検出した。未感染細胞または親ALVACウイルスに感染した細胞中には、狂犬病特異的産生物は検出されなかった。
系列継代実験
非アビアン種の範囲のALVACウイルスに関する研究において、増殖性感染または顕著な病気はなにも観察されなかった（テイラーら、1991b）。しかしながら、非アビアン細胞中の成長には親または組換えウイルスのいずれも適応できないことを確証するために、系列継代実験を行なった。
２つのウイルス、ALVACおよびALVAC−RGを、３つの細胞系列における10連続のブラインド継代に接種した：
（１）生後11日の白のレグホン種のひなから産生された初代ニワトリ胚繊維芽細胞（CEF）；
（２）ベロ細胞−アフリカ緑猿肝臓細胞の連続系列（ATCC＃CCL81）；および
（３）MRC−５細胞−人間の胎児肺組織から誘導した復相細胞系列（ATCC＃CCL171）
各皿２×106の細胞を含有する各細胞系列の３つの60mm皿を用いて、細胞当たり0.1pfuのm.o.i.で最初の接種を行なった。DNA複製の阻害因子であるシトシンアラビノシド（Ara Ｃ）40μg/mlの存在下で１つの皿を接種せしめた。37℃の１時間の吸着期間後、接種物を取り出して、単層を洗浄して未吸着ウイルスを除去した。この時点で、培地を、２つの皿の5mlのEMEM＋２％のNBCS（試料t0およびt7）および第３の40μg/mlのAra Ｃを含有する5mlのEMEM＋２％のNBCS（試料t7A）と置換した。試料t0を−70℃で凍結せしめ、残留入力ウイルスの徴候を与えた。試料t7およびt7Aを37℃で７日間インキュベートし、その後成分を収穫して感染音波処理により細胞を破壊した。
各細胞系列の試料t7の1mlを希釈せずに、同一の細胞系列の３つの皿（試料t0、t7およびt7Aを提供する）および初代CEF細胞の１つの皿に接種した。試料t0、t7およびt7Aを、継代１としての処理を施した。非アビアン細胞中に存在するウイルスのより敏感な検出のための増幅工程を提供するために、CEF細胞への追加の接種を行なった。
この方法を、10回（CEGおよびMRC−５）または８回（ベロ）の連続したブラインド継代について行なった。次いで試料を凍結せしめ、３回溶かし、初代CEF単層での滴定によりアッセイした。
次いで各試料のウイルス産生を、アガロースでのCEG単層でのプラーク滴定により測定した。実験の要約結果を表６と７に示す。
その結果により、親ALVACと組換えALVAC−RGの両者は、力価を損失することなくCEF単層で一様の複製ができることが示されている。ベロ細胞において、ウイルスの水準は、ALVACの２回の継代およびALVAC−RGの１回の継代の後に検出水準より低下した。MRC−５細胞において、同様の結果が明確であり、１回の継代後にはウイルスは検出されなかった。表６と７において、４回の継代の結果のみを示しているが、一連の結果は、８回（ベロ）および10回（MRC−５）の継代に関して、いずれのウイルスも非アビアン細胞における成長への適応は検出不可能であった。
継代１において、MRV−５細胞とベロ細胞のt7試料では比較的高い水準ウイルスが存在した。しかしながら、この水準のウイルスは、ウイルスの複製が生じないシトシンアラビノシドの存在下でインキュベートされたt0試料とt7A試料に見られる水準と等しかった。これにより、非アビアン細胞中の７日で見られるウイルスの水準は、残留ウイルスを表し、新たに複製されたウイルスは表さないことが示された。
アッセイをより敏感に行なうために、各細胞系列から収穫した７日の部分を任意のCEF単層に接種し、細胞変性効果（CPE）となったときに、またはCPEが不明確な場合は７日後に収穫した。この実験の結果を表８に示す。任意の細胞系列により増幅後でさえも、ウイルスは２回の追加の継代のMRC−５とベロ細胞に検出されたのみであった。これらの結果により、使用した条件下では、ベロ細胞とMRC−５細胞にはいずれのウイルス成長も適応しないことが示された。
マカクの接種
表９に記載したように、４つのHIV漿陽性（seropositive）マカクに最初にALVAC−RGを接種した。100日後、これらの動物に再接種し、追加抗原投与効果を測定し、追加の７匹の動物を供給量を変えて接種した。適切な間隔で血液を採取し、56℃で30分間の熱不活性化後、急速蛍光焦点抑制アッセイ（Rapid Fluorescent Focus Inhibition Assay）を用いた抗狂犬病抗体の存在について血清を分析した（スミスら、1973）。
チンパンジーの接種
２匹の大人のメスのチンパンジー（50から65kgの範囲）に、１×107pfuのvCP65を筋内または皮下に接種した。反応に関して動物を監視し、RFFI試験による抗狂犬病抗体の存在の分析のために規則的な間隔で採血した（スミスら、1973）。最初の接種から13週間後に等量の供給量で動物を再接種せしめた。
ネズミの接種
ネズミの群に、50から100μｌの範囲のvCP65の異なるバッチの希釈物を接種した。ネズミは足蹠で接種した。14日目に、狂犬病ウイルスの毒性CVS菌株の15から43ネズミLD50をネズミに皮内接種で抗原投与した。ネズミの生存を監視し、接種後28日での保護供給量50％（PD50）を計算した。
イヌとネコの接種
生後４か月の10匹のビーグル犬と生後４か月の10匹のネコに、ALVAC−RGを6.7または7.7log10TCID50で頭蓋内に接種した。接種後14日と28日に動物の採血を行ない、RFFI試験において抗狂犬病抗体を評価した。6.7log10TCID50のALVAC−RGを接種した動物に、ワクチン接種後29日目に、3.7log10ネズミLD50（イヌ）または4.3log10ネズミLD50（ネコ）のNYGS狂犬病ウイルス抗原投与菌株を抗原投与した。
リスサル（squirrel monkey）の接種
４匹のリスサル（Saimiri sciureus）の３つの群には、（ａ）ALVAC、親カナリヤポックスウイルス、（ｂ）ALVAC−RG、狂犬病Ｇ糖タンパク質を発現する組換え体、または（ｃ）vCP37、ネコ白血病ウイルスのエンベロープを発現するカナリヤポックスウイルス組換え体の３つのウイルスのうちの１つを接種した。接種はケタミン（ketamine）麻酔により行なった。各動物に同時に：（１）乱切することなく右目の表面に20μｌを；（２）口に数滴として100μｌを；（３）右腕の外面の毛を剃った皮膚の２か所の皮内注射部位のそれぞれに100μｌを；（４）右腿の前部筋肉に100μｌを与えた。
４匹のサルに各ウイルスを接種した。２匹には合計5.0log10pfuを、他の２匹には合計7.0log10pfuを接種した。動物から規則的な間隔で採血し、RFFI試験を用いて抗狂犬病抗体の存在に付いて血清を分析した（スミスら、1973）。ワクチン接種に対する反応について動物を毎日観察した。最初の接種から６か月後、LAVAC−RGを受けた４匹のサル、vCP37を受けた２匹のサル、および最初にALVACを受けた２匹のサル、並びに１匹の未接種のサルに、6.5log10pfuのALVAC−RGを皮下に接種した。RFFI試験において、狂犬病中和抗体の存在について血清をモニタした（スミスら、1973）。
人細胞系列へのALVAC−RGの接種
異種遺伝子の効果的な発現が、ウイルスが生産的に複製する非アビアン細胞中に得られるか否かを決定するために、１つのアビアンと４つの非アビアンの５つの細胞型を、ウイルス産生、異種狂犬病Ｇ遺伝子の発現およびウイルス特異的DNA蓄積に関して分析した。接種した細胞は：
（ａ）ベロ、アフリカ緑サルの肝臓細胞、ATCC＃CCL81;
（ｂ）MRC−５、ヒトの胎児の肺、ATCC＃CCL171;
（ｃ）WISHヒト羊膜、ATCC＃CCL25;
（ｄ）デトロイト−532、ヒト包皮、ダウン症候群、ATCC＃CCL54;および
（ｅ）初代CEF細胞であった。
生後11日の白レグホンの胚胎から産生されたニワトリ胚繊維芽細胞を陽性対照として含む。全ての接種は、以下に記載するように２×106細胞の前形成単層上で行なった。
A. DNA分析の方法
各細胞系列の３つの皿に、5pfu/細胞のウイルスを接種し、未接種の各細胞系列の余分の１つの皿を容易した。１つの皿を、40μg/mlのシトシンアラビノシド（Ara Ｃ）の存在下でインキュベーションした。37℃での60分間の吸着期間の後、接種物を除去し、単層を２回洗浄して未吸着ウイルスを除去した。次いで培地（Ara Ｃの有無に関わらず）を置き換えた。皿からの細胞（Ara Ｃのない）を時間ゼロ試料として収穫した。残りの皿を37℃で72時間インキュベーションし、その後細胞を収穫し、DNA蓄積を分析するのに用いた。各試料の２×106細胞を、40mMのEDTAを含有する0.5mlの食塩加リン酸緩衝液（PBS）中に再懸濁せしめ、５分間37℃でインキュベーションした。42℃に予熱し、120mMのEDTAを含有する等容積の1.5％アガロースを細胞懸濁液に加え、穏やかに混合した。懸濁をアガロースプラグモールドに運搬し、少なくとも15分間硬化せしめた。次いでアガロースプラグを取り出し、そのプラグを完全に覆う容積の溶菌緩衝液（１％サーコシル、100μg/mlのプロテイナーゼＫ、10mMのトリスHCl pH7.5、200mMのEDTA）中において50℃で12−16時間に亘りインキュベーションした。次いで溶菌緩衝液を5.0mlのステリル0.5×TBE（44.5mMのトリスホウ酸塩、0.5mMのEDTA）と置き換え、TBE緩衝液の３回の交換により４℃で６時間平衡せしめた。パルスフィールド電気泳動システムを用いて細胞RNAとDNAからプラグ内のウイルスDNAを分画せしめた。0.5×TBE中で15℃の50−90秒のランプでの180Vで20時間に亘り電気泳動を行なった。DNAは、ラムダDNA分子量標準で展開せしめた。電気泳動後、ウイルスDNA帯を、臭化エチジウムで染色することにより視覚化した。次いでDNAをニトロセルロース膜に運搬し、精製ALVACゲノムDNAから調製した放射線標識プローブでプローブした。
B. ウイルス産生の評価
入力多重度が0.1pfu/細胞であることを除いて、上述したように皿を正確に接種した。感染の72時間後、凍結と解凍の３連続のサイクルにより細胞を溶解せしめた。CEF単層のプラーク滴定により、ウイルス産生を評価した。
C. 狂犬病Ｇ遺伝子の発現分析
皿に10pfu/細胞の多重度で組換えウイルスまたは親ウイルスを接種し、未感染ウイルス対照としての追加の皿を用意した。１時間の吸着時間後、培地を除去し、メチオニン不含有培地と置き換えた。30秒後、この培地を、25uCi/mlの35S−メチオニンを含有するメチオニン不含有培地と尾個か得た。感染細胞を１晩標識し（約161間）、次いで緩衝液Ａ溶菌緩衝液の添加により溶解せしめた。狂犬病Ｇ特異的単クローン性抗体を用いて、前述したようにイムノプレシピテーションを行なった。
結果：ウイルス産生の評価
細胞当たり0.1pfuの接種72時間後の産生の滴定の評価を表10に示す。この結果により、生産的な感染がアビアン細胞においては達成されるが、４つの非アビアン細胞系においてはこの方法によりウイルスの産生の増大は検出されなかった。
ウイルスDNA蓄積の分析
非アビアン細胞中の生産的ウイルス複製に対するブロックが、DNA複製の前または後に生じるか否かを決定するために、細胞溶解産物からのDNAを、電気泳動により分画し、ニトロセルロースに運搬し、ウイルス特異的DNAの存在下でプローブした。おそらくは放射線標識した＋VAC DNAプローブ調製におけるCEF細胞DNAの汚染のために、未感染CEF細胞、時間ゼロでのALVAC−RG感染CEF細胞、感染から72時間後のALVAC−RG感染CEF細胞および40μg/mlのシトシンアラビノシドの存在下での感染から72時間後のALVAC−RG感染CEF細胞からのDNAは全て、バックグラウンド活性を示した。しかしながら、感染から72時間後のALVAC−RG感染CEF細胞は、ALVAC特異的ウイルスDNA蓄積を示す約350kbpの領域に強い帯を示した。培地がDNA合成抑制因子、シトシンアラビノシドの存在下でインキュベーションされる場合には、そのような帯は検知不可能である。ベロ細胞中で産生された等量の試料は、時間ゼロでのALVAC−RG感染ベロ細胞において約350kbpでは非常にわずかな帯を示した。この水準は、残留ウイルスを示す。ウイルス後代の増大とはならないベロ細胞に生じたウイルス特異的DNA複製の水準を示す帯の強度は、感染72時間後に増幅された。MRC−５細胞中に産生された等量の試料により、この細胞系列におけるこれらの条件下ではウイルス特異的DNA蓄積が検出されないことが示された。次いでこの実験を、追加のヒト細胞系列、特にWISHおよびデトロイト−532細胞を含むまでに広げた。ALVAC感染CEF細胞は、陽性対照として作用した。ALVACを接種したWISHまたはデトロイト細胞においてはウイルス特異的DNA蓄積は生じなかった。この方法の検出限界は完全に確認され、ういるくDNA蓄積が生じるが、方法の感度より低い水準である。ウイルスDNA複製が３チミジン含有により測定された他の実験は、ベロ細胞とMRV−５細胞に得られた結果を支持する。
狂犬病遺伝子発現の分析
ウイルス遺伝子発現、特に挿入された異種遺伝子の発現が、ウイルスDNA複製のないヒト細胞系列でさえ生じるか否かを決定するために、ALVACとALVAC−RGに感染したアビアンと非アビアン細胞の35メチオニン標識溶解産物にイムノプレシピテーションを行なった。狂犬病Ｇ特異的単クローン性抗体を用いたイムノプレシピテーションの結果は、ALVAC−RGに感染したWISHおよびデトロイト細胞、CEF、ベロおよびMRV−５細胞中の67kDa糖タンパク質の特異的イムノプレシピテーションを説明した。未感染、および親感染細胞溶解産物のいずれにもそのような特異的狂犬病遺伝子産生物を検出されなかった。
この実験の結果により、分析したヒト細胞系列において、ALVAC−RG組換え体は感染を開始し、H6初期／晩期ワクシニアウイルスプロモーターの転写制御下で異種遺伝子産生物を発現できるけれども、複製はDNA複製をとはならず、または検出可能なウイルス後代は産生されなかった。ベロ細胞において、ある水準のALVAC−RG特異的DNA蓄積が観察されたが、これらの方法によってはウイルス後代は検出されなかった。これらの結果により、分析したヒト細胞系列において、ウイルス複製に対するブロックは、DNA複製の着手の前に生じ、一方ベロ細胞においてはブロックはウイルスDNA複製の着手の後に生じる。
ALVAC−RGに発現された狂犬病糖タンパク質が免疫原性であるか否かを決定するために、多くの動物種を組換え体の接種により試験した。現在の狂犬病ワクチンの硬化は、ネズミモデルシステムにおいて評価される。それゆえ、同様の試験をALVAC−RGを用いて行なった。1ml当たり6.7から8.41log10TCID50の範囲に亘る感染力価を有する９つの異なるウイルスの調製物（種子ウイルスの10連続の組織培地継代後に産生された１つのワクチンバッチ（Ｊ）を含む）を連続的に希釈し、生後４から６週間のネズミの足蹠に50から100μｌの希釈物を接種した。14日後に、対照ネズミ群の致死率滴定により決定されるような15から43ネズミLD50を含有する狂犬病ウイルスのCVC菌株300μｌをネズミに頭蓋内経路により抗原投与した。PD50（保護的供給量50％）として表される効力は、抗原投与14日後に計算した。実験結果を表11に示す。結果により、ALVAC−RGは、平均値が3.73（STD0.48）である3.33から4.56に亘るPD50値での狂犬病ウイルス抗原投与に対して矛盾なくネズミを保護することができたことが示された。この研究の延長として、おすのネズミに、6.0log10TCID50のALVAC−RGを含有する50μｌのウイルスまたは等容積の未感染細胞懸濁液を頭蓋内で接種した。ネズミを接種から１、３および６日後に乱切し、ネズミの脳を取り出し固定して切り分けた。組織病理学的実験により、ネズミのALVAC−RGの神経毒性の証拠は見られなかった。
イヌとネコのALVAC−RGの安全性と効果を評価するために、生後14,5か月のビーグル犬と生後14,4ネコの群を分析した。各種において４匹をワクチン接種しなかった。５匹の動物に6.7log10TCID50を皮下に接種し、５匹の動物に7.7のlog10TCID50を同一経路で接種した。抗狂犬病抗体についての分析のために、動物から採血した。接種しなかった、または6.7log10TCID50のALVAC−RGを接種した動物に、ワクチン接種から29日後に、3.7log10ネズミLD50（イヌ、こめかみの筋肉に）または4.3log10ネズミLD50（ネコ、首に）のNYGS狂犬病ウイルス抗原投与菌株を抗原投与した。この実験結果を表12に示す。
いずれの接種ウイルスの供与量のネコまたはイヌにも接種に対して副作用は見られなかった。6.7log10TCID50で免疫化した５匹のうち４匹のイヌがワクチン接種から14日後に抗体力価を有し、全てのイヌが29日後には力価を有した。全てのイヌは、４匹のうち３匹の対照を殺した抗原投与から保護された。ネコにおいて、6.7log10TCID50で免疫化した５匹のうち３匹のネコは、14日後に特異的抗体力価を有し、全てのネコが29日後には陽性であったが、平均抗体力価は2.9IUと低かった。５匹のうち３匹のネコが、全ての対照を殺した抗原投与にも生き残った。7.7log10TCID50で免疫化した全てのネコが14日後に抗体力価を有し、29日後の幾何学平均力価は8.1国際単位として計算された。
ALVAC、ALVAC−RGおよび未関連カナリヤポックスウイルス組換え体による接種に対するリスサル（Saimiri sciureus）の免疫応答を実験した。サルの群に上述したように接種を行ない、狂犬病特異的抗体の存在に関して血清を分析した。皮内経路による接種に対するわずかな典型的な皮膚反応を別にして、どのサルにも副作用は見られなかった。皮内接種から２および４日後のみに、少量の残留ウイルスを皮膚の傷から単離した。全ての種が７日後以降に陰性であった。筋内注射に対する局部的な反応は見られなかった。ALVAC−RGを接種した４匹全てのサルは、RFFI試験に測定された抗狂犬病血清中和抗体を発達せしめた。最初の接種から約６か月後に、全てのサルと１匹の追加の純粋なサルに、皮下経路により、6.5log10TCID50のALVAC−RGを左腿の外面に再接種した。抗狂犬病抗体の存在について血清を分析した。結果を表13に示す。
狂犬病を未経験な５匹のサルのうち４匹が、ALVAC−RGの感染から７日後に免疫学的応答を発達せしめた。接種から11日後には５匹全てのサルが検知可能な抗体を有した。狂犬病等タンパク質に以前に露出した４匹のサルのうち全てが、ワクチン接種後３から７日の間に血清中和力価に著しい増大を示した。その結果により、ALVACpRGによるリスサルのワクチン接種は、簡単の側面効果を与えず、主要な抗体応答が誘発せしめられたことが示される。アムナネスティック（amnanestic）応答もまた再ワクチン接種により誘発せしめられる。ALVACまたは未関連異種遺伝子を発現するカナリヤポックス組換え体への事前の露出は、再ワクチン接種により抗狂犬病免疫応答の誘発を妨害しない。
ALVAC−RGの接種に対するHIV−２漿陽性マカクの免疫学的応答を評価した。上述したように動物を接種し、RFFI試験において抗狂犬病血清中和抗体の存在を評価した。表14に示した結果により、皮下経路により接種したHIV−２陽性動物は、１回の接種から11日後に抗狂犬病抗体を発達せしめた。最初の接種から約３か月後に与えられた追加抗原投与の接種後に既往反応が検知された。口頭経路により組換え体を接種した動物にはどのような反応も検知されなかった。加えて、一連の６匹の動物に、筋内または皮下経路のいずれかにより与えたALVAC−RGの減少した供給量を接種した。接種した６匹のうち５匹の動物は、ワクチン接種間から14日後にそれほど違わない抗体力価で反応した。
HIVに事前に露出した２匹のチンパンジーに、皮下または筋内経路により7.0log10pfuのALVAC−RGを接種した。接種から３か月後、両方の動物は各様式で再ワクチン接種した。結果を表15に示す。
皮下または筋内経路のいずれの経路によっても、接種に対して副作用は示されなかった。両方のチンパンジーは、14日後に最初の接種に反応し、強く上昇する反応が再ワクチン接種後に検知された。
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実施例16−フラビウイルスタンパク質を発現するNYVAC組換え体の構成
この実施例は、日本脳炎ウイルス（JEV）、黄熱病ウイルス（YV）および１型デング熱からの遺伝子を含有するNYVAC供与体プラスミドの構成、対応NYVACフラビウイルス組換え体の単離、および相同ウイルスによる致死抗原投与に対してネズミを保護するJEVまたはYFのゲノムの部分を発現するワクシニア組換え体の能力を記載している。
細胞系列およびウイルス菌株
ワクシニアウイルスvP410のコペンハーゲン菌株のチミジンキナーゼ変異体（グオら、1989）を用いて組換え体vP825、vP829、vP857およびvP864を産生した（下記参照）。vP555の産生は以前に記載している（メイソンら、1991）。FBSと抗生物質を補給したイーグルス最小限基礎培地中に37℃で成長せしめられたヘラ（HeLa）細胞を用いて生合成研究を行なった。全ての生体外実験で用いたJEVウイルスは、JEVのナカヤマ菌株の継代55哺乳ネズミ脳懸濁液に感染したC6/36から調製した浄化培養液体であった（メイソン、1989）。JEVの高度病原P3菌株を用いて動物抗原投与実験を行なった（下記参照）。
JEV遺伝子のワクシニアウイルス供与体プラスミド中へのクローニング
JRVワクシニア組換えウイルスを構成するのに用いたJEV cDNAは、JEVのナカヤマ菌株から誘導した（マックアダら、1987）。
pUC8のSma IとEcoR I部位にJEV cDNA（ヌクレオチド−28から1000）を含有するプラスミドpDr20をBamH IとEcoR Iで切断し、JEV cDNA挿入物をpIBI25（CT、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジーズ社）中にクローニングしてプラスミドJEV18を産生した。JEV18をJE配列（ヌクレオチド23）内のApa IとpIBI25内のXho Iで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドJ90（配列認識番号114）およびJ91（配列認識番号115）（Xho I粘着末端、Sma I部位、およびJEヌクレオチド１から23を含有する）と連結し、プラスミドJEV19を産生した。JEV19をpIBI25内のXho IとJE配列（ヌクレオチド602）内のAcc Iで切断し、産生した613bp断片を、プラスミド起点と、カルボキシ末端40％prMおよびＥの３分の２のアミノ末端（ヌクレオチド602から2124）をコードするJEV cDNAとを含有するJEV2のXho IとAcc I断片（メイソンら、1991）中にクローニングし、ＣのATGからＥの最後の３分の１に発見されたSac I部位（ヌクレオチド2124）のJE配列を含有するプラスミドJEV20を産生した。
TTTTTGTヌクレオチド1304から1310がTCTTTGTに変更せしめられ、Ｅの最後の３分の１からNS2Bの最初の２つのアミノ酸（ヌクレオチド2124から4126）までのJE配列、プラスミド起点およびワクシニア配列を含有するJEV8からのSma I−Sac I断片をJEV20からの精製Sma I−Sac I挿入物に連結し、JEV22−１を産生した。オリゴヌクレオチド定方向二本鎖開裂突然変異誘発（マンデッキ、1986）を用いて、JEV22−１を構成するのに用いたユニークSma I部位に対応する6bpを除去し、H6プロモーターが直接ATG開始コドンに先立つJEV24を産生した。
プラスミドJEV7（メイソンら、1991）をJE配列内のSph I（ヌクレオチド2180）とIBI24内のHind IIIで切断した。アニールしたオリゴヌクレオチドJ94とJ95［Sph I粘着末端、翻訳停止、ワクシニア初期転写終止信号（TTTTTAT;ユエンら、1987）翻訳停止、Eag I部位およびHind III粘着末端を含有する］への連結により、Ｅの最後の３分の１のSac I部位（ヌクレオチド2124）からＥのカルボキシ末端に亘るJE cDNAを含有するプラスミドJEV25が産生された。JEV25からのSac I−Eag I断片をJEV8のSac I−Eag I断片（15aaC、prMおよびＥヌクレオチド337から2124の３分の２のアミノ末端をコードするJE cDNA、プラスミド起点およびワクシニア配列を含有する）に連結し、プラスミドJEV26を産生した。ATG開始コドンを先行するユニークSma I部位を上述したように除去し、H6プロモーターが直接ATG開始コドンを先行するJEV27を産生した。
オリゴヌクレオチドJ96、J97、J98およびJ99（Sph I粘着末端を有するJEヌクレオチド2243から2380を含有する）をキナーゼし、アニールし、Sma I−Sph I切断してアルカリ性ホスファターゼ処理したpIBI25に連結し、プラスミドJEV28を産生した。JEV28をJE配列内のHpa I（ヌクレオチド2301）とpIBI25配列内のHind IIIで切断し、アルカリ性ホスファターゼ処理した。JEV1からのHpa I−Hind III断片またはJEV7からのHpa I−Hind III断片（メイソンら、1991）への連結により、JEV29（Sma I部位とそれに続く、30aaE、NS1、NS2A、ヌクレオチド2293から4126をコードするJE cDNAを含有する）およびjev30（Sma I部位とそれに続く30aaE、NS1、NS2A、NS2B、ヌクレオチド2293から4512をコードするJE cDNAを含有する）を産生した。
JEV29からのSma I−Eag I断片をSma I−Eag I切断したpTP15（メイソンら、1991）に連結してJEV31を産生した。JEV31を産生するのに用いたユニークSma I部位に対応する6bpを上述したように除去して、H6プロモーターが直接ATG開始コドンを先行するJEV33を産生した。
JEV30からのSma I−Eag I断片をSma I−Eag I切断したpTP15と連結してJEV32を産生した。JEV32を産生するのに用いたユニークSma I部位に対応する6bpを上述したように除去して、H6プロモーターが直接ATG開始コドンを先行するJEV34を産生した。オリゴヌクレオチドJ90（配列認識番号114）、J91（配列認識番号115）、J94（配列認識番号116）、J95（配列認識番号117）、J96とJ97（配列認識番号118）およびJ99とJ98（配列認識番号119）を以下に示す：
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ワクシニアウイルスJEV組換え体の構成
プラスミドJEV24、JEV27、JEV33およびJEV34をvP410感染細胞に移入して、それぞれワクシニア組換え体vP825、vP829、vP857およびvP864を産生した（第18図）。
生体外ウイルス感染および標識付け
ヘラ細胞単層を35mmの直径の皿に調製し、放射線標識付けの前にワクシニアウイルス（細胞当たり2pfuのm.o.i.）またはJEV（細胞当たり5pfuのm.o.i.）に感染せしめた。細胞を35S−Metを含有する培地で瞬間標識し、メイソンらに記載されたように（1991）正確に過剰の未標識Metの存在下で６時間追跡した。
ラジオイムノプレシピテーション、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、およびエンドグリコシダーゼ処理
放射線標識細胞溶解産物と培地液体を収穫し、ウイルスタンパク質をイムノプレシピテーションし、エンドグリコシダーゼで切断し、メイソンにより記載されているように（1989）SDS含有ポリアクリルアミドゲル（SDS−PAGE）中で分離した。
動物保護実験
メイソンらにより記載されているように（1991）、ネズミ保護実験を正確に行なった。手短に言うと、生後３週間のネズミの群を、107pfuのワクシニアウイルス組換え体で腹腔内（ip）注射により免疫化せしめ、３週間後に血清を選択したネズミから集積した。次いでネズミに組換えウイルスを再接種せしめるか、またはJEVのP3菌株に感染した哺乳ネズミ脳の懸濁液を腹腔内により1.3×103LD50で抗原投与した。３週間後、追加免疫した動物をレブル（rebled）し、4.9×105LD50のJEVのP3菌株で抗原投与した。抗原投与に続いて、３週間に亘り毎日ネズミを観察し、実験動物の同腹兄弟を用いて各抗原投与実験において致死救急量滴定を行なった。加えて、抗原投与後４週間後の全ての生存した血清集積した。
組換えウイルスの免疫応答
メイソンらに記載されたよう（1991）に正確に、35S−Met標識JEV感染細胞から得た培養液体または洗浄剤処理細胞溶解産物からのJEVタンパク質を沈殿せしめる能力に関して血清を試験した。NEUT試験においてカルボキシメチルセルロースを重るい培地に用いたことを除いてメイソンらに記載されたよう（1991）に、血球凝集素阻害（HAI）および中和（NEUT）試験を行なった。
組換えワクシニアウイルスの構造
ＣからNS2Bに亘るJEV暗号領域の部分を発現した４つの異なるワクシニア組換え体（HA座における）を構成した。これらの組換えウイルス中に含有されたJEV cDNA配列を第18図に示す。４つの組換えウイルス全てにおいて、JEV cDNAの感覚鎖はワクシニアウイルス初期／晩期H6プロモーターの背後に位置し、翻訳はウイルスcDNA配列の５′末端に位置する自然発生JEV Metコドンから開始されると予期された。
組換え体vP825は、カプシドタンパク質、構造タンパク質前駆体prM、構造糖タンパク質Ｅ、非構造糖タンパク質NS1、および非構造タンパク質NS2Aをコード下（マックエイダら、1987）。組換え体vP829は、prMのアミノ末端に先行する推定15aa信号配列、prMおよびＥをコードした（マックエイダら、1987）。組換え体vP857は、Ｅの30aa疎水性カルボキシ末端、続いてNS1およびNS2AをコードするcDNAを含有した。組換え体vP864は、vP857と同様のタンパク質と追加にNS2BをコードするcDNAを含有した。組換え体vP825とvP829において、Ｅ中の潜在的なワクシニアウイルス初期転写終止信号（TTTTTGT;ヌクレオチド1304−1310）を、aa配列を変更することなくTCTTTGTに変更した。この配列が生体外転写アッセイにおける転写終止を増大するのが示されているので、Ｅの発現の水準を増大せしめるためにこの変更を行なった（ユエンら、1987）。
組換えワクシニアウイルスにより発現される場合には、ＥおよびprMは正確に処理される
瞬間標識実験により、Ｅとサイズが同一のタンパク質が、Ｅ遺伝子を含有する全ての組換えワクシニアウイルスに感染した細胞中で合成されたことが示された（表16）。JEV、vP555およびvP829に感染した細胞において、SDS−PAGE中で遅く移動したＥタンパク質はまた、感染細胞から収穫された培養液体中にも観察された（表16）。JEVおよびvP555感染細胞により産生されたＥの細胞外形状は、vP829感染細胞により産生されたＥの細胞外形状に確認されるように、熟成したＮ連結グリカンを含有した（メイソン、1989;メイソンら、1991）。興味のあることに、prMとＥに加えてＣ暗号領域を含有したvP825は、細胞外液体中に放出されない形状のＥの合成を特定した（表16）。Ｍ（およびprM）に特有なMAbを用いた放射線標識組換えワクシニア感染細胞から調製したイムノプレシピテーションにより、prMはvP555、vP825、およびvP829に感染した細胞中で合成され、ＭはvP555またはvP829に感染した細胞の培養液体中に検出されたことが分かった（表16）。
vP555およびvP829に感染した細胞から収穫した細胞外液体は、vP410、vP825、vP857またはvP864に感染した細胞の培養液体には検出されなかったHA活性を含有した。このHAは、抗JEV抗体とそのpH最適条件によるその阻害に基づいてJEV感染細胞中に産生されたHAと同一であるように思われた（メイソンら、1991）。ワクシニアウイルスJEV組換え体vP829、vP825、vP857およびvP864に感染した細胞からの培養液体に関してショ糖密度勾配を調製した。勾配の分析により、JEV培養液体に見られた遅い沈降血球凝集素（SHA）のピークとともに移動したvP829感染試料のHA活性のピークを同定した（データは示さず）。この結果により、vP829感染細胞は、vP555感染細胞から収穫された培養液体中に観察されたＥおよびＭを含有する空のウイルスエンベロープに同一の細胞外粒子を産生することが示された（表16およびメイソンら、1991）。
組換えワクシニアウイルスにより発現される場合、NS1は正確に処理され分泌される
瞬間標識実験により、真正NS1およびNS1′とサイズが同一なタンパク質がvP555、vP825、vP857およびvP864に感染した細胞中で合成されることが示された。vP555感染細胞により産生されたNS1は、高分子量形状の感染細胞の培養液体中に放出された。NS1はまた、vP857およびvP864感染細胞の培養液体中に放出されるが、一方でNS1は、vP825に感染した細胞からは放出されなかった（表16）。NS2A（vP857）暗号領域またはNS2AおよびNS2B暗号領域を含有する組換えワクシニアウイルスからのNS1の合成の比較により、NS2B暗号領域の存在または不在は、NS1の発現には影響せず、NS2A遺伝子のみがNS1の真正処理に必要であることを示す以前のデータと首尾一貫していることが分かった（ファルゴートら、1989;メイソンら、1991）。
組換えワクシニアウイルスはJEV抗原に対する免疫応答を誘発した
各群から選択した動物から集積した前抗原投与した血清を、放射線標識したＥとNS1をイムノプレイピテーションする能力に関して試験した。これらの研究の結果により以下のことが示された（表16）：（１）Ｅに対して誘発せしめられた免疫応答の大きさは、vP829＞vP555＞vP825であった、（２）NS1およびNS2Aをコードする全てのウイルスはNS1に対する抗体を誘発した、（３）全ての免疫応答は、組換えウイルスの２回目の接種により増大せしめられた。これらの動物から集積した血清に関する中和とHA Iデータの分析により（表17）、イムノプレシピテーション分析の結果が確認でき、RIPにより示されたようにＥに対する免疫応答は、他の血清学的試験と良好に相関関係にあることを示す（表17）。
組換えウイルスによるワクチン接種は致死JEV感染からの保護を提供した
全ての組換えワクシニアウイルスは、JEVの末梢病原P3菌株による致死感染からの保護をネズミに与えることができた（ハング、1982）（表17）。これらの研究によりvP555の保護潜在能力が確認され（メイソンら、1991）vP825とvP829に感染した動物において同様の保護を示した。NS1に対する強い免疫応答を誘発した組換えウイルスvP857およびvP864は、低水準の保護を示したが、これらの組換え体を接種したネズミは、対照ウイルス、vP410を接種したネズミと比較してまだ十分に保護された（表17）。
後抗原投与免疫応答はJEV複製の水準を示す
これらの組換えウイルスを接種した動物の致死抗原投与からの保護の機構をよりよく理解するために、後抗原投与血清における抗体のJEVを認識する能力を評価した。これらの研究に関して、放射線標識したJEV感染細胞の溶解産物に存在する抗原を用い、高度免疫したネズミ（メイソンら、1987a）中の高水準の抗体を誘発するNS3タンパク質に対する応答を試験した。これらの研究結果（表18）は、高水準の保護を誘発した組換えウイルス（vP829、vP555、およびvP825）でワクチン接種した動物の群がNS3に対する低い後抗原投与応答を示したが、一方でNS1のみを発現した組換え体（vP857およびvP864）でワクチン接種した群の生存者からの血清はNS3に対して高い後抗原応答を示したという生存データと相関性がある。
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ワクシニアウイルスJEV組換え体の１回目または２回目の接種後のJEV抗原投与に生存したネズミからの抗原投与21日後の血清（表17）を、JEV HS3に対する抗体の存在について分析した。
JEV遺伝子のワクシニア（NYVAC）供与体プラスミド中へのクローニング
プラスミドpMP2VCL（K1L宿主範囲遺伝子の上流のワクシニア配列内のポリリンカー領域を含有する）をポリリンカー内のHind IIIとXho Iで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドSPHPRHA ＡからＤと連結し、Hind III部位、H6プロモーター−124から−１（パーカスら、1989）、並びにXho I、Kpn I、Sma I、Sac IおよびEcoR I部位を含有するSP126を産生した。
プラスミドpSD544VC（ポリリンカー領域と置換されたHA遺伝子の部位を包囲するワクシニア配列および６つの読取り枠中の翻訳終止コドンを含有する）をポリリンカー領域内のXho Iで切断し、DNAポリメラーゼＩのクレノウ断片を充填し、アルカリ性ホスファターゼで処理した。SP126をHind IIIで切断し、クレノウで処理し、Sma Iの切断によりH6プロモーターを単離した。H6プロモーター断片のpSD544VCへの連結により、ポリリンカー領域（HA転写方向内）にH6プロモーターを含有したSPHA−H6を産生した。
プラスミドJEVL14VCをH6プロモーター内のEcoR VとJEV配列内のSac I（ヌクレオチド2124）で切断し、1789bp断片を単離した。JEVL14VC（メイソンら、1991）をT5NT後のEag I部位でのEcl XIで切断し、DNAポリメラーゼＩのクレノウ断片で充填し、JEV配列内のSac I（ヌクレオチド2124）で切断し、2005bp断片を産生した。1789bp EcoR V−Sac Iおよび2005bp（Sac I充填Ecl XI）断片をEcoR V（H6内）に連結し、Sma I（ポリリンカー内）で切断し、SPHA−H6をアルカリ性ホスファターゼ処理しJEV35を産生した。JEV35をvP866（NYVAC）感染細胞中に移入し、ワクシニア組換え体vP908を産生した（第18図）。
JEV35をSac I（JE配列ヌクレオチド2124内）とEcl XI（T5NTの後）で切断し、5497bp断片を単離し、JEV25のSac I（JEVヌクレオチド2124）からEag I断片（Ｅの残りの３分の２、翻訳終止およびT5NTを含有する）に連結し、JEV36を産生した。JEV36をvP866（NYVAC）感染細胞中に移入し、ワクシニア組換え体vP923を産生した（第18図）。SPHPRHA ＡからＤオリゴヌクレオチドSPHPRHA:A＋Ｂ（配列認識番号120）およびSPHPRHA:C＋Ｄ（配列認識番号121）を以下に示す
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YFワクシニア組換えウイルス（クローン10IIIおよびクローン28III）を構成するのに用いたYF17D cDNAクローンをチャールスライス（MO、セントルイス、ワシントン大学スクールオブメディスン）から得た。全てのヌクレオチド座標はライスら1985に存在した配列データから誘導した。
カルボキシ末端80％prM、Ｅおよびアミノ末端80％NS1（ヌクレオチド537−1659）をコードするYF cDNAを含有するプラスミドYF0を、YF cDNAのAva IからNsi I断片（ヌクレオチド537−1659）とYF cDNAのNsi IからKpn I断片（ヌクレオチド1660−3266）をAva IとKpn Iで切断したIBI25（CT、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）中にクローニングすることにより誘導した。Ｃおよびアミノ末端20％prMをコードするYF cDNAを含有するプラスミドYF1を、YF cDNAのRsa IからAva I断片（ヌクレオチド166−536）とアニールしたオリゴヌクレオチドSP46とSP47（不能Hind III粘着末端、Xho IとCla I部位およびYFヌクレオチド119−165を含有する）をAva IとHind IIIで切断したIBI25中にクローニングすることにより誘導した。Ｅのカルボキシ末端60％とNS1のアミノ末端25％をコードするYF cDNAを含有するプラスミドYF3を、YF cDNAのApa IからBamH I断片（ヌクレオチド1604−2725）をApa IとBamH Iで切断したIBI25中にクローニングすることにより産生した。カルボキシ末端20％NS1、NS2a、NS2Bおよびアミノ末端20％NS3をコードするYF cDNAを含有するプラスミドYF8を、YF cDNAのKpn IからXbn I断片（ヌクレオチド3267−4940）をKpn IとXba Iで切断したIBI25中にクローニングすることにより誘導した。カルボキシ末端60％NS2Bおよびアミノ末端20％NS3をコードするYF cDNAを含有するプラスミドYF9を、YF cDNAのSac IからXba I断片（ヌクレオチド4339−4940）をSac IとXba Iで切断したIBI25中にクローニングすることにより産生した。Ｃのカルボキシ末端25％、prMおよびＥのアミノ末端40％をコードするYF cDNAを含有するプラスミドYF13を、YF cDNAのBal IからApa I断片（ヌクレオチド384−1603）をApa IとSma Iで切断したIBI25中にクローニングすることにより誘導した。
オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発（クンケル、1985）を用いて、以下の潜在的なワクシニアウイルス初期転写終止信号（ユエンら、1987）（１）YF1中のＣ遺伝子のアミノ末端からの49aa（TTTTTCTヌクレオチド263−269およびTTTTTGTヌクレオチド269−275）を（配列認識番号122）TTCTTCTTCTTGTに変更してプラスミドYF1Bを産生し、YF3中のＥ遺伝子において（ヌクレオチド1886−1893TTTTTGTからカルボキシ末端からのTTCTTTGT189aaおよびヌクレオチド2429−235TTTTTGTをカルボキシ末端からのTTCTTGT8aa）に変更することにより、それぞれYF3BとYF3Cを産生した。YF3CからのPst IからBamH I断片（ヌクレオチド1965−2725）をYF3Bの対応断片と交換し、両者とも突然変異誘発転写終止信号を有するカルボキシ末端60％Ｅとアミノ末端25％NS1をコードするYF cDNAを含有するYF4（ヌクレオチド1604−2725）を産生した。YF4からのApa IからBamH I断片（ヌクレオチド1604−2725）をYF0中の相当領域と置換して、両者とも突然変異誘発転写終止信号を有するカルボキシ末端80％prM、Ｅとアミノ末端80％NL1をコードするYF cDNAを含有するYF6（ヌクレオチド537−3266）を産生した。プラスミドYF6をIBI25内のEcoR Vとヌクレオチド537でのAva Iで切断し、YF1BからのEcoR VからAba I断片（IBI25内のEcoR Vからヌクレオチド536でのAva I）と連結し、119にXho IおよびCla I部位並びに４つの突然変異誘発終止信号を有するＣからNS1のアミノ末端80％をコードするYF cDNAを含有するYF2（ヌクレオチド119−3266）を産生した。
上述したオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、（１）Ｅのカルボキシ末端からのATG17aaに先行するXho IおよびCla I部位（ヌクレオチド2402−2404）をプラスミドYF3Cに挿入してYF5を産生し、（２）prMのカルボキシ末端からのあTG19aaに先行するXho IおよびCla I部位（ヌクレオチド917−919）をプラスミドYF13に挿入してYF14を産生し、（３）Ｅのカルボキシ末端からのATG23aaに先行するXho I部位（ヌクレオチド2384−2386）をプラスミドYF3Cに挿入してYF25を産生し、（４）Ｃのカルボキシ末端からのATG21aaおよびXho I部位（ヌクレオチド419）をプラスミドYF1に挿入してYF45を産生した。
YF5からのApa IからBamH I断片（ヌクレオチド1604−2725）をYF0の対応領域と交換して、2402でXho IおよびCla I部位（Ｅのカルボキシ末端からの17aa）並びに2429−2435での突然変異誘発転写信号（Ｅのカルボキシ末端からの8aa）を有するカルボキシ末端80％prM、Ｅおよびアミノ末端80％NS1をコードするYF cDNAを含有するYF7（ヌクレオチド537−3266）を産生した。YF25からのApa IからBamH I断片（ヌクレオチド1604−2725）をYF0の対応領域と交換して、2384でXho I部位（Ｅのカルボキシ末端からの23aa）および2428−2435での突然変異誘発転写終止信号（Ｅのカルボキシ末端からの8aa）を有するカルボキシ末端80％prM、Ｅおよびアミノ末端80％NS1をコードするYF cDNAを含有するYF26（ヌクレオチド537−3266）を産生した。
YF14からのAva IからApa I断片（ヌクレオチド537−1603）をYF6の対応領域と交換して、ヌクレオチド917でXho IおよびCla I部位（prMのカルボキシ末端からの19aa）および２つの突然変異誘発転写終止信号を有するカルボキシ末端80％prM、Ｅおよびアミノ末端80％NS1をコードするYF cDNAを含有するYF26（ヌクレオチド537−3266）を産生した。YF6をIBI25内のEcoR VとYF内のヌクレオチド537でのAva Iで切断し、YF45のEcoR V（IBI25内）からAva I断片に連結して419でXho I部位（Ｃのカルボキシ末端からの21aa）および除去し２つの転写終止信号を有するＣからアミノ末端80％NS1をコードするYF cDNAを含有するYF46（ヌクレオチド119−3266）を産生した。
上述したオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、NS2Bのカルボキシ末端でのSma I部位（ヌクレオチド4569）をプラスミドYF9に挿入してYF11を産生し、NS2Aのカルボキシ末端のSma I部位（ヌクレオチド4180）をプラスミドYF8に挿入してYF10を産生した。YF11からのSac IからXba I断片（ヌクレオチド4339−4940）およびYF8からのAsp718からSac I断片（ヌクレオチド3262−4338）をAsp718とXba Iで切断したIBI25に連結して、NS2Bのカルボキシ末端の後にあるSma I部位（ヌクレオチド4569）を有するカルボキシ末端20％NS1、NS2A、NS2Bおよびアミノ末端20％NS2BまをコードするYF cDNAを含有するYF12（ヌクレオチド3262−4940）を産生した。
YF遺伝子のpHESシステムワクシニアウイルス供与体プラスミドへのクローニング
YFクローニング配列のNYVAC供与体プラスミドへの挿入の前に、YF暗号配列をワクシニアプラスミドpHES4に挿入した（パーカスら、1989）。カルボキシ末端20％NS1、NS2AおよびNS2BをコードするYF12からのKpn IからSma I断片（ヌクレオチド3267−4569）、19aaprM、Ｅおよびアミノ末端80％NS1をコードするYF15からのXho IからKpn I断片（ヌクレオチド917−3266）およびXho I−Sma Iで切断したpHES4を連結してYF23を産生した。23aaE、アミノ末端25％NS1をコードするYF26からのXho IからBamH I断片（ヌクレオチド2384−2725）をYF23（カルボキシ末端75％NS1、NS2AおよびNS2B、複製の起点並びにワクシニア配列を含有する）からのXho IからBamH Iと連結してYF28を先生した。
Xho I−Sma I切断したpHES4を、17aaEおよびアミノ末端80％NS1をコードするYF7からのXho IからKpn I断片（ヌクレオチド2402−3266）およびカルボキシ末端20％NS1およびNS2AをコードするYF10からのKpnからSma I（ヌクレオチド3267−4180）を連結することにより、YF18を産生した。Ｃ、prM、Ｅおよびアミノ末端25％NS1をコードするYF2からのXho IからBamH I断片をYF18のXho IからBamH I断片（カルボキシ末端75％NS1およびNS1A、不正の起点並びにワクシニア配列を含有する）に連結し、YF19を産生した。YF2からの同一のXho IからBamH I断片をYF28からのXho IからBamH I断片（カルボキシ末端75％NS1およびNS2A、複製の起点並びにワクシニア配列を含有する）に連結し、YF20を産生した。21aaC、prM、Ｅおよびアミノ末端25％NS1をコードするYF46からのXho IからBamH I断片（ヌクレオチド419−2725）をYF18からのXho IからBamH I断片と連結し、YF47を産生した。オリゴヌクレオチドSP46（配列認識番号123）およびSP（配列認識番号124）は以下のとおりである：
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組換え体YFワクシニアウイルスの構成
ＣからNS2Bに亘るYF暗号領域の部分を発現した５つの異なるワクシニアウイルス組換え体を、宿主範囲選択システムを用いて構成した（パーカスら、1989）。プラスミドYF18、YF23、YF20、YF19およびYF47をvP293感染細胞中に移入し、ワクシニア組換え体vP725、vP729、vP764、vP766およびvP869を産生した。これらの組換え体中に含まれたYF cDNA配列を第19図に示す。５つの組換えウイルス全てにおいて、YF cDNAの間隔鎖は、ワクシニアウイルス初期／晩期H6プロモーターの背後に位置し、翻訳は、ウイルスcDNA配列の５′末端に位置するMetコドンから開始すると予期された（第19図）。
組換え体vP725は、非構造タンパク質NS1のＮ末端に先行する推定17−aa信号配列および非構造タンパク質NS1とNS2Aをコードした（ライスら、1985）。組換え体vP729は、ＥのＮ末端に先行する推定19−aa信号配列、Ｅ、NS1、NS2AおよびNS2Bをコードした（ライスら、1985）。組換え体vP764は、Ｃ、prM、Ｅ、NS1、NS2AおよびNS2Bをコードした（ライスら、1985）。組換え体vP766は、Ｃ、prM、Ｅ、NS1およびN2SAをコードした（ライスら、1985）。組換え体vP869は、prM構造タンパク質前駆体のＮ末端に先行する推定21−aa信号配列、並びにprM、Ｅ、NS1、およびNS2Aをコードした（ライスら、1985）。
致死YF抗原投与からの保護
vP869は、他の組換え体に感染した培養液体中に見られなかったHA活性を分泌した。このHAは、抗YF抗体により抑制とpH最適条件に基づいてYF感染細胞中に産生されたHAと同一であるように思われた。
生後３週間のネズミに、107pfuのvP869、vP764、またはYF−17Dを腹腔内に接種し、３週間後に100LD50のYFのフレンチ神経親和性菌株を抗原投与した。vP869は著しい保護を提供したが（表19）一方でvP764は、YF遺伝子を欠如した対照ワクシニアウイルスよりも良好な保護を提供しなかった（vP457）。
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YF遺伝子のNYVAC供与体プラスミド中へのクローニング
21アミノ酸Ｃ、prM、Ｅ、NS1、NS2A（NS1が掛けたヌクレオチド2962を有する）をコードするYF cDNAを含有するYF47からのXho IからSma I断片（ヌクレオチド419−4180）をXho I−Sma Iで切断したSPHA−H6（HA領域供与体プラスミド）と連結し、YF48を産生した。YF48をSac I（ヌクレオチド2490）で切断し、Asp718（ヌクレオチド3262）で部分的に切断し、6700bp断片を単離し、（複製のプラスミド起点、ワクシニア配列、21アミノ酸Ｃ、prM、Ｅ、アミノ末端3.5％NS1、カルボキシ末端23％NS1、NS2Aを含有する）YF18からのSac I−Asp718断片（2962に存在する塩基とともにNS1の残りを含有する）に連結し、YF51を産生した。オリゴヌクレオチド定方向二本鎖開裂突然変異誘発（マンデッキ、1986）を用いて、YF51中の特有のXho I部位に対応する6bpを除去し、HA座供与体プラスミド中にYF21アミノ酸Ｃ、prM、Ｅ、NS1、NS2Aをコードするプラスミドを産生した。供与体プラスミドYF50をvP866（NYVAC）感染細胞中に移入してワクシニア組換え体vP984を産生した。
オリゴヌクレオチド定方向二本鎖開裂突然変異誘発を用いて、YF48中の特有のXho I部位に対応する6bpを除去してYF49を産生した。オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、Ｅのカルボキシ末端でのSma I部位をYF4中に挿入し、YF16を産生した。YF49のApa I−Sma I断片（21アミノ酸Ｃ、prMおよびアミノ末端43％ＥをコードするYF cDNA、並びに複製のプラスミド起点、ワクシニア配列を含有する）をYF16からのApa I−Sma I断片（カルボキシ末端57％Ｅを含有するヌクレオチド1604−2453）に連結し、HA座にＥ、prM、Ｃの21アミノ酸を含有するYR53を産生した。供与体プラスミドYF53をvP913（NYVAC−MV）に感染した細胞中に移入してワクシニア組換え体vP997を産生した。
１型デング熱のワクシニアウイルス供与体プラスミド中へのクローニング
カルボキシ末端84％NS1およびアミノ末端45％NS2AをコードするDEN cDNAを含有するプラスミドDEN1（ヌクレオチド2559−3745、メイソンら、1987b）を、DEN cDNAのEcoR I−Xba I断片（ヌクレオチド2559−3740）およびアニールしたオリゴヌクレオチドDEN1（配列認識番号125）とDEN2（配列認識番号126）（Xba I粘着末端、翻訳終止コドン、T5ATワクシニアウイルス初期転写終止信号（ユエンら、1987）、Eag I部位およびHind III粘着末端を含有する）をHind III−EcoR Iで切断したpUC8中にクローニングすることにより誘導した。DEN1からのEcoR I−Hind III断片（ヌクレオチド2559−3745）およびＥのカルボキシ末端36％とアミノ末端16％NS1をコードするDEN cDNAのSac I−EcoR IをHind III−Sac Iで切断したIBI24（CT、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）に連結し、カルボキシ末端64％Ｅからアミノ末端45％NS2Aをコードし、NS1に塩基の欠けた（ヌクレオチド2467）DEN3を産生した。
Hind III−Xba Iで切断したIBI24をアニールしたオリゴヌクレオチドDEN9（配列認識番号127）およびDEN10（配列認識番号128）［Hind III粘着末端、Sma I部位、DENヌクレオチド377−428（メイソンら、1987b）およびXba I粘着末端を含有する］に連結し、SPD910を産生した。SPD910をSac I（IBI24内）とAva I（ヌクレオチド423のDEN内）で切断し、DEN cDNAのAva I−Sac I断片（ヌクレオチド424−1447メイソンら、1987）に連結し、カルボキシ末端11aaC、prMおよびアミノ末端36％ＥをコードするDEN4を産生した。
カルボキシ末端64％Ｅおよびアミノ末端18％NS1をコードするDEN cDNAを含有するプラスミドDEN6（ヌクレオチド2467が存在するヌクレオチド1447−2579、メイソンら、1987b）を、DEN cDNAのSac I−Xho I断片をIBI25（CT、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）中にクローニングすることにより誘導した。DEN5′未翻訳領域の51塩基、Ｃ、prMおよびアミノ末端36％ＥをコードするDEN cDNAを含有するプラスミドDEN15を、DEN cDNAのHind III−Sac I断片（ヌクレオチド20−1447、メイソンら、1987b）をHind III−Sac Iで切断したIBI25中にクローニングすることにより誘導した。カルボキシ末端55％NS2Aおよびアミノ末端28％NS2BをコードするDEN cDNAを含有するプラスミドでN23を、DEN cDNAのXba I−Sph I断片をXbai−Sph Iで切断したIBI25中にクローニングすることにより誘導した。カルボキシ末端55％NS2A、NS2Bおよびアミノ酸NS3をコードするDEN cDNAを含有するプラスミドDEN20（ヌクレオチド3745−4563）を、DEN cDNAのXba IからEcoR I断片をXba I−EcoR Iで切断したIBI25中にクローニングすることにより誘導した。
オリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発（クンケル、1985）を用いて以下の潜在的なワクシニアウイルス初期転写終止信号を変更せしめた（ユエンら、1987）。DEN4中のprM遺伝子における２つのT5NT配列、（１）カルボキシ末端からの29aa（ヌクレオチド822−828TTTTTCTをTATTTCTに）および（２）カルボキシ末端からの13aa（ヌクレオチド870−875TTTTTAからTATTTATに）を突然変異誘発せしめてプラスミドDEN47を産生した。DEN6中のNS1遺伝子における単一のT5NT配列、アミノ末端からの17aaを突然変異誘発せしめて（ヌクレオチド2448−2454TTTTTGTからTATTTGTに）プラスミドDEN7を産生した。
上述したようにオリゴヌクレオチド定方向突然変異誘発を用いて、（１）NS2Aのカルボキシ末端でのEag IとEcoR I部位（ヌクレオチド4102）をプラスミドDEN23に挿入してDEN24を産生し、（２）Ｅのカルボキシ末端らのATG15aaとSma I部位をDEN7（ヌクレオチド2348）に挿入してDEN10を産生し、（３）NS2Bのカルボキシ末端でのEag IとHind III部位（ヌクレオチド4492）をプラスミドDEN20に挿入してプラスミドDEN21を産生し、そして（４）プラスミドDEN15中のヌクレオチド63−67をワクシニアウイルス初期／晩期H6プロモーター（位置−１から−21、パーカスら、1989）と置換してDEN16（DENヌクレオチド20−59、EcoR V部位からH6プロモーターの−１およびDENヌクレオチド68−1447を含有する）を産生した。
DEN7からのSac I−Xho I断片（ヌクレオチド1447−2579）を、DEN13中の対応領域と置換して、カルボキシ末端64％Ｅとアミノ末端45％NS2AをコードするDEN cDNAを含有し（ヌクレオチド1447−3745）、ヌクレオチド2467が存在し修飾転写終止信号（ヌクレオチド2448−2454）を有するDEN19を産生した。DEN19からのXho I−Xbai断片（ヌクレオチド2579−3745）およびDEN24からのXba I−Hind III断片（Xba Iヌクレオチド3745DENからIBI24中のHind III）をXho I−Hind IIIで切断したIBI25に連結して、カルボキシ末端82NS1、NS2Aおよびアミノ末端28％NS2BをコードするDEN cDNAを含有し（ヌクレオチド2579−4213）、4102でのEag I部位、ヌクレオチド2467が存在し、突然変異誘発転写終止信号を有する（ヌクレオチド2448−2454）DEN25を産生した。DEN19からのXho I−Xba I断片（ヌクレオチド2579−3745）をXho I（IBI25内）とXba I（DENヌクレオチド3745）で切断したDEN21に連結し、カルボキシ末端82％NS1、NS2A、NS2Bおよびアミノ末端24aaNS3をコードし（ヌクレオチド2579−4564）、ヌクレオチド2467が存在し、修飾転写終止信号（ヌクレオチド2448−2454）および4492でのEag I部位を有するDEN22を産生した。
DEN16からのHind III−Pst I断片（ヌクレオチド20−494）をDEN47からのHind III−Pst I断片（Ｅのカルボキシ末端83％prMとアミノ末端36％ヌクレオチド494−1447および複製のプラスミド起点をコードする）と連結し、Ｃ、prMおよびアミノ末端36％Ｅ並びにＣのアミノ末端に先行するEcoR V部位とH6プロモーターの部分をコードするDEN17を産生した。
カルボキシ末端13aaC、prMおよびアミノ末端36％ＥをコードするDEN17からのHind III−Bgl II断片（ヌクレオチド370−1447）をアニールしたオリゴヌクレオチドSP111およびSP112（不能Hind III粘着末端、EcoR V部位からH6プロモーターの−１、およびBgl II粘着末端を有するDENヌクレオチド350−369）に連結し、EcoR V部位からH6プロモーターの−１、カルボキシ末端20aaC、prMおよびアミノ末端36％ＥをコーするDEN33を産生した。
Sma I−Eag Iで切断したpTP15（メイソンら、1991）を、カルボキシ末端11aaC、prMおよびアミノ末端36％ＥをコードするDEN4からのSma I−Sac I断片（ヌクレオチド377−1447）と、カルボキシ末端64％Ｅ、NS1およびアミノ末端45％NS2AをコードするDEN3からのSac I−Eag I断片とに連結し、DENLを産生した。カルボキシ末端64％Ｅおよびアミノ末端18％NS1をコードするDEN7からのSac I−Xho I断片（ヌクレオチド1447−2579）を、DEN47からのBstE II−Sac I（カルボキシ末端55％prMおよびアミノ末端36％Ｅヌクレオチド631−1447をコードする）とDENLからのBstE II−Xho I断片（カルボキシ末端11aaC、アミノ末端45％prM、カルボキシ末端82％NS1、カルボキシ末端NS2A、複製の起点およびワクシニア配列をコードする）とに連結し、DEN8を産生した。オリゴヌクレオチド定方向二本鎖開裂突然変異誘発（マンデッキ、1986）を用いて特有のSma I部位（H6プロモーターとATGの間に位置する）を除去し、H6プロモーターが直後ATG開始コドンに先行するDEN8VCを産生した。
DEN17からのEcoR V−Sac I断片（位置−21から−1H6プロモーターDENヌクレオチド68−1447）をDEN8VCのEcoR V−Sac I断片（ワクシニア配列、−21から−124のH6プロモーター、複製の起点およびアミノ末端64％Ｅ、NS1、アミノ末端45％NS2Aヌクレオチド1447−3745）に連結し、DEN18を産生した。DEN25からのXho I−Eag I断片（ヌクレオチド2579−4102）をDEN18のXho I−Eag I断片（複製の起点、ワクシニア配列およびDEN Ｃ、prM、Ｅおよびアミノ末端18％NS1を含有する、ヌクレオチド68−2579）に連結し、DEN26を産生した。DEN8VCからのEcoR V−Sac I断片（位置−21から−1H6プロモーター、ヌクレオチド377−1447）をDEN26からのEcoR V−Sac I断片（カルボキシ末端64％Ｅ、NS1およびNS2Aをコードしヌクレオチド2894でNS1に塩基の欠けたDEN領域、複製の起点およびワクシニア配列を含有する）に連結し、DEN32を産生した。DEN32をvP410に感染した細胞中に移入して組換え体vP867を産生した（第20図）。
DEN10からのSac I−Xho I断片（ヌクレオチド1447−2579）をDEN3中の対応領域と置換して、カルボキシ末端64％Ｅ、NS1およびアミノ末端45％NS2Aをコードし、Ｅのカルボキシ末端からのATG15aaとSma I部位を有するDEN cDNAを含有するDEN11を産生した。DEN11からのSma I−Eag I断片（カルボキシ末端15aaE、NS1およびアミノ末端45％NS2Aをコードする、ヌクレオチド2348−3745）をSma I−Eag Iで切断したpTP15に連結し、DEN12を産生した。
DEN22からのXho I−Eag I断片（ヌクレオチド2579−44929を上述したDEN18からのXho I−Eag I断片に連結して、DEN27を産生した。DEN12からのEcoR V−Pst I断片（位置−21から−1H6プロモーターDEN、ヌクレオチド2348−3447）を、DEN27からのEcoR V−Pst I断片（複製の起点、ワクシニア配列、H6プロモーター−21から−124およびNS2AとNS2BをコードするDEN cDNAを含有する）に連結し、DEN31を産生した。
DEN8VCからのEcoR V−Xho I断片（カルボキシ末端11aaC、prM Ｅ、アミノ末端18％NS1をコードする位置−21から−1H6プロモーターDENヌクレオチド）をDEN31からのEcoR V−Xho I−断片（カルボキシ末端82％NS1、NS2A、NS2Bをコードし、位置2894でNS1に塩基が存在するDEN cDNA、ワクシニア配列および複製の起点を含有する）に連結し、DEN35を産生した。DEN35をvP410感染細胞中に移入して組換え体vP955を産生した（第20図）。DEN33からのEcoR V−Sac I断片（カルボキシ末端20aaC、prMおよびアミノ末端36％Ｅをコードする位置−21から−1H6プロモーターDENヌクレオチド350−1447）およびDEN32からのSac I−Xho I断片（カルボキシ末端64％Ｅおよびアミノ末端18％NS1ヌクレオチドをコードする）を上述したDEN31からのEcoR V−Sac I断片に連結し、DEN34を産生した。DEN34をvP410に感染した細胞中に移入して、組換え体vP962を産生した（第20図）。オリゴヌクレオチドDEN1（配列認識番号125）、DEN2（配列認識番号126）、DEN9（配列認識番号127）、DEN10（配列認識番号128）、SP111（配列認識番号129）、およびSP（配列認識番号130）を以下に示す：
Figure 0003602530
実施例17−修飾NYVACウイルスの構成
ワクシニアの左側末端に近い［C7L−K1L］欠損のサイズを異なる程度に増大せしめ、右側末端に近い欠損を導入することにより、NYVACを修飾した。全ての欠損は、E.coliグアニンホソホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子とミコフェノール酸を一過性選択システムで使用することにより行なった。
一過性優性選択
環状供与体プラスミドを用いて、リン酸カルシウム沈殿プラスミドDNAをワクシニア感染ベロ細胞へ移入する標準方法によりワクシニアウイルスの組換えを行なった。24時間後、感染細胞を収穫して、溶解産物を１マイクログラム/mlのミコフェノール酸（MPA）の存在下で平板培養した。個々のプラークを採取してMPAの存在下でベロ細胞上で増幅した。ウイルスを収穫して、MPAが存在しない条件でプラークの採取を２回行なってプラークを精製した。MPAなくして各回で採取したプラークをベロ細胞上で平板培養し、適切な遺伝子の存在下でフィルターをハイブリダイゼーションした。
NYVAC.1.
vP866（NYVAC）中に存在する［C7L−K1L］欠損を、隣の２つのORFから右側のK2LおよびK3Lを含有するように拡張せしめた。K2L ORFに関する推定の翻訳産生物は、セリンプロテアーゼ阻害剤の類に対する相同性を示す（ボースネル、1988）。しかしながら、ワクシニアゲノムのこの領域の転写地図作成は発現されない（マルガン、1984）。
K3Lの翻訳産生物は、セリン（アミノ酸51）ホスホリル化部位に亘り重複する87アミノ酸に亘る真核性阻害因子２アルファ（eIF−２アルファ）に対して28％の相同性を示す。eIF−２アルファのホスホリル化は、インターフェロンにより誘発された抗ウイルス状態における段階であり、ワクシニアがインターフェロンの効果を回避する機構には、ワクシニアK3L遺伝子産生物が必要であることを示す。ワクシニアのコペンハーゲン菌株からのK3L遺伝子を欠損せしめた（ビーティーら、1991）。産生したウイルスは、タンパク質合成のウイルス誘発の阻害とウイルス複製の阻害により測定されるような生体外インターフェロンに対して増大した感度を示した。これにより、ワクシニアウイルスからのK3Lの欠損は、ワクチン接種の合併症の場合にはインターフェロンにより制御されるより安全なワクチン菌株となることが示される。
C7LからK3Lが欠損したプラスミドpMPC7K3GPTの構成
［C7L−K3L］欠損を側腹に有する左右ワクシニアアームを別々に組み立てた。左アームをpSD420から誘導して（バーカスら、1990）、中間欠損プラスミドpMP256/257中に組み立てた（パーカスら、1991）。合成オリゴヌクレオチドNPSYN379（配列認識番号131）、MPSYN380（配列認識番号132）
Figure 0003602530
を、テンプレートとしてプラスミドpSD420を用いたPCR反応におけるプライマーとして用いた。差錬成した0.14kb断片をHind III/Bgl IIで切断し、pMP256/257に挿入して、プラスミドの左アームを置換した。産生したプラスミドをpMP379/380と称した。0.7kb Sal I/BamH I断片をpSD420から単離して、Sal I/BamH Iで切断したpMP379/380に連結し、プラスミドpMPC7F4を形成した。
K3Lの右側の配列を含有する右側欠損接合部を構成するために、合成オリゴヌクレオチドMPSYN381/MPSYN382（配列認識番号133/配列認識番号134）
Figure 0003602530
をアニールしてBamH I/EcoR Iで切断したpUC8に連結し、プラスミドpMP381/382を形成した。1.0kb Hpa I（部分的）/EcoR V断片をクローニングしたワクシニアHind III Ｋから単離して、pP381/382に連結し、全縁右側ワクシニアフランキングアームを含有するプラスミドpMPK3Rを形成した。左側ワクシニアフランキングアームを0.8kb Bgl II（部分的）/Hind III断片としてのpMPC7F4から単離して、BamH I/Hind IIIで切断したpMPK3Rに挿入した。産生したプラスミド、pMPC7K3は、14遺伝子［C7L−K3L］が欠損している。
選択可能なマーカーとしての使用のために、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）をコードするE.coli遺伝子（プラットら、1983）を、ポックスウイルスプロモーターの制御下で配した。昆虫ポックス42kDaタンパク質をコードする遺伝子から直接上流の31bpプロモーター要素は、感染後の初期に組換えワクシニアウイルスの強力な真プロモーターとして機能できる。31bp EPV42kDaプロモーターを含有するアニールした合成オリゴヌクレオチドNPSYN369/370（配列認識番号135/配列認識番号136）
Figure 0003602530
を、pBS−SKバックグラウンドのEcogpt遺伝子ら上流に連結し、プラスミドpMP42GPTを産生した。42kDaプロモーター/Ecogpt遺伝子発現カセッテを含有するSma I断片をpNP42GPTから単離して、pUC/ワクシニア接合部でのSma I部位のワクシニア欠損プラスミドpMPC7K3に挿入した。産生したプラスミド、pMPC7K3GPTをvP866（NYVAC）中に移入した。一過性優性選択システムにおける組換えの中間産生物の選択に関して培養培地にミコフェノール酸を用いた（フォークナーら、1990）。選択的な圧力の除去後に、K2L DNA配列の損失したプラークハイブリダイゼーションとK4Lの保持により、後代ウイルスをスクリーニングした。欠損接合部の適合度をPCRおよびDNA制限および配列分析により確認した。組換えワクシニアウイルスvP954（NYVAC.1.）は、［C7L−K3L］欠損、並びにNYVACに存在する他の欠損（TK、HA、ATI、I4L、［B13−B14］）も含有する。
NYVAC.2.
