CZ295808B6 - Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara - Google Patents

Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara Download PDF

Info

Publication number
CZ295808B6
CZ295808B6 CZ20031366A CZ20031366A CZ295808B6 CZ 295808 B6 CZ295808 B6 CZ 295808B6 CZ 20031366 A CZ20031366 A CZ 20031366A CZ 20031366 A CZ20031366 A CZ 20031366A CZ 295808 B6 CZ295808 B6 CZ 295808B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
mva
virus
vaccine
human
genome
Prior art date
Application number
CZ20031366A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20031366A3 (cs
Inventor
Paul Chaplin
Paul Howley
Christine Meisinger
Original Assignee
Bavarian Nordic A/S
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=8159864&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ295808(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Bavarian Nordic A/S filed Critical Bavarian Nordic A/S
Publication of CZ20031366A3 publication Critical patent/CZ20031366A3/cs
Publication of CZ295808B6 publication Critical patent/CZ295808B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/275—Poxviridae, e.g. avipoxvirus
    • A61K39/285—Vaccinia virus or variola virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/24011—Poxviridae
    • C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
    • C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16311—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV regulatory proteins
    • C12N2740/16322—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Řešení se týká oslabeného viru, který je odvozený od modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) a který je charakterizovaný ztrátou schopnosti se reproduktivně replikovat v lidských buněčných liniích. Dále popisuje rekombinantní viry odvozené od tohoto viru a použití tohoto viru nebo jeho rekombinantů jako léčiv nebo vakcíny. Dále je poskytnutý způsob indukce imunitní odpovědi také u imunokompromitovaných jedinců, jedinců s již existující imunitou vůči viru vakcinie nebo jedinců u nichž probíhá protivirová terapie.

Description

Oblast vynálezu
Předložený vynález se týká oslabeného viru, kteiý je odvozený od modifikovaného viru vakcinie typu Ankara (MVA) a který je charakterizovaný ztrátou schopnosti reproduktivní replikace na lidských buněčných liniích. Dále popisuje rekombinantní viry odvozené od tohoto viru a použití viru nebo jeho rekombinantů jako léčiva nebo vakcíny. Dále je poskytnutí způsob indukce imunitní odpovědi také u pacientů s porušenou imunitou, pacientů s již existující imunitou vůči viru vakcinie nebo pacientů u nichž probíhá protivirová terapie.
Dosavadní stav techniky
Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA) je příbuzný viru vakcinie, člena z rodu orthopoxvirů z čeledi poxviridae. MVA byl generován z kmene viru vakcinie typu Ankara (CVA) sérií 516 pasáží na fibroblastech kuřecích embryí (přehled viz Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14, (1975)). Důsledkem těchto dlouhodobých pasáží výsledný MVA virus deletoval kolem 31 kilobas své genomické sekvence a proto byl popsán jako vysoce omezen co do hostitelských buněk na ptačí buňky (Meyer, H. et al., J. Gen. Vir. 72, 1031-1038 (1991)). V různých zvířecích modelech bylo ukázáno, že výsledný MVA byl významně nevirulentní (Mayr, A. & Danner, K. 1978 Dev. Biol. Stand. 41: 225-34). Navíc byly tyto kmeny MVA testované v klinických pokusech jako vakcíny na imunizaci proti lidským neštovicím (Mayr, A. et al., Zbl. Bakt. Hyg. I, Abt. Org. B 167, 375-390 (1987), Stickl et al., Dtsch. Med. Wschr. 99, 2386-2392 (1974). Tyto studie zahrnovaly 120 000 lidí, včetně vysoko rizikových pacientů a prokázaly, že v porovnání s vakcínami na bázi viru vakcinie, měl MVA zmenšenou virulenci nebo nakažlivost při zachování dobré imunogenicity.
V dalších desetiletích byl MVA genovým inženýrstvím upravený pro použití jako virový vektor pro expresi rekombinantního genu nebo jako rekombinantní vakcína (Sutter, G. et al. (1994), Vaccine 12: 1032-40.
Vzhledem k tomu je překvapující, že přestože Mayr et al. demonstrovali v 70. letech, že MVA je silně oslabený a v lidech a savcích nevirulentní, některá nedávno uvedená pozorování (Blanchard et al., 1998, J. Gen. Virol. 79, 1159-1167; Carroll & Moss, 1997, Virology 238, 198-211; Altenberger, patent US 5 185 146; Ambrosini et al., 1999, J. Neurosci. Res. 55(5), 569) ukázala, že MVA není úplně oslabený v savčích a lidských buněčných liniích, protože může dojít k reziduální replikaci v těchto buňkách. Předpokládá se, že výsledky uváděné v těchto publikacích byly získány s různými kmeny MVA, protože použité viry se podstatně liší ve svých vlastnostech, zejména v růstovém chování v různých buněčných liniích.