NYVACに存在する［C7L−K1L］欠損を、38のORF、［C23L−Ｆ」4L］の合計を含有するように両方向に拡張した。これは以前にワクシニア欠損変異体vP796に報告した同一の欠損である（パーカスら、1991）。拡張した欠損領域で除去した著しいORFは、NYVAC欠損の左側に位置するワクシニア成長因子（VGF;C11R）をがんゆうする。VGFの２つのコピーをがんゆうするワクシニアのWR菌株と対称的に、C11Rは、ワクシニアのコペンハーゲン菌株中のVGFをコードする唯一ORFである。WRからのワクシニア成長因子の両方のコピーの欠損は、家ウサギの皮内接種で皮膚の外傷のひどさを除去し、ネズミのウイルスの神経毒性を減少することが示されている（バラーら、1988）。［C23L−F4L］欠損における右側のORF、F4Lは、リボヌクレオチドレダクターゼの小さなサブユニットの遺伝子をコードする（スラボーら、1988）。この欠損にはORF R2Lが含まれ、これは、E.coli dUTPase、ヌクレオチド配列に必要な別の酵素に対する相同性を示す（ゲーベルら、1990a、ｂ）。F2Lまたはレトロウイルスプロテアーゼに対する相同性を示す（スラボーら、1989）。
C23LからF4Lの欠損したプラスミドpMPTRF4GPTの構成
ワクシニア欠損変異体vP796の産生に中間体として使用したプラスミドpMPLENDΔ（バーカスら、1991）を、pUC/ワクシニア接合部でEPV42kDaプロモーター/Ecogpt遺伝子を含有するSma I発現カセッテを添加することにより変更した。産生したプラスミド、pMPTRF4GPTをNYVAC中に移入した。MPAを用いた選択後に、F4L DNA配列の損失のためのプラークハイブリダイゼーションとF5Lの保持によりスクリーニングした。PCRおよびDNA制限分析により、欠損接合部の適合度を確認した。組換えウイルスvP938（NYVAC.2.）は、［C23L−F4L］欠損並びにNYVAC中に存在する他の欠損を含有する。
ORF B13R−B29Rの欠損
NYBAC中に存在するｕ欠損［B13R−B14R］を、右側の全てのORF、17のORF［B13R−B29R］の合計を含有するように拡張せしめた。これは、以前に報告したワクシニア欠損変異体vP759中の同一の欠損である（パーカスら、1991）。拡張欠損領域は、その産生物が互いに20％のアミノ酸同一性を示す２つの遺伝子を含有する（スミスら、1991）。これらの遺伝子産生物をコードするORFは、コペンハーゲンのB16RとB19Rを示し（ゲーベルら、1990a、ｂ）、これらはそれぞれWR菌株中のORF B15RとB18Rに対応する（スミスら、1991）。両方の遺伝子産生物が典型的な信号配列を含有するワクシニアのWR菌株とは違って、コペンハーゲンORF B16の予期した翻訳産生物をアミノ末端で切断されている。B19Rは、感染後初期に発現されたワクシニア表面タンパク質（Ｓ抗原）をコードした（ウエダら、1990）。B16RとB19Rの両者は、免疫グロブリン上科、特にIL−１受容体に対する相同性を示す。ワクシニア遺伝子産生物の１つまたは両方は、ワクシニアが、シトキン（cytokines）を結合せしめ、それゆえ宿主炎症応答を減少せしめることにより免疫システムを避けるのを助けることが示唆されている（スミスら、1991）。
B13RからB29Rの欠損したプラスミドpNPTRB13GPTの構成
ワクシニア欠損変異体vP759およびvP811の産生に中間体として用いたプラスミドpMPRENDΔ（パーカスら、1991）を、pUC/ワクシニア接合部でEPV42kDaプロモーター/Ecogot遺伝子を含有するSma I発現カセッテの添加により変更した。産生したプラスミド、pMPTRB13GPTをNYVAC中に移入した。MPAを用いた選択の後に、B15DNA配列の損失したプラークハイブリダイゼーションとB12の保持により、後代ウイルスをスクリーニングした。PCRとDNA制限分析により欠損接合部の適合度を確認した。組換えウイルスvP953は、［B13R−B29R］欠損並びにNYVAC中に存在する他の欠損を含有する。
左側［C23L−F4L］欠損と右側［B13R−B29R］欠損の結合
ワクシニアウイルスの左側［C23L−F4L］と右側［B13R−B29R］末端の両方で欠損を含有する、真ワクシニア欠損変異体vP811の産生を記載した（パーカスら、1991）。vP811は、ワクシニア宿主範囲遺伝子、C7Lおよび選択可能マーカーEcogptの両者を含有する。NYVACバックグラウンド中にC7LまたはEcogptを有さない巨大末端欠損を含有するウイルスを産生するために、vP953による組換えの供与体プラスミドとしてpMPTRF4GPTを用いた。後代ウイルスは上述した一過性優性選択システムにおいてMPAにより選択され、F4L DNA配列の損失したプラークハイブリダイゼーションとF5Lの保持によりスクリーニングされている。組換えウイルスvP977は、［B13R−B29R］および［C23R−F4L］の欠損並びにNYAVC中に存在する他の欠損を含有する。vP811のように、vP977は、ワクシニア末端反復のコピーの両方からの全ての遺伝子が欠損している。
実施例18−宿主制限ポックスウイルスによるHIV遺伝子産生物の発現
この実施例は、HIV−１遺伝子産生物を発現する宿主制限ポックスウイルスの産生を記載するものである。使用したベクターはNYVACとALVACである。
細胞およびウイルス
NYVACとALVACウイルスベクターおよびそれらの誘導体を前述したように繁殖せしめた（ピッチーニら、1989;テイラーら、1988a、ｂ）。ベロ細胞と初代ニワトリ胚繊維芽細胞（CEF）を前述したように増殖せしめた（テイラーら、1988a、ｂ）。P815ネズミの肥満細胞種（Ｈ−2d）をATCC（＃TIB64）から得て、10％の胎児の子牛血清CFBSおよび100Iu/mlペニシリンおよび1ml当たり100μｇのストレプトマイシンを補給したイーグルMEM中に保持した。
ネズミ
メスBALB/cJ（Ｈ−2d）ネズミをジャクソン研究所（ME、バーハーバー）から購入し、不断給餌で保持した。全てのネズミは、生後６から15週間のものを用いた。
培地
免疫学的アッセイのアッセイ培地は、10％のFBS、4mMのＬ−グルタミン、20mMのHEPES（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホネート）、５×10-5Mの２−メルカプトエタノール、1ml当たり100IUのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを補給したRPMI1640培地からなるものであった。スチム（stim）は、4mMのＬ−グルタミン、10-4Mの２−メルカプトエタノール、1ml当たり100IUのペニシリン、および1ml当たり100μｇのストレプトマイシンを補給したイーグル最小必須培地からなる。
HIV−１（III B）エンベロープのエピトープおよびV3ループを含有するALVACおよびNYVAC組換え体
HIV−１（III B）のV3ループを包含する150bp（アミノ酸299−344;ジャブヘリアンら、1989）を、テンプレートとしてのpHXB.2D（III）を有するオリゴヌクレオチドHIV3BL5（配列認識番号137）
Figure 0003602530
およびHIV3BL3（配列認識番号138）
Figure 0003602530
（MD.ベセスダ、NCI−NIH、Dr.R.C.ガロにより供給された）を用いたPCRにより誘導した。オリゴヌクレオチドHIV88A（配列認識番号139）
Figure 0003602530
およびHIV88B（配列認識番号140）
Figure 0003602530
をともにアニールして、HIV−１エピトープ88を含有する二本鎖断片を産生した（アミノ酸95−105、シャファーマンら、1989）。相補性配列の存在によるPCRにより、エピトープを含有する150bp V3含有PCR断片および88エピトープ配列を含有する42bp断片をともに融解せしめた。この反応はオリゴヌクレオチドHIV88C（配列認識番号141）（５′−AGTAATGTGACAGAAAATTTTAAC−３′）およびHIV3BL3（配列認識番号138）を用いて行なった。192bp PCR誘導断片は、V3ループ配列の上流で融解したエピトープ88配列を含有する。終止コドン（TAA）をオリゴヌクレオチドHIV3BL3Pに含有せしめ、読取り枠の翻訳を終止し、開始コドンを翻訳の開始として機能するオリゴヌクレオチドHIV88Cに含有せしめ、エピトープ88/V3ループ融解タンパク質を発現した。加えて、オリゴヌクレオチドHIV3BL3を、EcoR I部位が192bp PCR断片の３′末端に存在するように合成した。テンプレートとしてプラスミド、pAM12とともに、オリゴヌクレオチドRG273（配列認識番号142）（５′−AGGCAAGCTTTCAAAAAAATATAAATGATTC−３′）およびRG274（配列認識番号143）（５′−TTTATATTGTAATTATATATTTTC−３′）を用いたPCRにより、昆虫ポックスウイルス42kDa（初期）プロモーターを産生した。42kDaプロモーターを含有する108bp断片を、５′末端にHind III部位を含有するように合成した。断片を含有する42kDaをキナーゼして、EcoR Iで切断したエピトープ88/V3断片とHind IIIとEcoR Iで切断したpRW831に連結する前にHind IIIで切断した。産生したプラスミドをpC5HIVL88と称した。このプラスミドを、治療ウイルスとしてのCPppとともに生体外組換えアッセイにおいてvCP95を産生した。ALVAC組換え体、vCP95は、CPppのde−ORFed C5座にエピトープ88/V3ループを含有する。
プラスミドpC5HIVL88をHind IIIとEcoR Iで切断して、叙述したエピトープ88/V3発現カセッテを含有する300bp断片を離生した。この断片をLMP−アガロースゲルから切除して、フェノール抽出（２×）とエーテル抽出（１×）により単離した。2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いて、単離した断片をブラントエンドした。断片をpSD550に連結し、pSD548からの誘導体（第６図）をSma Iで切断してプラスミドpHIVL88VCを産生した。このプラスミドを治療ウイルスとしてのvP866とともに用いてvP878を産生した。vP878は、NYVACのde−ORFed I4L座にエピトープ88/V3ループカセッテを含有する。
HIV−１（III B）エンベロープ糖タンパク質を発現するALVACおよびNYVACベースの組換え体
ワクシニアウイルスH6プロモーターに３′が隣接したHIV−１（III B）env遺伝子からなる発現カセッテ（グオら、1989;テイラーら、1988a、ｂ）を、ALVACおよびNYVACベクターによりHIV−１からgp160の発現に関して操作した。オリゴヌクレオチドHIV3B1（配列認識番号144）
Figure 0003602530
およびHIV3B5（配列認識番号145）
Figure 0003602530
を用いて1.4kb断片をpHXB.2D（III）（MD、ベセスダ、NCI−NIH、Dr.R.C.ガロにより供給された）から増幅せしめた。この断片は、env遺伝子の３′部分を含有する。これらのプライマーによるPCR増幅は、暗号配列の後にワクシニアウイルス初期転写終止T5NT配列モチーフを配し、アミノ酸配列を変更することなく位置6146から6152に位置したT5NTモチーフ（ラトナー、1985）を除去した。この変化（ＴからＣ）は、この位置にEcoR I（GAATTC）を産生する。この1.4kb断片をEcoR I（５′末端）とXba I（３′末端）で切断し、EcoR IとXba Iで切断したpBS−SK（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入した。産生したプラスミドをpBSHIVENV1、５と称した。この断片のヌクレオチド配列分析により、配列は位置7848でのＴからＣの塩基移転を除いて完全に正確であることが示された。この塩基転移は以下のように正確であった：テンプレートとしてのpHXB.2D（III）とともにオリゴヌクレオチドHIV3B1（配列認識番号144）
Figure 0003602530
およびHIV3B17（配列認識番号146）
Figure 0003602530
を用いてPCRにより250bp断片を誘導した。この断片をBgl IIとEcoR Iで切断した。この断片を、Ggl IIとEcoR Iで切断したpBSHIV3B1、５に挿入し、それゆえ不正確なヌクレオチドノ領域と置換してプラスミドpBSHIV3BBPを産生した。
テンプレートとしてのpHXB.2D（III）とともにオリゴヌクレオチドHIV3B9（配列認識番号147）
Figure 0003602530
およびHIV3B10（配列認識番号148）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより、env遺伝子の５′部分を含有する150bp断片を誘導した。オリゴヌクレオチドVVH65P（配列認識番号149）
Figure 0003602530
およびVVH63P（配列認識番号150）
Figure 0003602530
を用いたPCRによりpC3FGAGからのワクシニアウイルスH6プロモーターを含有する128bp断片を産生した。両方の断片をKpn Iで切断し、これらの断片をKpn Iで切断したpBS−SKに挿入する前に、150bp断片をキナーゼした。産生したプラスミドをpBSH6HIV3B5Pと称した。
オリゴヌクレオチドHIV3B2（配列認識番号151）
Figure 0003602530
およびHIV3B7（配列認識番号152）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより、pHXB.2D（III）からの600bp断片を産生した。この断片をEcoR Iで切断し、キナーゼした。同一のテンプレートであるが、オリゴヌクレオチドHIV3B6（配列認識番号153）
Figure 0003602530
およびHIV3B8（配列認識番号154）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより、500bp断片を誘導した。この断片をKpn Iで切断した。これらの断片は、ヌクレオチド5878から6368にともに対応するものである（ラトナーら、1985）。これらのプライマーによりこれらの断片の操作はまた、アミノ酸配列を変更することなく、ヌクレオチド6332から6328に位置するT5NT配列を除去する。これらの２つの断片をKpn IとEcoR Iで切断したpBSHIV3B3Pに挿入した。このプラスミドをpBSHIV3BP2768と称した。
プラスミドpBSH6HIV3B5PをKpn Iで切断し、HIV−１ env遺伝子の５′部分（150bp）およびH6プロモーターを含有する360bp断片を離生した。このKpn I断片をKpn Iで切断したpBSHIV3BP2768に連結し、プラスミドpBSHIV3BEA IIを産生した。Xba Iの切断と続いての部分的なKpn Iの切断により2.8kb断片をpBSHIV3BEA IIから誘導した。この断片をブラントエンドし、Sma Iで切断したpSD550に挿入した。プラスミドpI4LH4HIV3Bを産生し、治療ウイルスとしてのvP866とともに生体外組換え実験に用いた。これにより、NYVACゲノムのI4L座にHIV−１ env遺伝子を含有するvP911が産生せしめられた。
HIV−１ evn遺伝子をALVACベクターに挿入するために、pBSHIV3BEA IIをNru IとXba Iで切断した。2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片で誘導した2.7kb断片をブラントエンドした。この断片は、ワクシニアH6プロモーターの３′末端側の21bp（Nru I部位に対して）に３′が隣接した全縁HIV−１ env遺伝子を含有する。pRW838のNru IとEcoR Iによる切断と続いてのクレノウによるブラントエンドにより誘導した3.1kb断片に、この断片を連結した。pRW838誘導断片は、カナリヤポックスから誘導した相同アームを含有し、異種遺伝子をC5座に向ける。この断片はまた、H6プロモーターの５′末端側の100bpを含有する。それゆえ、これらの断片の連結により、HIV−１ env遺伝子の発現カセッテを含有する挿入プラスミドが産生され、これをpC5HIV3BEと称した。治療ウイルスとしてとALVACによる生体外組換え実験にこのプラスミドを用いてvCP112を産生した。
HIV−１（III B）gp120を発現するNYVACベースの組換え体
プラスミドpBSHIV3BEA IIをEcoR IとXba Iで切断し、4.3kb断片を離生した。この断片は、HIV−１ env遺伝子に連結したワクシニアウイルスH6プロモーターからヌクレオチド6946を含有する（ラトナーら、1985）。4.3kb断片を、gp120暗号配列の３′部分に対応する300bpのEcoR I/Xba I切断PCR誘導断片に連結した。テンプレートとしてのpHXB.2DとともにオリゴヌクレオチドHIV1−120A（配列認識番号155）
Figure 0003602530
およびHIV1−120B（配列認識番号156）
Figure 0003602530
を用いて300bp PCR断片を誘導した。4.3kb Xba I/EcoR I断片と300bp Xba I/EcoR I断片の連結により、プラスミドpBSHIVB120を産生した。
最初にプラスミドをXba Iで線状化して続いて部分的にKpn I切断により1.6kbのKpn I/Xba I断片をpBSHIVB120から誘導した。2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片による処理でブラントエンドした。この断片をSma Iで切断したpSD54IVCに挿入し、pATIHIVB120を産生した。このプラスミドを生体外組換え実験に用いてvP921を産生した。この組換え体は、NYVACのATI座においてgp120をコードするHIV−１ env遺伝子の部分を含有する。
イムノプレシピテーション
vP911、vP921およびvCP112により発現されたHIV−１遺伝子産生物の真正を決定するために、イムノプレシピテーション分析を行った。ベロ細胞単層を、10PFU/細胞のm.o.i.で、疑似感染、親ウイルスvP866、または組換えウイルスに感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引して、細胞を2mlのMEM（２％のFBSおよび［35S］−メチオニン（20uCi/ml）を含有するマイナスメチオニン）で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％のNP−40、30mMのトリス、pH7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.03％のNa Azide、および0.6mg/mlのPMSF）を添付して続いて細胞単層を書き取ることにより、感染から18時間後に細胞を収穫した。
感染細胞から誘導した溶解産物を、HIV−１血清陽性個体（MD、NCI−NIH、Dr.ゲノベファフランチーニから得た）から集積した血清を用いてHIV−１ env遺伝子発現に関して分析した。この血清をvP感染ベロ細胞で前に吸着せしめた。前に吸着せしめたヒトの血清を４℃の１晩のインキュベーションによりタンパク質Ａプロテアーゼに結合せしめた。ある場合には、gp120に特異的な単クローン性抗血清（デュポン）を主要血清とて用い、第２の抗体としてラット抗ネズミを用いた。このインキュベーション期間の後に、物質を１×の緩衝液Ａで４回洗浄した。次いでタンパク質Ａセファロースに結合した血清陽性の個体からのヒトの血清とともに、通常のヒト血清とタンパク質Ａセファロースにより前に浄化した溶解産物を４℃でインキュベーションした。１晩のインキュベーション期間の後に、試料を、１×緩衝液Ａと２×LiCl2/尿素緩衝液で４回洗浄した。２×のラエムリス緩衝液（125mMのとリス（pH6.8）、４％のSDS、20％のグリセロール;10％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間沸騰せしめることにより、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。タンパク質を10％のトリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）上で分画し、固定し、蛍光光度法のために1MのNa−サリチル酸塩で処理した。
HIV−１血清陽性個体から集積した血清を用いたイムノプレシピテーションの結果により、vP911巻戦災房溶解産物からのgp160エンベロープ糖タンパク質のgp120およびgp41熟成形状の特異的な沈殿が示された。親（NYVAC;vP866）感染細胞溶解産物にはそのような特異的遺伝子産物を検出されなかった。gp120の特異的沈殿はまたvP921感染細胞溶解産物にも見られた。
同一の血清によるイムノプレシピテーション分析により、それぞれvP911およびvP921により発現されたgp160およびgp120種は、感染細胞の表面に存在したことが示された。
イムノプレシピテーションを、vCP112感染細胞に関しても行なった。ALVAC親ウイルスに感染した細胞および未感染細胞からのgp120細胞外部分に対して向けられた単クローン性抗体に関しては、HIV−特異的ポリペプチドは沈殿しなかった。しかしながら、２つのHIV特異的ポリペプチド種は、vCP112感染細胞からは沈殿した。これらの種は、それぞれ前駆体env遺伝子産生物および熟成細胞外形状に対応する160kDaおよび120kDaの明確な移動度で移動した。
接種
外側の尾の静脈により、0.1mlの食塩加リン酸緩衝液中５×107プラーク形成単位（PFU）をネズミに静脈接種せしめた。
ひ臓細胞調製
頸部の脱臼による安楽死の後に、ハンクス平衡塩溶液を含有する無菌のプラスチックバッグに、ネズミのひ臓を移した。単一の実験群からの個々のひ臓または集積したひ臓を、ストマッチャーブレンダー中での１分間のサイクルにより１つの細胞懸濁液に処理した。ひ臓細胞懸濁液を、アッセイ培地またはスチム培地のいずれかで適切に数回洗浄した。血球計算盤および顕微鏡を用いて、トリパンブルー染料排除により、またはカトラーカウンターの使用によりひ臓細胞を枚挙した。
血清
ネズミにエーテルで軽く麻酔をかけ、血液をレトロオービタル集網から集積した。実験群からなるネズミからの血液を集積し、凝固せしめた。血清を集積し、使用まで−70℃で貯蔵した。
第２の細胞毒性Ｔリンパ球（CTL）の産生のための生体外刺激
様々な実験群（応答細胞）からの集積したひ臓細胞まをスチム培地で５×106細胞/mlまで希釈した。同系の未経験のネズミ（刺激要因）からのひ臓細胞を、1ml当たり１×107まで希釈して、細胞当たり25pfuのm.o.i.で適切なワクシニアウイルスにより37℃で２％のFBSを含有する組織培養地中において１時間、感染せしめた。感染後、刺激要因細胞をスチム培地中で数回洗浄し、スチム培地により1ml当たり１×106細胞まで希釈した。5mlの刺激要因細胞と5mlの反応細胞を、25cm3の組織培養フラスコに加え、５％のCO2中で37℃、直立して５日間インキュベーションした。アッセイの日に、ひ臓細胞をアッセイ培地中で数回洗浄し、顕微鏡を使用したトリパンブルーの血球計算盤で数えた。
標的細胞の調製
ワクシニア特異的CTL活性に関して、組織培養細胞を、37℃で１時間に細胞当たり25pfuのm.o.i.での２％のFBSを含有する組織培養培地中に1ml当たり１×107細胞でのインキュベーションにより一晩感染せしめる。インキュベーション後、細胞を、10％のFBSを含有する組織培養培地により1ml当たり１−２×106細胞の間に希釈し、使用するまでさらに５％のCO2中でインキュベーションした。HIV特異的CTL活性に関して、組織培養細胞を、それぞれHIV−１単離体IIIB、SF2、およびMNのgp120のV3ループ領域に対応する20μg/mlのペプチドHBX2（MA、ケンブリッジ、アメリカンバイオテクノロジーズ）、SF2（MA、ケンブリッジ、アメリカンバイオテクノロジーズ）、またはMN（MA、ケンブリッジ、アメリカンバイオテクノロジーズ）で一晩インキュベーションした。アッセイの日に、アッセイ培地中での遠心分離により標的を数回洗浄した。最後の洗浄後、約100μCiのNa2 51CrO4（51Cr）中で再懸濁せしめた。37℃での１時間のシンキュベーション後、遠心分離によりアッセイ培地中で少なくとも３回洗浄し、血球計算盤上で計測し、アッセイ培地中で１×105/mlに希釈した。
細胞毒性アッセイ
第１のCTLアッセイに関して、新鮮に調製したひ臓細胞を1ml当たり１×107細胞までアッセイ培地で希釈した。第２のCTLアッセイに関して（生体内接種または生体外刺激のいずれかの後の）、ひ臓細胞をアッセイ培地中で２×106/mlまで希釈した。0.1mlのひ臓細胞懸濁液を、96ウェル（well）の丸底マイクロタイタ板（EXP）のウェル中で51Cr標識標的細胞に加えた。ほとんどの場合、第１のCTL活性に関してアッセイされるひ臓細胞は、標的細胞の添加の前に、マイクロタイタ委のウェル中でさらに２倍に希釈した。51Cr（SR）の自発的放出の測定の場合、標的細胞をアッセイ培地のみでインキュベーションした。51Cr（MAX）の最大放出を測定するために、アッセイの初めに、0.1mlの10％ナトリウムドデシル硫酸塩を適切なウェルに加えることにより、標的細胞を慎重に溶解せしめた。アッセイを開始するために、マイクロタイタ板を２分間200×ｇで遠心分離し、５％のCO2中、37℃で４、５時間インキュベーションした。インキュベーション後、各ウェルの培養上澄みを、スカトロン上澄み集積システムを用いて集積した。ベックマン5500Bガンマカウンターにより放出した51Crを測定した。特異的細胞毒性のパーセントは、以下の式によるカウントから決定した：
細胞毒性％＝（EXP−SR）／（MAX−SR）×100
単クローン性抗CD4と単クローン性抗CD8を用いたＴヘルパー細胞と細胞毒性Ｔリンパ球の欠損
抗CD4（単クローン性抗体172.4）の1:5の希釈物または抗CD8（単クローン性抗体抗Lyt2.2）の1:200の希釈物およびセダーレインロー−トックス家ウサギ補体の1:16の希釈物を含有する細胞毒性培地（0.2％のBSAおよび5mMのHEPESを含有するRPMI1640）中で107/mlの密度にひ臓細胞懸濁液を希釈した。単一成分の適切な対照（補体、抗CD4、抗CD8）を含有した。
抗HIV−１ gp160 ELISA
ELISA板のウェル（イムロンII）を、炭酸塩緩衝液、pH9.6中で100ngの精製HIV−１ gp160（NC、ダーハム、デューク大学、Dr.D.ボログネシーにより提供された）により４℃で一晩被膜した。次いでその板を、0.05％トイーン20を含有する食塩加リン酸緩衝液（PBST）により洗浄した。次いでその板を、１％の子牛血清アルブミン（BSA）を含有するPBSTで37℃で２時間ブロックした。PBSTによる洗浄後、0.1％のBSAを含有するPBST（希釈緩衝液）で血清を最初に1:20に希釈した。ELISA板のウェル中で血清をさらに２倍に希釈した。板を37℃で２時間インキュベーションし、PBSTで洗浄した。ウサギ抗ネズミイムノグロブリン（DAKO）に接合したホースラディッシュペルオキシダーゼを、希釈緩衝液出1:2000に希釈史、ELSA板のウェルに加え、37℃で１時間シンキュベーションした。PBSTでの洗浄後、基質緩衝液中のOPD（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド）を加え、約20分間周囲温度で色を呈させた。2.5MのH2SO4の添加により、反応を終わらせた。バイオテックEL−309ELISAリーダーで490nmでの吸収を測定した。血清の終端は、1.0の吸収値を与えた希釈の逆数として定義した。
リンパ球増殖反応測定
各ネズミからのひ臓細胞の単一の細胞懸濁液をアッセイ培地で２×106/mlまで希釈し、アッセイ培地のみ、１、５、または10μｇのHIV−１ペプチドT1、１、５、または10μｇのHIV−１ペプチドT2、および１、または10μｇの精製HIV−１ gp160（イムノ）を含有する96ウェル、平底マイクロタイタ板のウェルに加えた。細胞を５％のCO2中、37℃で５日間インキュベーションした。最終の６時間のインキュベーションのために、1.0はμCiの［3H］−チミジンまを各ウェルに加え、ケンブリッジPHD細胞収穫器を用いてベックマンレディーフィルター上で収穫した。フィルターディスクを液体シンチレーションカウンター中でドライカウントした。
刺激指数＝CPMEXP/CPMMEDIUM
結果:HIV gp120を発現する組換えワクシニアウイルスは、主要HIV特異的細胞毒性Ｔリンパ球活性を誘発する
５×107PFUのワクシニアウイルス組換え体vP878、vP911、またはvP921、または、対照としてのNYVACベクターでのiv投与の後に、ペプチドHBX2で一晩インキュベーションした有性生殖P815細胞に対して、BALB/cネズミのひ臓CTL活性を評価した（表20）。HIV gp120を発現するvP921を投与したネズミのひ臓において、適度であるが、著しい（Ｐ＜0.05）の主要CTL活性が産生された。どの法の組換えワクシニアウイルスまたはNYVAC親ベクターも、主要HIV特異的CTL活性を誘発できなかった。これは、主要ワクシニア特異的CTL活性に応答したワクシニアウイルスをネズミの各群に投与したときの不適切な感染のためではなかった。対照である、免疫しなかったネズミも標的には応答しなかった。
HIV envペプチドを発現する組換えポックスウイルスは、HIV特異的記憶細胞毒性Ｔリンパ球を産生する
組換えワクシニアウイルスの１つを１回接種してから少なくとも１か月後、ネズミひ臓細胞を、NYVACまたは各HIV組換えワクシニアウイルスに事前に感染した有性生殖未経験ひ臓細胞で生体外刺激した（表21）。vP878、vP911、またはvP921で免疫化したネズミのひ臓細胞培養中のみに強いHIV特異的CTL活性を検出され、この培養は、同一のワクシニアウイルスHIV組換え体（vP878、vP911、またはvP921）のうちの１つに感染した細胞で生体外で再刺激された。HIV gp120またはgp160を発現するワクシニアウイルス組換え体は、88エピトープに融合されるV3ループのみを発現するワクシニアウイルス組換え体よりも良好に記憶CTLを産生できた。HIV特異的記憶CTL活性は、免疫化しなかった対照またはNYVAC免疫化ひ臓細胞からは誘発できなかった。使用したいかなるワクシニアウイルスに感染したひ臓細胞での生体外刺激の後に明確であったので、ワクシニア特異的記憶CTL活性がベクター免疫したネズミにはないことは乏しい免疫化のためではなかった。
同様の研究において、88エピトープ（vCP95）に融合されるV3ループ領域を発現するカナリヤポックス組換え体HIV特異的記憶CTLを産生する能力を試験した（表22）。108PFUのvCP95またはALVACベクターの１回の接種から３週間後、HIV特異的記憶CTL応答、CPppを、組換えワクシニアウイルスアナログ、vP878により誘発された応答と比較した。ワクシニアおよびカナリヤポックスCTL応答は、適切な免疫化の対照として含んだ。vP878およびvCP95面液化ネズミからのひ臓細胞のみが、vP878により刺激されたHIV特異的記憶CTL活性を示した。機能的な細胞溶解性CTLに対して、存在する記憶CTLを刺激するvCP95の不能は、ワクシニアウイルス組換え体の使用に基づいて最大にせしめられた生体外条件に関連する。いうまでもなく、vCP95は、免疫化ネズミのひ臓中に著しいHIV特異的記憶CTLを産生することができた。
生体外刺激細胞毒性細胞の特徴付け
HIVペプチド瞬間標的細胞に対して細胞毒性を介在する細胞が、ナチュラルキラー細胞のようなCTLに関連のない非特異的エフェクター細胞の個体群を表すことが考えられる。このことを試験するために、vP921で免疫化し、vP921感染ひ臓細胞で生体外刺激したネズミのひ臓細胞は、Ｔヘルパーリンパ球（CD4）または細胞毒性リンパ球（CD8）のＴリンパ球結果表面抗原特性が枯渇しており、V3ループペプチド瞬間標的細胞に対してアッセイした（表23）。前述したように、vP911面液化したネズミのみが、vP921感染有性生殖ひ臓細胞で生体外刺激できる記憶HIV特異的CTL活性を示した。補体調製（Ｃ′）および単クローン性抗CD4および抗CD8はある程度毒性効果を示したが、CD8結果細胞（抗CD8＋Ｃ′）が枯渇した培養のみがHIV特異的細胞毒性エフェクター細胞が枯渇している。それゆえ、HIVペプチド瞬間標的細胞に対する細胞介在細胞毒性活性は、その細胞膜上に、MHC科Ｉ制限CTLの特性である、CD8抗原を有した。
HIV gp120のV3ループ領域のCTL抗原受容体認識の特異性
Ｔリンパ球抗原受容体は、エピトープ断片の主要アミノ酸配列における小さな変更に対して鋭敏に感度を有する。HIV gp120のV3領域は、超可変性であり、免疫学的にHIV単離体の中でも異なる。この超可変性は、いくつかのアミノ酸の置換および添加にある。HIVワクシニアウイルス組換え体により産生された細胞毒性細胞の特異性を試験するために、HIV単離体IIIB、SF2、およびMNのV3ループ領域に対応するペプチドをパルスしたP815標的細胞の中でCTL活性に対する感受性を比較した。vP911およびvP921による免疫化のみがHIV特異的主要CTL活性を誘発した（表24）。さらに、HIV特異的CTL活性は、HIV単離体IIIBのV3ループに対応するペプチドでパルスしたP815標的細胞のみに限られた。ワクシニアウイルス組換え体vP8787、vP911およびvP921による免疫化により誘発された生体外刺激したHIV特異的第２のCTL活性に関して同様の結果が得られた（表25）。それゆえ、HIV単離体IIIBのenv遺伝子の様々な部分を発現する組換えワクシニアウイルスにより誘発されたHIV特異的CTLは、同一の抗原単離体から誘導された標的エピトープのみを認識する。
ワクシニアウイルスHIV組換え体により免疫化後のHIVエピトープに対するリンパ球増殖対応
抗原に対するリンパ球増殖は、細胞介在免疫性の生体外体件（correlate）である。適切な抗原の提示は、抗原の受容体を発現する細胞の免疫個体群において細胞増殖を誘発する。増殖の開始と継続には、溶性媒介物によるＴヘルパーリンパ球の介在が必要である。HIV抗原を発現する組換えワクシニアウイルスで免疫化したネズミ中のHIV抗原に対する細胞媒介免疫性を評価するために、27日前に免疫化したネズミからのひ臓細胞を、T1およびT2と称するＴヘルパーリンパ球エピトープに関連するペプチド、並びに精製HIV gp160で５日間インキュベーションした（表26）。ひ臓細胞培養中には、Ｔヘルパー細胞エピトープT1およびT2に対する増殖応答は観察されなかった。しかしながら、vP921で事前に免疫化したネズミのひ臓細胞は、［3H］−チミジンの包含により測定されるように、HIV gp160に活発に応答した。2.0より大きな刺激指数（SI）は免疫性を示すと考えられる。それゆえ、vP921によるネズミの接種は、HIV gp160に対する細胞媒介免疫性を誘発した。
ワクシニアウイルスHIV組換え体を接種したネズミの抗体応答
HIVに対する体液性応答を評価するために、ネズミを０日にワクシニアウイルスHIV組換え体の１つで免疫化し、第５週に２回目の免疫化を行なった。ネズミを最初の免疫化から９週間に亘り様々な間隔で採血した。各処理群から集積した血清を、抗原として精製gp160を用いたELISAによりHIVに対する抗体についてアッセイした（表27）。第１回の抗体応答は、一般的に適度であったが、vP911により誘発された最高水準は、検出可能であった。第２回の免疫化後に、vP911およびvP921で免疫化したネズミの抗体力価は増大し、第９週にやや減少するまで、それぞれ4,600と3,200を越えた力価で第７週にピークとなった。それゆえ、２つのワクシニアウイルスHIV組換え体、vP911およびvP921は、著しい抗体応答を誘発することができた。
Figure 0003602530
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実施例19−ALVAC、TROVACおよびNYVAC中のHIV−１（ARV−２またはSF−２菌株）env遺伝子の発現
プラスミドの構成
全縁HIV−１（ARV−２またはSF−２菌株）ゲノムを含有するラムダクローンを、J.レビーにより得て、これは前述したものである（サンチェス−ペスカドールら、1985）。env配列をpUC13中にサブクローニングし、プラスミドpMP7MX373を産生した。このプラスミドは、env遺伝子産生物の開始コドン（ATG）に対して−１からenv遺伝子の終止コドン（TAA）の715bp下流までの配列を含有している。これらのenv配列をEcoR IとHind IIIによる切断によりpMP7MX373から切除し、プラスミドベクター、pIBI25（CT、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）に挿入し、プラスミドpIBI25envを産生した。
組換え体プラスミドpOBO25envは、応答能のあるE.coli CJ236（dut−ung−）細胞を転換するのに用いた。一本鎖DNAを、転換E.coli CJ236細胞のヘルパーファージ、MG408による感染により誘導したファージから単離した。この一本鎖テンプレートは、オリゴヌクレオチドMUENVT12配列認識番号157）
Figure 0003602530
により生体外突然変異誘発反応（クンケルら、1985）に用いた。このオリゴヌクレオチドによる突然変異誘発により、ＴからＣ転移が行なわれ、ARV−２ゲノムのヌクレオチド位置6929−6935でT5CTモチーフを分断する（サンチェス−ペスカドールら、1985）。この突然変異は、env遺伝子のアミノ酸配列を変更せず、突然変異誘発したプラスミドクローンのスクリーニングに用いられるEcoR I部位を産生する。ジデオキシヌクレオチド鎖終止法により配列の確認を行なった（サンガーら、1977）。産生した突然変異誘発プラスミドをpIBI25mutenv11と称した。
1.45kbのBgl II断片をpIBI25mutenv11から誘導した。この断片は、突然変異したenv配列を含有した。この断片をpIBIenv中の対応未突然変異断片を置換するのに用いた。産生したプラスミドをpIBI25mutenv8と称した。さらに変更をpIBI25mutenv8に行なった。レックスタンパク質とLTR配列（LTR領域）をコードする配列を遺伝子の３′末端から除去し、アミノ酸583から599の推定免疫抑制（IS）領域（配列認識番号158）
Figure 0003602530
を欠損するために、生体外突然変異誘発を行なった（クラッセら、1988）。オリゴヌクレオチドLTR2（配列認識番号159）
Figure 0003602530
およびMUENSVISR（配列認識番号160）
Figure 0003602530
によりpIBImutenv8から誘導した単一標準テンプレートに関してこれらの反応を行なった。ハイブリダイゼーションと制限分析により突然変異誘発したクローンを認識した。IS領域とLTR領域の両方が欠損し、またはLTRが欠損するように突然変異誘発せしめられたクローンをヌクレオチド配列により確認し、それぞれpIBI25mut3env40およびpIBI25mut2env22と称した。
全縁env遺伝子を含有する3.4kbのSma I/Hind III断片をpIBI25mut3env40とpIBImut2env22から誘発し、pCPCV1に挿入し、Sma I/Hind IIIで切断した。プラスミドpCPCV1は、CP組換え体の産生を可能にする挿入プラスミドである。異種遺伝子は、C3挿入座に向いていた。プラスミドpCPCV1とpFPCV2は、1989年４月20日に発行されたPCT国際出願第WO89/03429号に記載され、ここに参照文献として包含する。VVH6プロモーターとenv配列により正確なATG:ATG構造を構成するために、マンデッキの方法（1986）による生体外突然変異誘発反応に、オリゴヌクレオチドPROVECNS（配列認識番号161）
Figure 0003602530
を用いた。潜在的な変異体を、Sma I部位の損失に関してスクリーニングした。Sma I部位の欠如したプラスミドクローンを認識し、ヌクレオチド配列分析により確認した。適切に突然変異誘発したプラスミドクローンを認識し、pCPenvIS＋またはpCVenvIS−およびpFPenvIS＋またはpFPenvIS−と称した。
Nru IとHind IIIでの切断により、HIV−１ env遺伝子をpCPenvIS−から切除した。それぞれ2.5kb（envIS＋）および2.4kb（envIS−）の２つのenv断片を単離し、2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片との反応によりブラントエンドした。これらの断片を、Nru IとPst IによるpSIVenvVVの切断と続いての2mMのdNTPの存在下でのE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片によるブランティング工程により誘導した3.5kbの断片に連結せしめた。プラスミドpSIVenvVVは、ATI挿入座のワクシニアウイルスH6プロモーターにより規制されるSIV env遺伝子発現カセッテを含有する。pSIV envVVのNru IとPst Iによる切断は、全縁SIV env暗号配列とプロモーター要素の３′末端側の20bpを切除する。env IS−とenv IS＋断片との連結により、H6プロモーターの20bpが保存され、HIV−１ env遺伝子をATI挿入プラスミドに挿入する。産生したプラスミドをそれぞれ、env IS＋とenv IS−に関してpATR5VV＋とpAR6VVと称した。
生体外組換えと組換え体の精製
前述したように（ピッチーニら、1987）、CP（ALVAC）とFP（TROVAC）組換え体の両者のリン酸カルシウム沈殿により、プラスミドDNAを感染細胞に導入することにより組換えを行なった。それぞれ組換え体vCP61とvCP60を産生するためにプラスミドpSPenvIS＋とpCPenvIS−（C5座、第16図）を用いた。それぞれ組換え体vFP63とvFP62を産生するために、プラスミドpFPenvIS＋とpF＋envIS−（F7座、第22図）を用いた。治療としてvP866（NYVAC）により生体外組換え実験にプラスミドpAR5VV＋とpAR6VVを用いて、それぞれvP939とvP940を産生した。前述したように、32P−標識したenv特異的プローブによるハイブリダイゼーション後のオートラジオグラフィーにより組換えプラークを選択し、純度を確認するために連続して３回継代を行なった（ピッチーニら、1987）。
ラジオイムノプレシピテーション分析
細胞単層に、10pfu/細胞を修飾イーグルメチオニン不含有培地（MEMmet−）で感染せしめた。感染から２時間後、20uCi/mlの［35S］−メチオニンを２％の透析した牛の胎児の血清（フロー）を含有するMEM（−met）中に加えた。それらを溶解緩衝液（150mMのNaCl、1mMのEDTA pH8、10mMのトリス−HCl pH7.4、0.2mg/mlのPMSF、１％のNP40、0.01％のNa Axide）と50μｌのアプロチニン中に再懸濁せしめ、エッペンドルフ管に集めることにより細胞を感染から15分間後に収穫し、溶解産物を４℃で20分間回転せしめることにより精製した。60mmの直径のペトリ皿の上澄み液の３分の１を、１μｌの通常のヒトの血清と100μｌのタンパク質Ａ−セファロースCL−4B（SPA）（ファーマシア）とともに室温で２時間インキュベーションした。１分間の回転後、上澄み液を、２μｌの、HIV血清陽性の個体（熱不活性化した）からの前吸着したヒト血清と100μｌのSPAとともに４℃で１時間と30分間インキュベーションした。
ペレットを、溶解緩衝液で４回、塩化リチウム／尿素緩衝液（0.2M LiCl、2M尿素、10mMトリス−HCl pH8）で２回洗浄し、沈殿したタンパク質を60μｌのセエムリ緩衝液中に溶解せしめた（ラエムリ、1970）。100℃での５分間の加熱と１分間の回転を行ないセファロースを除去した後、上澄み中のタンパク質をSDS10％ポリアクリルアミドゲル上で再溶解せしめ、間接撮影を行なった。
HIV−１ env遺伝子の発現
ARV−２またはSF−２菌株のHIV env遺伝子がワクシニア初期−晩期プロモーター、H6の下流に挿入された６つの異なる組換えウイルスを調製した。簡単にするために、２つのALVACベースの組換えウイルス、vCP61およびvCP60をCPIS＋およびCPIS−と称し、２つのTROVACベースの組換え体、vFP63およびvFP62をFPIS＋およびFPIS−と称し、２つのNYVACベースの組換え体、vP939およびvP940をVV−とVV＋と称した。
HIV−１ env遺伝子の開始コドンがワクシニアH6プロモーターのATGと重複している点で、全ての構成を正確であった。さらに、３′から終止コドンまでの異種の遺伝子情報は除去されていた。gp41遺伝子産生物の５′部分の近くに位置したアミノ酸583−599に対応する51bp領域を欠損せしめることにより、CPIS−、FPIS−、およびVV−を得た。この領域は、他のレトロウイルス糖タンパク質の膜内外ポリペプチド（チアンチオロ、1985;ルーグら、1989a、ｂ）に生じる推定の免疫抑制領域（クラッセら、1988;ルーグら、1989b）との相同性を有する。
６つの組換えウイルスの発現分析は、CEF、ベロ、およびMRC−５細胞単層中で行なった。HIV血清陽性の個体から集積した血清を用いたイムノプレシピテーション実験は、材料と方法に記載したように行なった。６つの全ての組換え体は、HIV−１ gp161エンベロープ前駆体の合成を指示した。しかしながら、gp160からgp120およびgp41への処理の効果は、細胞の種類により異なり、また免疫抑制領域の欠損の影響を受けた。HIV血清陽性個体からの集積血清によるgp41の認識はまた、ウイルスバックグラウンドと細胞の種類により変化した。
実施例20−NYVAC中のHIV−２（ISSY菌株）env遺伝子の発現
gp160の発現
オリゴヌクレオチドHIV25PA（配列認識番号162）
Figure 0003602530
およびHIV25PB（配列認識番号163）
Figure 0003602530
をアニールして、HIV−２ SBL/ISY単離体（フランチーニら、1989）env暗号配列の最初の54bpを構成した。この断片は、テンプレートとしてpTP15を用いてオリゴヌクレオチドH65PH（配列認識番号164）
Figure 0003602530
およびH63PHIV2（配列認識番号165）
Figure 0003602530
によるPCRにより誘導した融解３′から129bp断片である。オリゴヌクレオチドHIV25PC（配列認識番号166）
Figure 0003602530
およびH65PH（配列認識番号164）を用いたPCRによりこれら２つの断片の融解を行なった。174bp PCR誘導断片をHind IIIとSac Iで切断し、Hind IIIとSac Iで切断したpBS−SKに挿入した（ストラタジェネ、ラジョラ、CA）。産生したプラスミドをpBSH6HIV2と称した。挿入はヌクレオチド配列分析により確認した。
HIV−２ env遺伝子の３′部分をPCRにより誘導した。この反応において、テンプレートとしてpISSY−KPN（MD、ベセスダ、NCI−NIH、Dr.ジェノベファフランチーニにより提供された）を用いてオリゴヌクレオチドHIV2B1（配列認識番号167）
Figure 0003602530
およびHIV2B2（配列認識番号168）
Figure 0003602530
に関して増幅した。この断片をBamH IとXba Iで切断した。この切断により誘導した150bp断片は、５′BamH Iおよび３′Xba I粘着末端を含有した。ワクシニアウイルス初期転写終止信号として認識されることが知られているT5NT配列モチーフを、終止コドンの後に含有するようにこの断片を操作した。
HIV−２ env遺伝子の大部分は、Sac IとBamH Iの切断によりpISSY−KPNから得た。この切断により産生された2.7kb断片を、遺伝子の３′末端に対応する150bp BamH I/Xba I断片とともにSac IとXba Iで切断したpBS−SKに挿入した。産生したプラスミドをpBSHIV2ENVと称した。
pBSH6HIV1からの174bp Spe I/Hind III断片とpBSHIV2ENVからの2.5kb Spe I/Xba I断片を、Hind IIIとXba Iで切断したpBS−SKに連結し、pBSH6HIV2ENVを産生した。pBSH6HIV3ENVからの2.7kb Hind III/Xba I挿入物を単離し、2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドした。このブラントエンドした断片をSma I切断pSD5HIVC挿入ベクターに挿入した。産生したプラスミドをpATIHIV2ENVと称した。このプラスミドを、治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに生体外組換え実験に用いてvP920を産生した。
イムノプレシピテーション分析を行なって、vP920が真正のHIV−２ gp160を発現するか否かを確認した。ベロ細胞単層を、疑似感染か、10PFU/細胞のm.o.i.で親ウイルスvP866に感染せしめるか、またはvP920に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、その細胞を、２％の牛の胎児の血清と［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlの修飾イーグル培地（メチオニンのない）で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％のNP−40、30mMのトリスpH7.4、150mMのNaCl、3mMのEDTA、0.03％のNa Azideおよび0.6mg/mlのPMSF）の添加と続いての細胞単層のひきかきにより感染から18時間後に細胞を収穫した。
感染細胞からの溶解産物を、HIV−２血清陽性個体（Dr.ジェノベッフェフランチーニから供給された）からの集積した血清を用いてHIV−２ env遺伝子発現に関して分析した。血清をvP866感染ベロ細胞で前吸着した。前吸着したヒト血清を、４℃の一晩のインキュベーションによりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間の後に、この物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常ヒト血清とタンパク質Ａセファロースで前浄化したした溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合した血清陽性個体からのヒト血清と、４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液で４回と、LiCl2/尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリス緩衝液（125mMのトリス（pH6.8）、４％のSDS、20％のグリセロール、10％の２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により沈殿タンパク質を免疫複合体から分離した。タンパク質を10％のドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）上で分画し、固定して蛍光光度法のために1MのNa−サリチル酸塩で処理した。
HIV−２血清陽性個体からのヒト血清は、vP920感染細胞からのHIV−２ gp160エンベロープ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめた。さらに、gp160ポリタンパク質を熟成gp120およびgp41タンパク質種に処理されるので、発現HIV−２ env遺伝子産生物の真正が確認された。疑似感染細胞またはNYVAC親ウイルスに感染した細胞からはHIV特異的タンパク質種は全く沈殿しなかった。また、vP920によるHIV−２ envの適切な発現の平衡は、遺伝子産生物はvP920感染細胞の表面上に発現されるということである。
gp120の発現
HIV−２ env遺伝子の５′末端に融解されたワクシニアウイルスH6プロモーターを含有するプラスミドpBSH6HIV2を、Spe IとHind IIIで切断し、これらの配列を含有する180bp断片を離生した。この断片をHind IIIとXba Iで切断したpBS−SKに、pBSHIV2120Aの1.4kb Spe I/Xba I断片とともに連結し、pSHIV2120Bを産生した。
最初にgp120暗号配列の３′部分をPCRにより誘導することにより、プラスミドpBSHIV2120Aを誘導した。PCRは、テンプレートとしてのpISSY−KPNとともにオリゴヌクレオチドHIV2120A（配列認識番号169）
Figure 0003602530
およびHIV2120B（配列認識番号170）
Figure 0003602530
を用いて行なった。PCR誘導断片をEcoR IとXba Iで切断し、５′EcoR I粘着末端と３′Xba I粘着末端を含有する300bp断片を産生した。この断片を、翻訳終止配列（TAA）と５′からXba I部位のT5NT配列モチーフについて操作した。300bpのXba I/EcoR I PCR断片を、pISSY−KPNから誘導された1.4kbのSac I/EcoR I断片とともにSac I/Xba Iで切断したpBS−SKに連結した。
プラスミドpBSHIV2120BをHind IIIとXba Iで切断し、３′に隣接したHIV−２ gp120暗号配列からワクシニアウイルスH6プロモーターを含有する1.8kb断片を産生した。この断片を、2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片とブラントエンドした。ブラントエンドした断片をSma Iで切断したpSDSHIVCに連結し、pATI HIV2120を産生した。このプラスミドを生体外組換え実験に用いてvP922を産生した。
vP922感染細胞のイムノプレシピテーション実験を、全縁HIV−２ env遺伝子の発現に関して上述したように行なった。疑似感染細胞またはvP866感染ベロ細胞からはHIV特異的種は沈殿しなかった。しかしながら、120kDaのタンパク質種が、vP922に感染した細胞から誘導した溶解産物から沈殿した。vP922により発現されたHIV−２ gp120は、vP920感染ベロ細胞の細胞表面上に存在することが分かった。
実施例21−NYVAC中のSIV遺伝子の発現
NYVAC/SIV gp140組換え体の産生
SIV（Mac142）env遺伝子を含有するプラスミドpSSIIEをDr.ジェノバフランチーニ（MD、ベセスダ、NCI−NIH）から得た。このプラスミドをHind IIIとPst Iで切断し、SIV env遺伝子のヌクレオチド220から翻訳終止コドンから160bp下流の領域を含有する2.2kbの断片を離生した。この断片をがゆうする発現カセッテは、gp160の種よりもgp140タンパク質種の発現となる。膜内外領域の40％欠損は、ゲノムのヌクレオチド7,934での成熟前終止から生じる（フランチーニら、1987）。env遺伝子産生物のそのような成熟前終止は、培養中のSIVの繁殖後には観察されない（コダマら、1989）。
テンプレートとしてのpSSIIEおよびオリゴヌクレオチドSIVENV1（配列認識番号171）
Figure 0003602530
とSIVENV2（配列認識番号172）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより遺伝子のアミノ部分を誘導した。産生した250bp断片は、ワクシニアウイルスH6プロモーターの３′側の20bp（Nru I部位の３′末端）から下流に隣接したSIV env遺伝子の５′側の230pbを含有する。SIV env遺伝子配列の80bpを除去するHind IIIの断片の切断により170bpの断片を得た。
成熟前終止信号の後のSIV env遺伝子の残りを含有する配列をPCRによりpSS35E（Dr.ジェノベファフランチーニから得た）から誘導した。このプラスミドは、SIV env遺伝子のＣ末端部分からenv遺伝子から下流のLTR領域を含有する配列を含有している。360bp断片を誘導するのに用いたオリゴヌクレオチドは、SIVENV3（配列認識番号173）
Figure 0003602530
とSIVENV4A（配列認識番号174）
Figure 0003602530
であった。この断片をPst IとEcoR Iで切断し、５′Pst I粘着末端と３′EcoR I粘着末端を有する260bp断片を産生した。
pSSIIEからの2.2kb Hind III/Pst I断片、遺伝子の５′末端を含有する170bpのNru I/Hind III断片および遺伝子の３′末端を含有する260bp Pst I/EcoR Iを、pRW838から誘導した3.1kbのNru I/EcoR Iと連結した。pRW838は、遺伝子のC5座への挿入を可能にするカナリヤポックスウイルス配列により側腹に位置する狂犬病Ｇ遺伝子に連結したワクシニアウイルスH6プロモーターを含有している。Nru IとEcoR Iの切断により、狂犬病Ｇ遺伝子を離生し、H6プロモーターの３′側20bpを除去する。ワクシニアH6プロモーターに連結したSIV env遺伝子を含有する産生したC5挿入プラスミドをpC5SIVENVと称した。
プラスミドpC5SIVENVをHind IIIとEcoR Iで切断し、SIV env遺伝子のヌクレオチド150から全縁遺伝子の末端までを含有する2.2kb断片を離生した。PCRを用いてpC5SIVENVからのワクシニアH6プロモーター/SIV env結合を、オリゴヌクレオチドMPSYN286（配列認識番号175）
Figure 0003602530
とSIVENV2（配列認識番号176）
Figure 0003602530
により誘導した。320bp断片をHind IIIで切断し、240bp断片を誘導した。2.2kb Hind III/EcoR Iと240bp Hind III断片をHind IIIとEcoR Iで切断したpC3Iにともに連結した。SIVenv暗号配列に関して適切な配向のHind III断片を含有する産生したプラスミドをpC3SINEMと称した。プラスミドpC3Iは以下のようにして誘導した。2.5kbのBgl IIカナリヤポックスウイルスゲノム断片のヌクレオチド配列分析により、全縁C3読取り枠と５′および３′非暗号領域が明確となった。C3読取り枠が完全に切除された、異種遺伝子のC3座への挿入のための供与体プラスミドを構成するために、PCRプライマーを用いてC3に対する５′および３′配列を増幅した。５′配列のプライマーは、RG277（配列認識番号177）
Figure 0003602530
およびRG278（配列認識番号178）
Figure 0003602530
であった。
３′配列のプライマーは、RG279（配列認識番号179）
Figure 0003602530
およびRG280（配列認識番号180）
Figure 0003602530
であった。ワクシニア転写および翻訳終止信号により側腹にある多重クローニング部位を含有するようにプライマーを設計した。また、左側アームと右側アームの５′末端と３′末端には、２つのアームをAsp718/Sac Iで切断したpBP−SKプラスミドベクターに連結せしめる適切な制限部位（左側アームにはAsp718とEcoR I、そして右側アームにはEcoR IとSac I）を含有した。産生したプラスミドをpC3Iと称した。
EcoR Iでの切断により、プラスミドpC3SIVEMを線状とした。続いての部分的なHind IIIでの切断により、2.7kbのHind III/EcoR I断片を離生した。この断片を、2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片での処理によりブラントエンドした。この断片をSma Iで切断したpSD550VCに連結した。産生したプラスミドをpSIVEMVCと称した。このプラスミドを、治療ウイルスとしてのvP866により生体外組換え実験に用いて、vP873を産生した。vP873はI4L座にSIV env遺伝子を含有した。
NYVAC/gag/polおよびgag組換え体の産生
gagおよびpol遺伝子を包含するSIV cDNA配列を含有するプラスミド、pSIVAGSSIIGをDr.ジェノベファフランチーニ（MD、ベセスダ、NCI−NIH）から得た。このプラスミドからのgagおよびpol遺伝子を、ワクシニアtkフランキングアームの間のワクシニアI3Lプロモーターに対して３′に隣接せしめた。これは、gagおよびI3Lプロモーターに対応するオリゴヌクレオチドSIVL1（配列認識番号181）
Figure 0003602530
とSIVL2（配列認識番号182）
Figure 0003602530
を含有するpSIVGAGSSIIGの4,800bp Cfo I/Tag I断片をpSD460の誘導体であるpSD542の4,070bp Xho I/Acc I断片中にクローニングすることにより行なった（第１図）。この操作により産生したプラスミドをpSIVG1と称した。
pol遺伝子を除去するために、オリゴヌクレオチドSIVP5（配列認識番号183）
Figure 0003602530
およびSIVP6（配列認識番号184）
Figure 0003602530
を用いて、215bpのPCT断片をpSIVGAGSSIIGから誘導した。PCR誘導断片をBamH IとStu Iで切断し、SIVG1の5,370bpの部分的なBamH I/Stu I断片に連結した。これにより、pSIVG2が産生した。pSIVG2を、治療ウイルスとしてのvP873と生体外組換え実験に用いてvP948を産生した。
gafとpolの両者をNYVACベースのベクターに挿入するプラスミドを以下のようにして操作した。上述したpSIVG1は、1kbのPCR断片を用いて除去した異種３′非暗号配列を含有する。この断片を、オリゴヌクレオチドSIVP5とSIVP6によりプラスミドpSIVGAGSSIIGから産生した。pol遺伝子の３′末端を含有するこのPCR誘導断片をBamH IとHpa Iで切断した。1kbのBamH I/Hpa I断片をpSIVG1の7,400bpの部分的なBamH I/Hpa I断片に連結し、pSIV4を産生した。
pSIV4の配列分析により、pol遺伝子内に１つの塩基対欠損が発見された。このエラーを修正するために、pSIVG1からの2,300bpのBgl I/Stu I断片をpSIVG4の6,100bpの部分的なBgl I/Stu I断片に挿入し、pSIVG5を産生した。プラスミド、pSIVG5を、治療としてのvP873とともに生体外組換え実験に用いてvP943を産生した。
NYVAC/SIV p16およびp28組換え体の産生
p28、p2、p8、p1およびp6をコードするgag遺伝子の部分とpol遺伝子をpSIVG1から除去した。これは、オリゴヌクレオチドSIVL10（配列認識番号185）
Figure 0003602530
およびSIVL11（配列認識番号186）
Figure 0003602530
をpSIVG1の4,430bp Acc I BamH I断片中にクローニングすることにより行ないpSIVG3を産生した。このプラスミドは、ワクシニアI3Lプロモーターにより発現されたSIV p17遺伝子産生物の発現カセッテを含有する。
昆虫ポックスウイルス42kDaプロモートしたSIV p28遺伝子（５′末端のみ）をI3Lプロモートしたp17遺伝子から下流に挿入した。これは、p28遺伝子の５′末端を含有するpSIVGIの360bp BspM I/BamH I断片、昆虫ポックス42kDaプロモーターを含有するオリゴヌクレオチドpSIVL14（配列認識番号187）
Figure 0003602530
およびSIVL15（配列認識番号188）
Figure 0003602530
を、pSIVG3の4,470bpの部分的なXba I/BamH I断片中にクローニングすることにより行なった。産生したプラスミドをpSIVG6と称した。
次いでp28遺伝子の３′部分をpSIVG6中に挿入した。SIV p28遺伝子の３′末端を含有する290bp PCR断片を、オリゴヌクレオチドSIVP12（配列認識番号189）
Figure 0003602530
およびSIVP13（配列認識番号190）
Figure 0003602530
を用いてpSIVGIから誘導した。この断片をBamH Iで切断し、pSIVG7の4,830bpの断片に連結し、治療ウイルスとしてのvP866とvP873とともに生体外組換え実験に用いて、それぞれvP942およびvP952を産生した。
発現アッセイ
SIV gp140 env遺伝子産生物は、感染細胞の形質膜と関連した典型的な糖タンパク質である。これは112kDaの細胞外種と28kDaの膜内外領域に対してタンパク質分解的に開裂された140kDaのポリタンパク質として発現される（フランチーニら、1987）。SIVに血清陽性のアカゲサルマカクからの血清と続いてウサギ抗サルIgGに接合したフルオレセインを用いた免疫発光分析により、組換え体感染ベロ細胞の表面にenv遺伝子産生物の発現が示された。表面発現は、疑似感染細胞またNYVAC（vP866）親ウイルスに感染した細胞の表面には観察されなかった。さらに、gag遺伝子のみを含有する組換え体に感染した細胞は、表面にSIV成分を発現したことを示さなかった。vP873、vP943、vP948およびvP952に感染した細胞中の表面発現はすべて表面発現を示し、SIV env遺伝子を著しく含有する。
NYVAC/HIV組換え体に感染したベロ細胞中の発現SIV遺伝子産生物（envおよびenv）の真正をイムノプレシピテーショにより分析した。10のm.o.i.でベロ細胞を個々の組換えウイルス、NYVAC親ウイルスに感染せしめ、または疑似感染せしめた。吸着期間の１時間後、接種物を除去し、感染細胞を、［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlのメチオニン不含有培地で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａの添加により、感染から17時間後に全ての試料を収穫した。感染細胞からの溶解産物を、SIV血清陽性アカゲサルマカクからの集積血清、またはgag p24遺伝子産生物に特異的な単クローン性抗体（両者ともMD、ベセスダ、NIC−NIH、Dr.ジェノベファフランチーニから得た）に関して分析した。
SIV血清陽性のマカクの血清に関してイムノプレシピテーションを以下のようにして行なった。マカク血清を、タンパク質Ａセファロースとともに４℃で16時間に亘りインキュベーションした。緩衝液Ａによる洗浄後、タンパク質Ａセファロースに結合した血清を、通常のサル血清とタンパク質Ａセファロースで前浄化した溶解産物に加えた。４℃での一晩のインキュベーション後、沈殿物を緩衝液Ａで４回とLiCl/尿素緩衝液で２回洗浄した。沈殿したタンパク質を抗体から分離するために、試料を80μｌの２×ラエムリ緩衝液中で５分間沸騰せしめた。ドリファスゲルシステムを用いて12.5％のゲル上で試料を分画した（ドリファスら、1984）。ゲルを固定して、蛍光光度法のために1MのNa−サリチル酸塩で処理した。SIV遺伝子を含有する全ての組換え体を適切な遺伝子産生物を発現していた。SIV env遺伝子を含有するNYVAC組換え体vP873、vP943、vP948およびvP952は全て真正のgp140を発現した。しかしながら、gp140タンパク質の112kDaおよび28kDa熟成形状への処理を評価するのは困難である。疑似感染ベロ細胞、vP866感染ベロ細胞およびSIV env遺伝子を含有しないNYVAC/SIV組換え体に感染した細胞からのマカク抗SIV血清によっては、140kDaのみかけ分子量を有する種は沈殿しなかった。SIVに感染したマカクからの集積血清およびp28 gag成分に特異てきな単クローン性抗体を用いて、vP942、vP943、vP948、およびvP952によるSIVgagコード遺伝子産生物の発現が示された。ベロ細胞中のNYVAC（vP948）によりプロテアーゼ機能を含むpol領域のない全縁p55 gagタンパク質の発現は明確である。これらの結果により、SIVプロテアーゼ発現の欠如はp55の熟成形状への完全なタンパク質分解を妨げることが示された。p28に特異的な単クローン性抗体を用いてgag特異的遺伝子産生物をvP948感染ベロ細胞から沈殿させる場合、このことはより明確に示される。この結果に対して、vP943感染ベロ細胞中にpol遺伝子（プロテアーゼを含む）を有するSIV gagの発現により、発現されたp55 gag前駆体ポリペプチドがその熟成形状にタンパク質分解的に開裂させることができた。
SIVに感染したマカクからの集積血清を用いて、vP942およびvP952感染ベロ細胞中のp16とp28 SIV遺伝子産生物の両方の発現が示された。p28に特異的な単クローン性抗体は明らかにp28発現成分のみを認識した。
実施例22−アビアンインフルエンザウイルスの血球凝集素糖タンパク質を発現するTROVAC組換え体の構成
この実施例は、アビアンインフルエンザウイルスの３つの血清型の血球凝集素遺伝子を発現する鶏痘ウイルス組換え体の展開を記載するものである。
細胞およびウイルス
H4、H5およびH7血球凝集素遺伝子のcDNAクローンを含有するプラスミドを、テネシー州、メンフィスのセントジュード小児科研究病院のDr.ロバートウェブスターから得た。FP−１と称するFPVの菌株は以前に記載した（テイラーら、1988a、ｂ）。これは生後１日の鶏のワクチン接種に有用な弱毒化ワクチン菌株である。親ウイルス菌株デュベッティを、鶏からの鶏痘かいせんとしてフランスから得た。鶏の感染幼虫包蔵卵での50回の継代と続いてのニワトリ胚繊維芽細胞（CEF）での25回の継代によりウイルスを弱毒化した。このウイルスを、フランス、リヨン、ローンメリクスにより1980年の９月に得て、マスターウイルス種を設立した。1989年の９月にウイルスをバイロジェネティックスが受けとり、ここで４連続のプラーク精製を行なった。初代CEF細胞中で１つのプラーク単離体をさらに増幅し、TROVACと称する株ウイルスを設立した。TROVAC−AIH5（vFP89）およびTROVAC−AIH4（vFP92）を産生する生体外組換え試験に用いた株ウイルスをさらに初代CEF細胞中で８回の継代により増幅した。TROVAC−AIH7（vFP100）を産生するのに用いた株ウイルスはさらに初代CEF細胞中で12回の継代により増幅した。
F8座での鶏痘挿入プラスミドの構成
プラスミドpRW731.15は、TROVACゲノムDNAからクローニングされた10kbpのPvu II−Pvu II断片を含有する。ヌクレオチド配列を、3661bp Pvu II−EcoR V断片の両鎖に決定した。この配列を第21図に示す。F8としてこの研究所で称する読取り枠をこの配列内に決定した。読取り枠は位置704で開始し、位置888で終止する。隣接する読取り枠を妨害しないように、以下に記載するように、位置781から位置1928に欠損を作った。
プラスミドpRW761は、2430bp EcoR V−EcoR V断片を含有するpRW731.15のサブクローンである。F8 ORFは完全に、PRW761のXba I部位とSsp I部位の間に含有された。TROVACゲノムDNAによる組換えにおいてF8 ORFを除去する挿入プラスミドを産生するために、以下の工程を行なった。プラスミドpRW761をXba Iで完全に、Ssp Iで部分的に切断した。3700bpのXba I−Ssp I帯を単離して、アニールした二本鎖オリゴヌクレオチドJCA019（配列認識番号191）およびJCA018（配列認識番号129）
Figure 0003602530
と連結した。
この連結により産生したプラスミドをpJCA002と称した。プラスミドpJCA004は、プラスミドpJCA002中のワクシニアウイルスH6プロモーターに連結した非関連遺伝子を含有する。ワクシニアウイルスH6プロモーターの配列は以前に記載した（テイラーら、1988a、b;グオら、1989;パーカスら、1989）。プラスミドpJAC004を、非関連遺伝子とH6プロモーターの３′末端の部分を欠損せしめるEcoR VとBamH Iで切断した。アニールしたオリゴヌクレオチドRW178（配列認識番号193）およびRW179（配列認識番号194）をEcoR VとBamH Iで切断し、JCA004のEcoR VとBamH I部位の間に挿入し、pRW846を形成した。
Figure 0003602530
それゆえ、プラスミドpRW846は、de−ORFed F8座にEcoR VのH6プロモーター５′を含有する。pRW846中のH6プロモーターには、終止コドン、ワクシニアウイルス初期プロモーターにより認識される転写終止配列（ユエンら、1987）およびSma I部位が続いている。
F7座での鶏痘挿入プラスミドの構成
起源F7非de−ORFed挿入プラスミド、pRW731.13は、pUC9のPvu II部位に5.5kbのFPゲノムPvu II断片を含有した。挿入部位は、これらの配列内の特有のHinc II部位であった。第22図に示したヌクレオチド配列は、特有のHinc II部位を包含する2356bp領域に関して決定した。この配列の分析により、特有のHinc部位（第22図での下線）が90アミノ酸のポリペプチドをコードするORF内に位置することが示された。ORFは、位置1531でのATGで開始し、位置898で終止する（第22図の矢印により示した位置）。
de−ORFed挿入プラスミドのアームを、テンプレートとしてのpRW731.13を用いたPCRにより誘導した。ORFから上流の領域に対応する596bpアーム（HBと称する）を、オリゴヌクレオチドF73PH2（配列認識番号195）
Figure 0003602530
およびF73PB（配列認識番号196）
Figure 0003602530
で増幅した。ORFから下流の領域に対応する270bpアーム（EHと称する）を、オリゴヌクレオチドF75PE（配列認識番号197）
Figure 0003602530
およびF73PH1（配列認識番号198）
Figure 0003602530
で増幅した。
断片EHをEcoR Vで切断し、126bp断片を産生した。EcoR V部位は３′末端であり、５′末端はHinc II部位の３′末端を含有するようにPCRにより形成した。この断片を、Hinc IIで切断したpBS−SK（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入し、プラスミドpF7D1を形成した。配列を、ジデオキシヌクレオチド配列分析により確認した。プラスミドpF7D1をApa Iで線状化し、T4 DNAポリメラーゼを用いてブラントエンドし、596bp HB断片に連結した。産生したプラスミドをpF7D2と称した。全縁配列と包囲をヌクレオチド配列分析により確認した。
プラスミドpF7D2をEcoR VとBgl IIで切断し、600bp断片を産生した。この断片を、Apa Iで切断されたpBS−SKに挿入し、T4 DNAポリメラーゼでブラントエンドし、続いてBamH Iで切断した。産生したプラスミドをpF7D3と称した。このプラスミドは、404bpのHBアームと126bpのEHアームを含有する。
プラスミドpF7D3をXho Iで線状化し、2mMのdNTPの存在下で、E.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片によりブラントエンドした。この線状化したプラスミドを、アニールしたオリゴヌクレオチドF7MCSB（配列認識番号199）
Figure 0003602530
およびF7MCSA（配列認識番号200）
Figure 0003602530
に連結した。これを行なって、Hind III、Pst IおよびSma Iの制限部位を含有する多重クローニング領域をEHとHBアームの間に挿入した。産生したプラスミドをpF7DOと称した。
F8座でのH4血球凝集素の挿入プラスミドの構成
プラスミドpTM4H833中に、A/Ty/Min/833/80から誘導したアビアンインフルエンザH4をコードするcDNAコピーをDr.R.ウェブスターから得た。このプラスミドをHind IIIとNru Iで切断し、dNTPの存在下でDNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。H4暗号領域を含有するブラントエンドした2.5kbpのHind III−Nru I断片をpIBI25（CT、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）のHinc II部位に挿入した。産生したプラスミドpRW828を部分的にBan IIで切断し、線状産生物を単離し、Hind IIIで再度切断した。100bp Hind III−Ban Iが欠損したプラスミドpRW828を、合成オリゴヌクレオチドRW152（配列認識番号201）およびRW153（配列認識番号202）のベクターとして用いた。これらのオリゴヌクレオチドは、EcoR V部位からのH6踏めの３′部分を表し、プロモーターのATGをH4 cDNAのATGと配列させる。
Figure 0003602530
オリゴヌクレオチドをアニールし、Ban IIとHind IIIで切断し、上述したHind III−Ban IIが欠損したpRW828ベクターに挿入する。産生したプラスミドpRW844をEcoR VとDra Iで切断し、３′H6プロモートしたH4暗号配列を含有する1.7kbp断片をpRW846（前出）のEcoR VとHinc II部位の間に挿入し、プラスミドpRW848を形成した。それゆえ、プラスミドpRW848は、鶏痘ウイルスのde−ORFedF8座のワクシニアウイルスH6プロモーターに連結したH4暗号配列を含有する。
F8座でのH5血球凝集素の挿入プラスミドの構成
プラスミドpTH29中に、A/ターキー／アイルランド/1378/83から誘導したアビアンインフルエンザH5のcDNAクローンをDr.R.ウェブスターから得た。合成オリゴヌクレオチドRW10（配列認識番号203）からRW13（配列認識番号206）を、前述したワクシニアウイルスH6プロモーターの翻訳開始コドンとH5遺伝子のATGが重複するように設計した。配列はH5遺伝子の５′Sal I部位を通じて継続し、H5終止コドンを含有する３′H5 Dra I部位で再度開始する。
Figure 0003602530
オリゴヌクレオチドを95℃で３分間アニールし、続いて室温で徐冷した。これにより、表示した末端を有する以下の二本鎖構造となる。
Figure 0003602530
pRW742BのEcoR VおよびPst I部位の間のオリゴヌクレオチドのクローニングによりpRW744が産生した。プラスミドpRW742Bは、前述したpRW731.15のHinc II部位に挿入された非関連遺伝子に連結したワクシニアウイルスH6プロモーターを含有する。Pst IとEcoR Vの切断により、H6プロモーターの３′末端と非関連遺伝子が除去される。プラスミドpRW744はここで、アビアンインフルエンザH5のATGと重複するH6プロモーターの３′部分を含有する。このプラスミドはまた、H5配列から５′Sal I部位までとH5終止コドン（Dra I部位を含有する）からの３′配列を含有する。Dra I部位を使用するとH5 ３′非暗号末端が除去される。オリゴヌクレオチドは、初期ワクシニアウイルスRNAポリメラーゼにより認識される転写終止信号を加える（ユエンら;1987）。H6プロモートしたH5構造を完成するために、H5暗号領域をpTH29から1.6kbp Sal I−Dra I断片として単離した。プラスミドpRW744を部分的にDra Iで切断し、線状断片を単離し、Sal Iで再度切断した。ここでSal IとDra Iの間の８つの塩基が欠損したプラスミドを、1.6kbpのpTH29 Sal IおよびDra I断片のベクターとして用いた。産生したプラスミドをEcoR VとDra Iで切断した。３′H6プロモーターおよびH5遺伝子を含有する1.7kbp PRW759 EcoR V−Dra I断片をpRW846（前出）のEcoR VとHinc II部位の間に挿入した。産生したプラスミドpRW849は、de−ORFdeF8座にH6プロモートしたアビアンインフルエンザウイルスH5遺伝子を含有する。
F7座でのH7血球凝集素の挿入ベクターの構成
A/CK/VIC/1/85からのH7血球凝集素を含有するプラスミドpCVH71をDr.R.ウェブスターから得た。H7遺伝子を含有するEcoR I−BamH I断片をDNAポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドし、PRW827としてpIBI25のHinc II部位に挿入した。合成オリゴヌクレオチドRW165（配列認識番号207）およびRW166（配列認識番号208）をアニールし、Hinc IIとSty Iで切断し、pRW827のEcoR VとSty I部位の間に挿入してpRW845を産生した。
Figure 0003602530
オリゴヌクレオチドRW165（配列認識番号207）およびRW166（配列認識番号208）は、H6プロモーターの３′部分をH7遺伝子に連結させる。pRW845のApaL I切断の線状産生物を単離し、これをEcoR Iで再度切断し、最大の断片を単離して合成オリゴヌクレオチドRW227（配列認識番号209）およびRW228（配列認識番号210）でアニールすることにより、H7遺伝子の３′非暗号末端を除去した。産生したプラスミドはpRW854であった。
Figure 0003602530
PRW854中のH7の終止コドンの次にはHpa I部位が続いている。de−ORFed F7座中の中間H6プロモートしたH7構造（以下に記載する）を、EcoR Vで切断し、そのPst I部位でブラントエンドしたpRW858中にpRW854 EcoR V−Hpa I断片を移動せしめることにより産生した。プラスミドpRW858（以下に記載する）はF7 de−ORFed挿入プラスミド中にH6プロモーターを含有する。非関連遺伝子に連結したH6プロモーターを含有する850bp Sma I/Hpa I断片を前述したpF7DOのSma I部位に挿入することによりプラスミドpRW858を構成した。pRW858をEcoR V（H6プロモーターの３′末端の24bp上流の部位）とPst Iでの切断により非関連配列を切除した。産生した3.5kb断片を単離し、2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。このブラントエンドした断片を、pRW854（前出）から誘導した1700bpのEcoR V/Hpa I断片に連結した。このEcoR V/Hpa I断片は、VV H6プロモーターの３′側の24bpに隣接した３′の全縁AIV HA（H7）遺伝子を含有する。産生したプラスミドをpRW861と称した。
126bp EHアーム（以前に規定した）をpRW861中で延長せしめ、組換え頻度をゲノムTROVAC DNAで増大せしめた。このことを達成するために、575bp Acc I/SnaB I断片をpRW731.13（前に規定した）から誘導した。この断片を単離し、pRW861のAcc IとNae I部位の間に挿入した。725bpのEHアームとAIV H7を側腹に有する404bpのHBアームを含有する、産生したプラスミドをpRW869と称した。それゆえ、プラスミドpRW869は、５′末端でワクシニアウイルスH6プロモーターに連結したH7暗号配列からなる。左側のフランキングアームは、404bpのTROVAC配列からなり、右側フランキングアームは、de−ORFed F7座への挿入を指向する725bpのTRVAC配列からなる。
TROVACアビアンインフルエンザウイルスの展開
アビアンインフルエンザウイルスHA暗号配列を含有する挿入プラスミドを、前述したリン酸カルシウム沈殿法を用いてTROVAC感染初代CEF細胞に個々に移入した（パニカリら、1982;ピッチーニら、1987）。HA特異的放射線標識プローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な個体群となるまで、連続したプラーク精製を行なった。次いで１つの代表的なプラークを増幅して株ウイルスを産生した。プラスミドpRW849を生体外組換え試験に用いてH5血球凝集素を発現する組換え体TROVAC−AIH5（vFP89）を産生した。プラスミドpRW848を用いてH4血球凝集素を発現する組換え体TROVAC−AIH4（vFP92）を産生した。プラスミドpRW869を用いて、H7血球凝集素を発現する組換え体TROVAC−AIH7（vFP100）を産生した。
蛍光光度法
インフルエンザウイルス感染細胞において、HA分子を合成し、粗い小胞体での前駆体分子としてグリコシル化する。形質膜に通過中に、ジスルヒド連結HA1およびHA2サブユニットへのタンパク質分解開裂となる広範囲の後翻訳修飾と、続いて熟成ウイルスエンベロープに含まれる宿主細胞膜への挿入を経る。TROVAC−AIV組換えウイルスに感染した細胞中に産生されたHA分子が細胞表面上に発現されたか否かを測定するために、蛍光光度法を行なった。間接蛍光光度法を記載したように行なった（テイラーら、1990）。間接蛍光光度法により、TROVAC−AIH5のH5血球凝集素、TROVAC−AIH4のH4血球凝集素、およびTROVAC−AIH7のH7血球凝集素の表面発現を確認した。H5HAに特異的な単クローン性抗体の貯留を用いて、H5血球凝集素の発現を検出した。ヒツジ単特異的抗H4血清を用いてH4HAの発現を分析した。H7特異的単クローン性抗体標品を用いてH7HAの発現を分析した。
イムノプレシピテーション
血球凝集素ポリペプチドの開列はウイルス粒子が感染性であるために必要であるので、血球凝集素分子の開裂部位がウイルスの毒性を決定するのに重要な役割を果たすことが分かっている。毒性H5およびH7ウイルスの血球凝集素タンパク質はHA1のカルボキシ末端に１つより多くの塩基アミノ酸を有している。これにより、一連の塩基アミノ酸を認識する細胞プロテアーゼが血球凝集素を開裂でき、感染ウイルスが生体外と体内の両方に広がる。H4無毒性菌株の血球凝集素分子は、異種トリプシンが加えられるまで、組織培養中で開裂されない。
TROVAC組換え体により発現された血球凝集素分子が確実に処理されたことを測定するために、上述した特異的試薬を用いて記載したように（テイラーら、1990）イムノプレシピテーションを行なった。
TROVAC−AIH5（vFP89）により発現されたH5血球凝集素のイムノプレシピテーション分析により、糖タンパク質は、それぞれ約44および23kDaの分子量を有する２つの開裂産生物HA1およびHA2として明確であることが示された。未感染細胞または親TROVACに感染した細胞からはそのようなタンパク質は沈殿しなかった。TROVAC−AIH7（vFP100）により発現された血球凝集素の同様のイムノプレシピテーション分析により、HA2開裂産生物の特異的な沈殿が示された。HA1開裂産生物は確認されなかった。未感染CEF細胞またはTROVAC感染CEF細胞からはタンパク質は特異的には沈殿しなかった。これに対して、TROVAC−AIH4（vFP92）の発現産生物のイムノプレシピテーション分析により、前駆体タンパク質HA0のみの発現が示された。これは、組織培養中の無毒性亜種の血球凝集素に開裂のないことと一致する。未感染CEF細胞またはTROVACに感染した細胞にはH4特異的タンパク質は検出されなかった。
実施例23−３つのアビアンインフルエンザ遺伝子を発現する３重組換え体の発生
プラスミドの構成
プラスミドpRW849は以前に記載しており、H6プロモートしたアビアンインフルエンザH5遺伝子を含有する。このプラスミドをvFP89の発生に用いた。プラスミドpRW861は、vFP100の発生に用いた以前に記載した中間プラスミドであった。このプラスミドは、H6プロモートしたアビアンインフルエンザH7遺伝子を含有する。プラスミドpRW849をSma Iで切断し、H6プロモーターの５′末端からH5遺伝子までの産生した1.9kbpの断片をpRW861のSma I部位に挿入し、pRW865を産生した。H4暗号配列を挿入するために、プラスミドpRW848を用いた。プラスミドpRW848をvFP92の発生に用いた。このプラスミドをH6プロモートしたH4遺伝子を含有する（前述）。プラスミドpRW848をSma Iで切断し、H6プロモートしたH4暗号配列を含有する1.9kbpの断片をH6プロモートしたH5配列のSma I部位５′でpRW865に挿入した。それゆえ、産生したプラスミドpRW872は、F7 de−ORFed挿入プラスミド中にH4、H5およびH7暗号配列を含有する。
遺伝子のde−ORFed F8座への挿入を指向するために、pRW872を部分的にSma Iで切断し、線状断片を単離し、Hind IIIで再度切断した。３つのH6プロモートしたアビアンインフルエンザ遺伝子を含有する5.7kbpのSma IからHind III pRW872断片をブラントエンドし、Hinc IIで切断されたpCEN100に挿入した。プラスミドpCEN100は、転写および翻訳終止信号および多重挿入部位を含有するde−ORFed F8挿入ベクターである。プラスミドpCEN100を以下のように産生した。合成オリゴヌクレオチドCE205（配列認識番号211）およびCE206（配列認識番号212）をアニールし、ホスホリル化し、pJCA002（前述）のBamH IおよびHind III部位に挿入し、pCE72を形成した。pCE72からのBgl IIからEcoR I断片をpJCA021のBgl IIおよびEcoR I部位に挿入し、pCEN100を形成した。
Figure 0003602530
pRW731−15（前述）からの4900bp Pvu II−Hind II断片をpBSSKTのSma IおよびHind II部位に挿入することにより、プラスミドpJCA021を得た。
最終の挿入プラスミドpRW874は、欠損F8 ORFと同一の方向に転写した。３つのアビアンインフルエンザHA遺伝子を有した。H4遺伝子に隣接したプラスミドの左側フランキングアームは、2350bpの鶏痘配列からなるものであった。H7遺伝子に隣接する右側フランキングアームは1700bpの鶏痘配列からなるものであった。このプラスミドの線状表示を以下に示す。
Figure 0003602530
組換え体vFP122の発生
前述したリン酸カルシウム沈殿法（パニカリら、1982;ピッチーニら、1987）を用いて、プラスミドpRW874をTROVAC感染初代CEF細胞中に移入した。特異的H4、H5およびH6放射線標識プローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択し、純粋な個体群となるまで、５連続のプラーク精製を行なった。前述した特定の試薬を用いたプラークイムノスクリーンにより、３つの糖タンパク質の全ての表面発現を確認した。２回の増幅後に、挿入遺伝子の安定性を確認し、組換え体をvFP122と称した。
実施例24−ALVACおよびNYVACのLD50の様々なワクシニアウイルス菌株との比較
ネズミ
オスの非近交スイスウェブスターネズミをタコニック農場（NY、ジャーマンタウン）から購入し、生後３週間までネズミに任意に餌と水を与え続けた（「通常の」ネズミ）。新生の非近交スイスウェブスターネズミは両方の性であり、タコニック農場により行なわれた妊娠により得た。使用した全ての新生ネズミは２日間で生まれたものであった。
ウイルス
カナリヤポックス個体群のプラーク精製によりALVACを誘導し、初代ニワトリ胚繊維芽細胞（CEF）において調製した。ショ糖密度勾配の遠心分離により精製に続いて、CEF細胞中でユニットを形成するプラークに関してALVACを列挙した。WRの巨大なプラーク表現型の選択により、ワクシニアウイルスのWR（Ｌ）変形を誘導した。ワクシニアウイルスのエス（Wyeth）ニューヨーク州保健局ワクチン菌株を、対照番号302001Bとして、製薬牛リンパ型ワクチンドライバックスから得た。コペンハーゲン菌株ワクシニアウイルスVC−２を、フランスのインスティテュートメリクスから得た。ワクシニアウイルス菌株NYVACをコペンハーゲンVC−２から誘導した。エス菌株を除いて全てのワクシニアウイルス菌株はベロアフリカグリーンサル肝臓細胞中で培養し、ショ糖勾配密度遠心分離により精製し、ベロ細胞上のユニットを形成するプラークに関して列挙した。エス菌株をCEF細胞中で成長せしめ、CEF細胞中で列挙した。
接種
10匹の通常のネズミの群に、無菌の食塩加リン酸緩衝液中で株標品を10倍に希釈することにより調製したウイルスいくつかの希釈物の１つの0.05mlを頭蓋内（ic）により接種した。ある例においては、未希釈の株ウイルス標品を接種に用いた。
0.03mlの接種容量を用いたことを除いて、生後１または２日の10匹の新生ネズミの群に頭蓋内に通常のネズミと同様に接種した。
接種後、全てのネズミを14日間（新生ネズミ）または21日間（通常のねすみ）に亘り、死亡率を毎日観察した。接種後の翌朝に死亡したネズミは、外傷による潜在的な死のために除外した。
実験個体群の50％の死亡率となるのに必要な致死量（LD50）を、リードとミュンヒの比例法により決定した。
ic経路による通常、若い非近交ネズミに関するALVACおよびNYVACのLD50と様々なワクシニアウイルス菌株との比較
若い通常のネズミにおいて、NYVACおよびALVACの毒性は、試験した他のワクシニアウイルス菌株よりも数桁低い大きさであった（表28）。NYVACおよびALVACは、通常のネズミにおいてエス菌株よりも3,000倍も毒性が弱く；親VC−２菌株よりも12,500倍も毒性が弱く;WR（Ｌ）変形よりも63,000,000倍も毒性が弱いことが分かった。これらの結果により、NYVACは他のワクシニア菌株と比較して非常に弱毒化されており、ALVACは頭蓋内に施されたときに若いネズミにとっては一般的に無毒性であるが、両者とも、この経路による接種の未決定の機構による非常に高い接種量（3.85×108PFU、ALVACおよび３×108PFU、NYVAC）ではネズミを死に至らせる。
ic経路による新生非近交ネズミに関するALVACおよびNYVACのLD50と様々なワクシニアウイルス菌株との比較
頭蓋内（ic）抗原投与モデルシステムの滴定により、通常の新生ネズミに関して５ポックスウイルス菌株の相対毒性を試験した（表29）。最終点での死亡率に関して、LD50値は、ALVACは、ワクシニアウイルスのエスワクチン菌株よりも100,000倍も毒性が弱く；ワクシニアウイルスのコペンハーゲンVC−２菌株よりも200,000倍も毒性が弱く；ワクシニアウイルスWR−Ｌ変形よりも25,000,000倍も毒性が弱いことが示された。言うまでもなく、試験した最高の接種量、6.3×107PFUでは、100％の死亡率となった。33.3％の死亡率は、6.3×106PFUで観察された。最高接種群のネズミの平均生存時間（MST）（約6.3LD50）は6.7±1.5日であるので、死亡の原因は、実際には決定されないが、毒性学的性質または外傷性質によるものではないようである。MSTが4.8±0.6日である5LD50の抗原投与量でのWR（Ｌ）と比較した場合、ALVACを抗原投与したネズミのMSTは著しく長い（Ｐ＝0.001）。
NYVACと比較して、エスは、15,000倍も毒性が強く;VC−２は35,000倍も毒性が強く;WR（Ｌ）は3,000,000倍も毒性が強いことが分かった。ALVACと同様に、NYVACの２つの最高接種量、６×108および６×107PFUでは100％の死亡率となった。しかしながら、380LD50に対応する、最高接種量を抗原投与したネズミのMSTは、２日のみであった（２日目に９匹死に、４日目に１匹死んだ）。対称的に、500LD50と等量の、WR−Ｌの最高接種量を抗原投与した全てのネズミは４日目まで生存した。
Figure 0003602530
Figure 0003602530
実施例25−EHV−１ gB、gCおよびgD糖タンパク質相同物を発現するNYVACベースの組換え体の産生
ワクシニアウイルスI3Lプロモーターの制御下にEHV−１ gB相同物遺伝子を配することにより、EHV−１ gB糖タンパク質の発現を行なった。ワクシニアウイルスH6プロモーターの制御下にEHV−１ gC相同物遺伝子を配することによりEHV−１ gC糖タンパク質の発現を行なった。昆虫ポックスウイルス42K遺伝子プロモーターの制御下にEHV−１ gD相同物遺伝子を配することによりEHV−１ gD糖タンパク質の発現を行なった。
vP1025の産生（ATI座におけるgBおよびgC;HA座におけるgD）
供与体プラスミドpJCA042の産生
EHV−１ gB暗号配列の430bpの５′側領域を、テンプレートとしてのプラスミドpJCA011（ATI座カセッテH6−EHV−１ gB）およびオリゴヌクレオチドJCA156（配列認識番号223）
Figure 0003602530
とJCA157（配列認識番号224）
Figure 0003602530
を用いてPCT誘導し、BamH Iで切断してキナーゼした。この430bpの断片を、テンプレートとしてのプラスミドpMP691（I3L101RAB）およびオリゴヌクレオチドJCA158（配列認識番号225）
Figure 0003602530
とMP287（配列認識番号226）
Figure 0003602530
を用いて得られたI3Lプロモーター要素を含有する120bpのPCT誘導断片に融合した。この120bp断片をXba Iで切断し、EHV−１ gB断片の430bp ５′側領域と連結する前にキナーゼした。産生したプラスミドをpJCA034と称した。pJCA034の直接の塩基配列決定法により、接合I3L−ATGおよびEHV−１ ５′側領域のI3Lプロモーターの配列を確認した。プラスミドpJCA034をSma IとBamH Iで切断して550bpのSma I−I3L−EHV−１ gB ５′−BamH I断片（Ａ）を切除した。プラスミドpMP665（COPCSシステム中のカセッテH6−HEV−１ gB）をBamH IとXho Iで切断し、2530bpのBamH I−EHV−１ gB ３′断片（Ｂ）を切除した。次いで断片ＡおよびＢをともに、Sma IとXho Iで切断したベクターpSD541VC（ATI deorfed座）に連結し、pJCA037を産生した。プラスミドpJCA037は、ATI deorfed座にカセッテI3L−EHV−１ gBを含有する供与体プラスミドである。プラスミドpJCA037をSma IとXho Iで切断し、3050bpのSma I−I3L−EHV−１ gB−Xho I断片（Ｃ）を単離した。225bpのKpn I−EHV−１ gC ３′末端浄化Hind III断片を、プラスミドpVHAH6g13（HAdeorfed座のカセッテH6−EHV−１ gC）およびオリゴヌクレオチドJCA154（配列認識番号227）
Figure 0003602530
とJCA163（配列認識番号228）
Figure 0003602530
を用いてPCR誘導し、Kpn IとHind IIIで切断し、Kpn IとHind IIIで切断したベクターpBS−SK+中に連結し、pJCA033を産生した。pJCA033の直接の配列塩基決定方により確認した。プラスミドpJCA033をKpb IとEcoR Vで切断し、22bpKpn I−EHV−１ gC′末端EcoR V断片（Ｄ）を単離した。プラスミドpVHAH6g13をBgl IIとKpn Iで切断し、1330bpのBgl II−H6−EHV−１ gC ５′Kpn I断片（Ｅ）を単離した。
断片Ｃ、ＤおよびＥを最終的に、Bgl IIとXho Iで切断したベクターpSD541VC中にともに連結し、プラスミドpJCA042を産生した。プラスミドpJCA042は、NYVAC ATI deorfed座にI3L−EHV−１ gB−−H6−EHV−１ gC二重構造を挿入する供与体プラスミドである。プラスミドpJCA042はIVRの前にNot Iを用いて線状化した。
供与体プラスミドとしてのpJCA042および治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）を用いてベロ細胞上で生体外組換え実験を行なった。標準プロトコルを用いて組換えウイルスを同定し精製した（ピッチーニら、1987）。ATI deorfed座にEHV−１ gBおよびgC遺伝子を含有するNYVACベースの組換え体をvP956と称した。
供与体プラスミドpJCA064の産生
プラスミドpEHV1BamH I D（EHV−１ BamH I Ｄ断片を含有する）をHind IIIで切断し、全縁EHV−１ gD暗号配列を含有するが15 ５′側bpを含有しない1240bpのHind III−Hind IIIを切除した。1240bpのHind III−Hind III断片をクレノウポリメラーゼでブラントエンドし、Sma Iで切断したベクターpCOPCS657に連結し、ホスファターゼした。産生したプラスミドはpJCA006と称した。プラスミドpJCA006をBgl IIとHind IIIで切断し、1500bpのHind III−H6−−EHV−１ gD−Bgl II断片を切除した。この断片を、BamH IとHind IIIで切断したベクターpIBI24に連結し、プラスミドpEHV1gp50aを産生した。プラスミドpEHV1gp50aを、両者とも特有部位であるEcoR VとNco Iで切断し、4100bp断片を切除した。この断片を、オリゴヌクレオチドJCA052（配列認識番号229）
Figure 0003602530
およびJCA053（配列認識番号230）
Figure 0003602530
との間のハイブリダイゼーションにより得た合成二本鎖オリゴヌクレオチドに連結した。産生したプラスミドをpgp50a3−２と称した。490bp EcoR I−EHV−１ gD ３′末端浄化−Hpa Iを、テンプレートとしてのプラスミドpJCA005およびオリゴヌクレオチドJCA041（配列認識番号231）
Figure 0003602530
とJCA099（配列認識番号232）
Figure 0003602530
を用いてPCT誘導した。プラスミドpgp50a3−２をEcoR Iで切断し、Hind IIIで部分的に切断し、850bp Hind III−H6−EHV−１ gD ５′−EcoR I断片を切除した。この断片を490bpのEcoR I−Hpa I断片とともにHind IIIとSma Iで切断したベクターpBS−SK+に連結し、プラスミドpJCA020を産生した。プラスミドpJCA020はカセッテH6−EHV−１ gDを含有する。
EHV−１ gD暗号配列の720bpの５′側領域を、テンプレートとしてのプラスミドpJCA020およびオリゴヌクレオチドJCA044（配列認識番号233）
Figure 0003602530
とJCA165（配列認識番号234）
Figure 0003602530
を用いてPCT誘導した。この断片をEcoR Iで切断し、キナーゼした。107bp 42Kプロモーター要素を、テンプレートとしてのプラスミドpAM12およびオリゴヌクレオチドRG286（配列認識番号235）
Figure 0003602530
とJCA164（配列認識番号236）
Figure 0003602530
を用いてPCR誘導した。この断片をBamH Iで切断し、キナーゼし、720bpのATG−EHV−１ gD ５′−EcoR I断片とともにBamH IとEcoR Iで切断したベクターpBS−SK+に連結し、プラスミドpJCA035を産生した。接合42K−EHV−１ gDおよびEHV−１ gD ５′部分の42Kプロモーターの配列をpJCA035の直接の塩基配列決定法により確認した。
プラスミドpJCA035をBamH IとEcoR Iで切断し、830bpのBamH I−42K−EHV−１ gD ５′部分−EcoR I断片（Ｆ）を単離した。プラスミドpJCA020をEcoR IとXba Iで切断し、500bpのEcoR I−EHV−１ gD ３′末端浄化−Xba I断片（Ｇ）を単離した。次いで断片ＦおよびＧを、BamH IとXba Iで切断したベクターpBS−SK+にともに連結し、プラスミドpJCA038を産生した。プラスミドpJCA038は、ベクターpBS−SK+中にカセッテ42K−EHV−１ gDを含有している。プラスミドpJCA038をBamH IとHpa Iで切断し、1340bpのHpa I−42K−EHV−１ gD−BamH I断片を単離した。この断片を、BamH IとSma Iで切断したプラスミドpSD544（HA deorfed座）に連結し、プラスミドpJCA064を産生した。プラスミドpJCA064は、カセッテ42K−EHV−１ gDをNYVAC HA deorfed座に挿入する供与体プラスミドである。IVRの前にNt Iを用いてプラスミドpJCA064を線状化した。
供与体プラスミドとしてのpJCA064および治療ウイルスとしての組換えワクシニアウイルスvP956（NYVACバックグラウンド）を用いてベロ細胞上で生体外実験を行なった。これは標準方法に関して行なった（ピッチーニら、1987）。ATI deorfed座にEHV−１ gBおよびgC遺伝子を、HA deorfed座にEHV−１ gD遺伝子を含有するNYVACベースの組換え体をvP1025と称した。
供与体プラスミドpJCA043の産生
プラスミドpJCA011およびオリゴヌクレオチドJCA159（配列認識番号237）
Figure 0003602530
とJCA160（配列認識番号238）
Figure 0003602530
を用いて220bpのHind III−EHV−１ gB ３′側領域をPCR誘導した。この断片をBamH IとHind IIIで切断し、BamH IとHind IIIで切断したベクターpBS−SK+に連結し、プラスミドpJCA036を産生した。pJCA036の直接の塩基配列決定法により、EHV−１ gB ３′側領域PCR断片の配列を確認した。
プラスミドpJCA033をEcoR VとKpn Iで切断し、Kpn I−EHV−１ gC ３′側領域−EcoR V断片（Ｈ）を単離した。プラスミドpJCA038をBamH IとHpa Iで切断し、1360bpのHpa I−42K−EHV−１ gD−BamH I断片（Ｉ）を単離した。プラスミドpVHAH6g13をKpn IとXho Iで切断し、900bpのXho I−EHV−１ gC中央部分−Kpn I断片（Ｊ）を単離した。次いで断片Ｈ、ＩおよびＪを、BamH IとXho Iで切断したベクターpBS−SK+にともに連結し、プラスミドpJCA041を産生した。
プラスミドpJCA034をHind IIIとXho Iで切断し、5900bpの線状化ベクターXho I−pBS−SK+−I3L−EHV−１ gB−Hind III断片（Ｋ）を単離した。プラスミドpJCA036をBamH IとHind IIIで切断し、220bpのHind III−EHV−１ gB ３−−側領域−BamH I断片（Ｌ）を単離した。プラスミドpVHAH6g13をBgl IIとXho Iで切断し、440bpのBgl II−H6−EHV−１ gC ５′部分−Xho I断片（Ｍ）を単離した。次いで断片Ｋ、Ｌおよびｍをともに連結し、プラスミドpJCA040を産生した。
プラスミドpJCA040をSma IとXho Iで切断し、3550bpのSma I−I3L−EHV−１ gB−EHV−１ gC ５′部分−Xho I断片（Ｎ）を単離した。プラスミドpJCA041をBamH IとXho Iで切断し、2460bpのXho I−EHV−１ gC ３′部分−−42K−EHV−１ gD−BamH I断片（Ｏ）を単離した。断片ＮおよびＯを最終的に、Bgl IIとSma Iで切断したプラスミドpSD541VC（NYVAC ATI deorfed座）にともに連結し、プラスミドpJCA043を産生した。プラスミドpJCA043は、I3L−EHV−１ gB−−H6−EHV−１ gC−−42K−EHV−１ gD三重構造をNYVAC ATI deorfed座に挿入する供与体プラスミドである。IVRの前にNot Iを用いてプラスミドpJCA043を線状化した。
供与体プラスミドとしてpJCA043および治療ウイルスとしてvP866（NYVAC）を用いて、初代ニワトリ胚繊維芽細胞上に生体外実験を行なった。標準方法を用いて産生した組換え体を同定し、精製した（ピッチーニら、1987）。ATI deorfed座にEHV−１ gB、gCおよびgD遺伝子を含有するNYVACベースの組換え体をvP1043と称した。
実施例26−EHV−１ gB、gCおよびgD糖タンパク質相同物を発現するALVACベースの組換え体の産生
供与体プラスミドpJCA049の産生
プラスミドpJCA040をSma IとXho Iで切断し、3550bpのSma I−I3L−EHV−１ gB−−H6−EHV−１ gC ５′部分−Xho I断片（Ａ）を単離した。プラスミドpJCA041をBamH IとXho Iで切断し、2460bpのXho I−EHV−１ gC ３′部分−−42K−EHV−１ gD−BamH I断片（Ｂ）を単離した。断片ＡおよびＢを、BamH IとSma Iで切断したプラスミドpSPVQC3Lにともに連結し、プラスミドpJCA049を産生した。皿pJCA049は、I3L−EHV−１ gB−−H6−EHV1 gC−−42K−EHV−１ gD三重構造をALVAC C3 deorfed座に挿入するプラスミドである。IVRの前に、Not Iを用いてプラスミドpJCA049を線状化した。
供与体プラスミドとしてのpJCA049および治療ウイルスとしてのCPpp（ALVAC）を用いて初代ニワトリ胚繊維芽細胞上で生体外実験を行なった。標準方法を用いて産生した組換え体を同定し精製した（ピッチーニら、1987）。C3 deorfed座にEHV−１ gB、gCおよびgD遺伝子を含有するALVACベースの組換え体をvCP132と称した。
実施例27−NYVAC−およびALVAC−ベースのウマヘルペスウイルス１型三重組換え体の発現分析
EHV−１ gB（16G5または3F6）、EHV−１ gC（14H7）およびEHV−１ gD（20C4）に特異的な単クローン性抗体を用いて、前述したように（テイラーら、1990）蛍光抗体法アッセイを行なった。全ての抗EHV−１単クローンをジョージアレン（40546−0076、ケンタッキー州、レキシントン、ケンタッキー大学、獣医科学科）から得た。３つのEHV−１特異的産生物全ての発現は、vP1025、vP1043まはvCP132のいずれに感染した細胞内部に検出可能であった。EHV−１ gC糖タンパク質のみが、感染細胞の表面上に良好に発現された。EHV−１ gB糖タンパク質の表面発現は非常に弱く、EHV−１ gD糖タンパク質の表面発現は疑わしいものであった。
同一の単クローン性抗体を用いてイムノプレシピテーションを行ない、発現されたEHV−１ gB、gCおよびgD遺伝子産生物の真正を測定した。EHV−１ gB糖タンパク質に特異的な単クローン性3F6は、組換えウイルスvP956、vP1025、vP1043またはvCP132に感染した細胞から誘導された溶解産物からの138kDa、70kDaおよび54kDaのSDS−PAGEゲルシステム上の見かけ分子質量を有するタンパク質を沈殿せしめた。未感染細胞またはいずれの親ウイルス（NYVACおよびALVAC）感染細胞から誘導された溶解産物からはどのタンパク質も沈殿しなかった。EHV−１ gC糖タンパク質に特異的な単クローン性14H7は、vP956、vP1025またはvP1043のいずれかに感染した細胞から誘導された溶解産物からは90kDaの見かけ分子質量を有する糖タンパク質を沈殿せしめた。組換え体vCP132により発現されたEHV−１ gC糖タンパク質は、組換え体vP956、vP1025またはvP1043により発現された糖タンパク質よりもやや小さな（約2kDa小さい）見かけ分子質量を有する。EHV−１ gD糖タンパク質に特異てきな単クローン性抗体20C4は、vP1025、vP1043またはvCP132に感染した細胞から誘導された溶解産物からは55kDaの見かけ分子質量を有する糖タンパク質を沈殿せしめた。
またはG.アレンから得たウサギ抗−EHV−１高度免疫血清を用いてイムノプレシピテーションを行なった。この血清は、vP1025、vP1043またはvCP132のいずれかに感染した細胞から誘導された溶解産物から３つのEHV−１産生物全てを沈殿せしめた。
実施例28−ハムスター抗原投与モデルを用いて得られた防御データ
抗原投与実験（ハムスターモデル）をローンメリクス（フランス、リヨン）で行ない、ポックスウイルスEHV−１組換え体vP956、vP1025およびvCP132により誘発した防御の相対水準を評価した。ハムスターを０日にワクチン接種し、14日にEHV−１組換え体の様々な希釈物を追加抗原投与した。全て免疫化し、対照の動物に、28日にハムスター適用EHV−１抗原投与気株を抗原投与した。死亡した動物の最終的な数は35日（抗原投与後７日）に数えた。抗原投与実験の結果を表30に示す。
Figure 0003602530
実施例29−イヌの免疫持続期間の研究
この研究の目的は、ALVAC−RG（vCP65）の１回の接種後のイヌに防御免疫応答が保持される期間を測定することにある。抗狂犬病抗体を有さない生後８か月の、41匹のビーグル犬に、皮下経路により6.7log10TCID50のALVAC−RGの１回の接種量を接種した。ワクチン接種後、０日と１、２、３、６および12か月でイヌを採血し、RFFI試験を用いて抗狂犬病抗体の存在について血清をアッセイした。全ての動物を、ワクチン接種の副作用について監視した。
ワクチン接種から６か月後、５匹のイヌに、狂犬病ウイルスの毒性NYGS菌株を筋内接種により抗原投与した。その動物には側頭筋に103.450％ネズミ致死量を投与した。３匹の未接種対照動物にも同一の接種を行なった。11匹のワクチン接種したイヌと３匹の未接種対し卯よイヌには、ワクチン接種から12か月後に同一の方法で抗原投与した。血清学的結果と６および12か月での抗原投与の結果を表31に示す。
ALVAC−RG（vCP65）でワクチン接種したどのイヌもワクチン接種に対する副作用は示さなかった。ALVAC−RG（vCP65）を接種した全てのイヌは、ワクチン接種から７日後に狂犬病ウイルス中和抗体の誘発を示した。最大の力価は、ワクチン接種後14から28日の間に達成され、その後減少した。ワクチン接種から６まは12か月後での抗原投与の時に、力価は低く、ある動物においてはゼロに近かった。低い力価にもかかわらず、全ての動物は、ワクチン接種をしなかった対照イヌが死んだ致死狂犬病抗原投与にも生存した。ワクチン接種から６か月後の抗原投与に生存した動物のRFFI力価を８か月目（抗原投与から２か月後）に評価した。これらの動物の血清力価は、7.4、7.4、2.3、1.8、および7.4国際単位であった。狂犬病中和抗体のこれらの上昇し保持された水準は、動物が最初の１回の接種により効果的に備えられたことを示す。実験は進行中であり、残りの動物は、ワクチン接種から２または３年後に抗原投与する。しかしながら、データに関して、実験を成功であり、本発明の効用を説明している。
Figure 0003602530
Figure 0003602530
実施例30−NYVAC中のウシヘルペスウイルス１型BHV1遺伝子の発現
NYVAC/BHV1 g IV組換え体の産生
プラスミドpBHVg IVをローンメリクスから得た。このプラスミドは、3.9kb Pst I断片上にコードされ、pBS−SK+のPst I部位にクローニングされるBHV1 g IV遺伝子（ストローブ菌株）を含有する。このプラスミドからのg IV遺伝子（チコーら、J.ビロル（1990）64:5132）をワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。g IV遺伝子をがゆうするpBHVg IVの2,000bp Pst I−Xho I断片を、pSD542のPst I−Xho I部位（実施例32に定義）にクローニングすることによりこのことを行なった。この操作により産生されたプラスミドをpBHV1と称する。
次いでπプロモーターの３′末端をg IV遺伝子の上流にクローニングした。これは、πプロモーターの３′末端とg IV遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチドBHVL7（配列認識番号239）
Figure 0003602530
およびBHVL8（配列認識番号240）
Figure 0003602530
をpBHV1の5,500bpの部分的Sst II−Xho I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV3と称する。
次いで異種３′非暗号配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチドBHVL5（配列認識番号241）（５′−GGGTGACTGCA−３′）およびBHVL6（配列認識番号242）（５′−GTCACCC−３′）をpBHV3の5,200bpの部分的Sma I−Pst I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBVH4と称する。
次いで異種リンカー配列を除去した。これはpBHV4の5,200bp Pst I断片を連結することにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをpBHV5と称する。
次いでπプロモーターの５′末端をpBHV5にクローニングした。これは、πプロモーターの５′末端を含有するpPI4の130bp Afl II−Xho I断片をpBHV5の5,200bp Afl II−Xho I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV6と称する。
pBHV6を治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに生体外組換え実験に用いてvP1051を産生した。
イムノプレシピテーションを行なって、vP1051が真正BHV1 g IV糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、10PFU/細胞のm.o.i.でNYVACに感染せしめたか、またはvP1051に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引して、２％の胎児ウシ血清と［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlの修飾イーグル培地（メチオニンのない）を細胞に重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％のNP−40、30mMのトリス（pH7.4）、3mMのEDTA、0.03％のNa Azideおよび0.6mg/mlのPMSF）および50mlのアプロチニンの添加と続いての細胞単層のかきとりにより細胞を感染から７時間後に収穫した。
次いでBHV1 g IV特異的単クローン性抗体3402（WI、マジソン、ウィスコンシン大学、Dr.ジオフリーリッチワースから得た）を用いて溶解産物を、BHV1 g IV発現に関して分析した。これは以下の方法によって行なった。ラット抗ネズミ血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗ネズミ抗体をg IV特異的単クローン性抗体3402に結合せしめた。一方で、通常のネズミ血清およびタンパク質Ａセファロース結合ラット抗ネズミ抗体を４℃で一晩に亘りインキュベーションすることにより、溶解産物を前浄化した。この物質を１×の緩衝液Ａで５回洗浄した後、BHV1セファロース単クローン性抗体、ラット抗ネズミ、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩に亘りインキュベーションした。その試料を、１×緩衝液Ａで５回、LiCl2/尿素緩衝液で２回洗浄した後、２×ラエムリ緩衝液（125mMのトリス（pH6.8）、４％のSDS、20％のグリセロール、10％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間沸騰せしめることにより、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を10％のドリファスゲルシステム上で分画し（ドリファスら、1984）、固定し、蛍光光度法のために1MのNa−サリチル酸塩で処理した。
BHV1 g IV特異的単クローン性抗体3402は、vP1051感染細胞からBHV1 g IV糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、NYVACまたは疑似感染細胞からはBHV1−特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
NYVAC/BHV1 g Iおよびg IV組換え体の産生
BHV1 g IV遺伝子を含有するプラスミドpBHVg IVは、ローンメリクスから得た。このプラスミドからのg IV遺伝子をワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。これは、g IV遺伝子を含有するpBHV1g IVの2,000bpのPst I−Xho I断片を、pSD542のPst I−Xho I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV1と称する。
次いでπプロモーターの３′末端をg IV遺伝子の上流にクローニングした。これは、πプロモーターの３′末端とg IV遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチドBHVL7（配列認識番号239）およびBHVL8（配列認識番号240）をpBHV1の5,500bpの部分的Sat II−Xho I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV3と称する。
次いで異種３′非暗号配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチドBHVL5（配列認識番号241）およびBHVL6（配列認識番号242）をpBHV3の5,200bp部分的Sma I−Pst I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV4と称する。
次いで異種リンカー配列を除去した。これし、pBHV4の5,200bpのPst I断片を連結することにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをpBHV5と称する。
次いでπプロモーターの５′末端をpBHV5にクローニングした。これは、πプロモーターの５′末端を含有するpPI4の130bpのAfl II−Xho I断片をpBHV5の5,200bpのAfl II−Xho I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV6と称する。
次いでBHV1 g I遺伝子をpBHV6にクローニングした。これは、H6プロモートしたg I遺伝子を含有するpBHV8の2,900bpのBgl II断片をpBHV6のBgl II部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV9と称する。
pBHV8を以下の方法により産生した。プラスミドpIBRS6をローンメリクスから得た。このプラスミドは、BHV1g I遺伝子を含有する6.6kbのSal I断片（ストローブ菌株）を含有する。g I遺伝子の５′末端（ホワイトベックら、J.ビロル（1988）62:3319）をH6プロモーターの下流と、ワクシニアウイルスHAフランキングアームの間にクローニングした。これは、pIBRS6の54bpのSal I−Pst I断片をpGD5の4,400bpのSal I−Pst I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpIBR2と称する。
次いでH6プロモーターの開始コドンを、オリゴヌクレオチドIBRL1（配列認識番号243）
Figure 0003602530
およびIBRL2（配列認識番号244）
Figure 0003602530
を、pIBR2の3,800bpのNru I−Sst I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpIBR4と称する。次いで将来の操作に必要なNco I部位をg I配列の下流に産生した。これは、オリゴヌクレオチドIBRL3（配列認識番号245）
Figure 0003602530
およびIBRL4（配列認識番号246）
Figure 0003602530
をpIBR4のPst I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpIBR5と称する。
次いで追加のg I配列をpIBR5にクローニングした。これは、pIBRS6の1,740bpのTth111I−Nco I断片をpIBR5の3,700bpのTth111I−Nco I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpIBR7と称した。
次いで将来の操作に必要なBgl II部位をg I配列の下流に産生した。これは、オリゴヌクレオチドIBRL5（配列認識番号247）
Figure 0003602530
およびIBRL6（配列認識番号248）
Figure 0003602530
をpIBR7のNco I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpIBR8と称する。
次いでg I遺伝子の３′末端をpIBR8にクローニングした。これは、pIBRS6の2,285bp Stu I断片をE.coli DNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）が充填されたpIBR8の4,300bp Stu I−Bgl II（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpIBR20と称する。
次いでH6プロモートしたBHV1 g I遺伝子をワクシニアウイルス供与体プラスミドに移動せしめた。これは、E.coli DNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）が充填されたpIBR20の2,900bp Bgl I−Nco I（部分的）断片をpSD542のSma I部位にクローニングすることにより行なった。これによりH6プロモートしたg I遺伝子をtkフランキングアームの間に配する。この操作により産生したプラスミドをpIBR22と称する。
次いでBgl II部位をH6プロモーターの下流に産生した。これは、pIBR22の2,800bp Hind III−EcoR V断片をpGD3の3,500bp Hind III−EcoR V断片にクローニングすることにより行なった。（pGD3は、H6プロモートした２型単純ヘルペスウイルス（HSV2）gD遺伝子から下流のGgl II部位を含有する。この操作により、HSV2gD配列をBHVIg I遺伝子が置換され、それゆえH6プロモートしたg I遺伝子から下流にBgl II部位を産生する）。この操作により産生したプラスミドをpBHV8と称する。
pBHV9を治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに生体外組換え実験に用いてvP1074を産生した。
イムノプレシピテーション分析を行ない、vP1074が真正BHV1 g Iおよびg IV糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染したか、10PFU/細胞のm.o.i.でNYVACに感染せしめたか、またはvP1074に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％の胎児ウシ血清および［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％のNP−40、30mMのトリス（pH7.4）、3mMのEDTA、0.03％のNa Azideおよび0.6mg/mlのPMSF）および50mlのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染から７時間後に細胞を収穫した。
次いでBHV1 g I特異的単クローン性抗体5106、およびg IV特異的単クローン性抗体3402（WI、マジソン、ウィスコンシン大学、Dr.ジオフェリーリッチワースから得た）を用いて、溶解産物をBHV1 g Iおよびg IV発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗ネズミ血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗ネズミ抗体をg I特異的単クローン性抗体とg IV特異的単クローン性抗体に結合せしめた。一方で、通常ネズミ血清とタンパク質Ａセファロース結合ラット抗ネズミ抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、g Iまたはg IV特異的単クローン性抗体、ラット抗ネズミ、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、LiCl2/尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（125mMのトリス（pH6.8）、４％のSDS、20％のグリセロール、10％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を10％のドリファスゲルシステム上で分画し（ドリファスら、1984）、固定し、蛍光光度法のために1MのNa−サリチル酸塩で処理した。
BHV1 g Iおよびg IV特異的単クローン性抗体、5106および3402は、vP1074感染細胞からBHV1 g Iおよびg IV糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはNYVAC感染細胞からのBHV1−特異的タンパク質は沈殿しなかった。
NYVAC/BHV1 g III組換え体の産生
プラスミドpBHVg IIIをローンメリクスから得た。このプラスミドは、pBSK+のBamH I/Hind III部位にクローニングされた3.4kbのBamH I/Hind III断片上にコードされたBHV1 g III遺伝子（ストローブ菌株）を含有する。このプラスミドからのg III遺伝子（フィッツパトリックら、ウイルス学、（1989）173:146）をワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。これは、g III遺伝子の５′末端を含有するpBHVg IIIの1,000bpのNco I−Xho I断片、およびI3LプロモーターをコードするオリゴヌクレオチドBHVL1（配列認識番号249）
Figure 0003602530
とBHVL2（配列認識番号250）
Figure 0003602530
をpSD544のBamH I−Xho I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV2と称する。
次いでg III遺伝子の３′末端をpBHV2にクローニングした。これは、g III遺伝子の３′末端をコードする、オリゴヌクレオチドBHVL15（配列認識番号251）
Figure 0003602530
およびBHVL16（配列認識番号252）
Figure 0003602530
をpBHV2の4,700bp Xho I−Asp718断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したフラクションをpBHV7と称する。
次いでg III遺伝子の残りをpBHV7にクローニングした。これは、g III遺伝子の内側部分を含有するpBHVg IIIの500bp部分的Sma I−Xho I断片をpBHV7の4,750bpの部分的Sma I−Xho I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV10と称する。
pBHV10を治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに生体外組換え実験に用いてvP1073を産生した。
イムノプレシピテーション分析を行なって、vP1073が真正BHV1 g III糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、10PFU/細胞のm.o.i.でNYVACに感染せしめたか、またはvP1073に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％の胎児ウシ血清および［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％のNP−40、30mMのトリス（pH7.4）、3mMのEDTA、0.03％のNa Azideおよび0.6mg/mlのPMSF）および50mlのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染から７時間後に細胞を収穫した。
次いでBHV1 g III特異的単クローン性抗体1507（WI、マジソン、ウィスコンシン大学、Dr.ジオフェリーリッチワースから得た）を用いて、溶解産物をBHV1 g III発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗ネズミ血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗ネズミ抗体をg III特異的単クローン性抗体、1507に結合せしめた。一方で、通常ネズミ血清とタンパク質Ａセファロース結合ラット抗ネズミ抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、g III特異的単クローン性抗体、ラット抗ネズミ、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、LiCl2/尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（125mMのトリス（pH6.8）、４％のSDS、20％のグリセロール、10％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を10％のドリファスゲルシステム上で分画し（ドリファスら、1984）、固定し、蛍光光度法のために1MのNa−サリチル酸塩で処理した。
BHV1 g III特異的単クローン性抗体、1507は、vP1073感染細胞からのBHV1 g III糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはNYVAC感染細胞からのBHV1−特異的タンパク質は沈殿せしめなかった。
NYVAC/BHV1 g IIIおよびg IV組換え体の産生
BHV1 g IV遺伝子を含有するプラスミドpBHVg IVをローンメリクスから得た。このプラスミドからのg IV遺伝子をワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。これは、g IV遺伝子を含有するpBHVg IVの2,000bp Pst I−Xho I断片をpSD542のPst I−Xho I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV1と称する。
次いでπプロモーターの３′末端をg IV遺伝子の上流にクローニングした。これは、π踏めの３′末端およびg IV遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチドBHVL7（配列認識番号239）およびBHVL8（配列認識番号240）をpBHV1の5,500bp部分的Sst II−Xho I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV3と称する。