Růstové chování je uznáváno jako indikátor pro oslabení viru. Obecně je kmen viru považovaný za oslabený, když ztratil schopnost nebo má jen sníženou schopnost reproduktivní replikace v hostitelských buňkách. Výše uvedená pozorování, že MVA není schopný úplné replikace v lidských a savčích buňkách, zpochybňuje absolutní bezpečnost MVA jako vakcíny pro lidi nebo jako vektor pro rekombinantní vakcíny.
Zejména pro vakcínu, jako i pro rekombinantní vakcínu je mimořádně důležitá rovnováha mezi účinností a bezpečností.
Cílem předloženého vynálezu je poskytnutí nových kmenů virů se zvýšenou bezpečností pro vývoj bezpečnějších produktů jako jsou vakcíny a farmaceutické přípravky. Dalším cílem předloženého vynálezu je poskytnutí prostředků pro zlepšení dosavadního vakcinačního režimu.
-1 CZ 295808 B6
Podstata vynálezu
Předmětem předloženého vynálezu je modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA), a to MVA uložený v Evropské sbírce mikroorganizmů (ECACC), Salisbury (UK) pod číslem V00083008 (MVA-BN) nebo jeho deriváty, přičemž deriváty jsou (i) schopné reproduktivní replikace ve fibroblastech kuřecích embryí (CEF) a v ledvinných buněčných liniích křeččích mláďat BHK, ale nejsou schopné reproduktivní replikace v lidských buněčných liniích a (ii) selháním replikace in vivo, ve vážně imunokompromitovaných myších.
Význakem viru MVA podle předloženého vynálezu je, že lidské buněčné linie jsou buněčné linie lidského osteosarkomu 143B, lidské keratinocytové buněčné linie HaCat a buněčné linie lidského cervikálního adenokarcinomu HeLa.
Dalším význakem viru MVA podle předloženého vynálezu je, že vážně imunokompromitované myši jsou myši neschopné tvorby zralých B a T buněk, s výhodou AGR129 transgenní myši.
Význakem viru MVA podle předloženého vynálezu je dále to, zeje purifikovaný klonováním.
Dalším význakem viru MVA podle předloženého vynálezu je, že obsahuje alespoň jednu heterologní sekvenci nukleové kyseliny.
Heterologní sekvence nukleové kyseliny je podle vynálezu vybraná ze sekvence kódující alespoň jeden antigen, antigenní epitop a/nebo terapeutickou sloučeninu.
Význakem viru MVA podle předloženého vynálezu je dále to, že antigenní epitopy jsou vybrané z virů ze skupiny virus Influenza, Flavivirus, Paramyxovirus, virus hepatitidy, virus lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) nebo virů způsobujících hemoragickou horečku.
Dále je význakem MVA podle předloženého vynálezu, kde MVA je MVA-BN obsahující nef gen.
Předmětem předloženého vynálezu je rovněž genom MVA.
Dále je předmětem předloženého vynálezu farmaceutická kompozice obsahující virus MVA podle vynálezu a/nebo genom podle vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič, rozpouštědlo a/nebo přísadu.
Předmětem předloženého vynálezu je rovněž vakcína obsahující virus MVA podle vynálezu a/nebo genom podle vynálezu.
Význakem předloženého vynálezu je, že farmaceutická kompozice nebo vakcína obsahuje alespoň 102 TCID50 MVA.
Dalším význakem předloženého vynálezu je virus MVA, genom, kompozice nebo vakcína pro ovlivnění a/nebo indukci imunologické odpovědi v živých zvířatech, včetně lidí.
Předmětem předloženého vynálezu je virus MVA podle vynálezu, genom podle vynálezu a kompozice nebo vakcína podle vynálezu pro očkování živých zvířat, včetně člověka proti lidské neštovícové nemoci.
Význakem vynálezu je dále MVA, genom, kompozice nebo vakcína podle vynálezu pro očkování živých zvířat, včetně člověka proti lidské neštovicové nemoci, kde lidské neštovicové onemocnění jsou pravé neštovice.