次いで異種３′非暗号配列を除去した。これは、折り服BHVL5（配列認識番号241）およびBHVL6（配列認識番号242）をpBHV3の5,200bpの部分的Sma I−Pst I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV4と称する。
次いで異種リンカー配列を除去した。これは、pBHV4の5,200bp Pst I断片を連結することにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV5と称する。
次いでπプロモーターの５′末端をpBHV5にクローニングした。これは、πプロモーターの５′末端を含有するpPI4の130bp Afl II−Xho I断片をpBHV5の5,200bp Afl II−Xho I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV6と称する。
次いでBHV1 g III遺伝子をpBHV6にクローニングした。これは、I3Lプロモートしたg III遺伝子を含有するpBHV10の1,600bp Asp718−BamH I断片をpBHV6の5,300bp部分的BamH I−Asp718断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV11と称する。
pBHV11を治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに生体外組換え実験に用いてvP1083を産生した。
イムノプレシピテーション分析を行なって、vP1083が真正BHV1 g IIIおよびg IV糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、10PFU/細胞のm.o.i.でNYVACに感染せしめたか、またはvP1083に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％の胎児ウシ血清および［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％のNP−40、30mMのトリス（pH7.4）、3mMのEDTA、0.03％のNa Azideおよび0.6mg/mlのPMSF）および50mlのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染から７時間後に細胞を収穫した。
次いでBHV1 g III特異的単クローン性抗体1507、およびg IV特異的単クローン性抗体3402（WI、マジソン、ウィスコンシン大学、Dr.ジオフェリーリッチワースから得た）を用いて、溶解産物をBHV1 g IIIおよびg IV発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗ネズミ血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗ネズミ抗体をg III特異的単クローン性抗体およびg IV特異的単クローン性抗体に結合せしめた。一方で、通常ネズミ血清とタンパク質Ａセファロース結合ラット抗ネズミ抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、BHV1 g IIIまたはg IV特異的単クローン性抗体、ラット抗ネズミ、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、LiCl2/尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（125mMのトリス（pH6.8）、４％のSDS、20％のグリセロール、10％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を10％のドリファスゲルシステム上で分画し（ドリファスら、1984）、固定し、蛍光光度法のために1MのNa−サリチル酸塩で処理した。
BHV1 g IIIおよびg IV特異的単クローン性抗体、1507および3402は、vP1083感染細胞からのBHV1 g IIIおよびg IV糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはNYVAC感染細胞からのBHV1特異的タンパク質は沈殿せしめなかった。
NYVAC/BHV1 g Iおよびg III組換え体の産生
BHV1 g III遺伝子を含有するプラスミドpBHVg IIIをローンメリクスから得た。このプラスミドからのg III遺伝子を、ワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。これは、g III遺伝子の５′末端を含有するpBHVg IIIの1,000bp Nco I−Xho I断片、およびI3LプロモーターをコードするオリゴヌクレオチドBHVL1（配列認識番号249）とBHVL2（配列認識番号250）をpSD544VCのBamH I−Xho I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV2と称する。
次いでg III遺伝子の３′末端をpBHV2にクローニングした。これは、g III遺伝子の３′末端をコードするオリゴヌクレオチドBHVL15（配列認識番号251）およびBHVL16（配列認識番号252）をpBHV2の4,700bp Xho I−Asp718断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV7と称する。
次いでg III遺伝子の残りをpBHV7にクローニングした。これは、g III遺伝子の内側部分を含有するpBHVg IIIの500bp部分的Sma I−Xho I断片をpBHV7の4,750bp部分的Sma I−Xho I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV10と称する。
次いでBHV1 g I遺伝子をpBHV10にクローニングした。これは、H6プロモートしたg I遺伝子を含有するpBHV8の2,900bp Bgl II断片をpBHV10のBamH I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV12と称する。
pBHV12を治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに生体外組換え実験に用いてvP1087を産生した。
イムノプレシピテーション分析を行なって、vP1087が真正BHV1 g Iおよびg III糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、10PFU/細胞のm.o.i.でNYVACに感染せしめたか、またはvP1087に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％の胎児ウシ血清および［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％のNP−40、30mMのトリス（pH7.4）、3mMのEDTA、0.03％のNa Azideおよび0.6mg/mlのPMSF）および50mlのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染から７時間後に細胞を収穫した。
次いでBHV1 g I特異的単クローン性抗体5106、およびBHV1 g III特異的単クローン性抗体1507（WI、マジソン、ウィスコンシン大学、Dr.ジオフェリーリッチワースから得た）を用いて、溶解産物をBHV1 g Iおよびg III発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗ネズミ血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗ネズミ抗体をg I特異的単クローン性抗体およびg III特異的単クローン性抗体に結合せしめた。一方で、通常ネズミ血清とタンパク質Ａセファロース結合ラット抗ネズミ抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、BHV1 g Iまたはg III特異的単クローン性抗体、ラット抗ネズミ、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、LiCl2/尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（125mMのトリス（pH6.8）、４％のSDS、20％のグリセロール、10％の20メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を10％のドリファスゲルシステム上で分画し（ドリファスら、1984）、固定し、蛍光光度法のために1MのNa−サリチル酸塩で処理した。
BHV1 g Iおよびg III特異的単クローン性抗体、5106および1507は、vP1087感染細胞からBHV1 g Iおよびg III糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはNYVAC感染細胞からBHV1特異的タンパク質は沈殿せしめなかった。
NYVAC/BHV1 g I、g IIIおよびg IV組換え体の産生
BHV1 g IV遺伝子を含有するプラスミド、pBHVg IVをローンメリクスから得た。このプラスミドからのg IV遺伝子をワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。このは、g IV遺伝子を含有する2,00bp Pst I−Xho I断片をpSD542VCVQのPst I−Xho I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをpBHV1と称する。
次いでπプロモーターの３′末端をg IV遺伝子の上流にクローニングした。これは、πプロモーターの３′末端およびg IV遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチド、BHVL7およびBHVL8を、pBHV1の5,500bp部分的Sat I−Xho I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをpBHV3と称する。
次いで異種３′非暗号配列を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、BHVL5（配列認識番号241）およびBHVL6（配列認識番号242）をpBHV3の5,200bpの部分的Sma I−Pst I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV4と称する。
次いで異種リンカー配列を除去した。これは、pBHV4の5,200bp Pst I断片を連結することにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV5と称する。
次いでπプロモーターの５′末端をpBHV5にクローニングした。これは、πプロモーターの５′末端を含有するpPI4の130bp Afl II−Xho I断片をpBHV5の5,200bp Afl II−Xho I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV6と称する。
次いでBHV1 g III遺伝子をpBHV6にクローニングした。これは、I3Lプロモートしたg III遺伝子を含有するpBHV10の1,600bp Asp718−BamH I断片をpBHV6の5,300bp部分的BamH I−Asp718断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV11と称する。
次いでBHV1 g I遺伝子をpBHV11にクローニングした。これは、H6プロモートしたg I遺伝子を含有するpBHV8の2,900bp Bgl II断片をpBHV11のBgl II部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBHV13と称する。
pBHV13を治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに生体外組換え実験に用いてvP1079を産生した。
イムノプレシピテーション分析を行なって、vP1079が真正BHV1 g I、g IIIおよびg IV糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、10PFU/細胞のm.o.i.でNYVACに感染せしめたか、またはvP1079に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％の胎児ウシ血清および［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％のNP−40、30mMのトリス（pH7.4）、3mMのEDTA、0.03％のNa Azideおよび0.6mg/mlのPMSF）および50mlのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染から７時間後に細胞を収穫した。
次いでBHV1 g I特異的単クローン性抗体5106、BHV1 g III特異的単クローン性抗体1507、およびg IV特異的単クローン性抗体、3402（WI、マジソン、ウィスコンシン大学、Dr.ジオフェリーリッチワースから得た）を用いて、溶解産物をBHV1 g I、g IIIおよびg IV発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗ネズミ血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗ネズミ抗体をg I、g IIIおよびg IV特異的単クローン性抗体に結合せしめた。一方で、通常ネズミ血清とタンパク質Ａセファロース結合ラット抗ネズミ抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、BHV1 g I、g IIIおよびg IV特異的単クローン性抗体、ラット抗ネズミ、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、LiCl2/尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（125mMのトリス（pH6.8）、４％のSDS、20％のグリセロール、10％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を10％のドリファスゲルシステム上で分画し（ドリファスら、1984）、固定し、蛍光光度法のために1MのNa−サリチル酸塩で処理した。
BHV1 g I、g IIIおよびg IV特異的単クローン性抗体、5106、1507および3402は、vP1079に感染した細胞から、BHV1 g I、g IIIおよびg IV糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはMYVAC感染差異簿からはBHV1特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
実施例31−NYVAC中のウシウイルス性下痢性ウイルス（BVDV）の発現
NYVAC/BVDV gE1/gE2組換え体の産生
BVDV gE1（gp48/gp25）「遺伝子」（オスロス菌株）をpIBI25にクローニングした。これは、pSP65−gE1の1,370bp EcoR I−BamH I断片（ベルギー、リージ、ユーロジェネティックから得た；レナードら、欧州特許第86870095号）をE.coli DNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）でブラントエンドし、その末端にXho Iリンカーを連結し、産生したプラスミドをpIBI25のXho I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV1と称する。
次いでH6プロモーターの開始コドンをgE1「遺伝子」の「開始コドン」に配列した。これは、H6プロモーターの３′末端およびgE1「遺伝子」の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、BDVM4（配列認識番号253）
Figure 0003602530
およびBDVM5（配列認識番号254）
Figure 0003602530
を、pBDV1の4,250bp Hind III−Bhgl I（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV6と称する。
次いでgE1「遺伝子」を、H6＋ATI＋HA三重プロモーター（ポーテテレら、ワクチン（1991）9:194）の下流およびHAフランキングアームの間にクローニングした。これは、gE1「遺伝子」を含有するpBDV6の1,380bp EcoR V−Past I（部分的）断片を、pATI25の3,700bp EcoR V−Pst I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV7と称する。
次いで、将来の操作に必要なBamH I部位をBVDV配列の下流に産生した。これは、オリゴヌクレオチド、BDVM6（配列認識番号255）
Figure 0003602530
を、pBDV7のXho I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV8と称する。
次いでgE2（gp53）配列（オスロス菌株）の約830bpをgE1配列の下流にクローニングした。これは、gE2配列を含有する、p7F2の980bp Bgl II−BamH I断片（ベルギー、リージ、ユーロジェネティックから得た；レナードら、欧州特許第86870095号）を、pBDV8の5,100bp BamH IーBgl II（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV9と称する。
次いでH6プロモートしたgE1/gE2配列をATIフランキングアームの間にクローニングした。これは、gE1/gE2配列を含有する、pBDV9の2,200bp Nru I−BamH I断片をpPGI7の4,900bp Nru I−BamH I断片にクローニングすることにより行なった。これにより、gE1/gE2配列がH6プロモーターの転写制御下に置かれ、挿入ベクターに配される。この操作により産生したプラスミドをpBDV23と称する。
次いで約270bpの追加のgE2配列（オスロス菌株）を存在するBVDV配列の下流にクローニングした。これは、gE2配列を含有する、pSP65E1＋E2−１の1,260bp Bgl II−BamH I断片（ベルギー、リージ、ユーロジェネティックから得た；レナードら、欧州特許第86870095号）を、pVDV23の6,100bp断片にクローニングすることにより行なわれた。この操作により産生されたプラスミドをpBDV24と称する。
pBDV24を治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに生体外組換え実験に用いて、vP972を産生した。
イムノプレシピテーション分析を行なって、vP972が真正BVDV gE1およびgE2糖タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞を、疑似感染せしめたか、10PFU/細胞のm.o.i.でNYVACに感染せしめたか、またはvP972に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞に、２％の胎児ウシ血清および［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlの修飾イーグルス培地（メチオニンを含まない）で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％のNP−40、30mMのトリス（pH7.4）、3mMのEDTA、0.03％のNa Azideおよび0.6mg/mlのPMSF）および50mlのアプロチニンを添加し、続いて細胞単層をかきとることにより、感染から18時間後に細胞を収穫した。
次いでBVDV gp48特異的単クローン性抗体、NYC16およびNY12B1、およびBVDV gp53特異的単クローン性抗体、209D3（フランス、リヨン、ローンメリクスから得た）を用いて、溶解産物をBVDV gE1およびgE2発現に関して分析した。これは以下の方法により行なった。ラット抗ネズミ血清を室温で４時間に亘りタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。１×緩衝液Ａで物質を５回洗浄した後、タンパク質Ａセファロース結合ラット抗ネズミ抗体をgE1特異的単クローン性抗体、NYC16およびNY12B1、およびgE2特異的単クローン性抗体、209D3に結合せしめた。一方で、通常ネズミ血清とタンパク質Ａセファロース結合ラット抗ネズミ抗体を４℃で一晩インキュベーションすることにより溶解産物を前浄化した。この物質を１×緩衝液Ａで５回洗浄した後に、BVDV gE1またはgE2特異的単クローン性抗体、ラット抗ネズミ、タンパク質Ａセファロース複合体を溶解産物に加え、４℃で一晩インキュベーションした。この試料を１×緩衝液で４回、LiCl2/尿素緩衝液で２回洗浄した後に、２×のラエムリ緩衝液（125mMのトリス（pH6.8）、４％のSDS、20％のグリセロール、10％の２−メルカプトエタノール）を添加し、５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。次いでタンパク質を10％のドリファスゲルシステム上で分画し（ドリファスら、1984）、固定し、蛍光光度法のために1mのNa−サリチル酸塩で処理した。
BVDV gE1またはgE2特異的単クローン性抗体は、vP972感染細胞からBVDV特異的糖タンパク質を沈殿せしめたが、NYVAC感染細胞または疑似感染細胞からはBVDV特異的タンパク質は沈殿せしめなかった。
NYVAC/BVDVカプシド/gE1/gE2組変え体の産生
BVDVgE1「遺伝子」をpIBIB25にクローニングした。これは、gE1「遺伝子」を含有する、pSP65−gE1の1,370bp EcoR I−BamH I断片をE.coli DNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）でブラントエンドし、その末端にXho Iリンカーを連結し、産生したプラスミドをpIBI25のXho I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV1と称する。
次いでgE1「遺伝子」をｕフランキングアームの間にクローニングした。これは、gE1配列を含有する、pBDV1の1,400bp Xho I断片をpSD486のXho I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをpBDV11と称する。
次いでgE1「遺伝子」の「開始コドン」をｕプロモーターの開始コドンに配列した。これは、ｕプロモーターの３′末端およびgE1配列の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、BDVM7（配列認識番号256）
Figure 0003602530
およびBDVM8（配列認識番号257）
Figure 0003602530
を、pBDV11の4,800bp部分的Bgl I−Cla I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV12と称する。
次いでBVDV gE2「遺伝子」の一部をgE1配列から下流のpBDV12にクローニングした。これは、gE2配列を含有する、p7F2の1,000bp Bgl II−BamH I断片をpBDV12の4,650bp Bgl II−BamH I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV14と称する。
次いでgE2「遺伝子」の残りをpBDV14にクローニングした。これは、gE2「遺伝子」を含有する、pSP65E1＋E2−１の1,260bp Bgl II−BamH I断片をpBDV14の4,650bp Bgl II−BamH I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV17と称する。
次いでカプシド「遺伝子」（オスロス菌株）をgE1配列の上流のpBDV17にクローニングした。これは２工程で行なった。最初の工程では、ｕプロモーターの開始コドンをカプシド「遺伝子」の「開始コドン」と配列せしめた。これはｕプロモーターの３′末端およびカプシド配列の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、VDVL12（配列認識番号258）
Figure 0003602530
およびBDVL13（配列認識番号259）
Figure 0003602530
を、pBDV17の5,200bp Cla I−Xba I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV25と称する。第２の工程で、カプシド「遺伝子」の残りをpBDV25にクローニングした。これは、カプシド「遺伝子」を含有する、pSP65C−E1−E2の1,870bp BstE II−Bgl II断片（ベルギー、リージ、ユーロジェネティックから得た；レナードら、欧州特許第86870095号）を、pBDV25の4,700bp BstE II−Bgl II断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV26と称する。
次いでｕプロモートしたカプシド/gE1/gE2配列をtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、ｕプロモートしたカプシド/gE1/gE2配列を含有する、pBDV26の3,200bp SnaB I−BamH I断片を、pSD542の4,000bp Sma I−BamH I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV27と称する。
pBDV27を治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに生体外組換え実験に用いてvP1017を産生した。vP972の発現に関して、vP1017感染細胞のイムノプレシピテーション実験を上述したように行なった。疑似感染ベロ細胞またはNYVAC感染ベロ細胞からはBVDV特異的タンパク質は沈殿しなかった。しかしながら、vP1017の溶解産物からは、BVDV特異的タンパク質が沈殿した。
NYVAC/BVDV gE2組換え体の産生
BVDV gE1「遺伝子」をpIBI25にクローニングした。これは、gE1「遺伝子」を含有するpSP66−gE1の1,370bp EcoR I−BamH I断片をE.coli DNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）でブラントエンドし、その末端にXho Iリンカーを連結し、産生したプラスミドをpIBI25のXho I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV1と称する。
次いでH6プロモーターの開始コドンをgE1「遺伝子」の推定「開始コドン」と配列せしめた。これは、H6プロモーターの３′末端およびgE1「遺伝子」の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、BDVM4（配列認識番号253）およびBDVM5（配列認識番号254）を、pBDV1の4,250bp Hind III−Bgl I（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV6と称する。
次いでgE1「遺伝子」をH6＋ATI＋HA三重プロモーターの下流とHAフランキングアームの間にクローニングした。これは、gE1「遺伝子」を含有する、pBDV6の1,380bp EcoR V−Pst I（部分的）断片を、pATI25の3,700bp EcoR V−Pst I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV7と称する。
次いで、将来の操作に必要なBamH I部位をBVDV配列の下流に産生した。これは、オリゴヌクレオチドBDVM6（配列認識番号255）をpBDV7のXho I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV8と称する。
次いでBVDV gE2配列の約830bpをgE1「遺伝子」の下流にクローニングした。これは、gE2配列を含有する、p7F2の980bp Bgl II−BamH I断片をpBDV8の5,100bp BamH I−Bgl II（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV9と称する。
次いでgE1/gE2配列をATIフランキングアームの間にクローニングした。これは、H6プロモートしたgE1/gE2「遺伝子」を含有するpBDV9の2,200bp Nru I−BamH I断片をpPGI7の4,900bp Nru I−BamH I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV23と称する。
次いで、約270bpの追加のgE2配列を存在するBVDV配列の下流にクローニングした。これは、追加のgE2配列を含有する、pSP65E1＋E2−１の1,260bp Bgl II−BamH I断片をpBDV23の6,100bp BamH I−Bgl II（部分的）断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpBDV24と称する。
次いでgE1配列をBDV24から欠損せしめた。これは、H6プログラムの３′末端およびgE2「遺伝子」の５′末端を含有する、130bp Nru I−Pst I PCR断片をpBDV24の5,900bp Nru I−Pst I断片にクローニングすることにより行なった。このPCR断片は、オリゴヌクレオチド、BDVP14（配列認識番号260）
Figure 0003602530
およびBDVP15（配列認識番号261）
Figure 0003602530
によりプラスミド、pBDV17から産生した。この操作により産生されたプラスミドをpBDV28と称する。
配列分析により、pBDV28中のH6プロモーターは2bp挿入物を含有することが分かった。この誤りを直すために、H6プロモーターの３′末端およびgE2「遺伝子」の５′末端を含有する、pBDV28の130bp Nru I−Pst I断片をpBDV24の5,900bp Nru I−Pst I断片にクローニングした。この操作荷より産生したプラスミドをpBDV29と称する。
pBDV29を治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに生体外組換え実験に用いてvP1097を産生した。
上述したようにvP1097感染細胞に関するイムノプレシピテーションを行なって、細胞または溶解産物からBVDVタンパク質を産生した。
実施例32−ポックスウイルスベクター中のヒトサイトメガロウイルス（HCMV）糖タンパク質抗原のクローニングおよび発現
HCMV gB遺伝子のNYVAC供与体プラスミド,pSD542へのクローニング
HCMV DNAのHindDプラスミド4,800bp Hind−BamH I断片をプラスミドpIBI24の2800bp Hind III−BamH I断片にクローニングした。オリゴヌクレオチドCMVM5（配列認識番号262）
Figure 0003602530
およびCMVM3（配列認識番号263）
Figure 0003602530
を用いた生体外突然変異誘発（クンケル、1985;ラッセルら、1986）により、ワクシニアH6プロモーターの制御下でgB遺伝子を変更して発現せしめた（テイラーら、1988a、b;パーカスら、1989）。変更gBを含有するプラスミドを24CMVgB（５＋３）と称した。
24CMVgB（５＋３）の2900bp EcoR V−BamH I断片をpSP131の3100bp EcoR V−Bgl II断片にクローニングした。このクローニング工程により、gB遺伝子がH6プロモーターの制御下におかれた。産生したプラスミドをSP131gBと称した。
SP131gB中のH6プロモートしたgBを側腹に有する制限部位を変更するために、以下の工程を行なった。プラスミドpMP22BHPは、BamH I部位でのポリリンカー領域にHBV sAgの部分を含有するワクシニアのHind III Ｆ断片（WR菌株）のサブクローンを含有する。pMP22BHPをポリリンカー内でHind IIIにより切断し、SP131CMVgBからのHind III断片（H6プロモートしたgB遺伝子を含有する）に連結し、プラスミドSAg22CMVgBを産生した。SAg22CMVgBをBamH Iで切断し、部分的にHind IIIで切断し、BamH IとHind IIIの切断によりpIBI24から誘導したポリリンカーに連結し、H6プロモートしたgB遺伝子を含有するがHVB sAgを有さないプラスミド22CMVgBを産生した。
実施例７に記載したようにベクタープラスミドpSD513を形成することにより、プラスミドpSD460からプラスミドpSD542（NYVAC TK座供与体プラスミド）を誘導した（タータグリアら、1992）。pSD513のポリリンカー領域を、Pst I/BamH Iで切断し、アニールした合成オリゴヌクレオチドMPSYN288（配列認識番号264）
Figure 0003602530
およびMPSYN289（配列認識番号265）
Figure 0003602530
に連結することにより変更し、プラスミドpSD542を産生した。
22CMVgBを、BamH IとNsi Iで切断してH6プロモーターおよびgB遺伝子の一部を含有する断片を産生し、Nsi IとPst Iで切断してgB遺伝子の残りを含有する断片を産生した。これら２つの断片を、ポリリンカー内のBamH IとPst Iで切断したpSD542と連結し、NYVAC供与体プラスミド542CMVgBを産生した。
HCMV gBサイズのALVAC供与体プラスミドCP3LVQH6へのクローニング
8.5kbのカナリヤポックスBgl II断片をpBS−SKプラスミドベクターのBamH I部位にクローニングしてpWW5を形成した。ヌクレオチド配列分析により、C3と称する読取り枠が示された。異種遺伝子を、C3読取り枠を完全切除したC3座に挿入するための供与体プラスミドを構成するために、PCRプライマーを用いてC3に関連した５′および３′配列を増幅した。５′配列のプライマーは、RG277（配列認識番号177）およびRG278（配列認識番号178）であった。
３′配列のプライマーは、RG279（配列認識番号179）およびRG280（配列認識番号180）であった。ワクシニア転写および翻訳終止信号を側腹に有する多重クローニング部位を含有するようにプライマーを設計した。また、左側アームおよび右側アームの５′末端および３′末端に、２つのアームをAsp718/Sac I切断したpBS−SKプラスミドベクターに連結させる適切な制限部位（左側アームにはAsp718とEcoR I、右側アームにはEcoR IとSac I）を含んだ。産生したプラスミドをpC3Iと称した。
プラスミドpWW5のNsi IとSap Iの切断によりC3座から直接上流のカナリヤポックスの908bpの断片を得た。テンプレートとしてのプラスミドpWW5およびオリゴヌクレオチドCP16（配列認識番号266）
Figure 0003602530
とCP17（配列認識番号267）
Figure 0003602530
を用いたPCR（エンゲルケら、1988）によりカナリヤポックスとDNAの604bp断片を得た。604bpの断片をAsp718とXho I（それぞれオリゴヌクレオチドCP16とCP17の５′末端に存在する部位）で切断し、Asp718−Xho Iで切断しアルカリ性ホスファターゼ処理したIBI25（CT、ニューハブン、インターナショナルバイオテクノロジー社）にクローニングしてプラスミドSPC3LAを産生した。SPC3LAを、IBI25内のEcoR VとカナリヤポックスDNA内のNsi Iで切断し、908bpのNsi I−Ssp I断片に連結し、C3座の上流の1444bpのカナリヤポックスDNAを含有するSPCPLAXを産生した。
カナリヤポックスDNAの2178bp Bgl II−Sty I断片をプラスミドpXX4（pBS−SKのPst I部位にクローニングされたカナリヤポックスDNAの6.5kb Nsi I断片を含有する）から単離した。テンプレートとしてのプラスミドpXX4およびオリゴヌクレオチドCP10（配列認識番号268）
Figure 0003602530
とCP20（配列認識番号269）
Figure 0003602530
を用いたPCR（エンゲルケら、1988）によりカナリヤポックスDNAの279bp断片を単離した。279bp断片をXho IとSac I（それぞれオリゴヌクレオチドCP19とCP20の５′末端に存在する部位）で切断し、Sac I−Xho Iで切断しアルカリ性ホスファターゼ処理したIBI25にクローニングして、プラスミドSPC3RAを産生した。
ポリリンカーに追加の特有の部位を加えるために、pC3Iをポリリンカー領域内のEcoR IとCla Iで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、キナーゼしてアニールしたオリゴヌクレオチドCP12（配列認識番号272）とCP13（配列認識番号273）（EcoR I粘着末端、Xho I部位、BamH I部位およびCla Iに一致する粘着末端を含有する）に連結し、プラスミドSPCP3Sを産生した。
Figure 0003602530
SPCP3Sを、C3座の下流のカナリヤポックス配列内のSty IとSac I（pBS−SK）で切断し、SPC3RAからの261bp Bgl II−Sac I断片とpXX4からの2178bp Bgl II−Sty I断片に連結し、C3座の下流の2572bpのカナリヤポックスDNAを含有するプラスミドCPRALを産生した。SPCP3Sを、C3座の上流のカナリヤポックス配列内のAsp718（pBS−SK内）とAcc Iで切断し、SPCPLAXからの1436bp Asp718−Acc I断片に連結し、C3座の下流の1457bpのカナリヤポックスDNAを含有するプラスミドCPLALを産生した。CPLALを、C3座の下流のカナリヤポックス配列内のSty IとSac I（pBS−SK内）で切断し、CPRALからの2438bp Sty I−Sac I断片に連結し、C3座の上流の1457bpのカナリヤポックスDNA、６つの読取り枠の終止コドン、初期転写終止信号、ポリリンカー領域、初期転写趣旨信号、６つの読取り枠の終止コドン、およびC3座の下流の2572bpのカナリヤポックスDNAを含有するプラスミドCP3Lを産生した。産生したプラスミドをSPCP3Lと称した。
テンプレートとしてのpRW838およびオリゴヌクレオチドCP21（配列認識番号270）
Figure 0003602530
とCP22（配列認識番号271）
Figure 0003602530
を用いたPCR（エンゲルケら、1988）により、初期／晩期H6ワクシニアウイルスプロモーター（グオら、1989;パーカスら、1989）を誘導した。PCR産生物を、BamH IとEcoR I（それぞれオリゴヌクレオチドCP21とCP22の５′末端に存在する部位）で切断し、ポリリンカー内のBamH IとEcoR Iで切断されたCP3Lに連結し、プラスミドVQH6CP3Lを産生した。ALVAC供与体プラスミドVQH6CP3Lを、ポリリンカー内のXho IとH6プロモーター内のNru Iで切断し、H6プロモーターとgB遺伝子を含有する22CMgBからのNru I/Hind III断片並びにXho IとHind IIIの切断によりpIBI24から誘導したポリリンカーに連結し、ALVAC供与体プラスミドCP3LCMVgBを産生した。
実施例33−組換えウイルス：サイトメガロウイルスの構成
CMV（サイトメガロウイルス）gB遺伝子をNYVACのTK部位に挿入した。組換えウイルスをvP1001と称した。CMV gB遺伝子をALVACのC3座に挿入した。組換え体をvCP139と称した。
実施例34−組換えウイルス感染細胞中のCMV GBタンパク質の蛍光抗体法
モルモット多クローン性血清と続いてフルオレセインイソチオシアネートヒツジ抗モルモットを用いて、蛍光抗体法研究を前述したように行なった（テイラーら、1990）。vP1001に感染した細胞は、形質膜上に発現されたgBを示した。vCP139に感染した細胞内では弱い内側発現が検出された。
実施例35−組換え体感染細胞中にCMV GBのイムノプレシピテーション
前述したようにイムノプレシピテーション実験を行なった（テイラーら、1990）。CMV感染細胞中で産生されたCMV gB糖タンパク質は、130kDaの前駆体形状とともに55kDaの分子量を有する（グレッチら、1988）。vP1001とvCP139に感染した細胞は、約116kDaと約55kDaの２つのCMV gB暗号タンパク質を産生する。
実施例36−中和抗体
vP1001（NYVAC−HCNV gB）によるCBAネズミの免疫化の後で、接種したネズミの血清の中和抗体力価した（ゴンクゾル、1986）。ヒトサイテメガロウイルスを中和できる抗体をネズミの血清中に、免疫化後14−21日（1:16の幾何学平均力価（gmt））および28と60日の間（gmt＝1:26）で検出した。CBAネズミのALVAC−HCMV gBによる免疫化により、1:64gmt（14−21日のpi、21と28日のpiでは1:91gmt）および28と60日の間のpiでは1:111のHCMV中和抗体力価を示した。それゆえ、HCMV gBを発現するカナリヤポックスウイルス組換え体またはワクシニアウイルスでのネズミの免疫化は、HCMVの感染性を中和できる抗体を誘発した。
実施例37−細胞媒介免疫
HCMV中和抗体力価以外にも、vCP139はまた、HCMV gBを発現する組換えワクシニアウイルス（ワクシニアWR−gB）に感染したネズミL929細胞を殺すことのできる細胞毒性Ｔリンパ球を誘発できる。CBAネズミに、2.5×108pfuのvCP139を腹腔内により免疫化した。16から30日後、ネズミのひ臓細胞の懸濁液を2:1の比率でvP1001に事前に感染せしめた同系ひ臓細胞とともにコインキュベーションすることにより生体外で再刺激した。５日後、ひ臓細胞を数え、51Cr−放出アッセイ（ジンカーナゲルら、1984）を用いて、未感染L929細胞またはアデノウイルスAd5dlE3、HCMV gBを発現する組換えアデノウルイス（Ad−gB）、ワクシニアウイルス、およびHCMV gBを発現する組換えワクシニアウイルスに感染したL929細胞に対する細胞毒性を評価した。未感染標的並びにAd5dlE3に感染した標的に対して、反応性のバックグラウンド水準のみが測定された。これに反して、生体外刺激ひ臓細胞は、HCMV gBを発現するAd−gBに感染したL929細胞を用意に殺した。ワクシニアウイルスベクターに感染した標的に対して溶菌がある程度観察されたが、gBを発現する組換えワクシニアウイルスに感染した標的に対してはより高い細胞溶解が測定された。これにより、HCMV gB内に位置するエピトープに特異的な細胞毒性Ｔリンパ球は、HCMV gBを発現する組換えカナリヤポックスウイルス（vCP139）の接種により産生されることが明確に示された。
実施例38−NYVACおよびALVAC供与体プラスミド構成：イヌパルボウイルス
イヌパルボウイルスVP2カプシド遺伝子を発現するポックスウイルス組換え体を産生するために、VP2遺伝子がCPV−ｄ単離体のゲノム（CPV−２抗原型）から増幅され、ワクシニアH6プロモーターに結合せしめられ（パーカスら、1989）、NYVACまたはALVAC挿入ベクターに挿入された供与体プラスミドを構成した。NYVAC挿入部位はdeorfedATI座であり、ALVAC挿入部位はdeorfedC3座である。
VP2遺伝子配列は、プラスミドpBI265（１）からPCRにより得た。NY、イタカ、コーネル大学、ジェームズA.ベーカー研究所、Dr.コリンR.パリッシュ、から得たこのプラスミドは、CPV−ｄ単離体のゲノムを含有する（コーネル790320）（抗原型CPV−２）。この単離体からのVP2遺伝子のDNA配列は公表されている（パリッシュら、1988）。
テンプレートとしてのpBI265（１）およびプライマーとしてのオリゴヌクレオチドRG451（配列認識番号274）
Figure 0003602530
とRG452（配列認識番号275）
Figure 0003602530
を用いて、PCRにより完全VP2読取り枠（ORF）を増幅した。精製したDNA断片をAsp718とEcoR Iで切断し、pBluescript SK＋中のAsp718およびEcoR I部位にクローニングし、pDT4を産生した。DNA配列分析によりVP2遺伝子を確認した。
VP2遺伝子は、初期転写終止信号として機能できるORF内に２つのTTTTTNT配列を含有する（ユエンら、1987）。これらの信号を除去するために、PCR部位定方向突然変異誘発を用いて、正確なアミノ酸配列を保持しながら、ヌクレオチド配列を変更した。合成オリゴヌクレオチドRG453（配列認識番号276）
Figure 0003602530
およびRG454（配列認識番号277）
Figure 0003602530
を用いてpBI265（１）から250bpの断片を増幅せしめた。精製した断片をBgl IIとAcc Iで切断し、Bgl II/Acc I VP2断片をpDT4に配するのに用いた。産生したプラスミドpED3は、TTTTTNT配列がTTTCTATおよびTTCTTCTに変更された変更VP2遺伝子を含有した。
pMPATIH6HSVTKは、H6プロモーターの制御下でHSV−１チミジンキナーゼ遺伝子の暗号配列を含有する発現カセッテがポリリンカー領域のHpa IとXho I部位の間に挿入されたpSD552（この明細書の別の箇所に記載されている）の誘導体である。このプラスミドをNru IとXho I部位で切断してtk遺伝子を切除するがH6プロモーターの５′末端を保持する。上述したこのベクターへの変更VP2遺伝子の挿入によりpATI−VP2が産生される。このNYVAC供与体プラスミドは、ATI挿入アームを側腹に有するH6プロモートしたVP2遺伝子である。
CPV VP2カプシド遺伝子を含有するALVAC供与体プラスミドを以下のように構成した。変更VP2遺伝子をNru IとXho IによりpED3から切除し、精製したプラスミドをNru IとXho Iで切断したpVQH6CP3L（フラビウイルスのセクションに記載されたプラスミド）にクローニングした。産生したプラスミド、pC3−VP2は、C3挿入アームを側腹に有するH6プロモートしたVP2遺伝子を含有する。
実施例39−NYVACおよびALVAC組換え体：イヌパルボウイルス（CPV）の構成
供与体プラスミドpATI−VP2を、治療ウイルスとしてのNYVAC（vP866）とNYVAC−RG（vP879）とともにベロ細胞において生体外組換え実験に用いて、それぞれvP998とvP999を産生した（タータグリアら、1992）。放射線標識したVP2特異的DNAプローブを用いて現場でのハイブリダイゼーション方法（ピッチーニら、1987）により組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製により組換えプラークを精製し、さらなる分析のために増幅した。
供与体プラスミドpC3−VP2を、治療ウイルスとしてのALVAC（CPpp）とALVAC−RG（vCP65A）をCEF細胞において生体外組換え実験に用いて、それぞれvCP123とvCP136を産生した。放射線標識したVP2特異的プローブ（陽性信号）とC3 ORF特異的プローブ（陰性信号）を用いた現場でのハイブリダイゼーション方法により組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製により組換えプラークを精製し、さらなる分析のために増幅した。
実施例40−NYVAC−およびALVAC−ベースのCPV VP2組換え体の発現分析
多クローン性CPVイヌ血清またはVP2エピトープに特異的な単クローン性抗体を用いる前述したような蛍光抗体法（テイラーら、1990）により、CPV VP2遺伝子を含有する全ての組換え体を発現に関して試験した。全ての血清は、NY、イサカ、コーネル大学、ジェームズA.ベーカー研究所、Dr.コリンR.パリッシュから得た。NYVACベースの組換え体をベロ細胞上で試験し、一方ALVACベースの組換え体はCEF細胞上で試験した。組換え体vP998、vP999、vCP123、およびvCP136は全て、核内に局在した内部蛍光を示した。表面には蛍光は検出されなかった。加えて、狂犬病Ｇ遺伝子を含有する２つの組換え体（vP999およびcCP136）は、狂犬病Ｇエピトープに特異的な単クローン性抗体でスクリーニングした。両者とも細胞の表面に強い蛍光を示した。
上述した組換え体中の真正VP2遺伝子産生物の発現をさらに特徴付けるために、同一の抗血清を用いてイムノプレシピテーションを行なった（テイラーら、1990）。NYAVCベースの組換え体をベロ細胞上で試験し、一方ALVACベースの組換え体はCEF細胞上で試験した。全ての組換え体（vP998、vP999、vCP123、およびvCP136）において、抗血清は65kDaのタンパク質を沈殿せしめ、これは天然VP2遺伝子のサイズと一致する。このサイズのタンパク質は、細胞溶解産物またはいずれの親ウイルス（NYVACまたはALVAC）からは検出されなかった。
実施例41−エプスタインバーウイルス（EBV）遺伝子のALVACへの挿入
供与体プラスミドEBV三重２の構成
プラスミドEBVトリプル（Triple）１（実施例11）は、全てワクシニアTK座挿入プラスミドに挿入されたEBV遺伝子gH、gBおよびgp340の発現カセッテを含有する。プラスミドEBVトリプル１をSma I/BamH Iで切断し、42kDa昆虫ポックスウイルスプロモーターとEBV gH遺伝子の５′末端を含有する0.3kb断片を単離した。またEBVトリプルプラスミドをBamH Iで切断し、EBV gH遺伝子の３′末端、EBV gB発現カセッテ、およびEBV gp340発現カセッテを含有する7.3kbの断片を単離した。次いでこれら２つの断片を、Sma I/BamH Iで切断したALVAC C4座挿入プラスミドpNVQC5LSP7（テタナスの実施例参照）に連結した。産生したプラスミドをEBVトリプル２と称した。
EBV遺伝子のALVACへの挿入
C5挿入座に、３つのEBV遺伝子、gH、gBおよびgp340の発現カセッテを含有するプラスミドEBVトリプル２をALVACによる組換えの供与体プラスミドとして用いてALVAC組換え体vCP167を産生した。
vP944およびvCP157によるEBVタンパク質の発現
ALVAC組換え体vCP167とvP944、同一の３つの遺伝子を含有するNYVACベースの組換え体（実施例11）に感染した細胞からの代謝標識した溶解産物に、EBVに対してはヒト多クローン性血清、並びにEBVgBとgp340に対してはネズミ単クローン性抗体を用いたイムノプレシピテーションを行なった。SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動と続いてのラジオオートグラフィーにより沈殿物を分析した。NYVACベースの組換え体vP944およびALVACベースの組換え体vCP167について、正確な分子量のタンパク質とEBV gB、gHおよびgp340の特異性を観察した。
実施例42−ウマインフルエンザHA（A1/プラハ/56）のNYVACおよびALVACへの挿入のための発現カセッテの構成
産生したEIV（A1/プラハ/56）ゲノムRNAをローンメリクス（フランス、リヨン）から得た。ガブラーとホフマンにより記載されたように（1983）、EIV−特異的cDNAを調製した。オリゴヌクレオチドEIVSIP（配列認識番号278）
Figure 0003602530
を用いて第１の鎖cDNAを合成した。このオリゴヌクレオチド（配列認識番号278）は、各ゲノムRNA断片の３′末端に相補的である。ガブラーとホフマン（1983）によると、cDNAはdGテイルされ（tailed）、EcoR Vで切断されたpMG5に挿入され、dCテイルされる。この方法によるcDNAのpMG5への挿入により、両方のプラスミド/cDNA配列縁にBamH I部位が産生される。
このEIV cDNAライブラリーからの500のコロニーを、アンピシリン（50μg/ml）を含有するLB−アガープレートに二通りに運搬した。コロニーを放射線標識したEIV HA特異的プローブとともにハイブリダイゼーションのためにニトロセルロースに運搬した。オリゴヌクレオチドEIVSIP（配列認識番号278）により合成した放射線標識した第１の鎖cDNAおよびテンプレートとしての精製HAゲノムRNAを用いてこのプローブを誘導した。HAゲノム断片を1.2％の低融点アガロースゲル（MD、ゲイサルスバーグ、ベセスダリサーチラボラトリーズ）から精製した。このゲルシステムにおいて１×のTBEの２ボルト/cmで展開して合計ゲノムRNAを分画した。HA帯を切除し、アガロースを75℃で融解し、続いて２回のフェノール抽出と１回のエーテル抽出とETOH沈殿によりHA RNAを収穫した。
標準方法（マニアチスら、1991）にしたがってコロニーハイブリダイゼーションンを行ない、1.4kb HA cDNA挿入物を含有するcDNAクローンを同定した。そのクローンは、ゲノムRNAに対するノーザンブロット分析とヌクレオチド配列分析により、HA特異的であることが分かった。この1.4kbの断片を用いて、続いてのcDNAライブラリースクリーニングのための放射線標識したHA特異的DNAプローブを産生した。
このプローブを用いて、他のHA特異的cDNAクローンを同定した。最大のものは、1.0kb、1.2kb、および1.4kbであり、それぞれ、pEIVAIPHA−１、−10、および−８と称した。集団的に、これらのコロニーは、ヌクレオチド配列分析により決定される全縁EIV HA暗号配列を含有する。これらの分析により決定されたEIV HAの全縁配列（A1/プラハ/56）を第23図に示す（（配列認識番号279）。
次に、異なるcDNAクローンからの断片をスプライシングすることによりEIV HAの全長のcDNAクローンを産生した。HA暗号配列の５′側の1200bpを、テンプレートとしてのこのプラスミドおよびオリゴヌクレオチドEIVSIP（配列認識番号278）とEIVAIP7A（配列認識番号280）
Figure 0003602530
を用いたPCRによりpEIVAIPHA−８から誘導した。この1200bpの断片をPst Iで切断し、５′と３′の両末端にPst I粘着性末端を産生した。HA暗号配列の３′側の600bpを、BamH IとPst Iでの切断によりpEIVAIPHA−10から誘導した。これら２つの断片を、Pst IとBamH Iで切断したpBS−SK（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入した。全縁EIV HA（A1/プラハ/56）暗号配列を含有する産生したプラスミドをpBSEIVAIPHAと称した。
オリゴヌクレオチドEIVAIPHA5P（配列認識番号281）
Figure 0003602530
およびEIVAIPHA3P（配列認識番号282）
Figure 0003602530
を用いて、pBSEIVAIPHAからPCRによりEIV HA暗号配列（ATGからTAA）を誘導した。オリゴヌクレオチドEIVAIPHA5P（配列認識番号281）は、枠ウイルスH6プロモーター（ゲーベルら、1990a、ｂ）の３′側
26bp（Nru I部位）を提供した。1.7kbのPCR誘導断片をNru I切断pCPCV1に挿入し、pC3EIVAIPHAを産生した。pCPCV1は、H6プロモーターを含有する挿入ベクターである。適切な方向で1.7kbのブラントエンドした断片を挿入することにより、H6プロモーターに対してEIV HA3′を配した。プラスミドpCPCV1を以下のようにして誘導した。pTP15（グオら、1989）のPst I部位にFeLV env遺伝子（ギルホットら、1987）を含有する2.4kbの断片を含有するプラスミドpFeLV1AをPst Iで切断して、FeLV配列を切除し、再結合せしめてプラスミドpFeLVFを産生した。ポリリンカー領域の次のワクシニアウイルスH6プロモーター要素は、Kpn IとHpa Iの切断によりpFeLVF4から離生した。T4 DNAポリメラーゼを用いて150bpの断片をブラントエンドし、カナリヤポックスDNAの3.3kb Pvu IIゲノム断片を含有するプラスミド、pRW764.2に挿入した。pRW764.2を、カナリヤポックス配列内の特有のEcoR I部位を認識するEcoR Iで線状化し、E.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。産生したプラスミドをpCPCV1と称した。このプラスミドは、ポリリンカー領域が続き、カナリヤポックスウイルス相同配列を側腹に有するワクシニアウイルスH6プロモーターを含有する。
実施例43−EIV HA（A2/フォンテインブルー（FONTAINEBLEAU）/79）をNYVACとALVACに挿入するための発現カセッテの構成
精製EIV（A2/フォンテインブルー/79）ゲノムRNAをローンメリクス（フランス、リヨン）から得た。ガブラーとホフマン（1983）により記載され、EIV（A1/プラハ/56）cDNA調製に記載されたように、EIV特異的cDNAを調製した。第１の鎖cDNA合成には、オリゴヌクレオチドEIVSIP（配列認識番号278）を用いた。
HA遺伝子の全長cDNAクローンを含有する細菌コロニーをスクリーニングするために、転換したコロニーの８つのプールを500mlの培養中で増幅し、標準方法により（サムブルックら、1989）プラスミドDNA標品を得た。オリゴヌクレオチドEIVSIP（配列認識番号278）およびEIVSIP（配列認識番号283）
Figure 0003602530
による標準PCR反応において全プラスミドDNAをテンプレートとして用いた。これらのプライマーはこれらの８つの断片の５′および３′末端での保存した（conserved）配列に相補的であったので、そのような反応は、潜在的に８つのEIVゲノム断片の全長cDNA配列のみを増幅する。
テンプレートとしてのプラスミド標品、pPEIVA2F−05は、全長HA特異的断片のサイズと一致する1.8kbのPCR誘導断片を産生した。このPCR誘導断片を、cDNAライブラリーの残りに対するプローブとしての使用のために、PCRにより再度増幅した。このプローブを用いて、クローンpEIVA2FHA−７および−８を同定し、注文合成したオリゴヌクレオチド（ゲーベルら、1990a）を用いたヌクレオチド配列分析によりcDNA挿入物を分析した。
ヌクレオチド配列分析により、クローン＃７および＃８は、EIV（A2/フォンテインブルー/79）HA暗号配列（第24図）（配列認識番号284）の３′側1200bpを表すことが分かった。
オリゴヌクレオチドA2F3P（配列認識番号285）
Figure 0003602530
およびA2FBAM2（配列認識番号286）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより、1200bp EIV（配列認識番号をクローン＃７から増幅した。BamH Iによる切断後のこの1200bpの断片の５′末端は、第24図の完全EIV（A2/フォンテインブルー/79）HA暗号配列（配列認識番号284）のヌクレオチド617に対応する。またこの断片を、オリゴヌクレオチドA2F3P（配列認識番号285）を用いて暗号配列に対して操作した３′であるSpe Iで切断した。この1200bp断片を、５′側616bpを含有する断片（以下に定義する）とともにSma I/Spe Iで切断したpBS−SK（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）にともに挿入した。しかしながら、潜在的な転換体のスクリーニングは、1200bpの断片が挿入されたことのみを示した。ヌクレオチド配列分析のために多くのクローンを選択した。
多くのクローンのヌクレオチド配列分析後、さらなる操作のために、pBSEIVA2FHA−19を選択した。このクローンは、ヌクレオチド617（第24図）（配列認識番号284）およびヌクレオチド1570（第24図）（配列認識番号284）でのBamH I部位の近くにエラーを含有する。これらのエラーを訂正するために、以下の操作を行なった。プラスミドpBSEIVA2FHA−19をBamH IとSph Iで切断し、切除した900bpの断片を単離した。この断片を、HA暗号配列の３′側領域を包含する250bp Sph I/Spe I断片とともにSpe I/BamH Iで切断したpBS−SKにともに挿入した。テンプレートとしてのクローン＃７（上記）およびオリゴヌクレオチドA2F3P（配列認識番号285）とA2F6（配列認識番号287）
Figure 0003602530
を用いて、この250bp PCR断片を誘導した。産生したプラスミドをpEIVH33Pと称する。
EIV HAのHA暗号配列の５′側616bpを以下の方法により産生した。最初に、第１の鎖cDNAを上述したように産生した。次いでこの第１の鎖cDNA標品をテンプレートとして用い、オリゴヌクレオチドA2F5P（配列認識番号288）
Figure 0003602530
とA2FBAM1（配列認識番号289）
Figure 0003602530
を用いたPCRによりこれらの配列を増幅した。この断片をHinc II切断したpBS−SK（CA、ラジョラ、シスラタジェネ）に挿入し、産生したプラスミドをpEIVH35Pと称した。
ワクシニアウイルスH6プロモーター配列（ゲーベルら、1990a、ｂ）およびHA暗号配列の５′側領域を、以下のように増幅し、融解せしめた。pBSH6IIIBEと称するH6プロモーターに正確に連結したHIV−１（IIIB）env遺伝子を含有するpBSベースのプラスミドからH6配列を誘導した。これらの配列を、オリゴヌクレオチドH65PH（配列認識番号164）
Figure 0003602530
およびH63P（配列認識番号291）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより増幅した。オリゴヌクレオチドH65PH（配列認識番号164）およびEIV5PACC（配列認識番号292）
Figure 0003602530
とともに120bpのH6断片をテンプレートとして用い、H6プロモーターおよびHA暗号配列の最初の41bpからAcc I制限部位を含有する161bp断片を産生した。この断片をHind IIIとAcc Iで切断し、pEIVH35Pからの550bp Acc I/BamH I断片とともにHind/BamH Iで切断したpBS−SKにともに挿入した。産生したプラスミドをpH6EIVH35Pと称した。
pH6EIVH35Pからの710bp Hind III/BamH I断片およびpEIVH33Pからの1200bp BamH I/Spe I断片をHindとSpe Iで切断したpBS−SKにともに挿入することにより、全縁HA発現カセッテを誘導した。誘導プラスミドをpBSA2FHABと称した。
ヌクレオチド位置617でのBamH I部位の近くの上述した塩基変化を訂正するために、マンデッキ方法（マンデッキ、1986）を用いた。pBSA2FHABをBamH Iで線状化し、オリゴヌクレオチドA2F7（配列認識番号293）
Figure 0003602530
を用いて突然変異誘発方法を行なった。HAの訂正変形を含有するプラスミドをpBSA2FHAと称した。
実施例44−それぞれvCP128およびvP961を産生するのに使用する挿入プラスミドpEIVC5LおよびpEIVHAVQVVの構成
プラスミドpC3EIVAIPHAをNru IとHind IIIで切断し、H6プロモーターの３′側26bpおよび全縁EIV（A1/プラハ/56）HA暗号配列を含有する1.7kbの断片を切除した。クレノウによるブラントエンドの後に、この断片を、Nru I/EcoR Iで切断しクレノウでブラントエンドしたプラスミドpRW838に挿入してプラスミドpC5AIPHAを産生した。プラスミドpRW838は、カナリヤポックス挿入プラスミド（C5座）中のワクシニアH6プロモーターに融合された狂犬病Ｇ遺伝子（キエニーら、1984）を含有する。Nru IとEcoR Iによる切断により、H6プロモーターの５′側100bpとC5フランキングアームを残して狂犬病Ｇ遺伝子を切除した。
プラスミドpC5AIPHAをSma IとSac Iで切断し、H6プロモーターとEIV（A1/プラハ/56）暗号配列の５′側645bpを含有する820bp断片を切除した。この断片を、HA暗号配列の残りを含有するpC3EIVAIPHAらの1.1kb Sac I/Hind III断片とともに、Hind IIIとSma Iで切断したpBS−SKに挿入した。産生したプラスミドをpBSAIPHAVQと称した。
次いでプラスミドpBSAIPHAVQを、Spe IとSma Iで線状化した。この4.7kbの断片をpBSA2FHAから誘導した1.8kb Spe I/部分的Hinc II断片に連結した。EIV（A1/プラハ/56）および（A2/フォンテインブルー/79）HA遺伝子を頭対頭の配置で含有する、産生したpBSベースのプラスミドを、pBSAIPA2FHAQと称した。
２つのHA遺伝子を含有するpBSAIP2FHAVQから誘導したNor I/Xho I断片（3.5kb）を単離し、pSD542（EIV（A2/サフォーク/89）に関して以下に記載する）とpC5Lに挿入し、それぞれ挿入プラスミドpEIVHAVQVVおよびpEIVC5Lを産生した。
C5L挿入プラスミドは以下のように誘導した。コスミドベクターpVK102（ノフおよびネスター、1982）を用いて、vCP65のゲノムライブラリー（C5座に狂犬病を有するALVACベースの狂犬病Ｇ組換え体）を構成した。このライブラリーに、pRW764.5（C5座）内に含有される0.9kbのPvu IIカナリヤポックスウイルスゲノム断片をプローブした。これらのカナリヤポックスDNA配列は、起点挿入座を含有している。28kbの挿入物を含有するクローンが成長せしめられ、pHCOS1と称した。C5配列を含有するこのコスミドから3.3kbのCla断片をサブクローンした。このCla I断片らの配列分析を用いて、１−1372のC5座の遺伝子地図を延長した。
C5挿入ベクター、pC5Lを、２段階で構成した。オリゴヌクレオチドC5A（配列認識番号294）
Figure 0003602530
およびC5B（配列認識番号295）
Figure 0003602530
を用いたPCR増幅により、1535bpの左側アームを産生した。テンプレートDNAはvCP65ゲノムDNAであった。この断片をEcoR I/Sma I切断pUC8にクローニングした。標準塩基配列決定プロトコルにより配列を確認した。オリゴヌクレオチドC5C（配列認識番号296）
Figure 0003602530
およびC5DA（配列認識番号297）
Figure 0003602530
を用いたPCR増幅により、404bpの右側アームを産生した。次いでこの断片を、以前に産生し、Sma I/Pst Iで切断した左側アームを含有するベクターにクローニングした。全縁構成を、標準配列分析により確認し、pC5Lと称した。この挿入プラスミドは異種遺伝子のC5座への挿入を可能にする。
実施例45−インフルエンザウイルス（A2/サフォーク/89）血球凝集素遺伝子を発現するALVAC−およびNYVACベースの組換え体を産生する挿入プラスミドの構成
ウマインフルエンザウイルス（A2/サフォーク/89）からの血球凝集素（HA）遺伝子を過含有するM13クローンをDr.M.ビンス（イギリス、CB8 7DW、サフォーク、ニューマーケット、P.O.Box5、アニマルヘルストラスト）から得た。このクローンは、Hind III部位によりM13ベクターに挿入されたこのHAS遺伝子を含有する全長1.7kb cDNA断片を含有する。
最初に、オリゴヌクレオチドEIVS1（配列認識番号298）
Figure 0003602530
およびEIVS2（配列認識番号299）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより上述したM13クローンからウマインフルエンザウイルス（EIV）HA遺伝子を増幅した。この1.7kbの断片を、Sma Iで切断したpBS−SK（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結した。２つの陽性クローンを誘導し、ヌクレオチド配列分析により分析した（ゲーベルら、1990a）。クローンＡは１つの非保存塩基変化を含有し、一方クローンＢは、第25図に示した配列と比較した３つの変化を含有した（配列認識番号300）。EIVHA遺伝子の全長訂正変形を産生するために、クローンＢをSac IとMsc Iで切断し、390bpの断片を切除した。この断片をクローンＡから誘導した4.3kbのMsc I/部分的Sac I断片に連結した。これにより訂正されたEIVHAが得られ、pBSEIVHSと称した。
EIVHA暗号配列の５′側360bpを、オリゴヌクレオチドI3L5EIV（配列認識番号301）
Figure 0003602530
およびEIVPVU（配列認識番号302）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより、pBSEIVHSから誘導した。オリゴヌクレオチドI3L5B5（配列認識番号303）
Figure 0003602530
およびEIV5I3L（配列認識番号304）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより全縁I3Lプロモーター領域（ゲーベルら、1990a、ｂ）をpMPI3L101から誘導した。オリゴヌクレオチドI3L5B5（配列認識番号303）およびEIVPVU（配列認識番号302）によるPCRによって、オリゴヌクレオチドI3L5EIV（配列認識番号301）およびEIV5I3L（配列認識番号304）による操作により協議された相補にしがたってこれらの断片を融合し、480bpの断片を産生した。
プラスミドpMPI3L101は、I3Lプロモーターの制御下で狂犬病糖タンパク質をコードする遺伝子からなる発現カセッテを含有し、全てはORF C6L−K1Lが欠損したワクシニア挿入プラスミドに挿入された（ゲーベルら、1990a、ｂ）。I3Lプロモーターは、ORFI3Lの開始コドンから直ちに上流の101塩基（nt64,973−65,074ゲーベルら、1990a、ｂ）からなる。
I3LプロモーターをEIVHA暗号配列の５′領域に正確に連結せしめる上述のように誘導した融合断片をBamH I（５′末端）とAcc I（３′末端）で切断し、400bpの断片を単離した。この断片をpBSEIVHSから誘導した4.6kbのBamH I/部分的Acc I断片に連結し、産生したプラスミドをpBSEIVHSI3Lと称した。
EIVHA発現カセッテを含有する1.8kb Sma I/Xho I断片をpBSEIVHSI3Lから誘導した。この断片をSma I/Xho I切断pSD542（実施例32に記載した）挿入ベクターに挿入し、pTKEIVHSI3Lを産生した。
pBSEIVHEI3L（上記）からの1.8kb Sma I/Xho I断片を、Sma I/Xho Iで切断した、CPpp（ALVAC）挿入プラスミド、VQCP3Lに挿入した。産生したプラスミドをpC3EIVHSI3Lと称した。
挿入プラスミドVQCP3Lを以下のように誘導した。Xma Iによる切断と、線状化したプラスミドのホスファターゼ処理と、アニールし、キナーゼしたオリゴヌクレオチドCP23（配列認識番号305）
Figure 0003602530
およびCP24（配列認識番号306）
Figure 0003602530
に連結することにより、VQCPCP3LをpSPCP3Lから誘導した。
実施例46−ALVACウマインフルエンザウイルス組換え体の発生
プラスミドpEIVC5Lは、ウマ−１、A1/プラハ/56（H7）およびウマ−２、A2/フォンテインブルー/79（H3）の血球凝集素暗号配列を含有する。両方の遺伝子をワクシニアウイルスH6プロモーターに連結し、de−orfed C5座に挿入する。ALVACウイルスは、生体外組換えにおいて治療ウイルスとして用い、挿入されたDNAを治療した。H7およびH3暗号配列に対するハイブリダイゼーションに基づいて陽性プラークを選択した。両方の異種遺伝子を含有する純粋な個体群が得られるまで、組換え体プラークにプラーク精製した。この時点で組換え体はvCP128と判明し、株ウイルスを設立した。ウマからの多クローン性抗H7血清およびH3血球凝集素に特異的な単クローン性抗体を用いて、蛍光抗体法を行なった。両方の試薬を用いてvCP128感染ベロ細胞に表面蛍光が検出され、両方の抗原が感染細胞表面に適切に存在することが示された。
H3特異的単クローン性抗体を用いたイムノプレシピテーション分析により、vCP128感染CEF細胞中に約75kdのタンパク質の存在が示された。これは潜在的にHA前駆体糖タンパク質を表すものである。開裂産生物は検出されなかった。H7特異的多クローン性血清を用いたイムノプレシピテーション分析により、約75kdの前駆体糖タンパク質の存在が示された。それぞれ約45および30kdの分子量を有するHA1およびHA2開裂産生物もまた視覚化された。
プラスミドpC3EIVHS13Lは、ウマ−２ A2/サフォーク/89亜型の血球凝集素暗号配列を含有する。遺伝子は、ワクシニアウイルスI3Lプロモーターに連結され、de−orfedC3挿入部位に挿入される。生体外組換えにおいて、ALVACウイルスは治療ウイルスとして用いられ、異種遺伝子を治療する。H3特異的放射線標識プローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて組換え体プラークを選択した。純粋な組換え体個体群となるまで、陽性プラークをプラーク精製した。この時点で、組換え体はvCP159であると判明し、ウイルス株を設立した。鶏からのH3特異的血清多クローンを用いたvCP159感染CEF細胞への蛍光抗体法により、免疫学的に認識したタンパク質が感染細胞表面に発現されたことが示された。
実施例47−ウマインフルエンザウイルス亜型の血球凝集素糖タンパク質を含有するNYVAC組換え体の発生
プラスミドpEIVHAVQVVは、ウマ−１、A1/プラハ/56（H7）およびウマ−２、A2/フォンテインブルー/79（H3）をコードする配列を含有する。両方の遺伝子をワクシニアウイルスH6プロモーターに連結し、TK部位に挿入する。NYVAC（vP866）を生体外組換えにおいて治療ウイルスとして用い、異種遺伝子を治療する。放射線標識したH3およびH7特異的タンパク質に対するハイブリダイゼーションに基づいて組換えプラークを選択した。純粋な個体群が得られるまで、組換え後代ウイルスをプラーク精製した。この時点で組換え体はvP961であると判明し、ウイルス株を設立した。H3特異的単クローン性行為およご多クローン性抗H7血清を用いた蛍光抗体法により、両方の糖タンパク質が感染細胞表面に発現されたことが分かった。同一の試薬によるイムノプレシピテーション分析により、H3糖タンパク質は、約75kdの分子量を有する前駆体糖タンパク質として発現されたことが示された。開裂産生物は証明されなかった。H7糖タンパク質は、約75kdの前駆体糖タンパク質として証明され、HA1およびHA2開裂産生物はそれぞれ約45および30kdの分子量を有した。
プラスミドpTKEIVHSI3Lは、ウマ−２ A2/サフォーク/89血球凝集素糖タンパク質の暗号配列を含有する。暗号配列を、I3Lプロモーターに連結し、TL部位に挿入する。NYAVC（vP866）を治療ウイルスとして用い、組換え体プラークは、H3特異的放射線標識したプローブに対するハイブリダイゼーションに基づいて選択した。純粋な個体群が得られるまで、組換え体プラーク後代をプラーク精製した。この時点で組換え体はvP1063であることが判明し、ウイルス株を設立した。鶏からの多クローン性抗H3を用いた蛍光抗体法により、免疫的に認識されたタンパク質が感染細胞表面に発現された子とが分かった。
実施例48−ワクシニアウイルス/FELV挿入プラスミドの構成
FeLV（ネコ白血病ウイルス）env DNA配列を、M13mp（ベクターに挿入された2.4kbp FeSV−SM DNA（ギルホットら、1987）の形状でDr.F.ゲイルバート（フランス、パリ、セントルイス、血液実験病院の研究所）から得た（メシング、1983）。全縁読取り枠を含有するこの2.4bp Pst I/Kpn I断片（FeLV p70＋p13E）を単離し、都合よくpUC18に挿入した（メシング、1983）。env配列の３′末端でのKpn I部位をPst I部位に変換し、2.4kbp Pst I断片を単離してPst I切断したpTp15に連結した（グオら、1989）。産生したプラスミドをpFeLV1Aと称した。
生体外突然変異誘発を用いて（マンデッキら、1986）、pFeLV1AをpFeLV1Bに変換した。これは、オリゴヌクレオチドSPBGLD（配列認識番号307）
Figure 0003602530
を用いて行なった。このオリゴヌクレオチドにより突然変異誘発により、H6プロモーターの境界でのBgl II部位およびHA配列を除去することができた。これにより、ウイルス中に発見されたこれらのDNA断片の実際の配列が提供される。
次いでプラスミドpFeLV1Bを、オリゴヌクレオチドFeLV5P（配列認識番号308）
Figure 0003602530
で突然変異誘発せしめ、pFeLV1Cを産生した。以下の変更に関して、生体外突然変異誘発をマンデッキ（1986）に記載されたように行なった。特有のSma I部位でのpFeLV1Bの切断後、DNAをBal31で切断した。５秒、10秒、20秒,40秒および80秒の時間に、アリコートを採取し、EGTAを20mMの最終濃度に加えることにより、反応を終了せしめた。アリコートを集積し、突然変異誘発反応に用いた。産生したプラスミド、pFeLV1Cは、ワクシニアウイルスH6プロモーターの３′で隣接したFeLV env遺伝子およびATG:ATG置換を含有した。プラスミドpFeLV1Cを、治療ウイルスとしてのvP425とともに生体外組換え試験に用い、全縁FeLVエンベロープ糖タンパク質を発現する組換えワクシニアウイルス（vP453）を産生した。
プラスミドpFeLV1Cを試薬として用いてpFeLV1Dを産生した。この組換えプラスミドは、推定免疫抑制領域を欠如することを除いては全縁FeLV env遺伝子を含有する（シアンシオロら、1985;マセスら、1978）。免疫抑制領域をコードする配列（ギホットら、1987におけるヌクレオチド2252−2332の配列）を以下の方法により生体外突然変異誘発により欠損せしめた（マンデッキ、1986）。プラスミドpFeLV1CをBsm Iで線状化した。線状化したプラスミドをBal31で処理し、１分、２分、４分および８分でアリコートを採取し、突然変異誘発反応の使用のために集積した。オリゴヌクレオチドFeLV1SD（配列認識番号309）
Figure 0003602530
を用いて生体外突然変異誘発を行なった。産生したプラスミド、pFeLV1Dを、治療ウイルスとしてのvP410とともに生体外組換え試験に用いて、vP456を産生した。このワクシニアウイルス組換え体は、推定免疫抑制領域が欠如した全縁エンベロープ糖タンパク質を発現するように産生された。
実施例49−アビポックスウイルス/FeLV挿入プラスミドの形成
FP−１組換え体の構成のために、2.4kbpのH6/FeLV env配列を、Bgl IIの切断とPst Iの部分的な切断により、pFELV1A（上記）から切除した。Bgl II部位は、H6プロモーター配列の５′境界にある。Pst I部位は、エンベロープ糖タンパク質読取り枠の翻訳終止信号から420bp下流に位置する。
2.4kbp H6/FeLV env配列をBamH IとPst Iで切断したpCE11に挿入した。多重クローニング部位を不可欠Hind II部位に挿入することにより、FP−１挿入ベクターpCE11をpRW731.13から誘導した。この挿入ベクターにより、FP−１ゲノムが産生される。次いで組換え体FP−1/FeLV挿入プラスミドをpFeLVF1で切断した。この構成では、ATG置換のための正確なATGが提供されない。
正確なATG:ATG構成を達成するために、約1.4kbpのNru I/Sst II断片をワクシニアウイルス挿入ベクターpFeLV1C（上述）から誘導した。Nru I部位は、ATGから24bp下流の位置にあるH6プロモーター内に生じる。Sst II部位は、ATGから1.4kbp下流で、翻訳終止コドンから1kbp上流に位置する。pFeLVF1のSst IIによる切断とNru Iによる部分的な切断によって産生された9.9kbpの断片に、Nru I/Sst II断片を連結した。この9.9kbpの断片は、5.5kbp FP−１フランキングアーム、pUCベクター配列、env遺伝子の下流部分に対応する1.4kbpのFeLV配列、およびH6プロモーターの５′側部分（約100bp）を含有する。産生したプラスミドをpFeLVF2と称した。ヌクレオチド配列分析により、正確なATG:ATG構成が確認された。
推定免疫抑制領域（上述）に対応するFeLV env配列を序供することにより、FeLVF2からさらなるFP−１挿入ベクター、pFeLVF3を誘導した。これは、ワクシニアウイルス挿入ベクター、pFeLV1D（上述）から得た約1kbpのPst I/Sst II断片を単離し、この断片を、pFeLVF2のPst IとSst IIによる切断によって誘導された残りのH6/FeLV env遺伝子を含有する10.4kbp Pst I/Sst II断片に挿入することにより行なった。
挿入プラスミド、pFeLVF2およびpFeLVF3を、治療ウイルスとしてのFP−１とともに、生体外組換え試験に用いた。後代ウイルスを、生後10日の感染幼虫包蔵卵から得た初代ニワトリ胚繊維芽細胞（CEF）単層に塗布し、CEF単層のプラークハイブリダイゼーションにより組換えウイルスをスクリーニングした。ハイブリダイゼーションにより同定した組換え体後代を選択し、４回のプラーク精製を行なって均質な個体群を得た。全縁FeLV env遺伝子をハーバリング（harboring）するFP−１組換え体は、vFP25と称し、それを含有するFP−１組換え体は、vFP32と称した。
CP組換え体を構成するために、H6/FeLV env遺伝子配列を含有する2.2bp断片を、Kpn IとHpa Iでの切断によりpFeLVF2とpFeLVF3から切除した。Kpn I部位は、H6プロモーター配列の５′境界にある。Hpa I部位は、エンベロープ糖タンパク質読取り枠の翻訳終止信号から180bp下流にある。これらの単離した断片をブラントエンドした。これらの2.2kbp H6/FeLV env配列を挿入プラスミドpRW764.2の不可欠EcoR I部位に挿入し、次いでEcoR I部位でブラントエンドした。これらの挿入ベクターにより、CPゲノムのC3座において異種遺伝子をハーバリングするCP組換え体が産生できる。次いで組換え体CP挿入プラスミドをそれぞれpFeLVCP2とpFeLVCP3と称した。
挿入プラスミド、pFeLVCP2とpFeLVCP3を、治療ウイルスとしてのCPとともに生体外組換え試験に用いた。組換え体の後代を、生後10日の感染幼虫包蔵卵（CT、ストー、SPAFAS）から得た初代ニワトリ胚繊維芽細胞（CEF）単層に塗布し、プローブとしての放射線標識したFeLV DNAを用いてハイブリダイゼーションにより組換えウイルスを選択した。陽性雑種形成プラークを選択し、４回のプラーク精製を施し、均質な個体群を得た。全縁FeLV env遺伝子を発現する組換え体をvCP35と称し、免疫抑制領域を欠いて全縁env遺伝子を発現する組換え体をvCP37と称した。
実施例50−FeLV−Ｂ env遺伝子を含有するALVACベースの組換え体の産生
プラスミドpFeLV env24は、ローンメリクス（フランス、リヨン）から得て、これはFeLV−Ｂ env遺伝子を含有する。このプラスミドは、NCE161 FeLV菌株から誘導した4.2kbのcDNA誘導断片を含有する。プラスミドpFeLVenv34は、pBS−SK（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）のSma I部位に4.2kbのFeLV−Ｂ特異的挿入物を含有する。FeLV−Ｂ env遺伝子の配列を第26図に示す（配列認識番号310）。この配列において、開始コドン（ATG）と終止コドン（TGA）に下線が引いてある。
FeLV−Ｂ envの発現カセッテは、以下のようにして構成した。オリゴヌクレオチドH65PH（配列認識番号164）
Figure 0003602530
およびH63PFB（配列認識番号311）
Figure 0003602530
を用いたPCRによりプラスミドpI4LH6HIV3B（HIVに関して上述した）から、ワクシニアウイルスH6プロモーターを誘導した。これらのオリゴヌクレオチドによるこれらの配列の増幅は、最初の20bpのFeLV−Ｂ env暗号配列を含有する３′末端と５′Hind III部位を有するH6プロモーターを産生した。
オリゴヌクレオチドFB5P（配列認識番号312）
Figure 0003602530
およびFB5PA（配列認識番号313）
Figure 0003602530
を用いたPCRによりpFeLV−Ｂ env34からFeLV−Ｂ env遺伝子の５′部分を誘導した。このPCR誘導断片は、H6プロモーターの３′側23bpの相同性（５′末端）および位置546での特有のApa I部位を含有する。テンプレートとして上記のように定義した２つのPCR断片と、オリゴヌクレオチドFB5PA（配列認識番号313）およびH65PH（配列認識番号164）を用いたPCRにより、H6プロモーターをFeLV−Ｂ env遺伝子に融合した。PCR融合断片をHind IIIとApa Iで切断し、680bp断片を産生した。
プラスミドpFeLV−Ｂ env34をApa IとNco Iで切断し、env遺伝子の中間部分を含有する740bpの断片を離生した。テンプレートとしてpFeLV−ｂ env34およびオリゴヌクレオチド（配列認識番号314）
Figure 0003602530
とFB3PX（配列認識番号315）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより、遺伝子の３′末端を誘導した。これらのオリゴヌクレオチドによるenv遺伝子の３′末端のPCR増幅により、位置1326−1332でのT5NT要素を除去した。位置1329でのＴからＣの置換を行なうことにより、この配列を変更した（第26図）。このPCR誘導断片の５′末端はまた、特有のNco I部位を含有する（位置1298での部位に一致する；第26図）。この断片をNco IとXba Iで切断し、707bpの断片を産生した。
740bpのNco I/Apa I断片と707bpのNco I/Xba I断片をもとに、Apa IとXba Iで切断したpBS−SKに挿入した。産生したプラスミドをpBSFB3Pと称した。次いでpBSFB3Pからの1.5kbのApa I/Xba I断片を、FeLV−Ｂ env遺伝子（上述）のH6プロモートした５′末端を含有する680bpのPCR断片とともに、Hind IIIとXba Iで切断したpBS−SKに挿入した。産生したプラスミドをpB5FEBと称した。
H6プロモートしたFeLV−Ｂ env遺伝子を含有する、pB5FEBからの2.2kb Hind III/Xba I断片を単離し、クレノウ断片でブラントエンドした。このブラントエンドした断片を、SmaIで切断したpC5L（このHIVに関する議論を参照）に挿入し、pC5LFEBを産生した。
プラスミドpC5LFEBを、治療ウイルスとしてのALVAC（CPpp）とともに、標準生体外組換えアッセイに用いた。FeLV−Ｂ env特異的DNAプローブを用いて、組換え体プラークを同定した。３回のプラーク精製後、ウイルスを繁殖せしめ、vCP177と称した。
実施例51−ALVAC−FeLV−Ａ ENV組換えウイルスの産生
FeLV−Ａ env配列を誘導したプラスミドpFGA−５はDr.J.ネイル（グラスゴー大学）から得て、以前に記載したものである（スチュワートら、1986）。最初に、ヌクレオチド１から531bpに対応する531bp Pst I/Hind III断片（スチュワートら、1986）を切除して、Pst IとHind IIIで切断したpCPCV1に連結し、pC3FA−１と称した。このプラスミドpCPCV1は以下のように誘導した。プラスミドpFeLV1AをPst Iで切断し、FeLV配列を切除して再度連結し、プラスミドpFeLVF4を産生した。ワクシニアウイルスH6プロモーター要素（テイラーら、1988）と続くポリリンカー領域を、Kpn IとHpa Iでの切断により、pFeLVF4から離生した。T4 DNAポリメラーゼを用いて150bpの断片をブラントエンドし、カナリヤポックスDNAの3.3kb Pvu IIゲノム断片を含有するプラスミド、pRW764.2に挿入した。カナリヤポックス配列内で特有のEcoR I部位を認識するEcoR IでpRW764.2を線状化し、E.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。産生したプラスミドは、pCPCV1と称した。このプラスミドは、ポリリンカー領域が続き、側腹にカナリヤポックスウイルス相同配列を有する、ワクシニアウイルスH6プロモーターを含有する。
プラスミドpC3FA−１を、Pst Iで線状化し、オリゴヌクレオチドFENVAH6−１（配列認識番号316）
Figure 0003602530
を用いたマンデッキ法（1986）により生体外組換えにおいて突然変異誘発を行なった。生体外突然変異誘発により、ワクシニアH6プロモーター要素の正確なATG:ATG配列となる異種５′非暗号配列およびFeLV−Ａ env配列を除去した。産生したプラスミドをpH6FA−１と称した。
注文合成したオリゴヌクレオチド（CA、サンラファエル、アプライドバイオシステムス）を用いた標準PCRによりFeLV−Ａ env遺伝子の残りをpFGA−５から誘導した。テンプレートとしてのpFGA−５およびオリゴヌクレオチドFENVA−２（配列認識番号317）
Figure 0003602530
とFENVAH（配列認識番号231）
Figure 0003602530
を用いて、836bp PCR断片を誘導した。この断片は、FeLV−Ａ env遺伝子のヌクレオチド488から1327と一致する（スチュワートら、1986）。オリゴヌクレオチドFENVA−２（配列認識番号317）の使用により、位置1301から1309でのヌクレオチド配列をGAT5GTをGAATTCTGTに変更する。この変更により、ポックスウイルス初期転写終止信号（ユエンとモス、1987）として認識されるT5NT配列モチーフを除去し、この位置でのEcoR I制限部位を導入する。これらのヌクレオチド操作は、グルタミン酸からアミノ酸414を保存アミノ酸アスパラギン酸に変化せしめる（スチュワートら、1986）。これらのヌクレオチド変化によりアミノ酸415は変更されない。この836bpの断片をHind IIIとEcoR Iで切断し、FeLV−Ａ env遺伝子のヌクレオチド532から1302に対応する770bpの断片を産生した。テンプレートとしてのpFGA−５およびオリゴヌクレオチドFENVA−３（配列認識番号319）
Figure 0003602530
とFENVA−４（配列認識番号320）
Figure 0003602530
を用いて、709bpのPCR断片を誘導した。この断片は、FeLV−Ａ env遺伝子のヌクレオチド1281から1990と一致する（スチュワートら、1986）。この断片を増幅するためにオリゴヌクレオチドFENVA−３（配列認識番号319）を用いて、T5NT要素を変更し、上述したように、836bp PCR誘導断片のためにEcoR I部位を導入する。709bpの断片をEcoR I/Hind IIIで切断し、産生したプラスミドを、836bp断片（上記）から誘導した770bp Hind III/EcoR I断片とともに、Hind IIIで切断したpBS−SK（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入した。産生したプラスミドをpF3BS1−Ｂと称し、FeLV env配列をヌクレオチド配列分析により確認した。
ワクシニアウイルスH6プロモーターに正確に連結した全縁FeLV−Ａ env遺伝子を再構成するために、1.5kb Hind III断片をpF3BA1−Ｂから単離した。この断片は、FeLV−Ａ envのヌクレオチド532から1990と一致する（スチュワートら、1986）。1.5kb Hind III断片をHind IIIで切断したpH6FA−１に連結した。1.5kb Hind III断片を含有するプラスミド構成物を、制限分析により適切な配位でスクリーニングし、H6プロモーターに連結した全縁無傷FeLV−Ａ env遺伝子を含有するプラスミドクローンをpH6HA−３と称した。
2.2kb H6/FeLV−Ａ env発現カセッテを、EcoR Iでの部分的な切断と、Hind IIIでの部分的な切断によりpH6FA−３から切除した。この断片を、Hind IIIとEcoR Iで切断したpRW831に挿入した。産生したプラスミドをpC5FAと称した。
pRW831は、異種遺伝子をC5読取り枠に挿入させるALVAC（CPpp）挿入プラスミドを指す。この領域への挿入工程において、pRW831の使用により、C5読取り枠のほとんどが欠損せしめられる。pRW831を産生するために、以下の操作を行なった。カナリヤポックスウイルスゲノムからの880bp Pvu IIゲノム断片をpUC9のPvu II部位の間に挿入した。産生したプラスミド、pRW764.5内に含有されたカナリヤポックスウイルス配列をヌクレオチド配列分析により分析し、C5読取り枠を定義した。この座で組換え体を操作するために、事前に、C5 ORF内に位置する１対のBgl II部位の間の挿入を用いた（テイラーら、1992）。全縁領域の配列を第16図に示す（配列認識番号220）。ヌクレオチド配列（配列認識番号220）はPvu II部位で開始する。C5 ORFは位置166で開始し、ヌクレオチド487で終止する。これらの配列の正確な操作により、ヌクレオチド167から455の欠損をすることができる。そのような欠損は、他のウイルス遺伝子の発現を妨害しないように行なった。
pRW831を誘導する方法を以下のように行なう。pRW764.5をRsa Iで部分的に切断し、線状化された断片を単離する。Rsa I線状断片をBgl IIIで再切断した。産生した2.9kb Rsa I/Bgl II断片（ヌクレオチド156から462が欠損した）を単離し、アニールしたオリゴヌクレオチドRW145（配列認識番号107）およびRW146（配列認識番号108）に連結した。産生したプラスミドはpRW831と称し、C5配列の場所に、特有のHind III、Sma I、およびEcoR I部位を有する配列を含有する。
プラスミドpC5FAを、治療ウイルスとしてのALVAC（CPpp）とともに生体外組換え実験に用いた。放射線標識したFeLV−Ａ env特異的プローブを用いた現場でのプラークハイブリダイゼーションにより組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製と続いてのハイブリダイゼーション確認後、組換え体をvCP83と称した。
実施例52−p15Eの推定免疫抑制領域が欠如したALVAC−FeLV−Ａ ENV組換えウイルスの産生
推定免疫抑制領域は、FeLVエンベロープ糖タンパク質のp15E膜内外領域内に位置する（シアンシオロら、1986;マセスら、1978）。この領域は以下の方法により欠損せしめた。ヌクレオチド1282から1602のFeLV−Ａ env配列（スチュワートら、1986）は，オリゴヌクレオチドFENVA−３（配列認識番号320）およびIS−Ａ（配列認識番号468）
Figure 0003602530
を用いたPCRによりpFGA−５から増幅した。ヌクレオチド1684から1990のenv配列（スチュワートら、1986）は、オリゴヌクレオチドFENVA−４（配列認識番号320）およびIS−Ｂ（配列認識番号323）
Figure 0003602530
を用いたPCRによりpFGA−５から増幅した。前者のPCR誘導断片は、EcoR Iで切断し、後者はHind IIIで切断し、続いてATPとT4キナーゼでキナーゼした。これらの断片を、Hind IIIとEcoR Iで切断したpBS−SKにともに連結した。産生したプラスミドは、ヌクレオチド配列分析により確認し、pBSFAIS-と称した。上述した断片の連結は、配列５′および３′を、推定免疫抑制領域をコードする81bpのDNA断片に結合させ、それゆえ、免疫抑制ペプチドをコードする配列を欠損せしめる。
免疫抑制領域をコードする領域が欠如したFeLV−Ａ配列をSst II/Apa Iでの切断によりpC5FAから切除した。この381bpの断片をpBSFAIS-からの300bp Sst II/Apa I断片により置換した。行なった連結は、pC5FAからの4.8kb Sst II/Apa I断片と上述した300bp断片によるものであった。産生したプラスミドをpC5FAISDと称した。
プラスミドpC5FAISDは、治療ウイルスとしてのALVAC（CPpp）とともに組換え実験に用いた。放射線標識したFeLV−Ａ env特異的プローブを用いた現場でのハイブリダイゼーションにより組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製後、組換え体をvCP87と称した。この組換え体は、推定27アミノ酸免疫抑制領域をコードする領域が欠如したFeLV−Ａ env遺伝子を含有する。この遺伝子をC5座に挿入した。
実施例53−ALVAC−FeLV−Ａ gag組換えウイルスの産生
FeLV−Ａ gag/pol配列をプラスミドpFGA−２ gagから誘導した。このプラスミドは、LTR（651bp）配列の部分、全縁gag遺伝子、およびpol遺伝子の1272bpを含有する3.5kb Pst Iサブ断片をサブクローニングすることによりFeLV−Ａ感染クローンpFGA−２（スチュワートら、1986）から誘導した。3.5kb断片をPst Iで切断したpUC8（MD、ゲイサースブルグ、ベセスダリサーチラボラトリーズ）に挿入した。最初にこの3.5kb Pst I FeLV−Ａ DNA断片を単離し、pBS−SK（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入した。産生したプラスミドをpBSGAGと称した。ヌクレオチド配列（配列認識番号324）（第27図）分析により全縁3.5kb挿入物を分析し、開始コドン（第27図に下線を引いたヌクレオチド652から654）およびFeLV−Ｂ（レプロベッテら、1984）に関して以前に記載したgag領域のヌクレオチド配列内に定義された関連制限部位の位置を確認した。
プラスミドpFGA−２ gagをBal IIとPst Iで切断し、2.5kb断片を離生した。Bal IIは、ヌクレオチド位置1076（配列認識番号324）での部位を認識し、一方Pst Iは、FeLV−Ａ挿入物の末端での部位を認識する。2.5kb団便を単離し、共移動プラスミド配列内の部位を認識するPst IとHind IIIで再切断した。これにより、プラスミド配列の続いての連結反応を競合する能力が除去された。
PCRを用いてFeLV−Ａ gag暗号配列の５′末端を誘導した。プラスミドpFGA2 gagは、オリゴヌクレオチドFGAGBGL（配列認識番号325）
Figure 0003602530
およびFGAGATG（配列認識番号326）
Figure 0003602530
とともにテンプレートとして用いた。オリゴヌクレオチドFGAGATG（配列認識番号326）は、ワクシニアウイルスH6プロモーターの３′側の25ヌクレオチドを含有し、その５′末端でのNru I部位の３′側3bpを含有する。これらのH6配列は、ATG（開始コドン）で正確に結合し、ヌクレオチドはgag暗号配列の最初の16ヌクレオチドに一致する。オリゴヌクレオチドFGAGBGL（配列認識番号325）は、gag配列中の特有のBgl II部位から59bp下流の配列の逆補体と一致する（レプレボッテら、1984）。これらの試薬を用いたPCRにより、続いてBgl IIで切断されて450bp断片を産生する500bp断片を産生した。
450bp Bgl II切断PCR誘導断片を、gag遺伝子の残りとpol遺伝子の部分を含有する2.5kb Bgl II/Pst I断片、およびNru IとPst Iで切断したpCPCV1（上記env構造）と共連結した。pCPCV1（Nru I/Pst I）は、Nru I認識信号の５′側の3bpを含有するワクシニアウイルスH6プロモーターの５′部分を含有する。産生したプラスミドをpC3FGAGと称した。
プラスミドpC3FGAGを、Pst Iで線状化し、T4 DNAポリメラーゼでブラントエンドし、pSD513（実施例７に定義した）から切除した100bp Ssp I/Sma I断片に連結した。100bpのSsp I/Sma I断片により、FeLV−Ａ gag/pol配列の３′末端で終止コドンが提供される。産生したプラスミドをpC3FGAGVQと称した。
FeLV−Ａ gag/pol発現カセッテを、EcoR IとHind IIIでの切断によりpC3FGAGVQから切除した。産生した3.4kb断片を単離し、EcoR IとHind IIIで切断したpC3I（実施例32に定義した）に連結し、pC3D0FGAFVQを産生した。
プラスミドpC3D0FGAGVQを、治療ウイルスとしてのvCP83とvCP87とともに生体外組換え実験に用いた。FeLV−Ａ gag/pol配列および全縁FeLV−Ａ env遺伝子を含有する組換え体はvCP97と称し、一方同一のgag/pol配列および免疫抑制領域が欠如した全縁FeLV−Ａ envを含有する組換え体をvCP93と称した。
実施例54−FeLV−Ａ gagのワクシニアウイルスバックグラウンドへの挿入
pC3FGAG（上記）からの3.3kb EcoR I/Hind III断片をpSD553のSma I部位にクローニングすることにより、挿入プラスミドpCEN151を産生した。2mMのdNTPの存在下でのE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片によりその断片をブラントエンドした後に、この挿入を行なった。
プラスミドpSD553は、COPAKシリーズのワクシニア欠損／挿入プラスミドである。このプラスミドは、フランキングコペンハーゲンワクシニアアーム内のワクシニアK1L宿主域遺伝子（ギラードら、1986;パーカスら、1990）を含有し、ATI領域（ORF A25L、A26L;ゲーベルら、1990a、ｂ）を置換する。pSD553は以下のようにして構成した。プラスミドpSD541のワクシニアATI欠損座に位置するポリリンカー領域（実施例10に定義した）を以下のように拡張した。pSD541をBgl II/Xho Iで切断し、アニールした相補合成デオキシオリゴヌクレオチドMPSYN333（配列認識番号329）
Figure 0003602530
およびMPSYN334（配列認識番号330）
Figure 0003602530
に連結し、プラスミドpSD552を産生した。K1L宿主域遺伝子を、プラスミドpSD452からの1kb Bgl II（部分的）/Hpa I断片として単離した（パーカスら、1990）。pSD552を、Bgl II/Hpa Iで切断し、断片を含有するK1Lに連結し、pSD553を産生した。
プラスミドpCEN151を、治療ウイルスとしてのvP866とともに生体外組換え実験に用いてvP1011を産生した。
実施例55−ALVAC組換えウイルスにおけるFeLV ENVおよびgag遺伝子の蛍光抗体法およびイムノプレシピテーション分析
イムノプレシピテーション
ベロ細胞単層を、10pfu/細胞に等しいm.o.i.で親または組換えウイルスに感染せしめた。感染から１時間後、接種物を吸引し、（35S）−メチオニン（MA、ボストン、デュポン;1000Ci/mモル）、20μCi/mlを補給したメチオニン不含有培地を加え、さらに感染から18時間後までインキュベーションした。ウシ抗FeLV血清（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）またはp27コアタンパク質に特異的な単クローン性抗体（GA、アテネ、ローンメリクスから得た）を用いて、イムノプレシピテーションおよび蛍光抗体法分析を前述したように行なった。
FeLVウイルスの単離
１日目に、３×104QN10細胞／ウェルを、HEFPES緩衝液（DFB）、10％のFBS、および４μg/mlのポリブレン（polybrene）を含有する1mlのダルベッコMEM中の12ウェル板に展開した。細胞を37℃で一晩インキュベーションした。培地を取り除くことなく、200μｌの試料（ネコ血漿）を各ウェルに加えた。37℃の２時間のインキュベーション後、培地を1.5ml新鮮なのDFBと置き換えて、さらに37℃でシンキュベーションした。５日目に、板を転換に関して検査した。陰性の場合には、培地を1.5mlの新鮮なDFBと置き換えて、さらに37℃でシンキュベーションした。８日目に、板を転換に関して再検査した。陰性の場合には、トリプシン−EDTAでの２回の洗浄により細胞を分散せしめ、5cmの板への接種のための4mlのDFB中に配することにより、細胞を5cmの板に継代培養せしめた。転換の検査の前に、細胞を37℃で４時間に亘りインキュベーションせしめた。
蛍光抗体法によるFeLV抗原の検出
血液スミアを−20℃で５分間MeOH中に固定し、dH2O中で洗浄し、次いで空気乾燥せしめた。24μｌのウサギ抗FeLV抗体を、ダイアモンドペンでスミア上に記した円内に血液スミアを施した。PBSで３回、dH2Oで１回の洗浄の前に、抗体の存在下で加湿器中、１時間、37℃でスミアをインキュベーションした。次いでスミアを空気感想せしめた。25μｌのヒツジ抗ネコIgG−FITCを円に施し、主要抗血清とともに上述したようにインキュベーションした。紫外線光源での顕微鏡による蛍光抗体法の検査の前に、試料を洗浄し、主要抗血清について上述したように乾燥せしめた。
FeLV抗体中和アッセイ
１日目に、５×104QN10細胞／ウェルを、1mlのDFBと４μg/mlのポリブレン中の12ウェル板に展開した。細胞を37℃でインキュベーションした。50μｌのレイボウィッツ培地を用いて、1:2から1:256までの血清希釈物を丸底96ウェル板中に調製した。1ml当たり４×105フォーカス形成単位（ffu）での50μｌのFeLV−Ａを加えた。２つのウェルをウイルス対照として血清のない培地とともにインキュベーションした。板を37℃で２時間インキュベーションした。２時間の吸着期間後、25μｌの各希釈物をQN10細胞のウェル中に配した。QN10細胞への25μｌの接種の前に、96ウェル板中のレイボウィッツ培地の50μｌ中で1:2、1:4、1:8および1:6で希釈することによりウイルス対照を滴定した。３日間、37℃で板をインキュベーションした。１日目に培地を1mlのDFB/ウェルと置き換えた。２日後に、フォーカスを顕微鏡で数えた。ウイルス対照と比較したフォーカスの数が75％減少した血清の希釈物として、中和抗体抗体滴定を評価した。
vCP83およびcCP87により発現されたenv遺伝子産生物が感染細胞の形質膜に運搬されたか否かを決定するために、前述したように蛍光抗体法実験を行なった（テイラーら、1990）。初代CEF単層を、親（ALVAC）または組換えウイルス、vCP83およびvCP87に感染せしめ、感染から24時間後に、ウシ抗FeLV血清を用いて蛍光抗体法を行なった。結果により、vCP83に感染した細胞は、強い表面螢光着色を示し、vCP87または親ALVACに感染した細胞は著しい表面着色は示さなかったことが分かった。
ウシ抗FeLV血清を用いて、イムノプレシピテーション分析により、FeLV env遺伝子産生物の発現もまた分析した。未感染CEFまたは親ALVACウイルスに感染したCEFから誘導した溶解産物からはFeLV特異的タンパク質種は沈殿しなかった。vCP83感染細胞からは、85kDa、70kDa、および15kDaの見かけの分子量を有する３つのFeLV特異的タンパク質が沈殿した。この結果は、前駆体env遺伝子産生物（85kDa）および熟成開裂産生物p70およびp15Eの発現と一致するものである。vCP88感染細胞から誘導した溶解産物からのイムノプレシピテーションにより、83kDaの見かけの分子量を有する１つのFeLV特異的タンパク質種が示された。これは、推定免疫抑制領域の欠損後に予期されたサイズの非タンパク質分解加工env遺伝子産生物の発現に一致するものである。手短にいうと、免疫抑制領域の欠如したenvの発現は、感染細胞の表面には明らかに適切には運搬されず、または熟成env特異的タンパク質形状にはタンパク質分解的に開裂されない。
p27コアタンパク質（D5）内のエピトープに特異的な単クローン性抗体およびウシ抗FeLV血清を用いたイムノプレシピテーションにより、FeLV gag特異的遺伝子産生物の発現を分析した。未感染細胞または親ウイルスに感染した細胞から誘導した溶解散物からは、FeLV特異的タンパク質は沈殿しなかった。D5およびウシ抗FeLV血清により、vP1011、cCP93、およびvCP97に感染した細胞からは、55kDaのFeLV特異的タンパク質種が沈殿した。これらの見かけの分子量のタンパク質種は、gag特異的前駆体形状と一致する。熟成p27コアタンパク質のサイズに一致する低水準の27kDaタンパク質種もまた明確であった。
実施例56−vCP93およびvCP97の体内評価
組換えウイルスの２回の接種後のネコの生FeLV抗原投与によりvCP93およびvCP97の防御効果を評価した。０日と28日の皮下経路の108PFUにより、ALVACベースのFeLV組換え体を投与した。追加抗原投与接種後から７日目に、相同FeLV−Ａ菌株（グラスゴー１）を口鼻投与によりネコに抗原投与した。FeLV抗原血症（p27検出）、FeLV単離、蛍光抗体法による白血球（WBC）スミア中のFeLV抗原の存在、およびFeLV中和活性の誘発の評価のために、抗原投与の前と後に、血液試料を得た。
ALVAC（カナリヤポックスウイルス）ベースの組換えウイルス、vCP93およびvCP97によるワクチン接種後には、副作用は観察されなかった。６つの非ワクチン接種対照の全ては、FeLV抗原投与のために死亡し、抗原投与の露出後３週間で持続性のウイルス血症を発達せしめた。これは、血液中のp27抗原の検出、FeLVの単離およびWBCスミアの蛍光抗体法によるFeLV抗原の検出により証拠付けられた（表32）。非ワクチン接種の対照は、研究の残りの期間に亘り感染し続けた（抗原投与後12週間まで）。
持続性のウイルス血症は、抗原投与から３週間後にvCP93をワクチン接種した６匹のネコのうち３匹に発達した。この時点で、これらの３匹のネコからの血液のサンプリングにより、p27抗原および／または生FeLVを含有することが示された（表32）。これらのネコのうち１匹（２番）は、感染から６週間後にこの感染から解放され、抗原投与から12週間後までウイルス血症のないままでいた。他の２匹のネコ（１番と５番）は、３つの分類基準、p27抗原血症、FeLVの単離、およびWBC中のFeLV抗原検出により持続的に感染したままであった。vCP93をワクチン接種した６匹のネコのうち３匹（３番、４番、および６番）は、抗原投与から９週間に亘り持続性ウイルス血症には感染しないままでいた（表32）。これらのネコのうち２匹（３番と６番）は、抗原投与後から12週間に亘り循環ウイルスのないままであったが、一方で１匹のネコ（４番）は、12週間目に突然感染した。vCP93でのワクチン接種により、持続性ウイルス血症に対して部分的な防御（６匹のネコのうち３匹）が与えられた。
最も印象的なことには、vCP97をワクチン接種した６匹のネコ全てが、FeLV−Ａ（グラスゴー１）による相同抗原投与に対して完全に防御された。これらのネコのうち１匹のみ（12番）が、持続性ウイルス血症の様子を示した。p27抗原が血液試料中に検出された（表32）抗原投与から３週間後に生じた。抗原投与後に、このネコの血液からは生FeLVは決して単離されなかった。他のネコは、抗原投与露出から12週間に亘り、p27抗原血症がなく、生FeLVがなく、WBCスミア中にFeLV抗原を決して示さなかった（表32）。
FeLV中和抗体の進化
FeLV感染に対する防御における中和抗体の潜在的な役割のために（ラッセルおよびジャレット、1978;ラッツら、1980）、そのような応答の発生は抗原投与の前後に監視された。vCP93またはvCP97のいずれかでワクチン接種された研究におけるネコは、FeLV抗原投与前には、中和抗体力価を示さなかった（表33）。抗原投与後に、持続性ウイルス血症を発達せしめたどのネコも、検出可能な中和抗体力価を示したものはいなかった。驚くべきことに、持続性感染に対して防御されたネコは、FeLV特異的血清中和力価を発達せしめた（表33）。これらの力価は、抗原投与後に防御された全てのネコにおいて著しく増大し、研究の終止時点である抗原投与から12週間後に、高水準であることが観察された（表33）。
Figure 0003602530
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実施例57−FHV−１ gD糖タンパク質を発現するALVACベースの組換え体の産生
ワクシニアウイルスI3Lプロモーターの制御下で、FHV−１ gD相同遺伝子のALVACベクターへの挿入により、１型ネコヘルペスウイルス（FHV−１）gD糖タンパク質の発現を行なった。カセッテI3L−FHV−１ gDをALVACに挿入するのに必要とされる供与体プラスミドを以下のように産生した。
FHV−１ C0菌株ゲノムDNAをEcoR Iで完全に切断し、断片Ｍ（4480bp）をアガロースゲルから切除し（遺伝子洗浄方法）、EcoR Iで切断してホスファターゼしたベクターpBS−SK+にクローニングした。FHV−１ EcoR I Ｍ断片を含有する、産生したプラスミドをpHFeM2と称した。修飾T7酵素シーケナーゼ（米国バイオケミカル社）を用いて、両鎖のFHV−１ EcoR I Ｍ断片完全ヌクレオチド配列を、ベクターpBS−SK+に挿入されたFHV−１ EcoR I Ｍ断片のいくつかのサブクローンから得た（テイバーおよびリチャードソン、1987）。0.4M−NaOH中で変性せしめられた二本鎖テンプレートを用いて、標準ジデオキシヌクレオチド鎖終止反応（サンガーら、1977）を行なった（ハットリおよびササキ、1986）。M13順および逆プライマーを用いて、各クローンの最初の配列を得た。標準化学種（バイオリサーチ8700およびアプライドバイオシステム380B）を用いて合成した、注文プライマー（18mer）を続いての配列反応に用いた。続発性断片間の接合の配列を、最初のクローン、pHFeM2で確認した。全ての配列データ分析に、PC＼GENE（インテリジェネティックス）およびIBIパステルソフトウェアーパッケージを用いた。スイスプロトリリース18.0（インテリジェネティックス）に対するPASTPプログラム（リップマンおよびペアーソン、1985）に関して、相同探求を行なった。FHV−１ C0菌株gD相同遺伝子の全配列を第28図に示す（配列認識番号290）。
テンプレートとしてのプラスミドpHFeM2およびオリゴヌクレオチドJCA234（配列認識番号331）
Figure 0003602530
とJCA235（配列認識番号332）
Figure 0003602530
を用いて、FHV−１ gD暗号配列の185bp ５′側領域を誘導し、BamH Iで切断した。この185bp断片を、プラスミドpMP691（I3L101RAB）およびオリゴヌクレオチドMP287（配列認識番号226）
Figure 0003602530
とJCA158（配列認識番号225）
Figure 0003602530
を用いて得たI3Lプロモーター要素を含有する120bpのPCR誘導断片に融合し、Xba Iで切断した。185bpおよび120bp断片を、Xba IとBamH Iで切断したベクターpBS−SK+中にともに連結し、プラスミドpJCA071を産生した。接合部I3L−ATGおよびFHV−１ gD ５′側領域のI3Lプロモーターの配列を、pJCA071の直接塩基配列決定法により確認した。プラスミドpJCA067は、FHV−１ EcoR I Ｍ断片のサブクローンである。以下のようにしてそのプラスミドは産生された。プラスミドpHFeM2をBamH Iで切断し、1850bp BamH I−BamH I断片をアガロースゲルから切除し、BamH Iで切断したpBS−SK+に連結した。このクローンは、FHV−１ gDの３′領域およびさらなる下流の配列を含有する。プラスミドpJCA067をBamH IとXho Iで切断し、1270bpのBamH I−FHV−１ gD ３′−領域−g I ５′領域−Xho I断片を切除した。この断片をBamH IとXho Iで切断したベクターpBS−SK+に連結し、pJCA072を産生した。テンプレートとしてのプラスミドpHFeM2およびオリゴヌクレオチドJCA237（配列認識番号333）
Figure 0003602530
とJCA242（配列認識番号334）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより３′側290bpのFHV−01 gD暗号配列を誘導した。これら注文合成したオリゴヌクレオチドによるこの断片の合成は、１）FHV−１ gDの３′側の配列および５′末端でのXba I部位を含有し、２）FHV−１ gD暗号配列の３′末端に、T5NT要素および特有のHpa I、Hind III並びにXho I部位を加える。この断片をXba IとXho Iで切断し、Xba IとXho Iで切断したプラスミドpJCA072から得た3575bp Xba I−Xho I断片により連結した。産生したプラスミドをpJCA073と称した。
FHV−１ gDの290bp Xba I−−＞Xho I部分の配列を、pJCA073の直接塩基配列決定法により確認した。プラスミドpJCA071をSma IとBamH Iで切断し、305bp Sma I−I3L−FHV−１ gD ５′側領域−BamH I断片を切除した。プラスミドpJCA073をBamH IとXho Iで切断し、97bpのBamH I−FHV−１ gD ３′領域−Xho I断片を切除した。Sma I−BamH I 305bp断片とBamH I−Xho I 970bp断片を最終的にベクターpCPC6L（C6 deorfed座;pCPC6Lの産生の他のALVAC C6供与体プラスミドを参照）中にともに連結し、Sam IとXho Iで切断した。この連結により産生したプラスミドをpJCA084と称した。
プラスミドpJCA084を、治療ウイルスとしてのCPppとともに初代ニワトリ胚繊維芽細胞における生体外組換え実験に用いてvCP162を産生した。放射線標識FHV−１ gD特異的プローブを用いた標準方法（ピッチーニら、1987）にしたがった現場でのハイブリダイゼーションにより組換えウイルスを同定した。組換え体プラークを３回のプラーク精製により精製し、さらなる分析のために増幅した。組換えウイルスvCP162は、カナリヤポックスウイルスのC6座にFHV−１ gD暗号配列を含有する。
実施例58−vCP162の発現分析
フランス、ローンメリクス、D.ファーギュードから得たヒツジ抗FHV−１ gD多クローン性血清を用いて前述したように（テイラーら、1990）、蛍光抗体法アッセイを行なった。組換え体vCP162は、強烈な内部並びに表面蛍光を示し、感染細胞の表面にFHV−１ gD糖タンパク質の発現を示した。
同一の抗血清を用いてイムノプレシピテーションを行ない、発現されたFHV−１ gD産生物の真正を決定した。この方法は、前述した方法にしたがって行なった（テイラーら、1990）。ヒツジ抗FHV−１ gD血清は、組換えウイルスvCP162に感染した細胞から誘導した溶解産物から、SDS−PAGEゲルシステム上で60kDaの見かけの分子質量を有する産生物を沈殿せしめた（ドリファスら、1984）。未感染細胞または親カナリヤポックスウイルス（CPpp）に感染した細胞からはタンパク質はまったく沈殿しなかった。
実施例59−HANTAANウイルスG1およびG2糖タンパク質を発現するNYVACおよびALVACベースの組換え体の産生
昆虫ポックスウイルス42kDaプロモーターの制御下で、Ｍ断片をNYVACとALVACベクターに挿入することにより、ハンターン（Hantaan）ウイルスG1およびG2糖タンパク質の発現を行なった。これらのウイルスベクターに挿入するポックスウイルス発現カセッテは以下のようにして産生した。
ハンターンウイルスＭ断片のcDNAクローンをシュマルジョンらにより記載されたように（1987）誘導し、Dr.J.ダルリンプル（MD、フレデリック、感染病の米国陸軍医療研究所、ウイルス学部門）から得て、プラスミドベクターpTZ19R（NJ、ピスキャタウェイ、ファーマシア）に挿入した。cDNAの全配列は、以前にシュマルジョンらにより示した（1987）。テンプレートとしてＭ断片cDNAを含有するプラスミドpTZ19RおよびオリゴヌクレオチドHM5P（配列認識番号335）
Figure 0003602530
とHM3P（配列認識番号336）
Figure 0003602530
を用いて、Ｍ断片暗号配列の326bp ５′側領域を誘導した。この326bp断片を、テンプレートとしてのpAM12およびオリゴヌクレオチドRG273（配列認識番号142）
Figure 0003602530
とRG274（配列認識番号143）
Figure 0003602530
を用いて得た42kDaプロモーター要素を含有する107bp PCR誘導断片に融合した。テンプレートとしての107bpと326bpの断片およびオリゴヌクレオチドRG273（配列認識番号142）とHM3P（配列認識番号336）の等モル混合物を用いて、PCR融合を行なった。融合断片をHind III（５′末端）とBcl I（３′末端）で切断し、343bp断片を産生した。
プラスミドpAM12を以下のように誘導した。Amsacta moorei昆虫ポックスウイルス（AmIPV）から単離したゲノムDNAをCla Iで切断し、アガロースゲル電気泳動により断片を分離した。高度に転写されたAmEPV遺伝子を含有することが以前に同定された2.6kb断片をゲルから精製し、pBS−SK+のCla I部位にクローニングし、pAM12を産生した。この断片のDNA配列分析により、42kDaの完全ORFが明らかになった。この遺伝子からの５′末翻訳配列（AmEPV 42kDaプロモーター）は、ワクシニアとアビポックスウイルスにおける強い、初期プロモーターとして機能することが続いて示された。
Ｍ断片暗号配列の３′側748bpを、テンプレートとしてpTZ19R中に得られたcDNAクローンおよびオリゴヌクレオチドHMTS−５（配列認識番号337）
Figure 0003602530
とHMTS−３（配列認識番号338）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより誘導した。これらの注文合成オリゴヌクレオチドによるこの断片の合成は、１）５′末端でのEcoR V部位と３′側配列を含有し、２）ヌクレオチド位置2678−2693でT5NT配列モチーフを分断し（ユエンおよびモス、1987）、３）暗号配列の３′末端部位でEoR I部位およびT5NT要素を加える。この断片をEcoR Iで切断し、741bp EcoR V/EcoR I断片を産生した。741bp EcoR V/EcoR I断片をpBS−SK（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）に挿入し、プラスミドpBSHVM3Pを産生した。
pTZ19R中にＭ特異的cDNAクローンを含有するプラスミドを用いて、GM48（Dam-）細菌細胞（MD、ゲイサースブルグ、BRL）を転換した。この細菌菌株から誘導したプラスミドDNAをBcl IとEcoR Vで切断し、2362bp断片を産生した。この2362bp断片を、暗号配列の５′側領域に融合された42kDaプロモーターを含有する343bp Hind III/Bcl I断片とともに、Hind IIIとEcoR Vで切断したpBSHVM3Pに挿入した。全縁Ｍ断片発現カセッテを含有する産生したプラスミドをpBSHVMと称した。制限エンドヌクレアーゼHind IIIおよびEcoR Iを用いて、pBSHVMから全縁Ｍ断片カセッテを切除した。3508bp誘導断片を、2mMのdNTPの存在下でE.coliのクレノウ断片でブランドエンドした。ブラントエンドした断片をpSD550に挿入して、pHVMVCを産生した。
プラスミドpSD550を以下のように誘導した。プラスミドpSD548（タータグリアら、1992）は、I4L ORF（ゲーベルら、1990a、ｂ）がBgl IIとSma I部位からなるクローニング領域により置換されたワクシニアベクタープラスミドである。多重クローニング領域を延長するために、pSD548をBgl IIとSma Iで切断し、アニールした補体合成オリゴヌクレオチド539A（配列認識番号339）
Figure 0003602530
および539B（配列認識番号340）
Figure 0003602530
に連結した。産生したプラスミド、pSD550において、多重クローニング領域は、Bgl II、Sma I、Xho I、Kpn IおよびBamH I制限部位を含有する。
プラスミドpHVMVCを治療ウイルスとしてのvP804（タータグリアら、1992）とともにベロ細胞において生体外組換え実験に用いて、vP882を産生した。放射線標識したＭ特異的DNAプローブを用いた標準方法（ピッチーニら、1987）にしたがって、現場でのハイブリダイゼーションにより、組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製により、組換えプラークを精製し、さらなる分析のために増幅した。組換えウイルス、vP882は、ワクシニアウイルスのI4L座にハンターンＭ断片を含有する。I4L読取り枠とvP804バックグラウンド中のＭ断片カセッテとの置換により、NYVAC−等量ウイルスバックグラウンドが作られる（タータグリアら、1992）。
Ｍ断片カセッテ（上述）を含有する、pBSHVMから誘導した3508bp Hind III/EcoR I断片を、Hind IIIとEcoR Iで切断したpC4Iに挿入した。プラスミドpC4Iを以下のように誘導した。CPppからの6.5kb Nsi I断片をpBS−SK+のBamH I部位にクローニングし、pXX−４を産生した。DNA配列分析により、座中のC4挿入物を含有した完全読取り枠ORFを同定した。C4 ORFが欠損した供与体プラスミドを構成するために、オリゴヌクレオチドRG287（配列認識番号341）
Figure 0003602530
RG293（配列認識番号342）
Figure 0003602530
RG289（配列認識番号343）
Figure 0003602530
およびRG290（配列認識番号344）
Figure 0003602530
をプライマーとして用い、pXX4からのC4 ORFの５′および３′未翻訳領域を増幅した。精製したPCR断片をKpn I−Sac I部位でのpBS−SK+に挿入した。産生したプラスミド、pC4Iは、完全ORFが翻訳およびワクシニア初期転写終止信号を側腹に有する多重クローニング部位と置換されたC4の５′および３′未翻訳領域（各201bp）を含有する（ユエンおよびモス、1987）。
Ｍ断片カセッテのpC4Iへの挿入により、プラスミドpC4HVMが産生した。pSD513から誘導した100bpのSsp I/Sma I断片の挿入のために、プラスミドpC4HVMをSma Iで線状化した（実施例７に定義した）。産生したプラスミドをpC4HVMVQと称した。プラスミドpC4HVMVQをSma Iで切断し、続いて部分的なHind IIIでの切断により、Ｍ断片カセッテを含有する3.6kb断片を回収した。この断片を、2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。このブラントエンドした断片を、Sma I切断したpSPCPC3Lに挿入し、pC3HVMVQ（実施例32に定義した）を産生した。
供与体プラスミドとしてpC3HVMVQおよび治療ウイルスとしてCPpp（ALVAC）を用いて、初代ニワトリ胚繊維芽細胞に、生体外組換え実験を行なった。標準プロトコルを用いて組換えウイルスを同定し、精製した（上述；ピッチーニら、1987）。ハンターンウイルスＭ断片を含有するALVACベースの組換え体をvCP114と称した。
実施例60−ハンターンウイルスＳ暗号配列を含有するNYVAC−およびALVAC−ベースの組換え体の産生
ワクシニアウイルスH6プロモーターの制御下で、Ｓ断片をNYVACおよびALVACベクターに挿入することにより、ハンターンウイルス核タンパク質の発現を行なった（ゲーベルら、1990a、ｂ）。これらのウイルスベクター中に挿入したポックスウイルス発現カセッテは以下のように構成した。
ハンターンウイルスＳ断片のcDNAクローンをシュマルジョンらにより記載されたように（1987）誘導し、Dr.ジョエル ダルリンプル（MD、フレデリック、Ft、デトリック、感染病の米国陸軍医療研究所、ウイルス学部門）から得て、プラスミドベクターpGEM−１（WI、マジソン、プロメガバイオテック）に挿入した。Ｓ断片の全縁配列は以前に記載している（シュマルジョンら、1986）。
テンプレートとしてプラスミドpI4LH6HIV3BおよびオリゴヌクレオチドH65PH（配列認識番号164）
Figure 0003602530
とHTH63P（配列認識番号346）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより、H6プロモーター要素を増幅した。この150bp PCR誘導断片は、５′末端にHind III部位を含有し、Ｓ断片暗号配列の５′側領域を含有する３′末端での28bpの延長部を有する。
オリゴヌクレオチドHTS5P（配列認識番号347）
Figure 0003602530
およびGPS5PNCI（配列認識番号348）
Figure 0003602530
並びにテンプレートとしてのＳ特異的cDNAクローンでのPCRにより、Ｓ断片暗号配列の５′末端を合成した。560bpのPCR誘導断片を、オリゴヌクレオチドH65PH（配列認識番号164）およびHTS5PNCI（配列認識番号348）を用いたPCRにより融合した。PCR誘導融合産生物をHind IIIとNci Iで切断した。
オリゴヌクレオチドT5HT3PPS（配列認識番号349）
Figure 0003602530
およびHPS55PN（配列認識番号350）
Figure 0003602530
並びにテンプレートとしてのＳ特異的cDNAクローンを用いたPCRにより、ハンターンウイルスＳ断片の中央領域を産生した。581bp断片は、その３′末端でPst I部位を含有し、５′末端はＳ断片の位置499のNci I部位を含有する（シュマルジョンら、1986）。さらに、オリゴヌクレオチドT5HT3PPS（配列認識番号349）を使用することにより、アミノ酸配列を変更することなく、位置1029から1035までのT5NT要素を除去する。次いでこの断片をNci IとPst Iで切断した。H6プロモーターに融合された暗号配列の５′末端を含有するPCR断片（上述のようにHind III/Nci I切断した）を、Ｓ断片の中央領域を含有する581bp Nci I/Pst I断片とともにHind IIIとPst Iで切断したpBS−SKに連結した。産生したプラスミドをpBSHTSH65Pと称した。
オリゴヌクレオチドHTS3PXBA（配列認識番号351）
Figure 0003602530
およびT5HT5PSP（配列認識番号352）
Figure 0003602530
並びにテンプレートとしてのＳ特異的cDNAクローンを用いたPCRによりＳ断片の３′側438bpを誘導した。この断片の５′末端は、Ｓ断片暗号配列の位置1039に位置するPst I部位を含有し（シュマルジョンら、1986）、３′末端は、T5NT配列モチーフおよび特有Xba I部位を含有する。Pst I/Xba Iで切断したpBS−SKへの挿入の前に、この断片をPst IとXba Iで切断し、pBSHTS3Pを産生した。
全縁Ｓ断片発現カセッテを産生するために、1122bp Pst I/部分的Hind III断片をpBSHTSH65Pから誘導した。この断片を、pBSHTS3Pからの290bp Pst I/Xba I断片とともにHind III/Xba I切断pBS−SKに挿入した。産生したプラスミドを、Xba Iで線状化し、続いて部分的なHind IIIでの切断し、pBSHVSと称した。この断片を、2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドし、次いでpSD541のSma I部位に挿入して、pATIHVSを産生した。
プラスミドpATIHVSを、治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とvP882とともにベロ細胞における生体外組換え実験に用いた。これは、標準プロトコルにより行なった（ピッチーニら、1987）。放射線標識したＳ断片特異的DNAプローブを用いた前述したプラークハイブリダイゼーション方法（ピッチーニら、1987）により組換えウイルスから誘導したプラークを同定した。それぞれ治療ウイルスvP866およびvP882を用いて回収したウイルスに関して、産生した組換え体をvP950およびvP951と称した。組換えウイルス、vP950は、ATI部位にＳ断片発現カセッテを含有し、vP951は、同一の座にこのカセッテを含有するが、vP882を含有するＭ断片による治療のために、I4L座にもＭ断片を含有する。
プラスミドpBSHVMをSal Iで線状化し、2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドした。このプラスミドを、ハンターンＳ断片発現カセッテを含有するpBSHVSから誘導した1.4kb Xba I/部分的Hind III（上述したようにクレノウでブラントエンドした）断片に連結した。誘導したプラスミドをpBSHVMSと称した。このプラスミドは、頭対頭（head to head）の配置でＭおよびＳカセッテを含有した。プラスミドpBSHVMSをXho Iで線状化し、クレノウでブラントし（上述したように）、pSD513（実施例７で定義した）からの100bp Ssp I/Sma I断片に連結し、pBSHVMSVQを産生した。
プラスミドpBSHVMSVQをSla I/Asp718で切断し、Ｓ断片発現カセッテを含有する1.5kbの断片を離生した。この断片を2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片を用いてブラントエンドし、pSPCP3L（実施例32に定義した）のSma I部位に挿入し、pC3HVSVQを産生した。
プラスミドpC3HVSVQを、治療ウイルスとしてのCPpp（ALVAC）とともに初代ニワトリ胚繊維芽細胞における生体外組換え実験に用いた。これは、プラーク同定、プラーク精製、およびウイルス増幅のような標準方法を用いて行なった（ピッチーニら、1987）。産生した組換え体をvCP119と称した。この組換え体は、ALVACのC3座にＳ断片を含有する。
実施例61−NYVAC−およびALVAC−ベースのハンターンウイルスＭおよびＳ断片組換え体の発現分析