-2CZ 295808 B6
Význakem vynálezu dále je MVA, genom, kompozice nebo vakcína podle předloženého vynálezu pro očkování, kde zvíře je imunokompromitované.
Význakem vynálezu dále je MVA, genom, kompozice nebo vakcína podle předloženého vynálezu pro očkování, kde zvíře má již existující imunitu vůči poxvirům.
Dále je význakem vynálezu MVA, genom, kompozice nebo vakcína pro očkování, kde zvíře prochází antivirovou terapii.
Význakem vynálezu dále je MVA, genom, kompozice nebo vakcína podle předloženého vynálezu pro očkování, kde antivirová terapie je antiretrovirovou terapií.
Předmětem předloženého vynálezu je dále MVA, farmaceutická kompozice nebo vakcína podle vynálezu, kde MVA, kompozice nebo vakcína se podává v terapeuticky účinných množstvích při primárním očkování a v posilujícím očkování.
Předmětem předloženého vynálezu je dále MVA podle vynálezu nebo genom podle vynálezu pro zavedení homologní a/nebo heterologní sekvence nukleové kyseliny do cílové buňky.
Předložený vynález rovněž zahrnuje použití MVA podle vynálezu a/nebo genomu podle vynálezu pro přípravu léčiva nebo vakcíny.
Význakem předloženého vynálezu je, že léčivo nebo vakcína podle předmětného vynálezu se podává pro indukci imunologické odpovědi živému zvířeti včetně člověka.
Význakem vynálezu je dále, že léčivo nebo vakcína se podle předmětného vynálezu používá proti lidským poxvirovým nemocím.
Význakem vynálezu je, že léčivo nebo vakcína podle vynálezu se používá tam, kde lidská poxvirová nemoc jsou pravé neštovice.
Dále je význakem předloženého vynálezu, že léčivo nebo vakcína podle vynálezu pro výše uvedené použití podle vynálezu obsahuje alespoň 102 TCID50 MVA.
Význakem vynálezu je výše uvedené použití podle vynálezu, kde MVA se podává v terapeuticky účinných množstvích při primárním očkování a v posilujícím očkování.
Vynález dále zahrnuje použití léčiva nebo vakcíny podle vynálezu pro podávání, kde zvíře je imunokompromitované.
Vynález rovněž zahrnuje použití léčiva nebo vakcíny podle vynálezu pro podávání, kde zvíře má již existující imunitu vůči poxvirům.
Význakem předloženého vynálezu je také použití léčiva nebo vakcíny pro podávání tam, kde zvíře prochází antivirovou terapií.
Vynález dále zahrnuje použití léčiva nebo vakcíny podle vynálezu, kdy zvíře prochází antivirovou terapií, přičemž antivirovou terapií je antiretrovirová terapie.
Předmětem předloženého vynálezu je MVA podle vynálezu jako adjuvans.
Předložený vynález zahrnuje rovněž použití MVA podle vynálezu jako adjuvans.
-3CZ 295808 B6
Předmětem vynálezu je způsob zavedení homologní a/nebo heterologní sekvence nukleové kyseliny do cílových buněk in vitro, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje infikování cílových buněk virem MVA podle vynálezu nebo transfekcí cílové buňky genomem podle vynálezu.
Předmětem vynálezu je rovněž způsob produkce peptidu, proteinu a/nebo viru MVA, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje
a) infikování hostitelské buňky virem MVA podle vynálezu,
b) kultivaci infikované hostitelské buňky za vhodných podmínek, a
c) izolaci a/nebo obohacení peptidu a/nebo proteinu a/nebo viru MVA produkovaného hostitelskou buňkou.
Předmětný vynález dále zahrnuje buňku, včetně lidské, obsahující MVA nebo genom podle vynálezu.
Předmětem předloženého vynálezu je způsob získání viru MVA podle vynálezu jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje následující kroky:
- zavedení obecně dostupného kmene viru vakcinie do jiných než lidských buněk, ve kterých je virus schopný reproduktivní replikace,
- izolaci/obohacení virových částic z těchto buněk a
- analýzu zda získaný virus má alespoň jednu z vynálezem definovaných biologických vlastností, přičemž výše uvedené kroky mohou být libovolně opakovány do té doby než se získá virus s požadovanými replikačními vlastnostmi.
Význakem způsobu získání viru MVA podle předloženého vynálezu je, že obecně dostupný kmen viru vakcinie je MVA 575.