G1、G2、またはウサギ抗ハンターン多クローン性血清に特異的な単クローン性抗体のプールのいずれかを用いて、前述したように蛍光抗体法アッセイを行なった（テイラーら、1990）。全ての血清は、Dr.C.シュマルジョン（MD、フレデリック、Ft.デトリック、感染病の米国陸軍医療研究所、ウイルス学部門）から得た。Ｍ断片のみ（vP882、およびvCP114）またはＳ断片との組合せ（vP951）を含有する組換えウイルスは、上述した抗血清のいずれを用いても強い表面蛍光を示し、感染細胞の表面にG1およびG2の糖タンパク質の両方の発現を示した。核タンパク質が感染細胞の表面には現れないので、Ｓ断片のみを含有する組換え体（vP950およびvCP119）を用いては、表面蛍光は観察されなかった。しかしながら、ウサギ抗ハンターン血清を用いての組換え体、vP950およびvCP119に関しては、内部蛍光が観察された。
同一の抗血清を用いてイムノプレシピテーションを行なって、発現したG1、G2、およびＳ遺伝子産生物の真正を測定した。この方法は、前述した方法にしたがって行なった（テイラーら、1990）。G1に特異的な単クローン性抗体プールは、SDS−PAGEゲルシステム上で、組換えウイルスvP882、vP951、およびvCP1154に感染した細胞から誘導した溶解産物から64kDaの見かけの分子質量を有するタンパク質を沈殿せしめた（ドリファスら、1984）。未感染細胞、または親（NYVACおよびALVAC）に感染した細胞もしくはＳ断片のみを含有する組換えウイルス（vP950およびvCP119）に感染した細胞から誘導した溶解産物からはタンパク質は沈殿しなかった。沈殿したポリペプチドが約50−55kDaの分子質量を有したことを除いては、G2に特異的な単クローン性抗体プールを用いては同様の結果が得られた。これらのサイズのタンパク質（64kDaおよび50−55kDa）は、それぞれG1およびG2タンパク質のサイズと一致する（シュマルジョンら、1990）。
ウサギ抗ハンターンは、vP951に感染した細胞から誘導した溶解産物から、G1、G2および核タンパク質の発現と一致する64kDa、50−55kDa、および48kDaの見かけの分子量を有する３つのタンパク質種を沈殿せしめた。同一の血清は特異的に、vP882およびvCP114感染細胞溶解産物からはG1およびG2（64kDa、50−55kDa）種を、vP950およびvCP119感染細胞溶解産物からは核タンパク質（48kDa）を沈殿せしめた。未感染細胞またはNYVACまたはALVAC親ウイルスに感染した細胞から誘導した溶解産物からはそのようなタンパク質は沈殿しなかった。
実施例62−Ｂ型肝炎ウイルス（HBV）遺伝子のALVAC挿入プラスミドへの挿入
ALVAC C5挿入プラスミドpNVQH6C5LSP18（実施例44に定義した）をBamH Iで切断し、キナーゼしてアニールした合成オリゴヌクレオチドMPSYN438/MPSYN439（配列認識番号353/354）に連結した。
Figure 0003602530
産生したプラスミド、pMPC5Smaは、リンカー領域のBamH I部位の隣にSma I部位を含有する。
pMP550E311ps（ここの他のHBVの実施例に定義した）をBal II/BamH I（部分的）で切断し、EPV42kDaプロモーターの制御下でHBV lpsAgを含有する1.2kbの断片を単離し、BamH Iで切断したpMPC5Smaに連結し、プラスミドpMPC5Lを産生した。pMPC5LをSma I（部分的）で切断し、単位長さ（4kb）断片を単離した。この断片をNru Iで切断し、最大の帯（4kb）を単離した。
pGJ15（実施例13で定義した）をSma I（部分的）とNru Iで切断し、HBV spsAgおよびH6プロモーターの24bpを含有する0.9kb断片を単離し、pMPC5Lからの4kb Sma I/Nru Iベクター断片に連結し、プラスミドpMPC5LSを産生した。
実施例63−SPSAGよびLPSAGをコードするHBV遺伝子のALVACへの挿入
C5挿入座にHBV lpsAgおよびspsAgの両方を含有するpMPC5LSを、ALVACに関する組換え体の供与体プラスミドとして用い、ALVAC組換え体vCP157を産生した。
vCP157のHBVタンパク質の発現
ALVAC−HBV二重組換え体vCP157に感染した細胞からの代謝的に標識した溶解産物に、ウサギ抗S2血清を用いてイムノプレシピテーションを行ない、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動と続いてのラジオオートグラフにより分析した。lpsAg（41kDa、38kDa）およびspsAg（36kDa、33kDa）の正確なサイズのタンパク質を観察した。これらのタンパク質は、対照として用いたspsAgまたはlpsAgを発現するNYVAC単体HBV組換え体により産生された同一のタンパク質とともに移動した。
実施例64−SPSAG、LPSAGおよびS12/コア融合をコードするHBV遺伝子のALVACへの挿入
C5挿入座にHBV lpsAgおよびspsAg遺伝子並びにS12/コア融合を特定する遺伝子の両方を含有するpMPC5LSCをALVACに関する組換えの供与体プラスミドとして用い、ALVAC組換え体vCP169を産生した。
実施例65−HBV遺伝子を発現するNYVACベースの組換え体：ウサギ、ネズミおよびモルモットからの免疫学的データ
ウサギ、ネズミおよびモルモットに、NYVACベースのＢ型肝炎ウイルス（HBV）組換え体vP856、vP930、vP932およびvP975を接種した（実施例13）。vP856は、表面抗原の中間（Ｍ）形状である。spsAgを発現する。vP930は、表面抗原の大型（Ｌ）形状である。lpsAgを発現る。vP932は、spsAgとlpsAgの両方を発現する。vP975は、spsAg、lpsAgおよびコア抗原に融合される表面抗原preS1＋preS2領域からなる融合タンパク質を発現する。AUSAB試験（アボット）を用いて、HBV表面抗原に対する抗体について、およびCORAB競合ラジオイムノアッセイキット（アボット）を用いて、HBVコア抗原に対する抗体について、血清を分析した。HBV preS1およびpreS2領域に対する抗体をELISAによりアッセイした。結果を表34から40に示す。
Figure 0003602530
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実施例66−ポックスウイルス中の細菌遺伝子の発現：ポックスウイルス中の破傷風毒素断片Ｃ（C.TETANI）
C.tetaniは、クロストリジウム属、胞子形成嫌気菌の細菌である;C.botulinumもまたその属に含まれる。C.Tetaniは、感染に観察される麻痺効果に主に原因となる毒素、テタノスパスミン（tetanospasmin）（TT）を産生する。TTは、１本の150kDaの軽鎖および細菌から放出された100kDaの重鎖である。重鎖は、穏やかなタンパク質分解処理により２つの断片、ＢおよびＣ（45kDaおよび55kDa）を産生する。この実施例は、本発明のウイルスが、C.tetaniの断片Ｃのような免疫原細菌遺伝子産生物を発現するのに用いられることを示す。
発現カセッテは、一連のポリメラーゼ鎖反応により産生される。この方法は、天然破傷風毒素配列に存在するTTTTTAT初期転写終止信号（ユエンおよびモス、1987）を除去するのに必要であった（イーゼルら、1986;フェアウェザーおよびリネス、1986）。
プライマーH6TETC（配列認識番号355）
Figure 0003602530
およびTETFIX2（配列認識番号356）
Figure 0003602530
を用いてプラスミドpSS1261（ハルパーンら、1990）からPCRによりH6プロモーター連結した断片Ｃを誘導した。構成の残りの暗号領域は、プライマーTETFIX1（配列認識番号357）
Figure 0003602530
およびTETEND（配列認識番号358）
Figure 0003602530
を用いて、プラスミドpSS1261のPCR増幅により、構成の暗号領域の残りを産生される。これらの暗号配列は、プライマーH6TETC（配列認識番号355）およびTETND（配列認識番号358）を用いた、これら553bpおよび881bp PCR誘導産生物のPCR増幅により行なわれた。産生した1.4kbのPCR誘導産生物をEcoR IとXho Iで切断した。1.4kbの断片をアガロースゲルから単離して、同様に単離したpBS−SK＋（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結した。ヌクレオチド配列分析を行なって、産生したプラスミドpBSTETC中に挿入物を確認した。ＴからＣのサイレント置換がこのプラスミド中に発見され、これはイーゼルら（1986）の配列における位置3535に対応する。
pC5L（実施例44に定義した）をポリリンカーないのAsp718とNru Iで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、キナーゼしてアニールしたオリゴヌクレオチドCP26（配列認識番号359）
Figure 0003602530
およびCP27（配列認識番号360）
Figure 0003602530
（不能Asp718部位、６つの読取り枠中の翻訳終止コドン、ワクシニア初期転写終止信号（ユエンおよびモス、1987）、BamH I、Kpn I、Xho I、Xba I、Cla I、およびSma I制限部位、ワクシニア初期転写終止信号、６つの読取り枠中の翻訳終止コドン、および不能Not I部位を含有する）に連結し、プラスミドpC5LSPを産生した。オリゴヌクレオチドCP30（配列認識番号361）
Figure 0003602530
およびCP31（配列認識番号362）
Figure 0003602530
を用いて、プロモーターを含有するプラスミドからPCRにより初期／晩期H6ワクシニアウイルスプロモーター（パーカスら、1989）を誘導した。このPCR産生物をBamH IとXho I（PCRにより５′および３′末端で産生した部位）で切断し、同様に切断したpC5LSPに連結し、pVQH6C5LSPを産生した。pVQH6C5LSPをEcoR Iで切断し、アルカリ性ホスファターゼで処理し、自己アニールしたオリゴヌクレオチドCP29（配列認識番号363）
Figure 0003602530
に連結し、Not Iで切断し、線状精製して自己連結した。この方法によりpVQH6C5LSPにNot I部位を導入し、pNVQH6C5LSP18を産生した。pBSTETCからの1.4kb EcoR V/Xho I断片を単離し、同様に切断したpNVQH6C5LSP18に連結し、pC5TETCを産生した。
PCRとプライマーH6PCR1（配列認識番号364）
Figure 0003602530
およびH6PCR2（配列認識番号365）
Figure 0003602530
を用いて、合成H6プロモーター（パーカスら、1989）を含有するプラスミドからEcoR VにつながったH6プロモーターを誘導し、５′Hind III部位を産生した。この122bp PCR誘導断片をHind IIIとEcoR Vで切断し、同様に切断したpBS−SK＋（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結し、プラスミドpBSH6をさんせいした。ヌクレオチド配列分析により挿入物を確認した。pC5TETCからの1.4kb EcoR V/Xba I断片を切除して、同様に切断したpBSH6に連結し、pH6TETCを産生した。
次いで全縁H6断片Ｃカセッテを含有するpH6TETCからの1.5kb Xho I断片をpSD542（実施例32に定義した）に連結し、pTKTETCを産生した。
イムノプレシピテーション分析を行なって、vCP161およびvP1075が真正断片Ｃを発現するか否かを測定した。ベロ細胞単層を、親ウイルス、CPpp（ALVAC）またはvP866（NYVAC）に感染せしめたか、または10pfu/細胞のm.o.i.でvCP1661またはvP1075に感染せしめた。細胞を、感染せしめ、［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）中でインキュベーションし、溶解せしめ、テイラーらにより記載された（1990）ように、ネズミ単クローン性抗体（IN、インディアナポリス、ベーリンガーマンハイム、クローン49.4）および第２の抗体としてのヤギ抗ネズミ抗血清を用いて沈殿せしめた。溶解産物を通常のネズミ血清およまびタンパク質Ａセファロースで前浄化した。
単クローン性抗体は特異的に、約47kDaに対応する種をvCP161およびvP1075感染細胞から沈殿せしめた。CPpp（ALVAC）またはvP866（NYVAC）感染細胞からは類似のタンパク質種は沈殿しなかった。47kDaサイズは、天然破傷風毒素のパパイン切断により産生された断片Ｃ並びにvCP161およびvP1075によりコードされたものと同一のE.coli産生組換え断片CI関してマコフら（1989）による観察と一致する。
実施例67−ブタ中のNYVACベースの仮性狂犬病ウイルス（PRV）組換え体の効果
４匹の子豚の６つの群に、NYVACベースのg II組換え体（vP881）、g III組換え体（vP883）、gp50組換え体（vP900）、NYVAC親ウイルス（vP866）、市販の不活性化仮性狂犬病ウイルスワクチン、または仮性ワクチンとして胎児ウシ血清を含有するイーグルMEMのいずれかに感染せしめた。全てのブタに、筋内経路により28日の間隔で２回投与した。親または組換えNYVACウイルスを投与されたブタに、接種当たり約106TCID50で接種した。感染から12日間に亘り、全てのブタを体温と臨床の徴候について監視した。組換え体または親NYVACウイルスでのワクチン接種に対しては部分的なまたは全身的な副作用は観察されなかった。
仮性狂犬病ウイルスに対する血清中和抗体を、接種から１、２、および４週間後に監視した。表41から明確なように、不活化ワクチン標品のみが１回の接種後に著しい仮性狂犬病ウイルス血清中和力価を誘発できた。しかしながら、２回の接種後では、全ての３つのNYVACベースの組換え体が識別できる仮性狂犬病ウイルス血清中和力価を誘発することができた（表42）。力価は、仮性狂犬病ウイルスgp50糖タンパク質を発現するNYVAC組換え体について最も著しかった。実際、NYVAC組換え体を発現するgp50により誘発された力価は、市販されている不活化ワクチンの２回の接種に得られた水準に相当した（表42）。
２回の免疫化から４週間後、鼻腔内点滴注入により、全てのブタに約105PFUの毒性仮性狂犬病ウイルス菌株を抗原投与した。予期したように、仮性および親NYVACワクチン接種対照は全て、最も厳しい臨床症候を示し、鼻と口咽頭スワブにより単離した仮性狂犬病ウイルスの最高水準は、抗原投与から14日後までであった。NYVACベースの仮性狂犬病ウイルス組換えウイルスは、対照と比較して、毒性仮性狂犬病ウイルス抗原投与の効果（すなわち、臨床症候およびウイルス単離）を減少し、組換えウイルスを発現するgp50が最も有効であった。実際、この組換え体は、市販の不活化仮性狂犬病ウイルスワクチンと同程度に効果的である。
他のヘルペスウイルスのようにPRVは、ストレスまたはコルチコステロイドの投与により再活性化される潜伏性感染を発達せしめる可能性を有するので（ホイットマンおよびジハ、1989）、そのような感染に対するNYVAC組換え体の防御効果を評価するために、２匹のブタの群に関して実験を行なった。プロトコルには、以下のスケジュールにおいてブタにデキサメタゾンを投与することが必要であった:1日目に静脈経路により1.25mg/ポンドおよび静脈経路により0.25mg/ポンド。以後、４日間に亘り約12時間ごとにデキサメタゾンの投与（0.5mg/ポンド）を行なった。鼻（Ｎ）と喉（Ｔ）のスワブを用いてデキサメタゾン処理後０日から10日まで、ウイルスの放出（shedding）を評価した。結果を表43に示す。これらの結果は明らかに、潜伏性PRV感染の成立に対する防御におけるNYVACベースのPRV組換えウイルスの効果を示した。この基準により、NYAVC−g II（vP881）は十分に最も有効である。
Figure 0003602530
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実施例68−ベクターとしてのNYVAC.1（vP954）の使用
NYVAC.1（vP954）（実施例17）において、NYVAC（vP866）中の［C7L−K1L］欠損は、K3Lを通じて、その右側の、欠損がインターフェロンに対する感度を高める遺伝子まで拡張せしめられる（ビーティーら、1991）。狂犬病糖タンパク質の免疫化ベクター並びに以下に記載するような麻疹HAおよびＦ遺伝子の免疫化ベクターとしてNYVAC.1を試験した。
狂犬病糖タンパク質遺伝子のvP954への挿入；ワクシニア組換え体cP1006の産生
TK欠損座に挿入された狂犬病糖タンパク質の発現カセッテを含有する、供与体プラスミドpRW842（実施例７）を、治療ウイルスとしてのvP954とともに組換えに用いた。狂犬病糖タンパク質Ｇ暗号配列に対する32P−標識DNAプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより組換えワクシニアウイルスvP1006を同定した。
麻疹HA、Ｆをコードする遺伝子のvP954への挿入；ワクシニア組換え体vP1015の産生
TK挿入座に麻疹Ｆおよび麻疹HAの両方の発現カセッテを含有する、pRW857（実施例９）を、vP954治療ウイルスとともに組換えのための供与体プラスミドとして用いた。麻疹HAおよび麻疹Ｆの暗号配列の両方に対する32P標識プローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより組換えウイルスvP1015を同定した。
免疫化ビヒクルとしてのK3LのないNYVAC.1ベースのベクターの効能；狂犬病Ｇ組換え体vP1006
生後４から６週間のネズミ（ウイルスごとで希釈ごとに10匹）に、vP1006、vP954（vP1006の親）、vP879（NYVACベースの狂犬病Ｇ、実施例７）、またはワクシニア狂犬病187 XP12の未希釈、10-2、10-4、または10-6のいずれかを接種した。接種は、足のパッドによりネズミごとに50−100μｌで行なった。接種から14日後に、全てのネズミに、20LD50のCVS菌株（0.03ml中）を大脳半球間接種により抗原投与した。生存したネズミを数え、防御投与量50％（PD50）を計算した。
表44に示すように、vP1006の親ウイルス、vP954は、最高量の接種物でさえも生狂犬病抗原投与からネズミを防御しなかった。組換えウイルス187 XP12（キーニーら、1984）、vP879、およびvP1006は全て、生狂犬病抗原投与からネズミを防御する能力を示した。しかしながら、この能力におけるこれらのウイルスの相対的な効能は、PD50値により示したように（表44）異なる。
麻疹ウイルス組換え体vP1015
２匹のウサギに、０日と28日に皮下経路により8.0log10PFUのvP1015を接種した。０、14、21、28、35、42および49日目に、連続の採血を行なった。アルブレヒトら（1981）により記載されたプラーク退行（reduction）中和法を用いたウイルス中和抗体の存在に関して血清を分析した。
この分析により結果を表45に示す。両方の動物は、１回のvP1015の接種後に血清転化し、動物A169は、接種から２週間後に防御水準の抗体を示した。抗体水準における著しい増加が２回目の接種後に観察された。等しいプロトコルにおける、２匹のウサギのNYVAC−MV（vP913;実施例９）による接種の結果を表45に示す。この結果により、K2LとK3Lの欠損は、効果的な免疫化ビヒクルとして機能するウイルスの能力には影響しないことが示される。
Figure 0003602530
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実施例69−ベクターとしてのNYVAC.2（vP938）の使用；狂犬病糖タンパク質Ｇ遺伝子を含有するワクシニア組換え体VP996の産生
NYVAC.2（vP938）において（実施例17）、NYVAC（vP866）中の［C7L−K1L］欠損が、38 ORF［C23L−F4L］の合計を含むように両方向に拡張される。TK欠損座に挿入された狂犬病糖タンパク質の発現カセッテを含有する、供与体プラスミドpRW842（実施例７）を、vP938治療ウイルスとともに組換えに用いた。狂犬病糖タンパク質Ｇ暗号配列に対する32P標識DNAプローブを用いたプラークハイブリダイゼーションにより組換えワクシニアウイルスvP996を同定した。
ベロ細胞およびMRC−５細胞上の修飾NYVACウイルスの成長
ワクシニアの左側［C23L−F4L］および右側［B13R−B29R］末端に近い大型欠損の、組織培養中の成長への効果を実験するために、MRC−５細胞とベロ細胞上の複製に関してNYVAC（vP866）、vP938、vP996および以下の追加のNYVACベースのウイルスを試験した。
vP879（実施例７）は、NYVACのTK座に挿入された狂犬病糖タンパク質遺伝子を含有する。
vP953（実施例17）は、NYVAC欠損およびゲノムの右側末端に近い追加の欠損［B13R−B29R］を含有する。
vP997（実施例17）は、NYVAC欠損に加えゲノムの左右の末端の両方に近い追加の欠損を含有する。
1.5×106での60mm皿中の感染の２日前に、ベロ細胞（アフリカグリーンサルの肝臓細胞系、ATCC CCL 81）およびMRC−５細胞（ヒトの胎児の肺、ATCC CCL 171）に接種した。感染時に、全ての細胞は融合性であり、皿は２×106の細胞を含有した。細胞を、ara Ｃの有無にかかわらずMEM＋２％新生ウシ血清（NCS）で希釈された（最終濃度40μg/ml）、細胞当たり0.1pfuの多重度でのウイルス（表46）に感染せしめた。ときどきロッキング（rocking）しながら、感染単層を37℃で60分間インキュベーションせしめた。１時間の吸着期間後、細胞をMEM＋２％ NCSで２回洗浄し、次いで3mlの、ara Ｃの有無にかかわらずMEM＋２％で重るいし、37℃でシンキュベーションした。３回の凍結と解凍により、感染から１時間後と72時間後に感染細胞を収穫した。各試料を、ベロ細胞上で２重に滴定した。
表46に示すように、NYVAC（vP866）は、ヒトMRC−５細胞上で制限された成長を行なうことができる。ここに試験した条件下で（0.1pfu/細胞のmoi、72時間のインキュベーション）、NYVACは、約2logの力価の増大を示した。これらの同一の条件下で、ゲノムの左側（vP938）および右側（vP953）末端の近くに欠損を含む修飾NYVACウイルスは、約1logの力価の増大を示した。両末端の近くに欠損を含有する修飾NYVAC（vP977）からの収穫は、入力ウイルスと比較して減少し、MRC−５細胞上では増幅を示さなかった。これに対して、これらの条件下では、ベロ細胞上で試験した全てのウイルスはほぼ同程度増幅した。表46に示すように、様々な修飾NYVACウイルスけっそん変異体に関するベロ細胞上の収穫と比較したMRC−５細胞上のワクシニアウイルス収穫の百分率は、以下のとおりである:vP866（NYVAC）3.5％;vP938（NYVAC.2、左末端欠損）1.42％;vP953（右末端欠損）0.5％;vP977（左右末端欠損）0.06％。MRC−５細胞上のNYVACベースの狂犬病組換え体vP879およびNYVAC.2ベースの狂犬病組換え体vP996の収穫は、それぞれの親ウイルスに関して実質的に同一であり、異種遺伝子の発現は、組織培養中の組換えウイルスの成長には影響しないことを示す。
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実施例70−マンプスＦおよびHN遺伝子のcDNAクローニング
マンプスウイルスのウラベAM−９菌株は、欧州と日本においてワクチンとしての使用が認可されている生、弱得化ウイルスである。このウイルスは、フランス、マーシールエトイル、メリクス研究所からワクチン標品（イモバクス オレイロンス）として得た。ウイルスをベロ細胞上で増幅し（２継代）、全RNAを単離して感染細胞から精製した（チャーグウィンら、1979）。AMV逆トランスクリプターゼと任意のプライマーを用いて、このRNAから第１の鎖cDNAを調製した（ワトソンおよびジャクソン、1985）。RWマンプス菌株からの公表された配列を用いて（ワキサムら、1987;ワキサムら、1988）、ＦおよびHN遺伝子の５′および３′未翻訳領域から一連の特異的なプライマーを合成した。これらのプライマーを用いて、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）により第１の鎖cDNAからウラベAM−９ ＦおよびHN遺伝子を増幅した。合成オリゴヌクレオチドRG503（配列認識番号366）
Figure 0003602530
およびRG494（配列認識番号367）
Figure 0003602530
を用いてＦ遺伝子を増幅した。RG500（配列認識番号368）
Figure 0003602530
およびRG501（配列認識番号369）
Figure 0003602530
を用いてHN遺伝子を増幅した。５′プライマー（RG503およびRG500）をSac I部位で、３′プライマー（RG494およびRG501）をAsp718部位で切断した。増幅したＦおよびHN断片をSac IとAsp718で切断し、多重クローニング部位のSac IとAsp718でのpBluescript SK＋にクローニングした。６つのＦ遺伝子クローンと５つのHN遺伝子クローンをDNA配列していかなる逆トランスクリプターゼまたはPCRのエラーも除去した。第29図はpURF3（配列認識番号370）により示されるコンセンサスＦ配列を提供し、第30図はpURHN5（配列認識番号371）により示されるコンセンサスHN配列を提供する。
実施例71−ALVAC供与体プラスミドの構成：マンプスＦおよびHN遺伝子
マンプスＦおよびHN遺伝子を発現するALVAC組換え体の産生のためのALVAC供与体プラスミドの全体的な設計を以下に示す。マンプスＦ遺伝子は、昆虫ポックス42Kプロモーター（実施例59に記載した）に結合せしめられ、マンプスHN遺伝子はワクシニアH6プロモーターに結合せしめられている（パーカスら、1989）。２つのプロモートされた遺伝子を５′対５′配向に配置し、ALVAC C3座挿入プラスミドに挿入した。構成の特定の詳細を以下の段落に示す。
pSPCP3Lの多重クローニング領域（実施例32に記載した）を、EcoR V、Rsr II、Sma IおよびPst I制限部位を含有する31bpリンカー断片を加えることにより変更した。アニーリング合成オリゴヌクレオチドRG560（配列認識番号372）
Figure 0003602530
およびRG561（配列認識番号373）
Figure 0003602530
によりリンカーを産生し、次いでEcoR VとPst Iで切断した。リンカーをpSPCP3LのEcoR VとPst I部位にクローニングし、pC3LRを産生した。
合成オリゴヌクレオチドRG562（配列認識番号374）
Figure 0003602530
およびRG563（配列認識番号375）
Figure 0003602530
を用いたPCRによりpRW823からH6プロモーターを増幅した。pRW823は、パーカスら、1989により記載したように、H6プロモーター配列を含有する。精製した断片をEcoR IとSma Iで切断し、pC3LR中のEcoR IとSma I部位に連結し、pC3LRVQH6を産生した。
マンプスＦ遺伝子を、Hind III/Asp718断片（Ｎ末端から約50コドンを欠如したＦ遺伝子ORF）としてpURF3から切除した。この断片の末端をクレノウポリメラーゼを用いて修復し、EcoR Iで切断されクレノウポリメラーゼにより修復されたpC3LRVQH6に連結した。正確な配向のスクリーニングにより、pC3LRFVQH6を産生した。
合成オリゴヌクレオチドRG564（配列認識番号376）
Figure 0003602530
およびRG565（配列認識番号377）
Figure 0003602530
を用いたPCRによりpURF3から、Ｆ遺伝子のＮ末端pURF3および42Kプロモーター配列を含有する断片を増幅した。精製した断片をNco IとPst Iで切断し、Nco IとPst Iで切断したpC3LRFVQH6に連結した。産生したプラスミドpC3LRF42KVQH6を、挿入断片のDNA配列分析により確認した。
マンプスHN遺伝子を、Ssp I/Asp718断片（Ｎ末端から約35コドンの欠如したHN遺伝子）としてpURHN5から切除した。この断片の末端をクレノウポリメラーゼを用いて修復し、Sma Iで切断したpC3LRF42KVQH6に結合した。正確な配向のスクリーニングによりpFR2A−30を産生した。H6プロモーターの３′部分およびHN遺伝子のＮ末端配列を含有する断片を、合成オリゴヌクレオチドRG566（配列認識番号378）
Figure 0003602530
およびRG567（配列認識番号379）
Figure 0003602530
を用いたPCRによりpURHN5から増幅した。精製した断片をNru IとBsu36 Iで切断し、Nru IとBsu36 Iで切断したpFR2A−30に連結した。産生したALVAC供与体プラスミド、pC3URFHNを、挿入プラスミドのDNA配列分析により確認した。
実施例72−ALVAC組換え体の産生
供与体プラスミドpC3URFHNを、ALVAC（CPpp）とともにCEF細胞中の生体外組換え実験に用いてvCP171を産生した（テイラーら、1992）。放射線標識したＦおよびHN特異的プローブを用いた現場でのハイブリダイゼーション方法（ピッチーニら、1987）により、組換えウイルスを同定した。３回のプラーク精製により組換えプラークを精製し、発現分析により増幅した。発現分析により、ＦおよびHNを発現した。
実施例73−日本脳炎ウイルス（JEV）15aaC、prM、Ｅ、NS21、NS2Aを含有する挿入ベクターの構成
pRW838の構成は前述している（実施例15参照）。
pRW838を、狂犬病糖タンパク質遺伝子の３′末端での、H6プロモーター内のEcoR Vで切断されたDNAポリメラーゼＩのクレノウ断片が充填されたEcoR Iで切断し、アルカリ性ホスファーゼで処理し、H6プロモーターの５′の103bp、複製のプラスミド起点およびC5フランキングアームを含有する3203bp断片を単離した。ワクシニアウイルス供与体プラスミド中で15アミノ酸Ｃ、prM、Ｅ、NS1、NS2AをコードするJEV cDNAを含有するプラスミドJEVL14VC（メイソンら、1991）（ヌクレオチド337−4125、コニシら、1991）をH6プロモーター中のEcoR IとJEV配列中のSac I（ヌクレオチド2124）で切断し、1809bp断片を単離した。JEVL14VCを、DNAポリメラーゼＩのクレノウ断片が充填され、T5ATの後のEag I部位でのEclX Iで切断し、JEV配列内のSac I（ヌクレオチド2124）で切断し、2011bp断片を産生した。1809bp EcoR V−Sac I、2011bp Sac I充填EclX Iおよび3202bp Ecp V充填EcoR I断片を連結し、JEVCP1を産生した。
実施例74−JRV 15aaC、prM、Ｅを含有するC5挿入ベクターの構成
プラスミドJEV36を、H6プロモーター内のEcoR VとJEV配列内のSph I（ヌクレオチド2380）で切断し、2065bpの断片を単離した。プラスミドVQH6C5LSP（実施例44で定義した）を、H6プロモーター内のEcoR Vとポリリンカー内のXba Iで切断し、2065bp断片とアニールしたオリゴヌクレオチドSP131（配列認識番号382）およびSP123（配列認識番号383）（Sph I粘着末端、Ｅ暗号領域を補充したＴヌクレオチド、翻訳終止、ワクシニア初期転写終止信号（AT5AT;ユエンおよびモス、1987）、第２の翻訳終止、およびXba I粘着末端）に連結し、C5フランキングアームの間のH6プロモーターの制御下で15アミノ酸Ｃ、prMおよびＥをコードするプラスミドJEVCP5を産生した。
実施例75−ALVACベースのJEV組換え対の構成
JEVCP1をALVAC感染初代CEF細胞に移入し、15アミノ酸Ｃ、prM、Ｅ、NS1、NS2Aをコードするカナリヤポックス組換え体vCP107を産生した。JEVCP5をALVAC感染初代CEF細胞に移入し、JEV15 aaC、prMおよびＥをコードするカナリヤポックス組換え体vCP140を産生した。
Figure 0003602530
実施例76−組換え体感染細胞中のJEVタンパク質のイムノプレシピテーション
前述したようにイムノプレシプテーション実験を行なった（コニシら、1991）。vCP107およびvCP140感染細胞中に産生したＥタンパク質を、真正Ｅタンパク質を生産することが示されているJEV−ワクシニア組換え体により産生されたＥタンパク質とともに移動する（コニシら、1991）。vCP107は、真正NS1タンパク質を産生することが示されているJEV−ワクシニア組換え体により産生されたNS1タンパク質とともに移動する（コニシら、1991）。
実施例77−ネズミのcCP107による免疫化
腹腔注射により、生後３週間のスイスネズミを107PFUのvCP107で免疫化し、３週間後に選択したネズミから血清を採取した。ネズミの半分にvCP107を再接種せしめ、３週間後に血清を採取した。前述したように、中和（Neut）および血球凝集阻害抗体（HA I）について血清をアッセイした（コニシら、1991）。vCP107で１度または２度免疫化したネズミは、高い力価のNeutおよびHA I抗体を発達せしめ、両方の力価は２度目の免疫化により増大した。親ALVACを投与したネズミは抗体力価を発達せしめなかった。vCP107免疫化ネズミに得た抗体水準は、JEV−ワクシニア組換え体での免疫化により達成された水準と匹敵した（コニシら、1991）。
実施例78−TROVAC−NDV（vFP96）への効能研究
特定病原体感染防止条件（SPF）の鶏と市販のブロイラーの鶏におけるTROVAC−NDV（vFP96）（実施例８）のNDV（ニューカッスル病ウイルス）に対する防御効能を測定するために、数多くの研究を行なった。
研究A.
生後１日のSPF鶏の４つの群に、0.3から6.3log10TCID50の投与量の範囲のTROVAC−NDV（vFP96）または親TROVACウイルスを足に筋内経路により接種した。接種部位での反応について鳥を監視し、抗NDV血清中和抗体および血球凝集素抑制抗体の存在の分析のために、接種から14日後に血清試料を集積した。接種から21日後に、鳥に5.0log1050％卵感染量の短潜伏期性NDV菌株テキサスGBを筋内接種により抗原投与した。健康な鳥が防御されたと考えられる抗原投与から14日間に亘り鳥を保持した。6.3または2.6log10TCID50のTROVAC−NDV（vFP96）またはTROVAC親ウイルスの筋内接種により、接種の時点で、ある場合には死亡する皮膚の病害となることが分かった。病害のひどさには特定の投与量効果があり、これは、1.1から1.4log10TCID50の投与量で、接種の時点でのわずかな炎症反応に限られる。全ての場合において、病害は接種の点に限定され、鶏の他の部分には広がらない。効果はTROVAC−NDV中のNDV ＦおよびHN遺伝子の発現によるものではなく、同様の効果が親ウイルスにも観察された。他の接種経路が用いられた場合に、高い投与量のTROVACまたはTROVACベースの組換え体の接種では有害な副作用が見られるので、反応はこの接種経路に特異的である。
血清学分析と防御効能の結果を表47に示す。TROVAC親ウイルスを接種した全ての鳥は、致死量抗原投与のために死亡した。1.1および2.6log10TCID50のTROVAC−NDV（vFP96）をワクチン接種した全ての鳥は、抗原投与に生き残り、一方0.3log10TCID50を投与した鳥の82％が生存した。これにより、この経路によるこの組換え体の50％の防御投与量（PD50）は0.3TCID50であることが分かった。
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研究B.
市販のブロイラー鶏の２つの供給源とSPF鶏におけるTROVAC−NDV（vFP96）の防御効能を評価した。生後１日の鳥の３つの群について研究した。群1:鶏痘ウイルスによりワクチン接種した経験のないふ化場から得た卵から鶏をふ化させた。群2:鶏痘ウイルスによりワクチン接種した経験のあるふ化場から得た卵から鶏をふ化させた。群3:特定病原体感染防止条件鶏を得た。
2.0または4.0log10EID50のいずれかのTROVAC−NDVを皮下で鳥にワクチン接種した。ワクチン接種から21および28日後に鳥から採血し、NDV HI抗体の存在を評価した。また、アガーゲル沈降試験を用いてワクチン接種後の鶏痘抗体の存在について血清を評価した。ワクチン接種から28日後、各群の10匹の鳥と10匹の対照に、4.2log10EID50の短潜伏期性のNDV菌株テキサスGBを筋内接種により抗原投与し、生存した鳥を評価した。また、各群の10匹の鳥と10匹の対照に、鶏痘ウイルスのNVSL菌株を翼に刺す接種により抗原投与した。鶏痘抗原投与からの防御を、接種部位での病害または生着（take）の欠如に基づいて評価した。この実験結果を表48に示す。
この結果により、市販のブロイラー鶏はTROVAC−NDVにより発現されたNDV抗原に対する検出可能な免疫応答を発達させず、一方SPF鶏は免疫応答を示したことが分かる。市販の鳥には特異的抗NDV抗体の欠如にもかかわらず、短潜伏期性NDV抗原投与後に見られた防御水準には差はなかった。アガーゲル沈降試験により検出可能な鶏痘ワクチン接種に対する免疫応答は、どの鳥も示さなかった。検出可能な抗鶏痘抗体の欠如にもかかわらず、全てのワクチン接種した鳥は、鶏痘抗原投与から防御され、一方ワクチン未接種の鳥は死亡した。これらの結果により、雄鳥の鶏痘ウイルスへの先の露出では、鶏痘ベースのNDV組換え体をワクチン接種した鶏におけるNDVまたは鶏痘に対する防御免疫の誘発を妨げないことが分かる。
Figure 0003602530
ヒト組換え体免疫不全ウイルス−NYVACまたは−ALVACウイルス；細胞系に関する以下の実施例79から81のための材料および方法
P815ネズミ肥満細胞種細胞（Ｈ−2d）をアメリカ型培養コレクションから得て、10％の胎児ウシ血清（FBS）および100IU/mlのペニシリン並びに100μg/mlのストレプトマイシンを補給したイーグルMEM中に保持した。
ネズミ
雌BALB/cJ（Ｈ−2d）ネズミをジャクソン研究所（ME、バーハーバー）から購入し、任意に餌と水を与え続けた。全て生後６から15週間のネズミを用いた。
接種
外側尾静脈により0.1mlの食塩加リン酸緩衝液中の５×107プラーク形成単位（pfu）を、ネズミに静脈接種した。
血清
ネズミをエーテルで軽く麻酔して、レトロオービタル（retroorbital）叢から血液を採取した。実験群よりなるネズミからの血液を集積し、凝固せしめた。血清を集積し、使用まで−70℃で貯蔵した。
細胞毒性Ｔリンパ球のアッセイおよび細胞毒性Ｔリンパ球の記憶前駆体の生体外刺激
生後６週間の雌BALB/cネズミに、５×107pfuのワクシニアウイルス（NYVAC）、HIV−１（III B）envを発現する組換えワクシニアウイルス（vP911）、カナリヤポックスウイルス（ALVAC）、またはHIV−１（III B）envを発現する組換えカナリヤポックスウイルス（vCP112）を静脈接種した。７日後、HIV−１（III B）gp120の超可変V3ループ領域に対応するペプチドで一晩インキュベーションしたP815細胞または未修飾P815細胞に対する主要CTL活性に関して、ひ臓細胞をアッセイした。最初の免疫化から22日後、実験ネズミのひ臓細胞をポックスウイルス感染刺激要因ひ臓細胞でインキュベーションし、前述のようにペプチド瞬間標識した標的に対する記憶CTL活性に関してアッセイした。第２のCTL活性を測定するために、最初の接種から29日後、主要免疫化ネズミに最初と同量で同成分の第２の接種を行なった。５日後、ペプチド瞬間標識標的に対する細胞毒性活性に関してひ臓細胞をアッセイした。細胞毒性アッセイに関して、Ｈ−2dP815ネズミ肥満細胞種細胞を、20μg/mlのV3ペプチド（CNTRKRIRIQRGPGRAFVTGK、アメリカンバイオテクノロジー社）（配列認識番号457）の有無のかかわらず培地中（アール塩を含有し、10％の胎児ウシ血清、2mMのＬグルタミン、100U/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを補給した）で一晩インキュベーションした。次の朝、遠心分離によりP815細胞を洗浄し、２×106の細胞当たり100μCiのNa2 51CrO4中37℃で１時間標識した。無傷ひ臓を、安楽死させたネズミから除去して、氷冷したハンクス平衡塩溶液中に入れ、ストマッチャーブレンダーを用いて１つの細胞懸濁液に粉砕した。ひ臓細胞懸濁液を低速遠心分離により数会戦場史、アッセイ培地（10％の胎児ウシ血清、20mMのHEPES、2mMのＬグルタミン、５×10-5Mの２−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを含有するRPMI1640）中に再懸濁せしめた。記憶CTL活性に関して、免疫化したネズミからのひ臓細胞を刺激培地中に再懸濁せしめ（10％の胎児ウシ血清、2mMのＬグルタミン、10-4Mの２−メルカプトエタノール、100U/mlのペニシリン、および100μg/mlのストレプトマイシンを含有するアール塩を有するMEM）、ポックスウイルスまたはポックスウイルス組換え体の１つに感染した未経験同系刺激要因ひ臓細胞により、りょくりつした25cm2組織培養フラスコ中で生体外刺激した。37℃での５日間の後、細胞を洗浄し、数え、アッセイ培地中に再懸濁した。51クロム標識標的細胞を、４時間の51Cr放出アッセイのための96ウェルマイクロタイタ板中の滴定した効果器細胞に加えた。３つのアッセイに見られた標的細胞に対する効果器の比率（E:T）は、100:1（主要）、20:1（記憶）および50:1（第２）であった。細胞毒性のパーセントは、（実験51Cr放出−自発的51Cr放出）／（最大51Cr放出−自発的51Cr放出）×100により計算した。最大放出は、５％のドデシル硫酸ナトリウムを標的細胞に加えることにより測定し、一方自発的放出は、効果器細胞の不在下で標的細胞をインキュベーションすることにより測定した。どの実験においても、最大51Cr放出の20％を超える標的細胞からの51Crの自発的な放出は存在しなかった。誤差のバーは、平均からの１標準偏差を示す。
（＊）Ｐ＜0.05、スチューデントｔ検定を適切なワクシニアまたはカナリヤワクシニア免疫化ネズミと比較した。
細胞毒性効果器細胞の細胞表面表現型
方法は実質的に、ワクシニアウイルス、カナリヤポックスウイルスベクター（NYVAC、ALVAC）またはHIV III B envを発現するワクシニアウイルスまたはカナリヤポックスウイルス組換え体（vP911、vCP112）で免疫化したネズミひ臓細胞に関して行なった。２回目の接種は、最初の接種から30日後に行なった。V3ペプチド瞬間標識した標的に添加する前に、ひ臓細胞を、２段階プロトコルにおいてネズミＴリンパ球表面抗原に対する単クローン性抗体または同種異系抗血清で処理した。手短にいうと、ひ臓細胞を、同種異系Thy1.2（セダーレーン）、単クローン性抗CD−４（172.4、デューク大学医療センター、K.J.ワインホールドからのギフト）、または単クローン性抗Lyt2.2（セダーレーン）が加えられる細胞毒性培地（0.2％のBSAおよび5mMのHEPESを含有するRPMI1640）に1ml当たり107の生存可能細胞で再懸濁せしめた。５℃での30分後、細胞を洗浄し、補体（セダーレーン、ウサギ ロートクスＭ）の有無にかかわらず２つの等しい部分に分けた細胞毒性培地の元の容積に再懸濁せしめ、37℃で45分間インキュベーションした。次いで細胞をアッセイ培地中で洗浄し、前処理細胞密度に基づいて、５時間の51Cr放出アッセイに添加する前に、100:1（主要）、10:1（記憶）、または80:1（第２）の標的細胞に対する効果器の比率を近似するアッセイ培地の容積中に再懸濁した。誤差のバーは平均からの１標準偏差を示す。
HIV III B gp120のV3グループ領域のCTL抗原受容体認識の特異性
細胞毒性Ｔリンパ球および細胞毒性Ｔリンパ球の記憶前駆体を、前述したようにネズミのvCP112による接種により産生した。P815標的細胞を、HIV−１ III B（CNTRKRIRIQRGPGRAFVTGK）（配列認識番号384）、MN（CNKRKRIHIGPGRAFYTTKN）（配列認識番号385）、またはSF2（CNTRKSIYIGPGRAFHTTGR）（配列認識番号386）からのV3ペプチドで一晩瞬間標識したことを除いては、上述したように、細胞毒性Ｔリンパ球のアッセイを行なった。標的細胞に対する効果器の比率は、100:1（主要）、20:1（記憶）、および50:1（第２）であった。
HIV−１（III B）gp120に対する抗体応答
ELISA板のウェル（イムロンII）を、炭酸塩緩衝液、pH9.6中の0.5μｇの部分的に精製したHIV−１（III B）gp120（NCI−NIH、Dr.G.フランチーニ）により４℃で一晩被膜した。次いでその板を0.05％のトイーン20（PBST）を含有する食塩加リン酸緩衝液で洗浄した。次いで板を、１％のウシ血清アルブミン（BSA）を含有するPBSTにより37℃で２時間遮断した。PBSTにより洗浄後、最初に血清を、0.1％のBSAを含有するPBST（希釈緩衝液）で1:20に希釈した。さらに血清をELISA板のウェル中で２倍に連続的に希釈した。この板を37℃で２時間インキュベーションし、PBSTで洗浄した。ウサギ抗ネズミイムノグロブリン（ダコ）に接合されたホースラディッシュペルオキシダーゼを希釈緩衝液中で1:2000に希釈して、ELISA板のウェルに加え、37℃で１時間インキュベーションした。PBSTでの洗浄後、基体緩衝液中のOPD（ｏ−フェニレンジアミンジヒドロクロライド）を加え、周囲温度で約20分間に亘り呈色せしめた。反応を、2.5MのH2SO4の添加により停止せしめた。490nmでの吸収を、バイオテックEL−309ELISAリーダーで測定した。0.4の吸収値を与えた希釈の逆数として血清の終点を定義した。
実施例79−HIV envを発現する組換え体カナリヤポックスウイルスはHIV特異的細胞毒性Ｔリンパ球活性を誘発する
HIVカナリヤポックスウイルス組換え体（vCP112;実施例18で定義した）での最初の接種から７日後、HIV V3ペプチド瞬間標識標的細胞に対するひ臓細胞の細胞毒性応答を、同一の投与量、５×107pfuの同一のHIV env遺伝子を発現するワクシニアウイルス組換え体（vP911）（実施例18）により誘発した細胞毒性応答に粗く等しくした（第31図）。適切な生体外刺激または第２の接種後に、カナリヤポックスウイルス組換え体を与えたネズミのひ臓細胞の細胞毒性の水準は増大し、同様にワクシニアウイルス組換え体を投与したネズミからのひ臓細胞と一致した。それぞれ、非組換えワクシニアウイルスまたはカナリヤポックスウイルスベクター、NYVACおよびALVACを接種したネズミのひ臓細胞からはそのような細胞毒性応答は検出されず、HIV env遺伝子を発現するポックスウイルス組換え体での免疫化の必要性を確認した。さらに、接種養生にもかかわらず、どのようなネズミからのひ臓細胞からの未修飾P815細胞に対しては細胞毒性反応性は検出されなかった。それゆえ、組換えワクシニアウイルスまたは、より著しくは、HIV−１からのenv暗号配列を発現する組換えカナリヤポックスウイルスを接種したネズミのみが、V3特異的細胞毒性応答を示した。
実施例80−細胞毒性効果器細胞の特徴付け
HIV−１ V3ペプチド瞬間標識標的の溶菌に関するひ臓細胞の同一性を測定するために、ネズミをvCP112で免疫化した。それぞれを免疫化した後に、または最初の接種から21日後に生体外刺激したときに、２段階枯渇方法を行ない、ひ臓細胞を、V3ペプチド瞬間標識P815細胞に対する細胞毒性に関して評価した。カナリヤポックスベクターALVACを接種したネズミは、ペプチド瞬間標識標的を殺すことのできるひ臓細胞を産生しなかった。１回の免疫化後、vCP112は、V3ペプチド瞬間標識標的を殺すことのできるひ臓細胞を誘発した。溶菌効果器細胞は、抗ネズミThy1.2またはLyt2.2および補体による処理に感度があり、第32図に示すように抗CD4に対して抵抗があった。この図は、細胞毒性Ｔリンパ球細胞表面抗原Thy1.2およびLyt2.2に対する抗体に対しての、vCP112で免疫化したひ臓細胞からの細胞毒性効果器細胞の感度を示す。補体またはいずれの単クローン性抗体または同種異系抗血清のみのどれもこれらの細胞の細胞溶解性作用に影響しなかった。30日目に投与した２回目の免疫化から５日後にも同様の結果が得られた。１回目の接種から21日後、vCP112感染同系ひ臓細胞による生体外刺激により、抗Thy1.2に部分的に感度があるが、抗Lyt2.2に完全に感度があり。抗CD4には抵抗がある溶菌効果器細胞となる。vCP112を接種したネズミからのひ臓細胞のvP911による生体外刺激後には、これらのThy1.2−、CD4−、Lyt2.2＋効果器細胞は見られない。いうまでもなく、HIV V3ループ特異的細胞毒性は、CD4ではなくThy1.2およびLyt2.2を発現するＴリンパ球の個体群により媒介されたことが明確である。
実施例81−HIV gp120のV3ループ領域のCTL抗原受容体の特異性
Ｔリンパ球抗原受容体は、エピトープ断片の主要アミノ酸配列中の小さな変更に対して精巧に感度がある。HIV gp120のV3ループ領域は超可変性であり、HIV単離体の中で免疫学的に異なる。超可変性は、置換といくつかのアミノ酸の添加にある。HIVカンリヤポックスウイルス組換え体により産生された細胞毒性細胞の特異性を試験するために、CTL活性に対する感受性は、HIV単離体III B、MN、またはSF2のgp120のV3ループ領域に対応するペプチドで瞬間標識したP815標的細胞の中で比較した。HIV特異的主要CTL活性は、第33図に示したように、HIV単離体MNまたはSF2のgp120のV3ループ領域に対応するペプチドで瞬間標識した標的細胞ではなく、HIV単離体III BのV3ループに対応するペプチドで瞬間標識したP815標的細胞のみに限定された。第33図は、HIV MNまたはSF2のV3ループのではなく、gp120のHIV III B超可変V3ループの細胞毒性Ｔリンパ球抗原受容体の特異性を説明するものである。生体外刺激された、HIV特異的記憶CTL活性およびカナリヤポックスウイルス組換え体vCP112による免疫化により誘発された第２のCCTL活性に関して、同様の結果が得られた。それゆえ、HIV単離体III Bのenv遺伝子を発現する組換えカナリヤポックスウイルスにより誘発されたHIV特異的CTLは、同一の抗原単離体から誘導された標的エピトープのみを認識する。これらの結果は明確に、HIVカナリヤポックスウイルス組換え体により産生されたリンパ球効果器細胞の精巧な特異性を示し、ナチュラルキラー（NK）細胞活性としての非特異的効果器機構を除外する。これらの結果は、HIV V3特異的ネズミ細胞毒性Ｔリンパ球によるエピトープ認識の正確さを特徴付ける他の報告と完全に一致する。
実施例82−NYVAC−およびALVACベースのHIV組換え体を接種したネズミの抗体応答
HIVに対する体液性応答を評価するために、０日にワクシニアウイルスHIV組換え体またはカナリヤポックスウイルス組換え体でネズミを免疫化し、４週間目に２回目の免疫化を行なった。最初の免疫化から20週間に亘り、様々な間隔でネズミを採血した。各処理群から集積した血清を、抗原として精製したgp120を使用したELISAによりHIVに対する抗体に関してアッセイした；ベクター（NYVAC、ALVAC）またはワクシニアウイルス組換え体vP911またはHIV−１ envを発現するカナリヤポックス組換え体（vCP112）で免疫化したネズミのHIV III Ｂ gp120に対する抗体応答を提供する第34図に結果を示す。ここで逆三角形は、２回目の接種の投与時間を示す。主要抗体応答は、一般的に穏やかであったが検出可能であった。２回目の接種後に、vP911およびvCP112の両方出免疫かしたネズミの抗体力価は増大し、６週目に10,000を超える力価でピークとなった。これらの抗体力価は、研究の期間に亘りほぼ同一の水準で保持された。それゆえ、カナリヤポックスウイルスHIV組換え体、vP112は、著しい抗体応答を誘発することができた。
HIV−１のenv遺伝子を発現するカナリヤポックスウイルスによるネズミの接種により、細胞毒性Ｔリンパ球の特徴：免疫化の必要条件、細胞表面表現型、記憶、および簡潔なエピトープ特異性を有するひ臓細胞活性を誘発する。さらに、この組換えカナリヤポックスウイルスの接種によりHIV−１ gp120にいする抗体応答が誘発される。
実施例83−ALVACおよびNYVACによるHIV−１（MN）envを発現するNYVAC−およびALVACベースHIV−１組換え体の誘導
HIV−１（MN）env配列を、それぞれ、HIV−１（MN）のゲノムcDNAからの1774bpおよび1803bpサブ断片を含有するプラスミドpMN1.8−９およびpMN1.8−10から誘導した。これらのプラスミドは、Dr.R.C.ガロ（NCI−NIH）の研究所から得た。オリゴヌクレオチドHIVMN6（配列認識番号387）
Figure 0003602530
およびHIV3B2（配列認識番号151）を用いたPCRによりpMN1.8−９からのこれらの配列を増幅し、続いてKpn I/EcoR Iによる切断により、1,026bp Kpn I/EcoR I断片を誘導した。この断片をKpn Iで切断したpBS−SKに挿入し、pBSMIDMNを産生した。
オリゴヌクレオチドHIVMN5（配列認識番号388）
Figure 0003602530
およびHIVMN3P（配列認識番号389）
Figure 0003602530
を用いたPCRと、続いてのSac IとXba Iによる切断により、pMN1.8−10から1,028bp Sal I/Xba I断片を誘導した。この断片を、404bp EcoR I/Sac I断片とともに、EcoR IとXba Iで切断したpBS−SKに連結した。テンプレートとしてのpMN1.8−９およびオリゴヌクレオチドHIV3B1（配列認識番号144）並びにHIVMN4（配列認識番号390）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより、404bp断片を誘導した。産生したプラスミドをpBS3MNと称した。
pBSMIDMNからの1,026bp EcoR I/Kpn I断片を、EcoR I/Kpn Iで切断した4,315bp pBS3MNに挿入した。このプラスミドは、５′側領域を除いたenv遺伝子のほとんどを含有する。pH6HIIIBE（実施例18に定義した）から318bp Kpn I断片を単離することにより、ワクシニアウイルスH6プロモーター（ゲーベルら、1990a、ｂ）およびenv遺伝子の５′側領域を得た。この断片を、pBSMID3MNからの2.9bp Kpn I/Xba I断片とともに、Kpn I/Xba I切断pBS−SKに連結した。産生したプラスミドをpH6HMNEと称した。
H6プロモーターの３′側の26bpに３′が隣接した全縁HIV−１（MN）env遺伝子を含有する、pH6HMNEからの2.7bp Nru I/Xba I断片をブラントエンドし、Nru I/Sma I切断pSPHAH6に挿入した。これによりプラスミドpHAHIVMNEを産生した。プラスミドpSPHAH6を以下のように誘導した。
プラスミドpMP2VCL（K1L宿主範囲遺伝子の上流のワクシニア配列内にポリリンカー領域を含有する）を、ポリリンカー内のHind IIIとXho Iで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドSPHPRHA ＡからＤまでに連結し、
Figure 0003602530
Hind III部位、H6プロモーター−124から−１（パーカスら、19889）およびXho I、Kpn I、Sma I、Sac I並びにEcoR I部位を含有するpSP126を産生した。
プラスミドpSD544（ポリリンカー領域で置換したHA遺伝子の部位を囲むワクシニア配列および６つの読取りワクシニア中の翻訳終止コドンを含有する）をポリリンカー内のXho Iで切断し、DNAポリメラーゼＩのクレノウ断片で充填し、アルカリホスファターゼで処理した。SP126をHind IIIで切断し、クレノウで処理し、Sma Iでの切断によりH6プロモーターを単離した。pSD554へのH6プロモーター断片の連結により、ポリリンカー領域（HA転写の方向）内にH6プロモーターを含有したpSPHAH6を産生した。この挿入プラスミドにより、ワクシニアHA遺伝子（A56;ゲーベルら、1990a、ｂ）の異種遺伝子材料による置換が可能になった。
pH6HMNEからの2.8kb Xba I/部分的Kpn I断片を単離し、Xba IとKpn Iで切断したpC5L（実施例44に定義した）に挿入した。産生したプラスミドをpC5HIVMNEと称した。
プラスミドpHAHIVMNEおよびpC5HIVMNEを、治療ウイルスとしての、それぞれNYVAC（vP866）およびALVAC（CPpp）とともに生体外組換え実験に用いた。これらは、標準方法により行なった（ピッチーニら、1987）。組換えウイルスから誘導したプラークを、放射線標識したenv特異的DNAプローブを用いたハイブリダイゼーションにより同定した（ピッチーニら、1987）。３回のプラーク精製後、組換えウイルスを増幅した。NYVAC−ベースのHIV−１（MN）env組換え体をvP1008と称し、ALVACベースの組換え体vCP125と称した。
組換えウイルス、vCP125およびvP1008を、前述した方法を用いて蛍光抗体法およびイムノプレシピテーションによりHIV−１（MN）env遺伝子の発現に関して分析した（テイラーら、1990）。HIV血清陽性個体から集積したヒトの血清（CA、エメリービル、シロン社、Dr.K.ステイマーから得た）をこれらのアッセイに用いた。蛍光抗体法からの結果により、vCP125またはvP1008に感染した細胞は、その表面にHIV−１（MN）遺伝子産生物を発現することが示された。vP1008およびvCP125感染細胞から調製した溶解産物からのイムノプレシピテーションは、それぞれ約160kDa、120kDa、および41kDaの見かけの分子質量を有する３つの主要HIV−１−特異的タンパク質を示した。これらは、前駆体エンベロープ糖タンパク質（160kDa）りおよびタンパク質分解により誘導した熟成形状（120kDaおよび41kDa）の発現と一致する。
実施例84−NYVACおよびALVACによるりHIV−１（MN）gp120の発現
オリゴヌクレオチドT7（配列認識番号395）
Figure 0003602530
およびHIVMN120（配列認識番号396）
Figure 0003602530
を用いてpBS3MNから391bp EcoR I/Xba I断片を増幅し、続いてEcoR IとXba Iで切断した。この断片をpH6HMNE（実施例83で定義した）から誘導した4.2kb EcoR I/Xba I断片に連結した。産生したプラスミドは、pBS−SK中のHIV−１（MN）gp120のポックスウイルス発現カセッテを含有し、pBSHIVMN120と称した。
1.7kb Xba I/部分的Kpn I断片を単離し、Kpn I/Xba Iで切断したpC5Lに挿入した。産生したプラスミドをpC5HIVMN120と称した。HIV−１（MN）gp120をNYVACへ組み込む挿入プラスミドは、最初にpBSHIVMN120から1.6kb Nru I/Sma I断片を単離することにより得た。この断片をNru IとSma Iで切断したpSPHAH6に挿入し、pHAHIVMN120を得た。
挿入プラスミド、pC5HIVMN120およびpHAHIVMN120を、治療ウイルスとしてのALVAC（CPpp）およびNYVAC（vP866）とともに組換え実験に用いた。これらのアッセイおよびプラーク同定と精製は標準方法により行なった（ピッチーニら、1987）。放射線標識したHIV−１（MN）gp120特異的プローブに関してハイブリダイゼーション分析を行なった。ALVACベースのHIV−１（MN）gp120組換え体をvCP124と称し、HYVACベースのHIV−１（MN）gp120組換え体をvP1004と称した。
vCP124およびvP1004に感染した細胞を、蛍光抗体法およびイムノプレシピテーションにより、HIV−１（MN）gp120を発現した組換え体の存在に関して分析した。これらのアッセイは、前述したように（テイラーら、1990）、HIV−血清陽性個体から集積したヒトの血清（CA、エメリービル、シロン社、K.ステイマーから得た）を用いて行なった。これらの研究からの結果により、vCP124およびvP1004のいずれかに感染した細胞は、HIV−１（MN）gp120を含有したことが分かり、一方gp120は、親ウイルス、ALVACおよびNYVACに感染した細胞および未感染細胞には観察されなかった。
実施例85−ALVACおよびNYVACによるHIV−１ gp160の非開裂形状の発現
HIV−１（III B）gp160の非開裂形状を発現するために、スレオニン突然変異に対するアルギニンをグオらにより示されたように（1990）、アミノ酸511で操作した（ラトナーら、1985）。感染細胞の表面からのgp120の放出を減少するためにこれらの変更を行なった。これらの操作を以下のように行なった。オリゴヌクレオチド（配列認識番号397）
Figure 0003602530
およびHIVECB（配列認識番号398）
Figure 0003602530
を用いてpH6HIIIBEからの配列を増幅し、続いてPst IとXba Iでの切断により376bp Pst I/Xba I断片を得た。この断片を、pH6HIIIBEからの4.5kb EcoR I/Xba I断片と1,061bp Pst I/Xba I断片に連結し、pBSHIV3BEECを産生した。
gp160カセッテに連結したH6プロモーターの３′側26bpを含有する、pBSHIV3BEECからの2.6kb Nru I/Xba I断片を単離し、pBSHVS（実施例60で定義した）の3.0kb Nru I/Xba I断片に連結し、pBSHIV3BEECMを産生した。Nru IとXba Iでの切断により、H6プロモーターの３′側26bpおよびハンターンウイルスＳ配列を切除した。3.0kb Nru I/Xba I断片は、pBS−SKプラスミド中にH6プロモーターの５′側100bpを含有する。
pBSHIV3BEECMからの2.8kb Xba I/部分的Kpn I断片をXba I/Kpn Iで切断したpC5Lに連結し、pC5HIV3BEECを産生した。pBSHIV3BEECMからの2.7kb Nru I/Xba I断片をE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片でブラントエンドし、Nru I/Sma Iで切断したpSPHAH6に挿入し、pHAHIV3BEECを産生した。
治療ウイルスとしての、それぞれALVAC（CPpp）およびNYVAC（vP866）を用いた標準方法（ピッチーら、1987）により、挿入プラスミド、pC5HIV3BEECおよびpHAHIV3BEECを生体外組換え実験に用いた。HIV−１ env遺伝子に特異的な放射線標識プローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション分析（ピッチーニら、1987）により組換えプラークを同定した。３回の精製後に、組換えウイルスを増幅した。ALVACベースのHIV−１（III B）gp160（非開裂可能）をvCP126と称し、NYVACベースのものをvP1020と称した。
HIV血清陽性個体から集積したヒトの血清（CA、エメリービル、シロン社、K.ステイマーから得た）を用いてvP1020およびvCP126感染細胞について、前述した方法（テイラーら、1990）により、蛍光抗体法およびイムノプレシピテーション分析を行なった。蛍光抗体法の結果により、vCP126またはvP1020のいずれからに感染した細胞の表面上のHIV−１（III B）gp160（非開裂可能形状）の表面発現が示された。さらに、イムノプレシピテーションの結果により、熟成gp120およびgp41フレームにタンパク質分解的に開裂されなかったこれらの感染細胞中にHIV−１（III B）gp160の存在が示された。
HIV−１（III B）gp160の非開裂可能形状を追跡し、組換えウイルスを以下のようにして得た。
オリゴヌクレオチドHIVMN3P（配列認識番号389）
Figure 0003602530
およびHIVECA（配列認識番号399）
Figure 0003602530
を用いたpH6HMNEからのPCR増幅と続いてのPst IとXba Iでの切断により、Pst I/Xba I断片を得た。1061bp断片を、pBSHIVNNTからの391bp EcoR I/Pst I形状（下記）およびpH6HMNEからの4.2kb EcoR I/Xba I断片（実施例83に記載した）に連結した。産生したプラスミドをpBSHIVMNEEC1と称した。HIV env挿入物の配列分析により、１つのヌクレオチドが失われたことが示された。これを訂正するために、以下の操作を行なった。pH6HMNEからの4.6kb Sac I/Xba IによりpBSHIVMNEECが形成された。
pBSHIVMNEECからの2.6 Nru I/Xba I断片を挿入し、クレノウでブラントエンドし、Nru I/Sma Iで切断したpSPHAH6（実施例83で定義した）に挿入した。産生したプラスミドをpHAHIVMNEECと称した。pBSHIVMNEECからの2.6kb Nru I/XbaA I断片もNru I/Xba Iで切断したpVQH6C5LSP6（下記）に挿入し、pC5HIVMNEECを産生した。
挿入プラスミド、pHAHIVMNEECおよびpC5HIVMNEECを、治療ウイルスとしての、それぞれNYVAC（vP866）およびALVAC（CPpp）とともに、標準組換え実験（ピッチーニら、1987）に用いた。放射線標識したHIV env特異的DNAプローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション（ピッチーニら、1987）より、組換えウイルスを同定し、プラーク精製した。次いで精製した組換えウイルスを増幅した。HIV−１（MN）非開裂可能gp160を含有するNYVACベースの組換え体をvP1078と称し、ALVACのものをvCP144と称した。
vCP126およびvP1078の発現分析を上述したように行なった。これらの結果により、発現は、質的にHIV−１（III B）対照物、vP1020およびvCP126と等しいことが分かった。
実施例86−ALVACおよびNYVACによるHIV−１ envの非開裂可能分泌形状の発現
タンパク質分解的に開裂されず、遺伝子産生物のカルボキシ末端の近くの膜内外配列の除去により分泌されるHIV−１（MN）envを発現するALVAC−およびNYVACベースの組換えウイルスを産生した。最初にpH6HMNE（実施例83に定義した）からのこれらの配列をオリゴヌクレオチドHIVECA（配列認識番号399）およびHIVMNT1（配列認識番号400）
Figure 0003602530
を用いて増幅し、続いてPst I（５′末端）およびXba I（３′末端）での切断により502bp Pst I/Xba I断片を得た。この断片は、ヌクレオチド7219から7808に対応する（ラトナーら、1985）。この断片は、env発現カセッテの３′末端として作用する。それ自体、env遺伝子産生物は、膜内外領域が欠如し、オリゴヌクレオチド（配列認識番号400）により提供される終止コドンにより終止せしめられ、オリゴヌクレオチドHIVECA（配列認識番号399）を用いて提供された511（上記）でのアミノ酸変化により開裂されない。この502bp断片を、オリゴヌクレオチドHIV3B1（配列認識番号144）およびHIVECB（配列認識番号398）、並びにpH6HMNEに対する4.2kb EcoR I/Xba I断片を用いたPCRによりpH6HMNEから誘導した391bp EcoR I/Pst I断片に、この502bp断片を連結した。産生したプラスミドをpBSHIVMNTと称した。