Dále je význakem uvedeného způsobu získání viru MVA podle předloženého vynálezu, že jiné než lidské buňky jsou vybrané ze skupiny CEF buněk a BHK buněčných linií.
Předmětný vynález dále zahrnuje soupravu pro primámí/posilující imunizaci, obsahující virus MVA podle vynálezu, kompozici podle vynálezu nebo vakcínu podle vynálezu pro primární očkování v první ampuli/nádobce a pro posilující očkování v druhé ampuli/nádobce.
Podrobný popis vynálezu
K dosažení výše uvedených předmětů jsou podle výhodného provedení podle vynálezu poskytnuté nové viry vakcinie, které jsou schopné reproduktivní replikaci v jiných než lidských buňkách a buněčných liniích, zejména ve fibroblastech kuřecích embryí (CEF) a ledvinných buněčných liniích křeččích mláďat BHK (ECACC 85011433), ale nejsou schopné reproduktivní replikace v lidských buněčných liniích.
Známé kmeny vakcinie se reproduktivně replikují alespoň v některých lidských buněčných liniích, zejména v lidských keratinocytových buněčných liniích HaCat (Boukamp et al., 1988, J. Cell Biol. 106 (3):761-71). Replikace v buněčné linii HaCat je prediktivní pro replikaci in vivo, zejména pro in vivo replikaci v lidech. V příkladové části je ukázáno, že všechny známé testované kmeny vakcinie, které vykazují reziduální produktivní replikaci v HaCat se skutečně replikují
-4CZ 295808 B6 in vivo. Vynález se přednostně týká virů vakcinie, které se nereplikují produktivně v lidských buněčných liniích HaCat. Zejména se týká kmenů viru vakcinie, které nejsou schopné reproduktivní replikace v žádné s následujících lidských buněčných linií: lidské buněčné linie cervikálního adenokarcinomu HeLa (ATCC č. CCL-2), lidské embryonální ledvinné buněčné linie 293 (ECACC č. 85120802), lidské kostní osteosarkomální buněčné linie 143B (ECACC č. 91112502) a v buněčných liniích HaCat.
Růstové chování nebo amplifíkace/replikace viru je normálně vyjádřeno poměrem množství viru produkovaného infikovanou buňkou (výstup) k množství viru původně použitého pro infikování buněk na začátku (vstup) („amplifíkační poměr“). Poměr „1“ mezi výstupem a vstupem definuje stav amplifikace, kdy množství viru produkovaného infikovanými buňkami je stejné jako množství viru použitého na počátku pro infikování buněk. Tento stav poukazuje na skutečnost, že infikované buňky jsou permisivní pro virové infekce a reprodukci viru.
Amplifíkační poměr menší jako 1 tj. pokles amplifikace pod hladinu vstupuje ukazatel nedostatku reproduktivní replikace a tudíž ukazatel pro oslabení viru. Proto bylo v zájmu vynálezců identifikovat a nakonec izolovat kmen, který vykazuje amplifíkační poměr menší jako 1 ve vícero lidských buněčných liniích, zejména ve všech buněčných liniích 143B, HeLa, 293 a HaCat.
Termín „neschopný reproduktivní replikace“ tudíž znamená, že virus podle předloženého vynálezu vykazuje amplifíkační poměr menší než 1 v lidských buněčných liniích, jako jsou buněčné linie 293 (ECACC č. 85120602), 143B (ECACC č. 91112502), HeLa (ATCC č. CCL-2) a HaCat (Boukamp et al., 1988, J. Cell. Biol. 106 (3):761-71), za podmínek uvedených v příkladu 1 předloženého popisu pro některé specifické kmeny MVA. S výhodou je amplifíkační poměr viru podle předloženého vynálezu v každé z buněčných linií HeLa, HaCat a 143B 0,8 nebo menší.
V příkladu 1 a tabulce 1 je podrobně ukázáno, že viry podle předloženého vynálezu se nereplikují reproduktivně ani v jedné z buněčných linií 143B, HeLa a HaCat. Konkrétní kmen podle předloženého vynálezu, který byl použit v příkladech, byl uložen v Evropské sbírce mikroorganizmů pod číslem V00083008. Tento kmen je v celém popisu označován jako „MVA-BN“.
Známé kmeny MVA vykazují zbytkovou replikaci alespoň v jedné z testovaných lidských buněčných linií (obr. 1, příklad 1). Všechny známé kmeny vakcinie vykazují alespoň nějakou replikaci v buněčných liniích HaCat, zatímco kmeny MVA podle předloženého vynálezu, zejména MVABN, se nereplikují reproduktivně v HaCat buňkách. Podrobněji, MVA-BN vykazuje amplifíkační poměr 0,05 až 0,2 v lidské embryonální ledvinné buněčné linii 293 (ECACC č. 85120602). V lidské osteosarkomální buněčné linii 143B (ECACC č. 91112502) je poměr v rozmezí 0,0 až 0,6.
V lidské buněčné linii cervikálního adenokarcinomu HeLa (ATCC č. CCL-2) a lidské keratinocytové buněčné linii HaCat (Boukamp et al., 1988, J. Cell. Biol. 106(3):761-71) je amplifíkační poměr v rozmezí 0,04 až 0,8, případně 0,02 až 0,8. MVA-BN má amplifíkační poměr v ledvinných buňkách afrických zelených opic (kočkodan) (CV1: ATCC č. CCL-70) 0,01 až 0,06. Tudíž se MVA-BN, který je prototypový kmen podle předloženého vynálezu nereplikuje reproduktivně ani v jedné z testovaných buněčných liniích.
Amplifíkační poměr MVA-BN je jasně nad 1 ve fíbroblastech kuřecích embryí (CEF; primární kultury) nebo v ledvinné buněčné linii křeččích mláďat BHK (ATCC č. CRL-1632). Jak uvedeno výše, poměr vyšší než „1“ ukazuje reproduktivní replikaci, protože množství viru produkovaného infikovanými buňkami se zvýšilo v porovnání s množstvím viru, které bylo použito k infekci buněk. Proto může být virus snadno rozšiřován a amplifíkován v CEF primárních kulturách s poměrem nad 500 nebo v BHK buňkách s poměrem nad 50.
Další provedení podle předmětného vynálezu se týká derivátů viru uloženého pod číslem ECACC V0083008. „Deriváty“ virů uložené pod číslem ECACC V00083008 se týkají virů, které mají v podstatě stejné replikační charakteristiky jako uložený kmen, ale vykazují rozdíly v jedné nebo více částech jeho genomu. Viry, které mají stejné „replikační vlastnosti“ jako viry uložené, jsou
-5 CZ 295808 B6 viry jež se replikují ve stejných amplifíkačních poměrech jako uložené kmeny v CEF buňkách a v buněčných liniích BHK, HeLa, HaCat a 143B a vykazují podobnou replikaci in vivo jak bylo stanoveno v AGR129 transgenním myším modelu (viz dále).
Podle výhodného provedení jsou kmeny viru vakcinie podle předloženého vynálezu, obzvláště MVA-BN a jeho deriváty, charakterizované chybějící replikací in vivo. V souvislosti s předloženým vynálezem se „chybějící replikace in vivo“ týká virů, které se nereplikují v lidech a myším modelu popsaném níže. Chybějící replikace in vivo se s výhodou stanovuje u myší, které nejsou schopné tvorby zralých B a T buněk. Příkladem takové myši je transgenní myší model AGR129 (získaný od Marka Suttera, Institute of Virology, University of Zurich, Zurich, Švýcarsko). Tento myší kmen má geneticky cílené disrupce v IFN receptoru typu I (IFN-α β) a typu II (IFN γ) genů a v RAG. V důsledku těchto disrupcí nemají myši žádný IFN systém a nejsou schopny tvorby zralých B a T buněk a jako takové jsou silně imunokompromitované (mají silně porušenou imunitu) a jsou silně vnímavé vůči replikujícímu se viru. Namísto AGR129 myši lze použít jiný kmen myší, který není schopný tvorby zralých B a T buněk a jako takový je silně imunokompromitovaný a je vysoce vnímavý vůči replikujícímu se viru. Konkrétně viry podle předloženého vynálezu nezabíjejí AGR129 myši v době nejméně 45 dnů, s výhodou do 60 dnů, nebo až 90 dnů po infekci myší s 107 pfu viru podaného intraperitoneálně. S výhodou jsou viry vykazující defekt v replikaci in vivo dále charakterizované tím, že žádný virus nemůže být znovu získán z orgánů nebo tkání AGR129 myší po 45 ti dnech, s výhodou 60 dnech a nejlépe 90 ti dnech po infekci myší s 107 pfu viru aplikovaného intraperitoneálně. Podrobné informace týkající se infekčních testů s AGR129 myším a testy použité na stanovení zda virus může být opětně získán z orgánů a tkání jsou k nalezení v příkladové části.