pBSHIVMNTからの2.2kb Xba I/部分的Kpn I断片を単離し、Xba IとKpn Iで切断したpC5Lに挿入した。産生したプラスミドをpC5HIVMNTと称した。pBSHIVMNTから2.1kb Nru I/Xba I断片を単離することにより、NYVAC挿入プラスミドを誘導した。次いで、この断片を2mMのdNTPの存在下でE.coli DNAポリメラーゼのクレノウ断片によりブラントエンドし、Nru IとSma Iで切断したpSPHAH6に挿入し、pHAHIVMNTを産生した。
挿入プラスミド、pC5HIVMNTおよびpHAHIVMNTを、治療ウイルスとしての、それぞれALVAC（CPpp）およびNYVAC（vP866）とともに標準組換え実験（ピッチーニら、1987）に用いた。放射線標識したHIV env特異的プローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション（ピッチーニら、1987）により組換えウイルスを同定した。増幅の前に、組換えウイルスに３回の精製を行なった。ALVACベースのHIV−１（MN）env（非開裂可能；分泌）をvCP120と称し、NYVACのものをvP944と称した。
前述した方法により（テイラーら、1990）、HIV血清陽性個体から集積したヒト血清を用いて、vCP120およびvP944感染細胞に関してイムノプレシピテーションを行なった。vCP120およびvP994の両者は、非開裂可能、切形遺伝子産生物と一致する分子量を有するHIV−１（MN）env特異的遺伝子産生物を発現した。さらに、vCP120およびvP994感染細胞培養からの細胞不含有培地のイムノプレシピテーションにより、このenv遺伝子産生物の分泌が示された。
HIV−１（III B）envに関して同様の構成を操作した。これを行なうために、以下の操作を行なった。最初にpH6HIIIBE（実施例18に定義した）からのこれらの配列を、オリゴヌクレオチドHIVECA（配列認識番号399）およびHIV3BT（配列認識番号401）
Figure 0003602530
を用いて増幅し、続いてPst IとXba Iでの切断により487bp Pst I/Xba I断片を得た。pBSHIV3BEECから397bp EcoR I/Pst I断片を単離して、pH6HIIIBEMから4.2kb EcoR I/Xba I断片を単離した。これの３つの断片をともに連結し、pBSHIV3BT1を産生した。
pBSHIV3BEECMのHind III/Xba I切断により誘導した2.1kbおよび2.9kb断片をpBSHIV3BT1からの105bp Hind III/Xba I断片に連結し、pBSHIV3BTを産生した。このプラスミドをNru IとXba Iで切断し、2.1kb断片を切除した。この断片をブラントエンドし、Nru IとSma Iで切断したpSPHAH6に挿入し、pHAHIV3BTを産生した。
プラスミドpHAHIV3BTを、治療ウイルスとしてのNYVAC（vP866）とともに、上述したように組換え実験に用いた。組換えウイルスを同定し、上述したように精製し、産生した組換え体をvP1036と称した。この組換え体はvCP120およびvP994に関して上述した発現特徴全てを有した。
実施例87−NYVACおよびALVACにより膜内外配列により固定されたHIV−１（MN）の発現
gp120をコードするenv領域を親水性膜内外配列をコードする領域に融合するために、以下の操作を行なった。オリゴヌクレオチドHIV3B1（配列認識番号144）およびHIVMN18（配列認識番号402）
Figure 0003602530
を用いてpH6HMNEからPCRにより、gp120暗号配列の３′側領域に対応する200bp断片を誘導した。オリゴヌクレオチドHIV3B1（配列認識番号144）およびHIVTM3（配列認識番号405）
Figure 0003602530
をも用いて、PCRによりこの断片を、アニールしたオリゴヌクレオチドHIVTM1（配列認識番号403）
Figure 0003602530
およびHIVTM2（配列認識番号404）
Figure 0003602530
に融合した。オリゴヌクレオチドHIVTM1（配列認識番号403）およびHIVTM2（配列認識番号404）は、ヌクレオチド7850から7934に対応し（ラトナーら、1985）、HIV env親水性固定配列をコードする領域を示す。HIVTM3（配列認識番号405）による融合は、終止コドンおよび３′Xba I部位を有する最後のカセッテの３′末端を操作する。誘導断片をEcoR I/Xba Iで切断し、EcoR IとXba Iで切断したpH6HMNEに連結し、pBSHIVMN120Tを産生した。
H6プロモーターの３′側の26bpおよび全縁HIV−１カセッテを含有する、1.7kb Nru I/Xba I断片を単離し、pVQH6C5LSP6からの5.1kb Nru I/Xba I断片に挿入し、pC5HIVMN120Tを単離した。pVQH6C5LSP6を以下のように誘導した。
pC5LSP（実施例66で定義した）をBamH Iで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドCP32（配列認識番号406）
Figure 0003602530
およびCP33（配列認識番号407）
Figure 0003602530
に連結してpVQC5LSP6を産生した。
pBSHINMN120Tからの1.7kb Nru I/Xba I断片もまたブラントエンドし、Nru IとSma Iで切断したpSPHAH6に挿入した。産生したプラスミドをpHAHIVMN120Tと称した。
挿入プラスミド、pC5HIVMN120TおよびpHAHIVMN120Tを、治療ウイルスとして、それぞれALVACおよびNYVACとともに、標準組換え実験（ピッチーニら、1987）に用いた。放射線標識したHIV−１ gp120特異的DNAプローブを用いた標準プラークハイブリダイゼーション（ピッチーニら、1987）により、組換えウイルスを同定し、精製した。純粋な個体群を増幅し、ALVACベースの固定した（anchored）HIV−１（MN）gp120組換え体をvCP138と称した。NYVACベースのものをvP1035と称した。
標準方法により（テイラーら、1990）、蛍光抗体法およびイムノプレシピテーション分析を行ない、vP138およびvP1035感染細胞中のHIV−１（MN）固定gp120の発現を評価した。HIV血清陽性個体から集積したヒト血清（CA、エメリービル、シロン社、Dr.K.ステイマーから得た）を用いて、アッセイを行なった。
表面蛍光抗体法の探求により、vCP138およびvP1035感染細胞が形質膜中にHIV−１（MN）gp120を含有したことが分かった。特に、vCP138およびvP1035感染細胞の表面染色は、gp160または非固定gp120を発現する組換えウイルス（すなわち、vCP125、vCP124、vP1004、およびvP1008）に感染した細胞と比較して、著しく増大した。イムノプレシピテーション分析からの結果により、vCP138およびvP1035感染細胞の発現、および発現された産生物が予期した分子質量であったことが確認された。
実施例88−NYVAC/HIV−１ GAG（プロテアーゼ−）組換え体の産生
１型ヒト免疫不全ウイルス（HIV−１）cDNA配列を含有するプラスミド、pHXB2DはDr.R.C.ガロ（NCI−NIH）（NCI−NIH）から得た。gag遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、gag遺伝子の５′末端を含有する、pHXB2Dの1,625bp Bgl II断片をpSD542（実施例32に定義した）の4,075bp Bgl II断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生されたプラスミドをpHIVG2と称した。
次いでgag遺伝子の３′末端をgag遺伝子の残りの下流にクローニングした。これは、gag遺伝子の３′末端を含有する280bp Apa I−BamH I PCR断片を、pHIVG2の5,620bp Apa I−BamH I断片にクローニングすることにより行なった。このPCR断片は、オリゴヌクレオチドHIVP5（配列認識番号408）
Figure 0003602530
およびHIVP6（配列認識番号409）
Figure 0003602530
を有するプラスミド、pHXB2Dから産生した。この操作により産生したプラスミドをpHIVG3と称した。
次いでI3Lプロモーターをgag遺伝子の上流にクローニングした。これは、ワクシニアウイルスI3Lプロモーターおよびgag遺伝子の５′末端をコードするオリゴヌクレオチド、HIVL17（配列認識番号410）
Figure 0003602530
およびHIVL18（配列認識番号411）
Figure 0003602530
を、pHIVG3の5,540bp部分的Bgl II−Cla I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIVG4と称した。
pHIVG4を、治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに組換え実験に用いてvP969を産生した。イムノプレシピテーション分析を行なって、vP969が真正HIV−１ gag前駆体タンパク質を発現するか否かを測定した。ベロ細胞単層を、疑似感染したか、10PFU/細胞のm.o.i.で親ウイルスに感染せしめたか、またはvP969に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞を、２％の胎児ウシ血清および［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％のNP−40、30mMのトリス（pH7.4）、3mMのEDTA、0.03％のNa Azideおよび0.6mg/mlのPMSF）の添加と続いて細胞単層の削り取りにより、細胞を感染から18時間後に収穫した。
HIV−１血清陽性個体から集積した血清（CA、エメリービル、シロンから得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物をHIV−１ gag前駆体発現について分析した。血清を、vP866感染ベロ細胞で前吸着した。前吸着した血清を、４℃での一晩のインキュベーションによりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間後、材料を４回１×の緩衝液Ａで洗浄した。次いで、通常ヒト血清およびタンパク質Ａセファロースで前洗浄した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合したHIV−１血清陽性ヒト血清とともに４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、LiCl2/尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリ緩衝液（125mMのトリス（pH6.8）、４％のSDS、20％のグリセロール、10％の２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。タンパク質を10％のドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）上で分画し、固定し、フルオログラフィーのために1MのNa−サリチル酸塩で処理した。
HIV−１血清陽性個体からのヒト血清は、vP969感染細胞からのHIV−１ gag前駆体タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはNYVAC感染細胞からはHIV−１特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
実施例89−NYVAC/HIV−１ gag/pol組換え体の産生
gag遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。このは、gag遺伝子の５′末端を含有する、pHXB2Dの1,625bp Bgl II断片をpSD542（実施例32に定義した）の4,075bp Bgl II断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIVG2と称する。
次いでgag遺伝子の３′末端をpHIVG2にクローニングした。これは、gag遺伝子の３′末端を含有する、280bp Apa I−BamH I PCR断片をpHIVG2の5,620bp Apa I−BamH I断片にクローニングすることにより行なった。このPCR断片は、オリゴヌクレオチド、HIVP5（配列認識番号408）およびHIVP6（配列認識番号409）を有するプラスミド、pHXB2Dから産生した。この操作により産生したプラスミドをpHIVG3と称する。
次いでI3Lプロモーターをgag遺伝子の上流にクローニングした。これは、ワクシニアウイルスI3Lプロモーターおよびgag遺伝子の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、HIVL17（配列認識番号410）およびHIVL18（配列認識番号411）をpHIVG3の5,540bp部分的Bgl II−Cla I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIVG4と称する。
次いでp24、p2、p7およびp6をコードするgag遺伝子の部分を除去した。これは、オリゴヌクレオチド、HIVL19（配列認識番号412）
Figure 0003602530
およびHIVL20（配列認識番号413）
Figure 0003602530
をpHIVG4の4,450bp部分的Pvu II−BamH I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIVG5と称した。
pol遺伝子と同様に、gag遺伝子の残りをp17「遺伝子」の下流にクローニングした。これは、gag遺伝子のほとんどおよびpol遺伝子の全てのを含有する、pHXB2Dの4,955bp Cla I−Sal I断片をpHIVG5の4,150bp Cla I−Sac I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIVG6と称する。
次いで外来３′非暗号配列を除去した。これは、pol遺伝子の３′末端を含有する、360bp Afl II−BamH I PCR断片を、pHIVG6の8,030bp Afl II−BamH I断片にクローニングすることにより行なった。このPCR断片は、オリゴヌクレオチド、HIVP7（配列認識番号414）
Figure 0003602530
およぴHIVP8（配列認識番号415）
Figure 0003602530
を有するプラスミドpHXB2Dから産生した。この操作により産生したプラスミドをpHIVG7と称する。
pHIVG7を、治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに組換え実験に用いてvP989を産生した。
上述したように、HIV−１ gag前駆体タンパク質の発現に関して、vP989感染細胞にイムノプレシピテーションを行なった。疑似感染細胞またはNYVAC感染ベロ細胞からはHIV−１特異的種は沈殿しなかった。しかしながら、vP989感染細胞からの溶解産物からは、gag前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間帯と熟成gag開裂産生物が沈殿した。
実施例90−NYVAC/HIV−１ gag/polおよびenv（gp120）組換え体の産生
gag遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したようにプラスミドpHIVG7を調製することにより行なった（実施例89参照）。
pHIVG7を、治療ウイルスとしてのvP921とともに組換え実験に用いて、vP991を産生した。
HIV gag前駆体タンパク質の発現に関して、前述したように、vP991感染細胞のイムノプレシピテーションを行なった。疑似感染ベロ細胞からはHIV特異的種は沈殿しなかった。しかしながら、vP991感染細胞の溶解産物からは、envおよびgag前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体とじゅくせいgag開裂産生物が沈殿した。
実施例91−NYVAC/HIV−１ gag/polおよびenv（gp160）組換え体の産生
gag遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したように、プラスミドpHIVG7を産生することにより行なった（実施例89参照）。
pHIVG7を治療ウイルスとしてのvP911（上記）とともに組換え実験に用いてvP990を産生した。
前述したように、HIV−１ gag前駆体タンパク質の発現に関して、vP990感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞からはHIV01特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vP990感染細胞の溶解産物からは、envおよびgag前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体とじゅくせいgag開裂産生物が沈殿した。
実施例92−NYVAC/HIV−１ p17、p24組換え体の産生
HIV−１ cDNA配列を含有するプラスミドpHXB2DをDr.R.C.ガロ（NCI−NIH）から得た。gag遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したようにpHIVG5を調製することにより行なった（実施例89参照）。
次いでp24「遺伝子」の３′末端をpHIVG5にクローニングした。これは、p24「遺伝子」の３′末端を含有する、660bpのSal I−BamH I PCR断片をpHIVG5の4,450bp Sal I−BamH I断片にクローニングすることにより行なった。このPCR断片は、オリゴヌクレオチド、HIVP25（配列認識番号416）
Figure 0003602530
およびHIVP26（配列認識番号417）
Figure 0003602530
を有する、プラスミドpHXB2Dから産生した。この操作により産生したプラスミドをpHIVG8と称した。
次いで昆虫ポックス42kdプロモーターをp24「遺伝子」の上流にクローニングした。これは、昆虫ポックス42kdプロモーターおよびp24「遺伝子」の５′末端をコードする、オリゴヌクレオチド、HIVL21（配列認識番号418）
Figure 0003602530
およびHIVL22（配列認識番号419）
Figure 0003602530
をpHIVG8の5,070bp Xho I−Nsi I断片に挿入した。この操作により産生したプラスミドをpHIVG9と称する。
pHIVG9を、治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに組換え実験に用いてvP970を産生した。
前述したように、HIV−１ gag前駆体タンパク質の発現に関して、vP970感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはNYVAC感染ベロ細胞からは、HIV−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vP970感染細胞の溶解産物からはp24に対応するタンパク質種が沈殿した。
実施例93−NYVAC/HIV−１ p17、p24およびenv（gp120）の組換え体の産生
HIV−１ cDNA配列を含有する、プラスミドpHXB2DをDr.R.C.ガロ（NCI−NIH）から得た。gag遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したようにpHIVG9を調製することにより行なった（実施例92参照）。
pHIVG9を、治療ウイルスとしてのvP921とともに組換え実験に用いてvP973を産生した。
前述したように、HIV−１ gag前駆体タンパク質の発現に関して、vP973感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞からは、HIV−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vP973感染細胞の溶解産物からはp24に対応するタンパク質種が沈殿した。
実施例94−NYVAC/HIV−１ p17、p24およびenv（gp160）組換え体の産生
HIV−１ cDNA配列を含有する、プラスミドpHXB2DをDr.R.C.ガロ（NCI−NIH）から得た。gag遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したようにpHIVG9を調製することにより行なった（実施例92参照）。
pHIVG9を、治療ウイルスとしてのvP911とともに組換え実験に用いてvP971を産生した。
前述したように、HIV−１ gag前駆体タンパク質の発現に関して、vP971感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞からは、HIV−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vP971感染細胞の溶解産物からはenvおよびp24に対応するタンパク質種が沈殿した。
実施例95−NYVAC/HIV−１ gag（プロテアーゼ−）およびenv（切形の）組換え体の産生
HIV−１ cDNA配列を含有するプラスミドpHXB2DをDr.R.C.ガロ（NCI−NIH）から得た。gag遺伝子の５′末端をコードする配列を、ワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、最初に、前述したようにpHIVG9を調製することにより行なった（実施例89参照）。
次いでH6プロモートした切形HIV−１エンベロープ遺伝子をpHIVG4に挿入した。これは、H6プロモートした切形HIV−１エンベロープ遺伝子を含有する、pHIVE10のE.coli DNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）充填1,600bp Xho I−Not I断片を、pHIVG4の充填BamH I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIVGE11と称する。
pBSHIV3BCDT1からのSac I/部分的Kpn I断片をpIBI25（CT、ニューハブン、IBI）の多重クローニング領域に挿入することとによりプラスミドpHIVE10を誘導した。プラスミドpBSHIV3BCDT1は、HIV−１（III B）エンベロープ（アミノ酸１から447;ラトナーら、1985）の著しく切形された形状を発現するH6プロモートされたカセッテを含有する。V3ループ領域とT1エピトープを保持しながらCD4結合を除去するために、このカセッテの発現を評価した。
pBSHIV3BCDT1を構成するために、以下の操作を行なった。オリゴヌクレオチドHIV3B2A（配列認識番号397）およびHIVCD4A（配列認識番号420）
Figure 0003602530
を用いてpH6HIIIBE（実施例18で定義した）から200bpのPCR誘導断片を増幅した。オリゴヌクレオチドHIV3B2A（配列認識番号397）およびHIVTM3（配列認識番号405）を用いてPCRにより、この断片を、アニールしたオリゴヌクレオチドHIVTM1（配列認識番号403）およびHIVTM2（配列認識番号404）に融合した。HIV−１ env膜内外アンカー（アミノ酸691から718;ラトナーら、1985）、翻訳終止コドン（TAA）、および３′Xba I部位をコードする配列を配することにより、これらの操作で切形envカセッテの３′末端を産生した。このPCR融合産生物をEcoR IとXba Iで切断し、243bpの断片を産生した。この断片をpH6HIIIBEの4.5bp EcoR I/Xba I断片に連結し、pBSHIV3BCDT1を産生した。
pHIVGE11を、治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに組換え実験に用いてvP979を産生した。
前述したように、HIV−１ gag前駆体タンパク質の発現に関して、vP979感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはNYVAC感染ベロ細胞からは、HIV−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vP979感染細胞の溶解産物からはenvおよびgag前駆体タンパク質に対応するタンパク質種が沈殿した。
実施例96−NYVAC/HIV−１ gag/polおよびenv（切形）組換え体の産生
gag遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスtkフランキングアームの間に挿入した。これは、前述したように最初にプラスミドpHIVG7を調製することにより行なった（実施例89参照）。
次いでH6プロモートした切形HIV−１エンベロープ遺伝子をpHIVG7に挿入した。これは、H6プロモートした切形HIV−１エンベロープ遺伝子を含有する、pHIVE10（実施例95に定義した）のE.coli DNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）充填1,600bp Xho I−Not I断片を、pHIVG7の充填BamH I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIVGE12と称する。
pHIVGE12を、治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに組換え実験に用いてvP978を産生した。
前述したように、HIV−１ gag前駆体タンパク質の発現に関して、vP978感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはNYVAC感染ベロ細胞からは、HIV−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vP978感染細胞の溶解産物からはenvおよびgag前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成gag開裂産生物が沈殿した。
実施例97−NYVAC/HIV−１ gag/polおよびenv（gp120）組換え体の産生
gag遺伝子をコードする配列をワクシニアウイルスtkフランキングアームの間に挿入した。これは、前述したように最初にプラスミドpHIVG7を調製することにより行なった（実施例89参照）。
次いでI3Lプロモートしたgagおよびpol遺伝子をカナリヤポックス挿入ベクターに挿入した。これは、I3Lプロモートしたgagおよびpol遺伝子を含有する、pHIVG7の4,360bp部分的Bgl II−BamH I断片をpVQH6CP3LのBamH I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIVGE14と称する。
次いでH6プロモートしたHIV−１（MN）エンベロープ（gp120）遺伝子をpHIVGE14に挿入した。これは、オリゴヌクレオチド、HIVL29（配列認識番号421）
Figure 0003602530
およびHIVL30（配列認識番号422）
Figure 0003602530
並びにH6プロモートしたgp120遺伝子を含有する、pBSHIVMN120の1,600bp Nru I−Not I断片を、pHIVGE14の11,500bp Nru I−Nho I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIVGE15と称する。
次いで、H6プロモートしたエンベロープ（gp120）遺伝子およびI3Lプロモートしたgagとpol遺伝子をワクシニアウイルス挿入ベクターに挿入した。これは、H6プロモートしたgp120遺伝子およびI3Lプロモートしたgagとpol遺伝子を含有する、pHIVGE15の6,400bp Not I−BamH I断片をpSD542VCVQの4,000bp Not I−Bgl II断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIVGE16と称する。
pHIVGE16を、治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに組換え実験に用いてvP988を産生した。
前述したように、HIV−１ gag前駆体タンパク質の発現に関して、vP988感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはNYVAC感染ベロ細胞からは、HIV−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vP988感染細胞の溶解産物からはenvおよびgag前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成gag開裂産生物が沈殿した。
実施例98−NYVAC/HIV−１ gag/polおよびenv（gp160）組換え体の産生
gag遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように最初にプラスミドpHIVGE16を調製することにより行なった（実施例97参照）。
次いでgp160遺伝子により、gp120遺伝子を置換した。これは、全縁HIV−１（MN）エンベロープ（gp160）遺伝子を含有する、pH6HMNEの2,600bp Nru I−Not I断片をpHIVGE16の8,000bp部分的Nru I−Not I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIVGE19と称する。
pHIVGE19を、治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに生体外組換え実験に用いてvP1009を産生した。
前述したように、HIV−１ gag前駆体タンパク質の発現に関して、vP1009感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはNYVAC感染ベロ細胞からはHIV−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vP1009感染細胞からは、envおよびgag前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成gag開裂産生物が沈殿した。
実施例99−ALVAC/HIV−１ gag/polおよびenv（GP120）組換え体の産生
gag遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように最初にプラスミドpHIVGE15を調製することにより行なった（実施例97参照）。
pHIVGE15を治療ウイルスとしてのCPpp（ALVAC）とともに組換え実験に用いてvCP117を産生した。
イムノプレシピテーション分析を行なって、vCP117が真正HIV−１ gagおよびenv遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。CEF細胞単層を、疑似感染せしめたか、10PFU/細胞のm.o.i.で親ウイルスに感染せしめたか、またはvCP117に感染せしめた。１時間の吸着期間後、接種物を吸引し、細胞を、２％の胎児ウシ血清および［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％のNP−40、30mMのトリス（pH7.4）、3mMのEDTA、0.03％のNa Azideおよび0.6mg/mlのPMSF）と続いての細胞単層の削り取りにより、細胞を感染から18時間後に収穫した。
HIV−１血清陽性個体からの血清（ニューヨーク州保険省から得た）を用いてHIV gagおよびenv遺伝子発現に関して感染細胞から溶解産物を分析した。血清をCPpp感染CEF細胞で前吸着せしめた。前吸着した血清を４℃で一晩のインキュベーションによりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間後、材料を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常のヒト血清とタンパク質Ａセファロースで前浄化した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合したHIV−１血清陽性ヒト血清により４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション後、試料を１×緩衝液Ａで４回、LiCl2/尿素緩衝液で２回洗浄した。２×ラエムリ緩衝液（125mMのトリス（pH6.8）、４％のSDS、20％のグリセロール、10％の２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により免疫複合体から沈殿したタンパク質を分離した。タンパク質を10％のドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）上で分画し、固定し、フルオログラフィーのために1M Na−サリチル酸塩で処理した。
HIV−１血清陽性個体からのヒト血清は、vCP117感染細胞からはHIV−１ gagおよびenvタンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはCPpp感染細胞からはHIV−１特異的タンパク質は沈殿せしめなかった。
実施例100−ALVAC/HIV−１ gag/polおよびenv（gp160）組換え体の産生
gag遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように最初にプラスミドpHIBGE15を調製することにより行なった（実施例97参照）。
次いでgp120をgp160で置換した。これは、全縁HIV−１（MN）エンベロープ（gp160）遺伝子を含有する、pH6HMNEの2,600bp Nru I−Not I断片をpHIVGE15の9,800bp Nru I−Not I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIVGE18と称する。
次いで前の工程で欠損したカナリヤポックスフランキングアームをpHIVGE18にクローニングした。これは、C3フランキングアームを含有する、pHIVGE15の1,500bp Not I断片を、pHIVGE18の12,400bp Not I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIVGE20と称する。
pHIVGE20を治療ウイルスとしてのCPpp（ALVAC）とともに組換え実験に用いてvCP130を産生した。
イムノプレシピテーション分析を行なって、vCP130がHIV−１ gagおよびenv遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。CEF細胞単層を、疑似感染せしめたか、10PFU/細胞のm.o.i.で親ウイルスに感染せしめたか、またはvCP130に感染せしめた。１時間の吸着時間後、接種物を吸引し、細胞を、２％の胎児ウシ血清と［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％のNP−40、30mMのトリス（pH7.4）、3mMのEDTA、0.03％のNa Azideおよび0.6mg/mlのPMSF）の添加と続いての細胞単層の削り取りにより、細胞を感染から18時間後に収穫した。
HIV−１血清陽性個体から集積した血清（CA、エメリービル、シロンから得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物を、HIV−１ gagおよびenv遺伝子発現に関して分析した。血清をCPpp感染CEF細胞で前吸着せしめた。前吸着した血清を４℃での一晩のインキュベーションによりタンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで、通常のヒト血清とタンパク質Ａセファロースで前浄化した溶解産物を、タンパク質Ａセファロースに結合したHIV−１血清陽性ヒト血清により４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、LiCl2/尿素緩衝液で２回洗浄した。２×ラエムリ緩衝液（125mMのトリス（pH6.8）、４％のSDS、20％のグリセロール、10％の２−メルカプトエタノール）の添加および５分間の沸騰により、沈殿したタンパク質を免疫複合体から分離した。10％のドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）上で分画し、固定し、フルオログラフィーのために1MのNa−サリチル酸塩で処理した。HIV−１血清陽性個体からのヒト血清は、vCP130感染細胞からHIV−１ gagおよびenvタンパク質を沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはCPpp感染細胞からはHIV−１特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
実施例101−ALVAC/HIV−１ gag/pol組換え体の産生
HIV−１ cDNA配列を含有する、プラスミドpHXB2Dを、Dr.R.C.ガロ（NCI−NIH）から得た。gag遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように最初にプラスミドpHIVG7を調製することにより行なった（実施例89参照）。
次いで、gagおよびpol遺伝子をカナリヤポックスフランキングアームの間にクローニングした。これは、I3Lプロモートしたgagおよびpol遺伝子、並びにオリゴヌクレオチド、HIV2L6（配列認識番号423）
Figure 0003602530
とHIV2L7（配列認識番号424）
Figure 0003602530
を含有する、pHIVG7の4,400bp Sma I−Not I断片をpSPCP3LのSma I−Xho I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIVG24と称する。
pHIVG24を、治療ウイルスとしてのCPpp（ALVAC）とともに組換え実験に用いてvCP152を産生した。
前述したようにHIV−１ gagおよびenvタンパク質の発現に関して、vCP152感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染またはALVAC感染細胞からは、HIV−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vCP152感染細胞の溶解産物からは、gag前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成gag開裂産生物が沈殿した。
実施例102−ALVAC/HIV−１ gag/polおよびenv（切形）組換え体の産生
HIV−１ cDNA配列を含有する、プラスミドpHXB2Dを、Dr.R.C.ガロ（NCI−NIH）から得た。gag遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように、最初にプラスミドpHIVG24を調製することにより行なった（実施例101参照）。
pHIVG24を、治療ウイルスとしてのvCP120とともに組換え実験に用いてvCP155を産生した。
前述したようにHIV−１ gagおよびenvタンパク質の発現に関して、vCP155感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染細胞からは、HIV−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vCP155感染細胞の溶解産物からは、envおよびgag前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成gag開裂産生物が沈殿した。
実施例103−ALVAC/HIV−１ gag/polおよびenv（膜内外アンカーを有するgp120）組換え体の産生
HIV−１ cDNA配列を含有する、プラスミドpHXB2Dを、Dr.R.C.ガロ（NCI−NIH）から得た。gag遺伝子の５′末端をコードする配列をワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように、最初にプラスミドpHIVG24を調製することにより行なった（実施例101参照）。
pHIVG24を、治療ウイルスとしてのvCP138とともに組換え実験に用いてvCP156を産生した。
前述したようにHIV−１ gagおよびenvタンパク質の発現に関して、vCP156感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染細胞からは、HIV−１特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vCP156感染細胞の溶解産物からは、envおよびgag前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成gag開裂産生物が沈殿した。
HIV−１ gag特異的遺伝子産生物単体またはワクシニアウイルスによりenvとの組合せのいずれかの発現は、非感染ウイルス状粒子の産生となることが示されている（ハッファーら、1990;フら、1990）。このバックグラウンドに関して、HIV−１ gag−polおよびenv遺伝子を発現するALVACベースの組換え体に感染した細胞もまたそのような粒子を産生するか否かを探求した。さらにこれらのALVACべーす組換え体から非アビアン細胞（すなわち、ベロ、MRC−５、等）を感染せしめるのに用いられる場合、いかなるHIV−１ウイルス状粒子がポックスウイルスビリオン不純物もなく精製できた。
vCP156に感染したベロ細胞を用いた粒子形成を評価するために、以下の実験を行なった。ベロ細胞を約5pfu/細胞のm.o.i.で感染せしめた。24感染期間後、上澄みを収穫し、2000rpmでの10分間の遠心分離により浄化した。次いで上澄みを、30,000kDaの分子量をカットオフするフィルターを通じて回転せしめた。それゆえ、小さな分子はこれらのフィルターを通過する。HIV血清陽性個体から集積したヒト血清（ニューヨーク州、保険省、Dr.J.コーニーから得た）を用いて、標準ウエスターンブロット分析により、フィルターに保持された物質を分析した。ウエスタンブロット分析の結果により、フィルターに保持された物質中に主要コアタンパク質p24およびHIV−１（MN）固定gp120の存在が示された。上述したサイズ排除に関して、p24が高等構造立体配置（すなわち、ウイルス状粒子）になければ、p24はそのフィルターを通過する。それゆえ、これらの結果は強く、gp120エンベロープ成分を含有するHIV−１ウイルス状粒子はvCP156感染細胞中で産生されることを示唆している。
実施例104−ALVACおよびNYVAC中のHIV−１ env遺伝子のT1、T2,、およびTH4.1エピトープの発現
組換えポックスウイルスvP1062およびvCP146を産生して、個々のペプチドとしてHIV−１ envのT1、T2、およびTH4.1エピトープを発現した（ホスマリンら、1991）。
プラスミドp731T1の構成
プラスミドpMPI3Hは、pUC8バックグラウンド中にワクシニアI3L初期／中間プロモーター要素（シュミットおよびスタネンベルグ、1988;ホスおよびスタネルベルグ、1988）を含有する。テンプレートとしてのpMPVC1、ワクシニアHind III Ｉのサブクローンおよびプライマーとして、合成オリゴヌクレオチドMPSYN283（配列認識番号425）
Figure 0003602530
とMPSYN287（配列認識番号426）
Figure 0003602530
を用いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により、プロモーター要素を合成した。この反応からのDNAをHind IIIとRsa Iで切断し、プロモーター要素を含有する0.1kb断片を精製した。補体合成オリゴヌクレオチドMPSYN398（配列認識番号427）
Figure 0003602530
とMPSYN399（配列認識番号428）
Figure 0003602530
をアニーリングすることにより、リンカー領域を組み立てた。PCR誘導プロモーター要素およびポリリンカー領域を、Hind IIIとPst Iで切断したベクタープラスミドpUC8と連結した。産生したプラスミド、pMPI3Hは、開始コドンに対して位置−100から−６までのI3Lプロモーター領域と続いての、Hpa I、Pst I、Sal I、BamH I、Sma IおよびEcoR I部位を含有するポリリンカー領域を含有する。Hpa Iでの開裂により、プロモーター中の位置−６で線状化されたブラントエンドのDNAが産生される。
補体オリゴヌクレオチドT1C（配列認識番429）
Figure 0003602530
およびT1N（配列認識番号430）
Figure 0003602530
をHpa IとBamH Iで切断したプラスミドpMPI3Hに連結することにより、ワクシニアI3Lプロモーターに誘導されたT1ペプチドを含有するカセッテを産生した。この連結は、プロモーターの最後の５塩基対を再構成し、T1ペプチドの完全暗号配列を提供し、終止コドンとBamH I部位の間にXho I部位を産生する。これがプラスミドp731T1である。ヌクレオチド配列分析により断片の配列を確認した。
プラスミドpH6T2の構成
ワクシニアH6プロモーターによりドライブされたT2ペプチドを含有するカセッテを２工程で産生した:PCRおよびプライマーH6PCR1（配列認識番号364）とH6PCR2（配列認識番号365）を用いて、合成H6プロモーター（パーカスら、1989）を含有するプラスミドからEcoR V部位を通じるH6プロモーターを誘導し、５′Hind III部位を産生した。この122bp PCR誘導断片をHind IIIとEcoR Vで切断し、続いて同様に切断したpBS−SK＋（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結し、プラスミドpBSH6を産生した。EcoR V部位からのH6プロモーターの３′末端を完全にし、T2ペプチドをコードし、遺伝子の３′末端にBamH I部位を産生する補体オリゴヌクレオチドT2C（配列認識番号431）
Figure 0003602530
およびT2N（配列認識番号432）
Figure 0003602530
をアニールし、EcoR VとBamH Iで切断したpBSH6に連結した。このプラスミドをpH6T2と称し、ヌクレオチド配列分析により断片を確認した。
プラスミドpVQ42KTH4.1の産生
持続性PCR反応により、AmEPV 42KプロモーターによりドライブされたTH4.1ペプチドを含有するカセッテを産生した：プライマー42KVQ1（配列認識番号433）
Figure 0003602530
および42KVQ2（配列認識番号434）
Figure 0003602530
を用いて、42Kプロモーターの制御下で狂犬病糖タンパク質の遺伝子を含有するプラスミドである、プラスミドp42KRABIからPCRにより５′Pst IとSma I部位を有する107bp 42Kプロモーターを誘導した。このPCR誘導断片の107bpプロモーター領域の配列は（配列認識番号435）
Figure 0003602530
である。この断片と、テンプレートとしての、TH4.1ペプチドTH41C（配列認識番号436）
Figure 0003602530
およびTH41N（配列認識番号437）
Figure 0003602530
をコードする合成オリゴヌクレオチドと、プライマー42KTH41（配列認識番号438）
Figure 0003602530
および42KVQ1（配列認識番号433）とを用いて159bp PCR誘導断片を、第２のPCRでTH4.1の暗号配列に融合した。プライマー42KTH41（配列認識番号438）およびBAMVQ（配列認識番号441）
Figure 0003602530
を用いた第３のPCRのためにテンプレートとして合成オリゴヌクレオチドVQC（配列認識番号439）
Figure 0003602530
およびVQN（配列認識番号440）
Figure 0003602530
並びに断片を用いて、５′末端でBamH I部位を包含して、この210bp PCR誘導断片を５′末端に伸長した。続いてのヌクレオチド配列分析により、42KTH41の上記配列の下線により示したような位置24後に外来の塩基（Ａ）が挿入されているようなオリゴヌクレオチド42KTH41（配列認識番号438）の配列中のエラーが示された。これは、テンプレートとしてのBAMVQ入れ441）および42KTH41A（配列認識番号442）
Figure 0003602530
による第３のPCRから誘導した272bp断片を用いて最終PCで訂正した。最終PCR後、カセッテは、Xho IとBamH I部位３′を有する42K−TH4.1に対してBamH I、Pst I、およびSma I部位５′を含有した。この271bp PCR誘導断片をBamH Iで切断し、pBS−SK＋（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）のBamH I部位にクローニングし、プラスミドpVQ42KTH4.1を産生した。このプラスミドのヌクレオチド配列分析により、プロモーターと暗号領域の配列を正確であったことが確認された。しかしながら、3bpの欠損が生じ、３′BamH I部位の損失となった。
プラスミドpT1T2TH4.1の構成
これらの３つのカセッテを、I3L−T1が以下の方法の他の２つの遺伝子に対して反対方向となるように特異プラスミドpT1T2TH4.1に結合した:170bp Hind III/Xho I断片をp731T1から単離し、同様に切断したpH6T2に連結し、pT1T2を産生した。pVQ42KTH4.1からの290bp BamH I/Sac I断片を同様に切断したpT1T2に連結し、pT1T2TH4.1を産生した。挿入物の配列をヌクレオチド配列分析により確認した。
pC5LSP（実施例66に定義した）をEcoR Iで切断し、アルカリホスファターゼで処理し、Not Iで切断し線状精製して自己連結した自己アニールしたオリゴヌクレオチドCP29（配列認識番号363）
Figure 0003602530
に連結した。この方法によりNot I部位をpC5LSPに導入し、pNC5LSP5を産生した。
それぞれのプロモーターによりドライブされたエピトープの遺伝子を含有するpT1T2TH4.1からの602bp Xho I断片を、供与体プラスミドpNC5LSP5およびpSD550（実施例59で定義した）のXho I部位にクローニングした。ヌクレオチド配列分析を用いて挿入物の配列と配置を確認した。産生したプラスミドpC5T1T2TH4.1およびpI4T1T2TH4.1を、ALVACおよびNYVACとともに生体外組換え実験に用いて、それぞれ組換えウイルスvCP146およびvP1062を産生した。これらの組換えウイルスは、ウイルスプラークに対する特異的DNAプローブのハイブリダイゼーションにより所望の遺伝子を含有することが示された。
実施例105−HIV−１ envからの形質膜アンカードメイン有するものと有さないHIV−１ envのT1、T2、およびTH4.1エピトープを含有する２つの融合ペプチドの発現
組換えポックスウイルスvP1060、vP1061、vCP154およびvCP148を産生し、開裂可能リンカー領域によるHIV−１ envのT1、T2、およびTH4.1に対応する配列に結合したHIV−１ envからの信号配列からなる融合ペプチドを発現した。vP1060およびvCP154は、vP1061およびvCP148とは異なり、これは前者の組換えウイルスがHIV−１ envの形質膜領域に対応する配列とともに融合ペプチドを発現する点からである。
両方の融合ペプチドは、HIV−１（III B）envの51アミノ酸Ｎ末端部分、ラトナーら（1985）に基づく残留物１−50（開始Metを加える）を含有する。この信号領域（配列認識番号443）のアミノ酸配列は、
Figure 0003602530
である。これには、互いに信号から離れたT1、T2、およびTH4.1エピトープ（ホスマリンら、1991）、および存在する場合にはアンカー配列が続き、長さで５のアミノ酸までの開裂可能リンカー領域が続く。ペプチド（配列認識番号444）のこの領域のアミノ酸配列は、
Figure 0003602530
である。アンカードメインは、HIV−１（III B）envの28アミノ酸形質膜領域、残留物691−718である。この領域（配列認識番号445）のアミノ酸配列は、
Figure 0003602530
である。
融合ペプチドの両方のバージョンに関して、プライマーH6PCR1（配列認識番号364）およびPCRSIGT1（配列認識番号446）
Figure 0003602530
を用いてプラスミドpH6HIIIBEM（実施例18で定義した）からPCRによりH6プロモーターおよびHIV−１ env信号配列を誘導した。この314bp PCR誘導断片は、５′Hind III部位と続くH6プロモーターおよび信号、リンカー、並びにT1ペプチドの最初の６アミノ酸の暗号配列からなる。
プライマーPCRT1T2（配列認識番号449）
Figure 0003602530
およびPCRT4END（配列認識番号450）
Figure 0003602530
を用いてオリゴヌクレオチドT2T4A（配列認識番号447）
Figure 0003602530
およびT2T4TB（配列認識番号448）
Figure 0003602530
のPCR増幅により、形質膜領域のない構成の暗号領域の残りを産生した。この177bp PCR誘導断片は、T1ペプチド、リンカー領域、T2ペプチド、別のリンカー領域、およびTH4.1ペプチド、それに続く３′Xba I部位をコードする。この断片を、プライマーH6PCR1（配列認識番号364）およびPCRT4END（配列認識番号450）のPCRによりプロモーターおよび信号配列を含有する314bp PCR誘導断片と融合した。この473bp PCR誘導断片のHind IIIとXba Iでの切断の後、455bpの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切断したpBS−SKに連結し、ヌクレオチド配列分析により挿入物の配列を確認した。産生したプラスミドをpBST1T2TH4.1と称した。
プライマーPCRT1T2（配列認識番号449）およびPCRT4TM（配列認識番号451）
Figure 0003602530
を用いてオリゴヌクレオチド、T2T4A（配列認識番号447）およびT2T4TB（配列認識番号448）のPCR増幅により、形質膜アンカーを有するバージョンの暗号領域の残りを産生し、３′末端を変更して形質膜領域を収容した。この195bp PCR誘導断片を、プライマーPCRT1T2（配列認識番号449）およびPCRTMEND（配列認識番号450）を用いてアンカーからなるオリゴヌクレオチド、HIVTM1（配列認識番号403）およびHIVTM2（配列認識番号404）のPCRにより融合した。この276bp PCR誘導断片を、プライマーH6PCR1（配列認識番号364）およびPCRTMEND（配列認識番号450）のPCRによりプロモーターおよび信号配列を含有する314bp PCR誘導断片と融合した。この572bp PCR誘導断片のHind IIIおよびXba Iでの切断後、554bpの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切断したpBSに連結し、ヌクレオチド配列分析により挿入物の配列を確認した。産生したプラスミドをpBST1T2TH4.1Aと称した。
pC5LSP（実施例66に定義した）をBamH Iで切断し、アニールしたオリゴヌクレオチドCP32（配列認識番号406）およびCP33（配列認識番号407）に連結し、pVQC5LSP6を産生した。pVQC5LSP6をEcoR Iで切断し、アルカリホスファターゼで処理し、Not Iで切断し線状精製して自己連結した自己アニールしたオリゴヌクレオチドCP29（配列認識番号363）に連結した。この方法によりNot I部位をpVQC5LSP6に導入し、pNVQC5LSP7を産生した。
両カセッテを挿入プラスミドpNVQC5LSP7のXho IとXba I部位の間にそれぞれ配した。これらのプラスミドpC5ST1T1TH4.1およびpC5ST1T2TH4.1Aを用いて、それぞれC5座中にカナリヤポックスウイルス組換え体、vCP148およびvCP154を産生した。BamH I−Sma I断片をpC5ST1T1TH4.1およびpC5ST1T2TH4.1Aから切除し、同様に切断したpSD550（実施例59に定義した）に連結し、それぞれプラスミドpI4ST1T2TH4.1およびpI4ST1T1TH4.1Aを産生した。これらのプラスミドをNYVAのI4座のIVRに用いて、それぞれ組換え体vP1061およびvP1060を産生した。これらの組換え体は、ウイルスプラークに対する特異的DNAプローブのハイブリダイゼーションにより所望の遺伝子を含有することが示された。
実施例106−ALVAC、TROVAC、およびNYVAC中のHIV−１ nefの発現
HIV−１ nef（MN）を発現する、組換えポックスウイルスvP1084、vFP174、およびvCP168を以下のように産生した：
プライマーI3PCR1（配列認識番号452）
Figure 0003602530
およびPI3NEF2（配列認識番号453）
Figure 0003602530
を用いて、プラスミドpMPI3HからPCRによりI3Lプロモーターを誘導した。プライマーPI3NEF1（配列認識番号454）
Figure 0003602530
およびPNEFBAM（配列認識番号455）
Figure 0003602530
を用いて、pMN1.8−10（7792と9595でのSst I部位の間のMNゲノムのその部分のクローン）のPCR増幅により、nefの暗号領域を産生した。暗号領域とプロモーターとの融合は、プライマー（配列認識番号452）およびPNEFBAM（配列認識番号455）を用いて、以前のPCR産生物の増幅により行なった。この産生物のBamH Iでの切断後に、0.7kbの断片をアガロースゲルから単離し、同様に切断したpBS−SK＋（CA、ラジョラ、ストラタジェネ）に連結し、プラスミドpI3NEFを産生した。配列以上が最初に観察されたのがこの時点であった。プラスミドpMN1.8−10における以上のために、カセッテの配列は公表された配列（ガーゴら、1988、ゲンバンク承認番号M17449）とは異なると決定した。これらの違いは、公表された配列と比較して以下のように要約する。
Figure 0003602530
カセッテ中の２つのサイレント突然変異（位置8834と9127で）はPCR中で明確な誤差である。コードしたタンパク質には効果がないので、これらは存在し続けた。9930でのフレームシフトにより、他のHIV−１単離体をより密接に組み立てる伸長した読取り枠が生じる。NM単離体からのnefの公表されたサイズのままでいるには、このカセッテには暗号領域の切形３′末端を産生する第４のPCRが必要である。
位置9930での余分な塩基の除去は、プライマーI3PCR1（配列認識番号452）およびPNEFFIX1（配列認識番号456）
Figure 0003602530
によるpI3NEF中の挿入物のPCR増幅により行なった。この678bp PCR誘導断片のBamH Iでの切断後、660bpの断片をアガロースゲルから単離して、同様に切断したpBSに連結し、プラスミドpBSI3NEFを産生した。この挿入物をヌクレオチド配列分析により確認した。
nef遺伝子を含有するpBSI3NEFからの660bp BamH I断片を、挿入プラスミドpNVQC5LSP7（実施例105で定義した）のBamH I部位に配した。産生したプラスミドpC5I3NEFを、ALVACのC5座へのIVRに用いて、組換え体vCP168を産生した。また同一の660bp BamH I断片を、挿入プラスミドpSD550VC（実施例59で定義した）のBamH I部位に配し、プラスミドpI4I3NEFを産生した。NYVACを有するこのプラスミドに関するIVRにより組換え体vP1084を産生した。
TROVACのF16座の挿入プラスミドを以下のように誘導した。7.3kb Nae I/Nde I断片を、タータグリアら（1990）により記載した鶏痘ウイルスの10.5kb Hind III断片を含有するプラスミドから単離し、同様に切断したpUC9に連結し、プラスミドpRW866を産生した。
pUC9をPvu IIで切断し、EcoR IリンカーをPvu II部位の間に連結し、プラスミドpRW715を産生した。鶏痘配列を側腹に有するクローニング部位を、プライマーRW264（配列認識番号457）
Figure 0003602530
およびRW267（配列認識番号458）
Figure 0003602530
を有する10.5kb断片の部分のPCR増幅により産生した。隣接した領域もまた、プライマーRW266（配列認識番号459）
Figure 0003602530
およびRW265（配列認識番号460）
Figure 0003602530
を用いたPCRにより増幅した。これらのPCR誘導断片を、プライマーRW266（配列認識番号459）およびRW267（配列認識番号458）を用いた第３のPCRにより融合した。産生したPCR誘導断片は、５′EcoR I部位および３′Nde I部位を側腹に有する鶏痘配列からなる。この断片の中央は、Not I部位および６つの読取り枠中の翻訳終止コドンを側腹に有し、Sma I、BamH I、およびHind III部位を含有するポリクローニング領域である。初期転写終止信号（ユエンおよびモス、1987）は３′Not I部位に隣接している。EcoR IとNde Iで切断した、このPCR誘導断片を、同様に切断したpRW715に連結し、プラスミドpRW864を産生した。11kプロモートしたlac Ｚ遺伝子を、部分的なBamH Iの切断と全体的なPst Iの切断によりpAM1から切除した。この断片をクレノウポリメラーゼでブラントエンドし、Sma I切断したpRW864に連結し、pRW867Aを産生した。Not I部位が、Fsp I部位に連結される場合に再産生されるように、pRW867AからのNot I断片を、dNTPの存在下でクレノウポリメラーゼでブラントエンドし、挿入がタータグリアら（1990）により記載された位置1955に対応して行なわれるように部分的にFsp Iで切断されたpRW866に連結した。次いで産生したプラスミドpRW868をNot Iで切断し、lac Ｚカセッテを除去し、Not I切断により切除されたpRW864からの66bpポリリンカーに連結した。産生したプラスミドをpRW673と称した。81bp Sma I断片をpVQ42KTH4.1（実施例104で定義した）から誘導し、Sma I切断したpRW873に挿入し、プラスミドpVQ873を産生した。
nefカセッテを、pVQ873および続いてIVRによるTROVACのF16座への挿入のための684bp Hind III断片としてpBSI3NEFから切除し、vFP174を産生した。
実施例107−NYVAC中のHIV−２遺伝子の発現
NYVAC/HIV2 gag/pol組換え体の産生
２型ヒト免疫不全ウイルス（HIV2）gagおよびpol遺伝子を含有する、プラスミド、pISSYEGPをDr.G.フランチーニ（NCI−NIH）から得た。このプラスミドからのgagおよびpol遺伝子を、I3Lプロモーターの下流とワクシニアウイルスtkフランキングアームの間に挿入した。これは、HIV2 gagおよびpol遺伝子を含有するpISSYEGPの4,440bp BstU I−Bgl II断片、およびI3Lプロモーターを含有するオリゴヌクレオチドHIV2L1（配列認識番号461）
Figure 0003602530
とSIVL1（配列認識番号181）を、pSD542（実施例32に定義した）の4,070bp Xho I−Bgl II断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIV21と称する。
次いで外来３′非暗号配列を除去した。これは、pol遺伝子の３′末端を含有する280bp Bcl I−Sma I PCR断片をpHIV21の8,100bp Bcl I−Sma I断片にクローニングすることにより行なった。このPCR断片を、オリゴヌクレオチド、HIV2P2（配列認識番号462）
Figure 0003602530
およびHIV2P3（配列認識番号463）
Figure 0003602530
を有する、プラスミドpISSYEGPから産生した。この操作により産生したプラスミドをpHIV22と称する。
pHIV22を治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに組換え実験に用いてvP1045を産生した。
イムノプレシピテーション分析を行なって、vP1045が真正HIV2 gag遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。ベロ細胞単層を、疑似感染せしめたか、10PFU/細胞のm.o.i.で親ウイルスに感染せしめたか、またはvP1045に感染せしめた。１時間の吸着時間後、接種物を吸引し、細胞を、２％の胎児ウシ血清および［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％NP−40、30mMトリス（pH7.4）、3mM EDTA、0.03％Na Azideおよび0.6mg/ml PMSF）の添加と続いての細胞単層の削取りにより感染から18時間後に細胞を収穫した。
HIV2血清陽性個体から集積した血清（MD、ベセスダ、NCI−NIH、Dr.G.フランチーニ（NCI−NIH）から得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物をHIV2 gag発現に関して分析した。血清をvP866感染ベロ細胞で前吸着した。前吸着した血清を４℃で一晩タンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常ヒト血清とタンパク質AAセファロースで前浄化した溶解産物をタンパク質Ａセファロースに結合したHIV2血清陽性での４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、２×LiCl2/尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリ緩衝液（125mMトリス（pH6.8）、４％SDS、20％グリセロール、10％２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、免疫複合体から沈殿したタンパク質を分離した。タンパク質を10％ドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）上に分画し、固定し、フルオログラフィーのために1MのNa−サリチル酸塩で処理した。