Podle výhodného provedení jsou kmeny viru vakcinie podle předloženého vynálezu, zejména MVA-BN a jeho deriváty, vyznačené vyšší imunogenicitou v porovnání se známým kmenem MVA 575 jak bylo stanoveno při vyvolání smrtící odezvy v myším modelu. Podrobnosti tohoto pokusu jsou popsané v příkladu 2. Ve stručnosti, v takovém modelu nevakcinované myši umírají po infekci replikačně kompetentním kmenem viru vakcinie jako například s Western Reserve kmenem L929 TK+ nebo IHD-J. Infekce s replikačně kompetentním virem vakcinie se v kontextu s popisem modelu vyvolání smrtící odezvy uvádí jako expozice (výzva). Čtyři dny po expozici jsou myši obyčejně usmrceny a je stanovený virový titr ve vaječnících standardním plakovým testem za použití Věro buněk (více podrobností je v příkladové části). Virové titry byly stanoveny pro nevakcinované myši a pro myši vakcinované s viry vakcinie podle předloženého vynálezu. Podrobněji, viry podle předloženého vynálezu jsou charakterizované tím, že vtomto testu po vakcinaci s 102 TQD5o/ml viru podle vynálezu titry viru ve vaječnících jsou zredukované o nejméně 70 %, s výhodou nejméně 80 %, nejlépe 90 % v porovnání s nevakcinovanými myšemi.
Podle výhodného provedení jsou viry vakcinie podle předloženého vynálezu, zejména MVA-BN a jeho deriváty užitečné pro imunizaci podáváním vakcíny jako primámí/posilující očkování. Byla řada zpráv předpokládajících, že očkovací režimy primámí/posilující za použití MVA jako transportního vektoru indukuje jen slabé imunitní odpovědi a jsou horší než režimy DNA primární a MVA posilující (Schneider et al., 1998, Nat. Med. 4; 397-402). Ve všech těchto studiích byly použity MVA kmeny, které se liší od virů vakcinie podle předloženého vynálezu. Na vysvětlení slabé imunitní odpovědi, když MVA byl použit pro primární a posilující očkování byla přijata hypotéza, že protilátky vytvářené proti MVA během primárního podávání neutralizují MVA podaný při druhé imunizaci, bráníce tak účinnému posílení imunitní odpovědi. Na rozdíl od toho bylo referováno, že očkovací režimy DNA primámí/MVA posilující lépe generují odpovědi vysoké avidity, protože tento režim spojuje schopnost DNA účinně senzibilizovat imunitní odpověď s vlastnostmi MVA posílit tuto odpověď při absenci již dříve existující imunity vůči MVA. Je jasné, že když již dříve existující imunita vůči MVA a/nebo vakcinii brání posílení imunitní odpovědi, potom použití MVA jako vakcíny nebo terapeutického prostředku by mělo jen omezenou účinnost, zejména u jedinců, kteří byli očkováni proti pravým neštovicím. Avšak podle dalšího provedení virus vakcinie podle předloženého vynálezu, zejména MVA-BN a jeho
-6CZ 295808 B6 deriváty, jakož i odpovídající rekombinantní viry obsahující heterologní sekvence, lze použít pro účinné vyvolání imunitních odpovědí prvním očkováním a potom jejich posílení jak u novorozených zvířat, tak u zvířat s již dříve existující imunitou proti poxvirům. Tudíž virus vakcinie podle předloženého vynálezu indukuje alespoň v podstatě stejnou hladinu imunity v očkovacím režimu virus vakcinie primámí/virus vakcinie posilující ve srovnání s očkovacími režimy DNA primární/virus vakcinie posilující.
Virus vakcinie je považován za vir indukující alespoň v podstatě stejnou hladinu imunity v očkovacím režimu virus vakcinie primámí/virus vakcinie posilující ve srovnání s očkovacími režimy DNA primámí/virus vakcinie posilující, jestliže CTL odpověď tak jak byla měřená v jednom z následujících testů (test 1 a test 2), s výhodou v obou testech, je nejméně v podstatě stejná v režimech virus vakcinie primámí/virus vakcinie posilující v porovnání s režimy DNA-primámí/virus vakcinie posilující. S výhodou je CTL odpověď po podávání virus vakcinie primámí/virus vakcinie posilující vyšší v alespoň jednom testu v porovnání s režimy DNA-primámí/virus vakcinie posilující. Nejvýhodnější je je-li CTL odpověď vyšší v obou následujících testech.
Test 1
Pro podávání virus vakcinie primámí/virus vakcinie posilující, byly 6-8-týdnů staré BALB/c (H2d) myši primárně imunizované (základní imunizace) intravenózní aplikaci 107 TCID50 viru vakcinie podle předmětného vynálezu exprimující myší polytop popsaný Thomsonem et al, 1988, J. Immunolog. 160,1717, a posilující imunizace byla provedena stejným množstvím stejného viru, podaného tím samým způsobem o tři týdny později. Závěrem je nezbytné vytvořit rekombinantní virus vakcinie exprimující tento polytop. Způsoby vytváření takových rekombinantních virů jsou odborníkům v oboru známé a jsou dále podrobněji popsané. V režimech DNA primární/virus vakcinie viru posilující je primární vakcinace myší provedena nitrosvalovou injekcí s 50 pg DNA exprimující stejný antigen jako virus vakcinie; posilující podávání viru vakcinie se provádí přesně stejným způsobem jako při aplikaci virus vakcinie primámí/virus vakcinie posilující. Plazmid DNA exprimující polytop je rovněž popsaný ve výše uvedené publikaci Thomson et al. V obou režimech byla CTL odpověď vůči epitopům SYIPSAEKI, RPQASGVYM a/nebo YPHFMPTNL stanovena dva týdny po podávání posilující dávky. Stanovení CTL odpovědi se s výhodou provádí za použití ELISPOT analýzy jak je popsáno v Schneider et al., 1998, Nat. Med. 4, 397-402 a jak je dále popsáno v příkladech projeden specifický viros podle předloženého vynálezu. Viros podle předloženého vynálezu je charakterizovaný v tomto experimentu tak, že CTL imunitní odpověď vůči výše uvedeným epitopům, která je indukovaná podáváním virus vakcinie primámí/virus vakcinie posilující je v podstatě stejná, s výhodou alespoň stejná jako imunitní odpověď indukovaná při podávání DNA-primámí/virus vakcinie posilující jak bylo stanoveno počtem IFN-γ produkujících buněk/106 spleen buněk (viz experimentální část).
Test 2
Tento test v zásadě odpovídá testu 1. Avšak namísto 107 TQDS0 viru vakcinie podaného intravenózně jako v testu 1, se v tomto testu 108 TCID50 viru vakcinie podle předloženého vynálezu aplikuje podkožně, jak při primární imunizaci, tak při posilující imunizaci. Virus podle předloženého vynálezu je charakterizovaný v tomto experimentu tím, že CTL imunitní odpověď vůči epitopům výše uvedeným, indukovaná podáváním viros vakcinie primámí/virus vakcinie posilující je v podstatě stejná, s výhodou alespoň stejná jako imunitní odpověď indukovaná při podávání DNA-primámí/virus vakcinie posilující, jak bylo stanoveno počtem IFN-γ produkujících buněk/106 spleen buněk (viz experimentální část).
Síla CTL odpovědi změřená v jednom z uvedených testů odpovídá hladině ochrany. Viry podle předloženého vynálezu jsou tedy obzvlášť vhodné pro vakcinační účely.
Souhrnně je virus vakcinie podle předloženého vynálezu charakterizovaný tím, že má alespoň jednu z následujících vlastností:
-7CZ 295808 B6 (i) schopnost reproduktivní replikace ve fíbroblastech kuřecích embryí (CEF) a buněčných liniích BHK, ale nemá schopnost reproduktivní replikace v lidských buněčných liniích HaCat, (ii) selhání replikace in vivo, (iii) indukce vyšší imunogenicity v srovnání se známým kmenem MVA 575 (ECACC V00120707) v modelu smrtící expozice a/nebo (iv) indukce alespoň v podstatě stejné hladiny imunity v režimech virus vakcinie primámí/virus vakcinie posilující ve srovnání s režimy DNA-primámí/virus vakcinie posilující.
S výhodou má virus vakcinie podle předloženého vynálezu alespoň dvě z výše uvedených vlastností, výhodněji alespoň tři z uvedených vlastností. Nejvýhodnější jsou viry vakcinie mající všechny z výše uvedených vlastností.