HIV2血清陽性個体からのヒト血清は、vP1045感染細胞からHIV2 gag前駆体タンパク質、並びに様々な中間体および熟成gag開裂タンパク質産生物を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはNYVAC感染細胞からはHIV2特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
実施例108−NYVAC/HIV2 gag/polおよびenv（gp160）の組換え体の産生
HIV2 gagおよびpol遺伝子を含有するプラスミド、pISSYEGPをDr.G.フランチーニ（NCI−NIH）から得た。このプラスミドからのgagおよびpol遺伝子をI3Lプロモーターの下流とワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、上述したように最初にプラスミドpHIV22を調製することにより行なった（実施例107参照）。
pHIV22を治療ウイルスとしてのvP920とともに組換え実験に用いて、vP1047を産生した。
上述したように、HIV2 gagタンパク質の発現に関してvP1047感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染細胞からはHIV2特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vP1047感染細胞の溶解産物からは、HIV2 envおよびgag前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成gag開裂産生物が沈殿した。
実施例109−NYVAC/HIV2 gag/polおよびenv（gp120）組換え体の産生
HIV2 gagおよびpol遺伝子を含有するプラスミド、pISSYEGPをDr.G.フランチーニ（NCI−NIH）から得た。このプラスミドからのgagおよびpol遺伝子をI3Lプロモーターの下流とワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは、上述したように最初にプラスミドpHIV22を調製することにより行なった（実施例107参照）。
pHIV22を治療ウイルスとしてのvP922とともに組換え実験に用いて、vP1044を産生した。
上述したように、HIV2 gagタンパク質の発現に関してvP1044感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染細胞からはHIV2特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vP1044感染細胞の溶解産物からは、HIV2 envおよびgag前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成gag開裂産生物が沈殿した。
実施例110−ALVAC中のHIV2遺伝子の発現
ALVAC/HIV2 gag/polおよびenv（gp160）組換え体の産生
プラスミド、pBSH6HIV2ENVはH6プロモートしたHIV2 env（gp160）遺伝子を含有する。このプラスミドからのH6プロモートしたenv遺伝子をカナリヤポックスフランキングアームの間にクローニングした。これは、H6プロモートしたenv遺伝子を含有する、pBSH6HIV3ENVの2,700bp Xho I−Sac II断片、およびオリゴヌクレオチド、HIV2L4（配列認識番号464）
Figure 0003602530
とHIV2L5（配列認識番号465）
Figure 0003602530
を、pC6LのXho I−EcoR I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIV23と称する。
次いでHIV2 gagおよびpol遺伝子をpHIV23にクローニングした。これは、I3LプロモートしたHIV2 gagおよびpol遺伝子を含有する、pHIV22の4,450bp Xma I−Not I断片、およびオリゴヌクレオチド、HIV2L6（配列認識番号423）とHIV2L7（配列認識番号424）を、pHIV23の7,000bp Xma I−Xho I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpHIV25と称する。
pHIV25を治療ウイルスとしてのCPpp（ALVAC）とともに組換え実験に用いてvCP153を産生した。
イムノプレシピテーション分析を行なって、vCP153が真正HIV2 gagおよびenv遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。CEF細胞単層を、疑似感染せしめたか、10PFU/細胞のm.o.i.で親ウイルスに感染せしめたか、またはvCP153に感染せしめた。１時間の吸着時間後、接種物を吸引し、細胞を、２％の胎児ウシ血清および［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％NP−40、30mMトリス（pH7.4）、3mM EDTA、0.03％Na Azideおよび0.6mg/ml PMSF）の添加と続いての細胞単層の削取りにより感染から18時間後に細胞を収穫した。
HIV2血清陽性個体から集積した血清（MD、ベセスダ、NCI−NIH、Dr.G.フランチーニ（NCI−NIH）から得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物をHIV2 gagおよびenv遺伝子発現に関して分析した。血清をCPpp感染CEF細胞で前吸着した。前吸着した血清を４℃で一晩タンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常ヒト血清とタンパク質AAセファロースで前浄化した溶解産物をタンパク質Ａセファロースに結合したHIV2血清陽性での４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、２×LiCl2/尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリ緩衝液（125mMトリス（pH6.8）、４％SDS、20％グリセロール、10％２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、免疫複合体から沈殿したタンパク質を分離した。タンパク質を10％ドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）上に分画し、固定し、フルオログラフィーのために1MのNa−サリチル酸塩で処理した。
HIV2血清陽性個体からのヒト血清は、vCP153感染細胞からHIV2 envおよびgag前駆体タンパク質、並びに様々な中間体および熟成gag開裂タンパク質産生物を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞またはCPpp感染細胞からはHIV2特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
実施例111−NYVAC−SIV env（gp120−gp28）およびgag（プロテアーゼ−）組換え体のNYVAC産生におけるSIV遺伝子の発現
イムノプレシピテーション分析を行なって、vP948（実施例21で定義した）が真正SIVgagおよびenv遺伝子産生物を発現するか否かを測定した。ベロ細胞単層を、疑似感染せしめたか、10PFU/細胞のm.o.i.で親ウイルスに感染せしめたか、またはvP948に感染せしめた。１時間の吸着時間後、接種物を吸引し、細胞を、２％の胎児ウシ血清および［35S］−メチオニン（20μCi/ml）を含有する2mlの修飾イーグル培地（メチオニンを含まない）で重るいした。1mlの３×緩衝液Ａ（３％NP−40、30mMトリス（pH7.4）、3mM EDTA、0.03％Na Azideおよび0.6mg/ml PMSF）の添加と続いての細胞単層の削取りにより感染から18時間後に細胞を収穫した。
SIV血清陽性マカク（MD、ベセスダ、NCI−NIH、Dr.G.フランチーニ（NCI−NIH）から得た）を用いて、感染細胞からの溶解産物をSIVgagおよびenv前駆体発現に関して分析した。血清をvP866′NYVAC）感染ベロ細胞で前吸着した。前吸着した血清を４℃で一晩タンパク質Ａセファロースに結合せしめた。このインキュベーション期間後、物質を１×緩衝液Ａで４回洗浄した。次いで通常ヒト血清とタンパク質AAセファロースで前浄化した溶解産物をタンパク質Ａセファロースに結合したSIV血清陽性マカクでの４℃で一晩インキュベーションした。一晩のインキュベーション期間後、試料を１×緩衝液Ａで４回、２×LiCl2/尿素緩衝液で２回洗浄した。２×のラエムリ緩衝液（125mMトリス（pH6.8）、４％SDS、20％グリセロール、10％２−メルカプトエタノール）の添加と５分間の沸騰により、免疫複合体から沈殿したタンパク質を分離した。タンパク質を10％ドリファスゲルシステム（ドリファスら、1984）上に分画し、固定し、フルオログラフィーのために1MのNa−サリチル酸塩で処理した。
SIV血清陽性個体からのカマクは、vP948感染さいぼうからはSIV gag前駆体タンパク質およびエンベロープ糖タンパク質を特異的に沈殿せしめたが、疑似感染細胞からはSIV特異的タンパク質を沈殿せしめなかった。
実施例112−NYVAC/SIV gag/pol組換え体の産生
SIVMAC142cDNA配列を含有するプラスミド、pSIVGAGSS11GをDr.G.フランチーニ（NCI−NIH）から得た。このプラスミドからのgagおよびpol遺伝子をI3Lプロモーターの下流およびワクシニアウイルスtkフランキングアームの間にクローニングした。これは前述したようにプラスミドpSIVG5を調製することにより行なった（実施例21参照）。
次いで外来の３′非暗号配列を除去した。これは、pol遺伝子の３′末端を含有する、1,000bp BamH I−Hpa I PCR断片を、pSIVG1の7,400bp部分的BamH I−Hpa I断片にクローニングすることにより行なった。このPCR断片を、オリゴヌクレオチド、SIVP5（配列認識番号183）およびSOVP6（配列認識番号184）を有するプラスミド、pSIVGAGSS11Gから産生した。この操作により産生したプラスミドをpSIVG4と称する。
配列分析により、pSIVG4がpol遺伝子ないに単一の塩基対欠損を含有することが分かった。この誤差を訂正するために、pSIVG1の2,320bp Bgl II−Stu I断片をpSIVG4の6,100bp部分的Bgl II−Stu I断片にクローニングした。この操作により産生したプラスミドをpSIVG5と称する。
pSIVG5を治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに組換え実験に用いてvP1042を産生した。
SIV envおよびgag前駆体タンパク質に関して前述したように、vP1042感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはNYVAC感染ベロ細胞からはSIV特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vP1042感染細胞の溶解産物からは、gag前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成gag開裂産生物が沈殿した。
実施例113−NYVAC/SIV gag/polおよびenv（gp120−gp41）組換え体の産生
pSIVG5（実施例21）を治療ウイルスとしてのvP1050とともに組換え実験に用いてvP1071を産生した。
vP1071感染細胞のイムノプレシピテーション実験によりSIV遺伝子の発現が示される。
実施例114−NYVAC/SIV gag/polおよびenv（gp120−gp28）組換え体の産生
pSIVG5（実施例21）を治療ウイルスとしてのvP874とともに組換え実験に用いてvP943を産生した。SIV envおよびgag前駆体タンパク質の発現に関して、前述したようにvP943感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞からはSIV特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vP943感染細胞からは、envおよびgag前駆体タンパク質に対応するタンパク質種、並びに様々な中間体と熟成gag開裂産生物が沈殿した。
実施例115−NYVAC/SIV p16、p28組換え体の産生
SIV envおよびgag前駆体タンパク質の発現に関して、上述したようにvP942（実施例21）感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。しかしながら、vP942感染細胞の溶解産物からは、p16およびp28に対応するタンパク質種が沈殿した。
実施例116−NYVAC/SIV p16、p28およびenv（gp120−gp28）組換え体の産生
SIV envおよびgag前駆体タンパク質の発現に関して、上述したようにvP952（実施例21）感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。しかしながら、vP952感染細胞の溶解産物からは、env、p16およびp28に対応するタンパク質種が沈殿した。
実施例117−NYVAC/SIV env（gp120−gp41）組換え体の産生
プラスミド、pSIVEMVCは、H6プロモートしたSIVMAC142エンベロープ遺伝子（生体外選択切形バージョン）を含有する。未熟終止コドンを含有するエンベロープ遺伝子の領域をpBSK＋にクローニングした。これは、pSIVEMVCの1,120bp Cla I−BamH I断片をpBSK＋のCla I−BamH I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpSIV10と称する。
次いで上流の終止コドン、TAGを起点CAGコドンに変更した。これは、オリゴヌクレオチド、SIVL20（配列認識番号466）
Figure 0003602530
およびSIVL21（配列認識番号467）
Figure 0003602530
を、pSIV10の4,000bp Nhe I−PpuM I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpSIV11と称する。
次いで修飾コドンを含有する領域をpSIVEMVCにクローニングした。これは、終止コドンを含有する、pSIV11の380bp Bgl II−Nhe I断片をpSIVEMVCの5,600bp部分的Bgl II−Nkhe I断片にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpSIV12と称する。
pSIV12を治療ウイルスとしてのvP866（NYVAC）とともに生体外組換え実験に用いてvP1050を産生した。
SIV envおよびgag前駆体タンパク質の発現に関して、前述したようにvP1050感染細胞のイムノプレシピテーション実験を行なった。疑似感染ベロ細胞またはNYVAC感染ベロ細胞からはSIV特異種は沈殿しなかった。しかしながら、vP1050感染細胞の溶解産物からは、envに対応するタンパク質種が沈殿した。
実施例118−ALVAC中のSIV遺伝子の発現
ALVAC/SIV gag/pol組換え体の産生
SIVMAC142DNA配列を含有する、プラスミド、pSIVGAGSS11Gは、Dr.G.フランチーニ（NCI−NIH）から得た。このプラスミドからのgagおよびpol遺伝子を、I3Lプロモーターの下流とワクシニアウイルスフランキングアームの間にクローニングした。これは、前述したように最初にプラスミドpSIVG5を調製することにより行なった（実施例21参照）。
次いでgag/pol遺伝子をカナリヤポックスフランキングアームの間にクローニングした。I3Lプロモートしたgag/pol遺伝子を含有する、pSIVG5の4,500bp Sma I−Not I断片をpC5L（実施例44で定義した）のSma I−Not I部位にクローニングすることにより行なった。この操作により産生したプラスミドをpSIVGC13と称する。
pSIVGC13を治療ウイルスとしてのCPpp（ALVAC）とともに組換え実験に用いてvCP172を産生した。
vCP172感染細胞のイムノプレシピテーション実験によりSIV遺伝子の発現が示される。
実施例119−狂犬病糖タンパク質を発現するカナリヤポックスを用いてヒトの免疫化（ALVAC−RG;vCP65）
実施例15および第17図に記載したように、ALVAC−RG（VCP65）を産生した。拡張とワクチン製造のために、特定病原体感染防止条件卵から誘導した初代CEF中にALVAC−EG（vCP65）を成長せしめた。0.01の多重度で細胞を感染せしめ、37℃で３日間インキュベーションした。
感染細胞の血清不含有培地中の超音波分裂により、ワクチンウイルス懸濁液を得た；次いで細胞デブリを遠心分離と濾過により除去した。産生した浄化懸濁液に、１回の投与量のガラスびんに分配され凍結乾燥せしめられた凍結乾燥安定剤（アミノ酸の混合物）を補給した。凍結乾燥の前に、血清不含有培地と凍結乾燥安定剤の混合物中のウイルス懸濁液を連続の10倍希釈により、力価を減少させる３つのバッチを調製した。
細胞基質、培地およびウイルス種並びに、外来剤の探求と研究所のげっ歯動物の無害性に重点を置いた最終産生物に品質管理試験を施した。所望の特徴は見られなかった。
前臨床データ
生体外研究により、VEROまたはMRC−５細胞はALVAC−RG（vCP65）の成長を指示しないこと；一連の８（VERO）および10（MRC）ブラインド血清継代ではこれらの非アビアン系において成長するウイルスの適応は検出可能とはならなかったことが示された。ヒト細胞系の分析（MCR−５、WISH デトロイト532、HEL、HNKまたはEBC転換リンパ球幼若化ALVAC−RG（vCP65））は、これらの細胞中で複製のブロックがDNA合成の前に生じることを示唆するウイルス特異的DNAの蓄積を示さなかった。しかしながら、試験した全ての細胞系の狂犬病ウイルス糖タンパク質遺伝子の発現は、カナリヤポックス複製サイクルの不完全工程がウイルスDNA複製の前に生じることを目だって示している。
ALVAC−RG（vCP65）の安全性および効能を動物の一連の実験に報告した。カナリヤ、鶏、アヒル、ガチョウ、研究所のげっ歯動物（乳獣と成長したネズミ）、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコおよびイヌ、リスサル、アカゲサルマカク、およびチンパンジーを含む多くの種に105から108pfuの範囲の投与量で接種した。様々な経路を用いたが、通常は皮下、筋肉および皮内であるが、または口頭（サルとネズミ）および大脳内（ネズミ）もまた用いた。
カナリヤにおいて、ALVAC−RG（vCP65）は、病気または死の徴候を示さず乱切の部位で「生着」外傷を生じた。ウサギの皮内接種は、広がらず７日から10日で直った典型的なポックスウイルス接種反応となった。どの動物試験においても、カナリヤポックスのための副作用は生じなかった。急速蛍光焦点阻害試験（Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test;RFFIT）により測定したように、げっ歯動物、イヌ、ネコ、および霊長目動物へのALVAC−RG（vCP65）の接種後、抗狂犬病抗体の発達により、免疫抗原性を証明した。また、ALVAC−RG（vCP65）で免疫化したネズミ、イヌ、およびネコにおける狂犬病ウイルス抗原投与実験により防御を証明した。
志願者
狂犬病免疫化の前歴のない20−45才の25人の大人を登録した。志願者の健康状態を、完全な医学経歴、物理試験、血液学的および血液化学分析により評価した。除外基準は、妊娠、アレルギー、あらゆる種類の免疫低下、慢性衰弱病、癌、過去３か月の免疫グロブリンの注射、およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）またはＢ型肝炎ウイルス表面抗原に対する血清陽性を含んだ。
研究設計
標準ディプロイド細胞狂犬病ワクチン（HDC）バッチE0751番（フランス、リヨン、パスチュアーメリクス血清＆ワクチン）または研究ワクチンALVAC−RG（vCP65）のいずれかを接種するように、参加者を任意に分配した。
その試みを投与量段階的拡大研究と称した。実験ALVAC−RG（vCP65）の３つのバッチを、各段階の間が２週間の間隔で、志願者の３つの群（Ａ、Ｂ、およびＣ群）に連続的に使用した。３つのバッチの濃度は、投与量当たり、それぞれ103.5、104.5、105.5組織培養感染投与量（TCID50）であった。
各志願者に、４週間の間隔で三角領域に皮内に同一のワクチンを２回接種した。注射したワクチンの性質は、最初の注射のときには参加者には知られていないが、試験者は知っていた。
２回目の注射の時に即座の超感受性の危険を最小限にするために、中間投与量の実験ワクチンを分配したＢ群の志願者に、１時間前に低い投与量を注射し、高い投与量（Ｃ群）を分配した志願者には、１時間の間隔で低い投与量と中間の投与量を連続して接種した。
６か月後、ALVAC−RG（vCP65）（Ｃ群）とHDCワクチンの最高の投与量を接種した者は、３回目のワクチン投与を受けた；次いでその参加者には前と同一のワクチンたまは変更ワクチンのいずれかを任意に接種した。結果として、以下の免疫化計画に対応して、４つの群を形成した:1.HDC、HDC−HDC;2.HDC、HDC−ALVAC−RG（vCP65）;3.ALVAC−RG（vCP65）、ALVAC−RG（vCP65）−HDC;4.ALVAC−RG（vCP65）、ALVAC−RG（vCP65）、ALVAC−RG（vCP65）。
副作用の監視
注射後１時間に亘り全ての被実験者を監視し、次の５日間毎日再検査した。被実験者は、次の３週間に亘り局部的および全身的反応を記録するように求められ、週に２回電話で質問された。
研究所の研究者
登録の前と、各注射の２、４、および６日後に血液を採取した。分析は、完全血球細胞算定、肝臓酵素およびクレアチニンキナーゼアッセイを含んだ。
抗体アッセイ
最初の注射の７日前と、研究の７、28、35、56、173、187、および208日後に、抗体アッセイを行なった。
急速蛍光焦点抑制試験（RFFIT）（スミス＆イエーガー、狂犬病の研究所技術）を用いて、狂犬病に対する中和抗体の水準を測定した。直接ELISAによりカナリヤポックス抗体を測定した。抗原である、0.1％のトリトンX100により分断された精製カナリヤポックスウイルスの懸濁液をマイクロ板に被膜した。固定化した血清の希釈物を室温で２時間反応せしめ、反応抗体は抗ヒトIgGヤギ血清を標識したとが示された。結果を490mnでの光学密度リードとして示した。
分析
25人の対象を登録し、研究を完了した。この対象は、10人の男性と15人の女性であり、平均年齢は31.9（21から48）才であった。３人を除いた全ての対象は、前の天然痘ワクチン接種の形跡があった；残りの３人は典型的な跡およびワクチン接種の経歴がなかった。３人の対象に、低い投与量（103.5および104.5TCID50）の実験ワクチンを投与し、９人の対象には105.5TCID50を投与し、10人の対象にHDCワクチンを投与した。
安全性（表49）
最初の一連の免疫中、注射から24時間以内に、１人のHDC接種者（37.8℃）および１人のvCP65 105.5TCID50接種者（38℃）では37.7℃より高い熱が測定された。ワクチン接種に帰する他の全身的な反応はどの参加者にも見られなかった。
皮内にHDCを注射した接種者の9/10と、それぞれvCP65 103.5、104.5、105.5TCID50の接種者の0/3、1/3および9/9に局部的な反応が見られた。
テンダネス（tenderness）が最も一般的な症状であり、通常は軽かった。他の局部的な症状は、赤味（redness）および軽く一時的な硬化（induration）を含んだ。全ての症状は、通常24時間以内にやわらぎ、72以上は持続しなかった。
血球細胞算定、肝臓酵素またはクレアチニンキナーゼ値には、著しい変化はなかった。
免疫応答；狂犬病に対する中和抗体（表50）
最初の注射から28日後、全てのHDC接種者が防御力価（≧0.5IU/ml）を有した。これに対して、ＡおよびＢ群（103.5および104.5TCID50）では誰もその値に達せず、Ｃ群（105.5TCID50）における2/9のALVAC−RG（vCP65）接種者のみがこの防御力価に達した。
56日目に（すなわち、２回目の接種から28日後）、ALVAC−RG（vCP65）ワクチンの接種者のＡ群の0/3、Ｂ群の2/3およびＣ群の9/9において、防御力価が達成され、10人のHDC接種者全てに保持された。
56日での幾何学的平均力価は、Ａ、Ｂ、ＣおよびHDC群においてそれぞれ0.05、0.47、4.4および11.5IU/mlであった。180日目には、狂犬病抗体力価は全ての対象において実質的に減少したが、5/10のHCD接種者と5/9のALVAC−RG（vCP56）接種者においては0.5IU/mlの最小防御力価より上の値を保持した;HCDおよびＣ群における幾何学平均力価は、それぞれ0.51および0.45IU/mlであった。
カナリヤポックスウイルスに対する抗体（表51）
高い力価を有するそれらの対象におけるカナリヤ鳥との前の接触の欠如にもかかわらず、観察された前免疫力価は、0.22から1.23O.D.単位に変化する力価とともに大きく変化した。前免疫化と２回目の注射力価の間で２倍より大きい増加と定義した場合、血清転化はＢ群の1/3およびＣ群の9/9に達成されたが、ＡまたはHDC群においては血清転化された対象はいなかった。
追加抗原投与注射
追加抗原投与注射のときに、ワクチンは６か月後に同様に良好に耐性があった:2/9のHDC追加抗原投与接種者および1/10のALVAC/RG（vCP65）追加抗原投与接種者が熱を生じた。5/9のHDC追加抗原投与接種者と6/10のALVAC−RG（vCP65）追加抗原投与接種者には、局部的反応が存在した。
観察
第35図は、狂犬病中和抗体力価のグラフを示すものである（急速蛍光焦点抑制試験またはRFFIT、IU/ml）：同一または変更ワクチンのいずれかで以前に免疫化した志願者におけるHDCおよびvCP65（105.5TCID50）の追加抗原投与効果。ワクチンは０、28および180日に与えた。抗体力価は、０、７、28、35、56、173、および187と208日に測定した。
第35図に示すように、与えられた追加抗原投与量により、どのような免疫化計画の対象全てにおいても、狂犬病抗体力価がさらに増大することとなった。しかしながら、ALVAC−RG（vCP65）追加抗原投与は全体的に、HDC追加抗原投与およびALVAC−RG（vCP65）より低い免疫応答を誘発し、ALVAC−RG（vCP65）−ALVAC−RG（vCP65）群は他の３つの群よりも著しく低い力価を有した。同様に、ALVAC−RG（vCP65）追加抗原投与注射により、3/5の以前にHDCワクチンを接種した対象、および以前にALVAC−RG（vCP65）で免疫化した５人全ての対象において、カナリヤポックス抗体力価の増大となった。
一般的に、vCP65の投与からの局部的などの副作用も、ウイルスの局部的な複製を示さなかった。特に、ワクチンの注射後に観察されたような皮膚の外傷はなかった。ウイルスの複製の明確な欠如にもかかわらず、注射により志願者に、カナリヤポックスベクターおよび発現された狂犬病糖タンパク質の両方に対する著しい量の抗体を産生させた。
ネズミにおける血清中和化試験と良好に相関することが知られている急速蛍光焦点抑制試験（RFFIT）により、狂犬病中和抗体をアッセイした。105.5TCID50の９人の接種者のうち、５人は最初の投与の後に低水準の応答を有した。試験した最高投与量の接種者全て、および中間の投与量の３人のうち２人の接種者において、２回目の注射後には、狂犬病抗体の防御力価が得られた。この研究において、両方のワクチンは、生ワクチンに通常推奨されているが、不活化HDCワクチンに推奨されない皮内に与えられた。注射のこの経路は、注射部位の注意深い実験となるように選択されたが、これは、HDC接種者における抗体の遅い発生となる：実際、どのHDC接種者も７日目荷は抗体の増加とはならず、一方HDCワクチンが筋肉に与えられる研究のほとんどの場合、対象の著しい比率が抗体を増加させる（クレイトマンら、Int′１ グリーンクロス−ジェネバ、1981;クワートら、Int′１ グリーンクロス−ジェネバ、1991）。しかしながら、本発明は必ずしも皮下経路の接種に限られたものではない。
狂犬病中和抗体のGMT（幾何学的平均力価）は、HDC対照ワクチンによるものよりも、本発明のワクチンによるもののほうが低いが、防御に要する最小力価よりはまだ十分に高い。本研究に用いた３回の投与により得られた明確な投与量効果応答は、より高い投与量はより強い応答を誘発することを示唆する。この開示から、当業者は所定の患者に適切な投与量を選択することができる。
抗体応答を増加せしめる能力はこの実施例の別の重要な結果である；実際、狂犬病抗体力価の増大は、免疫化計画がどのようなものであろうとも、投与から６か月後に全ての対照に達成され、カナリヤポックスベクターまたは狂犬病糖タンパク質のいずれかにより誘発された前から存在する免疫性が、組換えワクチン候補または従来のHDC狂犬病ワクチンでの追加免疫への遮断効果を有さないことが示された。これは、免疫応答が前から存在する免疫性により遮断されるというヒトのワクシニア組換え体に関する他者の発見と対照的である（コーニーら、ランセット1991、337:567−72;エトリンガーら、ワクチン1991、9:470−72）。
それゆえ、この実施例は明確に、非複製ポックスウイルスは、複製剤が免疫応答に与える全ての長所を有するが、完全許容ウイルスにより生じた安全性問題なく、ヒトにおいて免疫化ベクターとして機能できることを示している。
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実施例120−NYVAC−JEV組換え体（vP908、vP923）による日本脳炎ウイルスに対する防御
NYVAC−JEV組換え体を用いて、日本脳炎ウイルスに対する防御を提供した。NYVAC vP866、NYVAC組換え体vP908とvP923、およびワクシニア組換え体vP555とvP829をここに記載したように産生した。
ネズミ防御実験
ネズミ防御実験を前述したように行なった（メイソンら、1991）。手短にいうと、生後４週間の非近交スイスネズミ10から12匹の群を、107PFUのvP829、vP866、vP908またはvP923で腹腔（i.p.）注射により免疫化し、血清を３週間後に採取した。ネズミに、JEVのベイジン（Beijing）P3菌株をi.p.注射により抗原投与した。抗原投与後、３週間後に実験が完了するまで毎日観察した。実験動物の同腹子を用いて致死量滴定を行なった。
ブタの防御実験
約25kgの体重のランドレース交雑去勢ブタを用いた。５匹のブタの群を、食塩加リン酸緩衝液（PBS）、または2mlのPBSで希釈された１×108PFUのvP866、vP908またはvP923で皮下（s.c.）注射により免疫化した。接種から28日後、上述したのと同じ方法で注射により追加抗原投与し、最初の接種から56日後に、２×105PFUのJEVのＢ−2358/84菌株をs.c.注射により抗原投与した。０（免疫化前）、７、14、28（追加抗原投与前）、31、35、42、56（抗原投与前）、57、58、59、60、61、62、63、64および76（抗原投与後）日に、全ての群の動物から血清を採取した。
免疫応答の評価
抗ブタイムノグロブリン（Ig）Ｇで被膜した固定Staphylococcus aureus細菌（カリフォルニア、カーピンテリア、ダコー社）を使用したことを除いては、ボニシら（1991）に記載されているように、［35S］Met−標識JEV感染細胞から得た培養液体または洗浄剤処理細胞溶解産物から、JEVタンパク質を沈殿せしめる能力に関して、ブタの血清を検定した。クラーケおよびカサルス（1958）の方法の修正方法により、ブタとネズミの前抗原投与血清のHAI検定を行なった。ブタの血清を検定するのに新鮮に解凍したヒトの血清を使用しなかったことを除いては、実質的にメイソンら（1991）に記載されたように、NEUT検定を行なった。
ウイルス血症
JEV抗原投与から８日後に採取した脊椎血清の新鮮に解凍したアリコートを、６ウェルマイクロ板中のVERO単層細胞上の感染JEVに関してプラーク滴定した。ウイルス吸着後、細胞単層を、１％のカルボキシメチルセルロースを含有する培地で重るいし、20％エタノール中に溶解せしめた0.1％のクリスタル紫の染色により感染から５日後にプラークを視覚化した。３つ以下のプラークが300μｌの血清でインキュベーションしたウェル中に観察された場合には、力価は＜10PFU/mlと記録した。
組換えワクシニアウイルスの構造
本研究において構成したワクシニア組換え体に含有されたJEV cDNA配列を第36図に示す。これらの組換えウイルスにおいて、JEV cDNAの血清ストランドを初期／晩期H6プロモーターの後ろに配した。組換え体vP908（およびvP555;メイソンら、1991）は、prM、prM、Ｅ、NS1およびNS2AのＮ末端に選考する推定15アミノ酸信号配列を含有する。組換え体vP923（およびvP828;コニシら、1991）は、prM、prM、およびＥの推定信号配列をコードする。
組換えワクシニアウイルスによるＥおよびNS1の合成
ＥまたはNS1遺伝子のイムノプレシピテーションを、ＥまたはNS1に特異的な単クローン性抗体を用いて行なった。vP555、vP908およびvP923に感染した細胞中でＥ MAbに反応性のあるタンパク質を合成し、vP923に感染した細胞中ではなくvP555およびvP908に感染した細胞中で、NS1 MAbに反応性のあるタンパク質を合成した。vP555感染細胞は、細胞の内側と外側でＥおよびNS1の正確な形状を産生した。vP908およびvP923により産生されたタンパク質は、vP555により産生されたタンパク質のサイズと等しかった。ＥおよびNS1に関して、細胞外形状は、SDS−PAGE中の細胞内形状より遅く移動し、これは、細胞からの放出に直ちに先行するＮ連結グリカンの成熟と一致する。加えて、vP908感染細胞は、NS1、NS1′の高分子量形状を産生し、これはJEVゲノムのNS2A領域によりコードされた配列の変更プロセシングにより誘導される（メイソンら、1987）。Ｍ（およびprM）に特異的なMAbを用いて放射線標識ワクシニア組換え体感染細胞から調製した免疫沈殿物（immunoprecipitates）により、vP908およびvP923に感染した細胞中でprMが合成されたことが分かった。
vP908およびvP923感染HeLa細胞の細胞外液体は、vP866感染細胞の培養液体中では検出不可能なHA活性を示した。データにより、vP829はvP555よりも約８倍多い細胞外血球凝集素の合成を誘発したことが分かった。その差異に対応して、vP923に感染した細胞は、vP908に感染した細胞よりも約８倍のHA活性を産生した。これらの結果により、vP980およびvP923により産生されたJEVタンパク質の組換え体形状は、それぞれvP555およびvP829により産生されたものと等しいことが示された。
ネズミの免疫化および抗原投与
NYVACベースの組換えウイルスの防御免疫を誘発する能力をネズミで実験した。前抗原投与血清のNEUTおよびHAIデータにより、vP908およびvP923は、vP829と同水準の抗体を産生した（コニシら、1991）（表52）。これらの血清学的データと一致して、vP908およびvP923は、JEVの病原体P3菌株による致死量JEV感染からの防御をネズミに提供することができた（表52）。防御の水準は、vP829での免疫化により達成された水準と同様であった（表52）（コニシら、1991）。これらの研究により、vP908およびvP923の２つのNYVACベースの組換え体は、前述した水準（コニシら、1991）と同様の水準でネズミに免疫原性であったことが確認された。
組換えワクシニアウイルスによるブタのJEV抗原に対する免疫応答の導入
７日ごとに収集した各群の全てのブタから集積した前抗原投与血清を、抗JEV NEUTおよびHAI活性に関して検定した。第37図に示すように、vP908およびvP923で免疫化したブタ中にはNEUTとHAI活性の両者が観察されたが、PBSまたはvP866を接種したブタには観察されなかった。vP908およびvP923免疫化ブタの両者には、１回目と２回目の接種から７日後に比較的高水準のNEUT抗体が観察されたが、21日後にわずかに検出可能な水準まで減少した。第１の接種と追加抗原投与の両方に関して、HAIは、NEUT抗体よりもゆっくりと減少した（第37図）。vP908は、vP923よりもやや高い水準のHAIおよびNEUT抗体を提供した。両方の組換え体のHAI力価は、１回の接種後に達成されたものよりも、２回目の接種後に達成されたほうが大きかった。vP923は、１回の接種よりも２回目の接種後のほうが高いNEUT力価を提供し、一方vP908は、１回または２回目の接種後には等量のNEUT力価を誘発した。
ブタを０日と28日に免疫化し、PBSまたはvP866で免疫化したブタから56日目に血清を採取し、vP908またはvP923で免疫化したブタからは０、７、28、35および56日目に血清を採取した。５の各群の全ての動物から集積した血清を、JEV感染細胞の培養液体から収穫した放射線標識したタンパク質をイムノプレシピテーションする能力に関して検定した。
Ｅに対する免疫応答は、NEUTおよびHAI検定の結果と良好に相関性があった。vP923で免疫化したブタに観察された35日目のＥに対するRIP応答は、vP908で免疫化したブタ中のＥに対するRIP応答よりも高かったが、35日目のHAI力価は、２つの群と等しかった。しかしながら、vP923で免疫化したブタにおける35日目のNEUT力価は、vP908で免疫化したブタよりも高かった。NEUTまたはHAIに関わる抗体以外の抗体が誘発されるが、RIP分析の量に関する面はさらには確認できなかった。比較的高いNEUT抗体力価にもかかわらず、７日目にＥに対する血清の弱いRIP応答が、免疫化後の初期のIgM抗体により説明できた。JEV特異的IgMの水準はさらには分析しなかった。どの集積した血清もNS1に対する免疫応答を示さなかった。
組換えワクシニアウイルスで免疫化したブタ中のウイルス血症
対照ブタ［PBS（4/5）またはvP866（5/5）］からの抗原投与後の血清中に、＞10PFU/mlのJEウイルス力価が検出され、一方vP923を接種した５匹のブタのうち２匹のみが＞10PFU/mlのウイルス血症を示した（第38図）。目だったことには、vP908で免疫化した５匹のブタのうちどれも、＞10PFU/mlの測定可能なウイルス血症を示さなかった。PBSおよびvP866（1.2×103PFU/ml）で免疫化した群の個々のブタの最大ウイルス力価の幾何学平均は、vP908およびvP923（1.9×101PFU/ml;スチューデントｔ検定によりＰ＜0.001;＜10PFU/mlのウイルス血症を有する全てのブタに関して、10PFU/mlの力価であると推定する）で免疫化した群の平均より著しく高かった。さらに、＞10PFU/mlの細胞を示すブタのウイルス血症の平均期間は、PBSおよびvP866に関しては2.7日であり、＞10PFU/mlの力価を有する２つのvP923免疫化ブタでは2.0日であった。これらの結果により、vP908およびvP923の免疫化は、抗原投与後にJEVウイルス血症を著しく減少したことが示される。
JEV抗原投与に対する免疫応答を評価するために、抗原投与後20日目に硝石した個々の血清をJEVに対する抗体に関して検定した。vP908またはvP923をワクチン接種したブタは、PBSまたはvP866を接種したブタよりも高いＥに対する応答を有し、抗原投与前に存在したＥに対する抗体活性をJEV感染により追加抗原投与したことが示された。組換えワクシニアウイルス中で発現されなかったJEVタンパク質、NS3およびNS5に対する応答が抗原投与後の血清全ての検出され、ある水準のJEV複製が、＜10PFU/mlのウイルス血症を有したブタでさえも生じたことを示した。それゆえ、NS3に対する抗原投与後の血清の反応性と血清JEV力価により測定された感染の欠乏との間の予期された逆数の関係は観察されなかった。これは、抗原投与後のNS3に対する集積しネズミの血清の反応性の欠乏が防御と相関するという、ネズミに得られた以前のデータと対照的である（コニシら、1991）。
防御実験中、抗原投与から12日後に親ワクシニア（vP866）群の１匹のブタが死亡した。この動物は、抗原投与後の期間に亘り、他のブタより高い体温を示し、３日間に亘り＞1,000PFUのJEV血清力価を有する唯一の動物であった。検死時にサンプリングした脳検体からはJEVは検出されなかったけれども、JEC感染により生じた病気により動物は死亡した。
観察
実施例は、NYVAC−JEVがJEVウイルス血升対する効果的な防御を提供することを示し；それゆえ、NYAVC−JEVは有用であり、獣医用途に安全である。
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実施例121ーNYVAC（vP866）およびNYVAC−RG（vP879）の評価
イムノプレシピテーション
アビアンまたは非アビアン細胞の前形成した単層に、細胞当たり10pfuの親NYVAC（vP866）まはNYVAC−RG（vP879）ウイルスを接種した。接種は、メチオニンを含まず、２％の透析胎児ウシ血清を補給したEMEM中で行なった。１時間のインキュベーション後、接種物を除去して、培地を20μCi/mlの35S−メチオニンを含有するEMEM（メチオニンを含まない）と置き換えた。約16時間の一晩のインキュベーション後、衝撃液Ａ（１％ノニデットＰ−40、10mMトリスpH7.4、150mM NaCl、1mM EDTA、0.01％アジ化ナトリウム、1ml当たり500単位のアプロチニン、および0.02％フェニルメチルスルホニルフッ化物）の添加により、細胞を溶解せしめた。ニューヨーク週、アルバニー、ニューヨーク州保険省、グリフィス研究所、Dr.C.トリナーチにより提供された24−3F10と称する狂犬病糖タンパク質特異的単クローン性抗体、およびベーリンガーマンハイム社（ネコ.605−500）から得たラット抗ネズミ複合体を用いて、イムノプレシピテーションを行なった。ニュージャージー州、ピスキャタウェイ、ファーマシアLKBバイオテクノロジー社から得たタンパク質ＡセファロースCL−48を、支持マトリックスとして用いた。免疫沈殿物を、ドリファスら（1984）の方法にしたがって、10％のポリアクリルアミドゲル上に分画した。ゲルを固定し、フルオログラフィーのために1MのNa−サリチル酸塩で１時間処理し、コダックXAR−２フイルムに露出して免疫沈殿したタンパク質種を視覚化した。
動物の供給源
ニュージーランド白ウサギをヘアマーランド（ニュージャージー、ヘウィット）から得た。生後３週間の雄のスイスウェブスター非近交ネズミ、妊娠時期の雌のスイスウェブスター非近交ネズミ、および生後４週間のスイスウェブスターヌード（nu+nu+）ネズミをタコニックファーム社（ニューヨーク、ジャーマンタウン）から得た。NIHガイドラインにしたがって、全ての動物を保持した。全ての動物のプロトコルは、IACUC協会により認可された。必要と思われる場合、明らかに末期の病気であるネズミを安楽死させた。
ウサギの病害の評価
２匹のウサギのそれぞれに、様々な部位に、104、105、106、107、または108pfuの各試験ウイルスを含有する0.1mlのPBSまたPBS単体を皮内に接種した。病害が解決されるまで、４日目から毎日ウサギを観察した。硬結および潰瘍を測定し、記録した。
接種部位からのウイルスの回収
１匹のウサギに、様々な部位に、106、107、または108pfuの各試験ウイルスを含有する0.1mlのPBSまたPBS単体を皮内に接種した。11日後、ウサギを安楽死させ、ウイルス回収のために機械的な分断と間接超音波処理により、各接種部位から採取した皮膚の生検材料を無菌の状態に調製した。CEF単層のプラーク滴定により感染ウイルスをアッセイした。
ネズミの毒性
10匹のネズミの群または５匹のヌードネズミの群に、0.5mlの無菌PBS中のウイルスのいくつかの希釈の１つをipにより接種した。実施例24を参照のこと。
シクロホスファミド（CY）処理
ip経路により、２日前に4ml（0.2ml）のCY（シグマ）をネズミに注射し、０日にウイルスを注射した。感染から以下の日に、ネズミにCYをipにより注射した:1日目に4mg;4、７および11日に2mg;14、18、21、25および28日に3mg。11日目にカルターカウンターで白血球を数え上げることにより免疫抑制を間接的にモニタした。平均の白血球数は、未処理ネズミでは１μｌ当たり13,500細胞（ｎ＝４）であり、CY処理対照ネズミでは１μｌ当たり4,220細胞（ｎ＝５）であった。
LD50の計算
50％の死亡率（LD50）となるのに必要な致死量を、リードおよびミュンヒ（リードおよびミュンヒ、1938）の比率方法により測定した。
ネズミのNYVAC−RGの効能検定
生後４から６週間のネズミには、50から100μｌの希釈範囲（2.0−8.0log10組織培養感染投与量50％（TCID50））のVV−RG（キーニーら、1984）、ALVAC−RG（テイラーら、1991b）、またはNYVAC−RGのいずれかをフットパッドで接種した。各群は８匹のネズミからなる。ワクチン接種から14日後、頭蓋内接種により、15LD50の狂犬病ウイルスCVS菌株（0.03ml）をネズミに抗原投与した。28日目に、生存したネズミを数え、防御投与量50％（PD50）を計算した。
NYVAC（vP866）の誘導
コペンハーゲンワクチン菌株のプラーククローン単離体である、VC−２から、ワクシニアウイルスのNYVAC菌株を産生した。VC−２からNYVACを産生するために、毒性に関連する多くのウイルス機能を含む、18のワクシニアORFは、この開示の最初のほうに記載したような一連の配列操作で正確に欠損せしめた。新たな望ましくない読取り枠の状況を避けるために設計した方法で、これらの欠損を構成した。第39図は、NYVACを産生するために欠損したORFを模式的に描いたものである。第39図の上部には、ワクシニアウイルスゲノムのHind III制限地図（VC−２プラーク単離体、コペンハーゲン菌株）が描かれている。NYVACの産生において続発的に欠損せしめられたVC−２の６つの領域が伸長している。欠損は、この開示の最初のほうに記載した（実施例１から６）。その座から欠損され、その遺伝子産生物の分子量および機能または相同性を伴ってORFがそのような欠損座の下に列記されている。
ヒト組織細胞系のNYVACおよびALVACの複製研究
ヒト起源の細胞中のワクシニアウイルス（vP866）のNYVAC菌株の複製水準を測定するために、６つの細胞系を、液体培養下で細胞当たり0.1pfuの入力多重度で接種し、72時間インキュベーションした。コペンハーゲン親クローン（VC−２）を平行して接種した。全てのウイルスの許容細胞基質を代表するために、初代ニワトリ胚繊維芽細胞（CEF）（CT、スパラス社、SPF期限の生後10−11日の感染細胞包蔵卵から得た）を含む。２つの基準に基づいて培養を分析した：生産的ウイルス複製の発生および外因性抗原の発現。
多くのヒト誘導細胞中のNYVACの複製能力を表53に示す。VC−２およびNYVACの両者は、CEF細胞中で生産的な複製ができるが、NYVACは、やや減少した産生となる。VC−２はまた、EBV転換リンパブラストイド（lymphoblastoid）細胞系JT−１（エプスタインバーウイルスで転換したヒトリンパブライトイド細胞系、リキンソンら、1984参照）を除いて、匹敵する産生物で処理した６つのヒト誘導細胞系において生産的複製ができる。これに対して、NYVACは、検定したヒト誘導細胞系のいずれにでも生産的複製能力においては高度に弱毒化されている。NYVAC感染MRC−５（ATCC＃CCL171、ヒト胚肺起源）、デトロイト532（ATCC＃CCL54、ヒト包皮、ダウン症候群）、HEL299（ATCC＃CCL137、ヒト胚肺起源）、およびHNK（ヒト新生児腎臓、MD、ウォーカースビル、ウィチカーバイオプロダクツ社、ネコ＃70−151）細胞から、残留ウイルス水準より高い感染細胞の少量の増加が達成された。NYVAC感染CEF細胞または親VC−２感染CEF細胞から得られたウイルス産生物と比較した場合、これらの細胞系の複製は著しく少ない（表53）。NYVACおよびVC−２両者のCEF細胞中の24時間での産生は、72時間の産生と等しい。それゆえ、ヒト細胞系培養を追加に48時間に亘りインキュベーションすると（さらなる２つのウイルス成長サイクル）、達成された相対ウイルス産生を増幅させる。
ヒト誘導細胞系、MEC−５およびデトロイト532に得られた低水準のウイルス産生と一致して、検出可能であるがわずかな水準のNYVAC特異的DNA蓄積が認められた。NYVAC感染CEF細胞中に観察されたDNA蓄積の水準と相対的なMRC−５およびデトロイト532NYVAC感染細胞系中のDNA蓄積の水準は、相対的なウイルス産生と匹敵する。NYVAC特異的ウイルスDNA蓄積は、いずれの他のヒト誘導細胞にも観察されなかった。
アビポックスウイルス、ALVACを用いて、同様の実験を行なった。ウイルス複製の結果を表53に示す。どの後代ウイルスも、アビアン種に対するカナリヤポックスウイルスの宿主範囲制限と一致してヒト細胞系のいずれにも検出不可能であった。いずれのヒト誘導細胞系にもALVAC特異的DNA蓄積が検出不可能であったことは、これらのヒト誘導細胞中のALVACの生産的複製の欠如と一致する。
ヒト細胞におけるNYVAC−RG（vP879）による狂犬病糖タンパク質の発現
異種遺伝子の能率的な発現が、生産的ウイルス複製の著しい水準の欠如した状態で得られるか否かを決定するために、同一の細胞系に、35S−メチオニンの存在下で狂犬病ウイルス糖タンパク質を発現するNYVAC組換え体（vP879、実施例７）を接種した。狂犬病糖タンパク質に特異的な単クローン性抗体を用いて放射線標識した培養溶解産物から、狂犬病糖タンパク質のイムノプレシピテーションを行なった。狂犬病糖タンパク質の完全グリコシル化形状と一致する67kDaタンパク質のイムノプレシピテーションが検出された。どの血清学的交差反応性産生物も、未感染または親NYVAC感染細胞溶解産物中には検出されなかった。分析した全ての他のヒト細胞系にも同様の結果が得られた。
ウサギの皮膚への接種
皮内接種後のウサギへの皮膚の外傷の性質と誘発を、枠ウイルス菌株の病原性の尺度として以前から用いている（バラーら、1988;チルドら、1990;フェナーら、1958;フレクスナーら、1987;ゲンドンおよびチャーノス、1964）。それゆえ、ワクシニア菌株WR（パニカリら、（1981）に記載されたような、ATCC＃VR119CV−１細胞上で精製したプラーク、ATCC＃CCL70、およびＬバリアントと称するプラーク単離体、選択したATCC＃VR2035）、WYETH（PA、マリエッタ、エスラボラトリーズによりDRYVACとして市販されているATCC＃VR325）、コペンハーゲン（VC−２）、およびNYVACによるid接種に関連する外傷の性質を、２匹のウサギの接種により評価した（A069およびA128）。２匹のウサギは、ウイルスに対して全体的に異なる感度を示した。すなわち、ウサギA128は、ウサギA069よりも強烈ではない反応を示した。ウサギA128において、外傷は比較的小さく、接種から27日後に消散した。ウサギA069では、外傷は酷く、WR接種部位では特に酷く、49日後に消散した。外傷の酷さはまた、リンパ球排液網に関連する接種部位の位置に依存した。特に、背の脊椎（backspine）より上に位置する全ての部位は、より酷い外傷を示し、側腹部に位置する外傷を消散するのにより長い時間が必要であった。全ての外傷を、４日目から最後の外傷が消えるまで毎日測定し、最大外傷サイズと消散までの日数の平均を計算した（表54）。対照PBSを注射した部位からは局部的な反応は観察されなかった。WR、VC−２、およびWYETHワクシニアウイルス菌株を注射した部位では潰瘍外傷が観察された。特に、NYVACを接種した部位では、硬結または潰瘍外傷は観察されなかった。
接種部位での感染細胞の残存率
接種部位でのこれらのウイルスの相対的残存率を評価するために、ウサギに、106、107または108pfuのVC−２、WR、WYRTHまたはNYVACを含有する0.1mlのPBSを様々な部位に皮内に接種した。各ウイルスに関して、背の脊椎の上の位置に107pfuの投与量と、その側腹に106および108の投与量を与えた。11日間に亘り、接種部位を毎日観察した。WRは、最も強烈な応答を誘発し、次にはVC−２とWYETHが続いた（表55）。WRとWYETHに関しては、９日目に、VC−２に関しては10日目に、潰瘍が観察された。NYVACまたは対照PBSを接種した部位は、硬結また潰瘍を示さなかった。接種から11日目に、接種の部位から皮膚の試料を切除し、機械的に分断し、ウイルスをCEF細胞上で滴定した。その結果を表55に示す。この時点で、投与したよりも回収したウイルスが多いことはなかった。投与したウイルスの量にかかわりなく、カーワクシニア菌株WRの回収は、各部位で約106pfuであった。ワクシニア菌株WYETHおよびVC−２の回収は、投与量にかかわらず103から104pfuであった。NYVACを接種した部位からは、感染ウイルスは回収されなかった。
遺伝子的または化学的免疫不全ネズミの接種
多量の投与量のNYVAC（５×108pfu）またはALVAC（109pfu）のヌードネズミへの腹腔内接種では、100日間の観察期間に亘り、死亡、外傷、およ明らかな疾病とはならなかった。これに対して、WR（103から104pfu）、WYETH（５×107または５×108pfu）またはVC−２（104から109pfu）を接種したネズミは、最初に爪先、次いで尾のポックスウイルスに典型的な広がった外傷を示し、続いてある動物ではこう丸炎を示した。WRまたはWYETHに感染したネズミにおいて、広がった外傷は一般的に、最終的には死亡を導き、一方ほとんどのVC−２に感染したネズミは最終的には回復した。計算したLD50値を表56に示す。
特に、VC−２を接種したネズミは、爪先に外傷を示し始め（赤い丘疹）、１から２日後には尾に示した。これらの外傷は、最高の投与量（109、108、107および106pfu）を与えたネズミでは接種後（pi）11と13日の間、105pfuを与えたネズミではpi16日目、そして104pfuを与えたネズミではpi21日目に生じた。103および102pfuを接種したネズミには100日の観察期間中は、外傷は観察されなかった。109から108pfuを与えたネズミにはpi23日目に、こう丸炎が観察され、他の群（107から104pfu）では約７日後に観察された。こう丸炎は、109と108pfuの群に特に強烈であったが、100日の観察期間の終りには、減退が観察された。数ひきのネズミの皮膚には、痘状の外傷がいくつか観察され、これはpi30−35日辺りに生じた。ほとんどの痘外傷は、通常pi60−90日の間に直った。109pfuを接種した群では１匹のネズミが死亡し（pi34日）、108pfuを接種した群では１匹のネズミが死亡した（pi94日）。VC−２接種ネズミでは他には死亡は観察されなかった。
104pfuのワクシニアのWR菌株を接種したネズミをpi17日目に痘外傷を示し始めた。これらの外傷は、VC−２注射ネズミ（膨れた爪先、尾）により示された外傷と同一であった。103pfuのWR菌株を接種したネズミは、pi34日目まで外傷を示さなかった。WRの最高投与量（104pfu）を接種したネズミのみにこう丸炎が観察された。観察期間の後半の段階に亘り、外傷が口の回りに発生し、ネズミは餌を食べるのをやめた。104pfuのWRを接種した全てのネズミは死亡したか、またはpi21と31日の間に必要な場合には安楽死させた。103pfuのWRを接種した５匹のネズミのうち４匹は死亡したか、またはpi35と57日の間に必要な場合には安楽死させた。低い投与量（１から100pfu）のWRを接種したネズミには死亡したものはなかった。
より多量（５×107および５×108pfu）の投与量のワクシニアウイルスのWYETH菌株を接種したネズミは、爪先と尾に外傷を示し、こう丸炎を発達させ、死亡した。５×106pfuまたはそれ未満のWYETHを接種したネズミは、疾病または外傷の徴候を示さなかった。
表56に示すように、CY処理ネズミは、ヌードネズミよりもポックスウイルスの毒性をアッセイするのにより感度のあるモデルを提供した。このモデル系において、WR、WYETH、およびVC−２ワクシニアウイルス菌株のLD50値は、ヌードネズミモデルよりも著しく低かった。加えて、以下に記載するように、WYETH、WRおよびVC−２ワクシニアウイルスを接種したネズミには外傷が発達し、各ウイルスの投与量が多ければ多いほど、外傷の形成が急速であった。ヌードネズミに見られるように、NYVACまたはALVACを接種したCY処理ネズミは外傷を発達せしめなかった。しかしながら、ヌードネズミのようではなく、投与量にかかわらず、NYVACまたはALVACを抗原投与したCY処理ネズミはその何匹かが死亡した。これらの偶発的な発生は、死因に関しては、疑わしい。
全ての投与量のWYETH（9.5×104から9.5×108pfu）を接種したネズミは、尾におよび／または爪先死pi7と15日の間に痘外傷を示した。加えて、尾と爪先は膨れた。尾の外傷の展開は、丘疹、潰瘍および最終的にかさぶたの形成とともに痘外傷の典型であった。全ての投与量のVC−２（1.65×105から1.65×109）を接種したネズミもまた、尾および／または爪先に、WYETH接種ネズミの外傷と相同な痘外傷を発達させた。これらの外傷は、接種から７−12日後に観察された。低い投与量のWRウイルスを接種したネズミには外傷は観察されなかったが、これらの群には死亡したネズミがいた。
NYVAC−RGの効力検定
産生したNYVAC菌株が有用なベクターとなる能力を著しくは変更することなく、ワクシニアウイルスのコペンハーゲン菌株の弱毒化が行なわれたことを決定するために、比較効力検定を行なった。ウイルスを弱毒化するために行なった連続遺伝子操作に間にベクターの免疫原をモニターするために、レポーター外因抗原として狂犬病ウイルス糖タンパク質を用いた。狂犬病糖タンパク質遺伝子を発現するベクターの防御効能を狂犬病の標準NIHネズミ効力検定により評価した（セリグマン、1973）。表57は、高度に弱毒化されたNYVACベクターに得られたPD50値は、tk座に狂犬病糖タンパク質遺伝子を含有するコペンハーゲンベースの組換え体を用いて得られたものと同一であり（キーニーら、1984）、アビアン種への複製に制限されたカナリヤポックスベースのベクター、ALVAC−RGに得られたPD50値と同様である。
観察
既知の毒性遺伝子が欠損し、制限された生体外成長特性を有する、NYVACを、動物モデル系で分析し、その弱毒化特性を評価した。神経毒性ワクシニアウイルス研究所菌株、WR、２つのワクシニアウイルスワクチン菌株、WYETH（ニューヨーク市保険局）およびコペンハーゲン（VC−２）、並びにカナリヤポックスウイルス菌株、ALVACとの比較で、これらの研究を行なった（実施例24参照）。これらのウイルスは、ネズミ抗原投与モデルとウサギ皮膚モデルにおける相対病原能力の範囲を提供し、WRは最も毒性のある菌株であり、WYETHおよびコペンハーゲン（VC−２）は報告した特性を有する、以前に使用した弱毒化したワクシニア菌株を提供し、ALVACは複製がアビアン種に制限されるポックスウイルスの実施例を提供した。これらの体内分析からの結果は、ワクシニアウイルス菌株、WR、WYETHおよびコペンハーゲン（VC−２）に関連するNYVACの高度に弱毒化された特性を明確に示す（表28−29、53−57）。特に、NYVACのLD50値は、アビアン宿主制限アビポックスウイルス、ALVACに観察された値と一致した。NYVAC、並びにALVACにより死亡は、頭蓋内経路により非常に多量の投与量のウイルスが投与されたときのみに、観察された（実施例24、表28、29、56）。それでも、これらの死亡が高いタンパク質質量の接種の非特異的な結果によるものであるかどうかは分かっていない。免疫無防備状態のネズミモデル（ヌードおよびCY処理）の分析結果は、WR、WYETHおよびコペンハーゲン菌株と比較して、NYVACの比較的高度に弱毒化された特性を示す（表54および55）。著しくは、NYVAC接種動物またはALVAC接種動物には、観察期間に亘り、広がったワクシニア感染または接種の疾病の証拠は観察されなかった。NYVACの多重毒性感染遺伝子の欠損は、病原性に関して相乗効果を示す。ウサギの皮膚への皮膚内投与により、NYVACの無害性の別の測定を提供した（表54および55）。非アビアン種中では複製できないウイルスであるALVACに関する結果を考慮すると、接種部位での複製能力は、ALVACの皮内接種が投与量依存方法において硬結の領域を生じるので（未公表の観察）、反応性に相関する唯一のものではない。それゆえ、ウイルスの複製容量以外の要因が外傷の形成に帰すると言えそうである。NYVAC中の遺伝子の欠損は、外傷の発生を妨げる。
これとともに、この実施例と、実施例24を含む前述した実施例の結果は、WR、および以前に用いたワクシニアウイルスワクチン菌株、WYETHとコペンハーゲンに対するNYVACの高度に弱毒化された性質を示す。実際、検定した動物モデル系における、NYVACの病原プロファイルは、アビアン種のみにおいて生産的複製をすることが知られているポックスウイルス、ALVACのプロファイルと同様であった。ヒトおよび、ネズミ、ブタ、イヌおよびウマを含む他の種から誘導した細胞上で生産的に複製するNYVACの明確に制限された容量により、ワクチン未接種接触または一般的な環境への潜在的な伝染を制限または妨げる重要なバリアを提供し、加えて、ワクチン接種した個体内の減少した繁殖の可能性を有するベクターを提供する。
特に、NYVACベースのワクチン候補は、有効であることが分かった。多くの病原から異種遺伝子産生物を発現するNYVAC組換え体は、霊長類を含むいくつかの動物種中の異種遺伝子産生物に対する免疫学的応答を誘発した。特に、狂犬病糖タンパク質を発現するNYVACベースの組換え体は、致死量狂犬病抗原投与に対してネズミを防御することができた。NYVACベースの狂犬病糖タンパク質組換え体の効力は、tk座に狂犬病糖タンパク質を過含有するコペンハーゲンベースの組換え体のPD50値に匹敵した（表57）。NYVACベースの組換え体はまた、ウサギの麻疹ウイルス中和抗体およびブタの仮性狂犬病ウイルスと日本脳炎ウイルス抗原投与に対する防御を誘発することが示された。高度に弱毒化されたNYVAC菌株には、ヒトと獣医用途について安全性の利点がある（タータグリアら、1990）。さらに、一般的な研究所発現ベクター系としてのNYVACの使用は、ワクシニアウイルスのしように関する生物学的危険を著しく減少する。
以下の基準により、この実施例および実施例24を含む、前述した実施例の結果により、NYVACが高度に弱毒化されていることが分かる:a）接種部位に硬結または潰瘍が検出不可能（ウサギの皮膚）;b）接種の皮内部位からの感染ウイルスの急速な除去（ウサギの皮膚）;c）精巣炎症がない（ヌードネズミ）;d）著しく低減した毒性（頭蓋内抗原投与、生後３週間と新生ネズミの両者）;e）著しく提言した病原性および免疫不全対象で伝染しないこと（ヌードおよびシクロホスファミド処理したネズミ）；およびｆ）著しく低減した様々なヒト組織培養細胞上の複製能力。それでも、高度に弱毒化されているにもかかわらず、ベクターとしてのNYVACは、外因抗原に対して強い免疫応答を誘発する能力を保持している。
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Claims (16)

  1. カナリアポックスウイルスの野生型の単離体に由来し、ニワトリ胚繊維芽細胞での200回を越える連続継代、それに続くマスターウイルス種の４回の連続プラーク精製、さらに５回の更なる連続継代による増幅によって弱毒化されたカナリアポックスウイルスであるALVACを含む組換えカナリアポックスウイルス。
  2. 非ポックスウイルス源からの外因性DNAをさらに含み、該非ポックスウイルス源が、狂犬病ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、麻疹ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、エプスタインバーウイルス、単純ヘルペスウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ウマヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、ウシウイルス性下痢性ウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、イヌパルボウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコヘルペスウイルス、ハンターンウイルス、C.tetani、鳥類インフルエンザウイルス、ムンプスウイルスおよびニューカッスル病ウイルスからなる群より選択されることを特徴とする請求項１記載の組換えカナリアポックスウイルス。
  3. 前記非ポックスウイルス源が狂犬病ウイルスであるところの、vCP65またはvCP136であることを特徴とする請求項２記載の組換えカナリアポックスウイルス。
  4. 前記非ポックスウイルス源がヒト免疫不全ウイルスであるところの、vCP95、vCP112、vCP60、vCP61、vCP125、vCP124、vCP126、vCP144、vCP120、vCP138、vCP117、vCP130、vCP152、vCP155、vCP156、vCP146、vCP148、vCP154、vCP168またはvCP153であることを特徴とする請求項２記載の組換えカナリアポックスウイルス。
  5. 前記非ポックスウイルス源がウマヘルペスウイルスであるところの、vCP132であることを特徴とする請求項２記載の組換えカナリアポックスウイルス。
  6. 前記非ポックスウイルス源がヒトサイトメガロウイルスであるところの、vCP139であることを特徴とする請求項２記載の組換えカナリアポックスウイルス。
  7. 前記非ポックスウイルス源がイヌパルボウイルスであるところの、vCP123またはvCP136であることを特徴とする請求項２記載の組換えカナリアポックスウイルス。
  8. 前記非ポックスウイルス源がエプスタインバーウイルスであるところの、vCP167であることを特徴とする請求項２記載の組換えカナリアポックスウイルス。
  9. 前記非ポックスウイルス源がウマインフルエンザウイルスであるところの、vCP128またはvCP159であることを特徴とする請求項２記載の組換えカナリアポックスウイルス。
  10. 前記非ポックスウイルス源がネコ白血病ウイルスであるところの、vCP177、vCP83、vCP35、vCP37、vCP87、vCP93またはvCP97であることを特徴とする請求項２記載の組換えカナリアポックスウイルス。
  11. 前記非ポックスウイルス源がネコヘルペスウイルスであるところの、vCP162であることを特徴とする請求項２記載の組換えカナリアポックスウイルス。
  12. 前記非ポックスウイルス源がハンターンウイルスであるところの、vCP114またはvCP119であることを特徴とする請求項２記載の組換えカナリアポックスウイルス。
  13. 前記非ポックスウイルス源がＢ型肝炎ウイルスであるところの、vCP169またはvCP157であることを特徴とする請求項２記載の組換えカナリアポックスウイルス。
  14. 前記非ポックスウイルス源がC.tetaniであるところの、vCP161であることを特徴とする請求項２記載の組換えカナリアポックスウイルス。
  15. 前記非ポックスウイルス源がムンプスウイルスであるところの、vCP171であることを特徴とする請求項２記載の組換えカナリアポックスウイルス。
  16. 前記非ポックスウイルス源がサル免疫不全ウイルスであるところの、vCP172であることを特徴とする請求項２記載の組換えカナリアポックスウイルス。
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