Dalším provedením vynálezu je souprava pro vakcinaci, která obsahuje virus podle předloženého vynálezu pro první vakcinaci v první ampulce/nádobce a pro druhou posilující vakcinaci v druhé ampulce/nádobce. Virus může být nerekombinantní virus vakcinie např. virus vakcinie, který neobsahuje heterologní nukleotidové sekvence. Příkladem takového virus vakcinie je MVA-BN a jeho deriváty. Alternativně může být virus rekombinantním virem vakcinie, který obsahuje další nukleotidové sekvence, které jsou heterologní k viru vakcinie. Jak je uvedeno v jiných částech popisu heterologní sekvence mohou kódovat epitopy, které indukují odpověď imunitního systému. Takže je možné použít rekombinantní virus vakcinie pro vakcinaci proti proteinům nebo činidlům obsahujícím řečený epitop. Vity mohou být upravené do aplikovatelné formy jak je uvedeno níže podrobněji. Množství viru, které má být použito pro každou vakcinaci bylo definováno výše.
Pro osobu znalou oboru je jasné, jak získat virus vakcinie mající alespoň jednu z následujících vlastností:
- schopnost reproduktivní replikace ve fíbroblastech kuřecích embryí (CEF) a ledvinných buněčných liniích křeččích mláďat BHK, ale neschopné reproduktivní replikace v lidských keratinocytových buněčných liniích HaCat,
- selhání replikace in vivo,
- indukce vyšší imunogenicity v porovnání se známým kmenem MVA 575 v modelu smrtící expozice a/nebo
- indukce alespoň v podstatě stejné hladiny imunity v režimech virus vakcinie primámí/virus vakcinie posilující v porovnání s režimy DNA-primámí/virus vakcinie posilující.
Způsob k získání takového viru zahrnuje následující kroky:
(i) zavedení známého kmene viru vakcinie s výhodou MVA 574 nebo MVA 575 (ECACC V00120707) do jiných než lidských buněk, ve kterých je virus schopný reproduktivní replikace, kde jiné než lidské buňky jsou s výhodou vybrané z buněk CEF a buněčných linií BHK, (ii) izolaci/obohacení virových částic z těchto buněk a (iii) analýzu, zda získaný virus má alespoň jednu z dříve definovaných biologických vlastností,
-8CZ 295808 B6 přičemž výše uvedené kroky mohou být libovolně opakovány do té doby než se získá virus s požadovanými replikačními charakteristikami. Vynález se dále týká virů získaných způsobem podle předloženého vynálezu. Způsoby jakými mohou být požadované biologické vlastnosti stanoveny jsou vysvětleny v jiných částech popisu.
Při použití tohoto způsobu vynálezci identifikovali a izolovali několikanásobným čištěním klonu kmen podle předloženého vynálezu vycházejíce z MVA izolátu pasáže 575 (MVA 575). Tento nový kmen odpovídá kmeni s přístupovým číslem ECACC V0083008, který je uvedený výše.
Růstové chování virů vakcinie podle předloženého vynálezu, zejména růstové chování MVA-BN ukazuje, že kmeny podle předloženého vynálezu převyšují jakýkoliv dosud charakterizovaný MVA izolát pokud se týče oslabení v lidských buněčných liniích a neschopnosti in vivo replikace. Kmeny podle vynálezu jsou proto ideálními kandidáty pro vývoj bezpečnějších produktů jako vakcín nebo farmaceutických přípravků jak jsou dále popsané.
V jednom provedení je virus podle předloženého vynálezu, zejména MVA-BN a jeho deriváty, použitý jako vakcína proti lidských neštovicovým nemocím, jako jsou pravé neštovice. Podle dalšího provedení může být virus podle předloženého vynálezu rekombinantní, tj. může exprimovat heterologní geny jako například antigeny nebo epitopy heterologní k viru a může tak být užitečný jako vakcína k indukci imunitní odpovědi vůči heterologním antigenům nebo epitopům.
Termín „imunitní odpověď“ znamená reakci imunitního systému při vstupu cizorodé látky nebo mikroorganizmu do organizmu. Podle definice je imunitní odpověď rozdělená na specifickou a nespecifickou, přestože jsou obě úzce spojené. Nespecifická imunitní odpověď je okamžitá obranná reakce na široký okruh cizorodých látek a infekčních činidel. Specifická imunitní odpověď je obrana vyvolaná se zpožděním, když organizmus je napaden látkou poprvé. Specifická imunitní odpověď je vysoce účinná a odpovídá za skutečnost, že jedinec, který se vyléčil ze specifické infekce je chráněný proti této specifické infekci. Tudíž druhá infekce tím samým nebo velice podobným infekčním činidlem způsobuje o mnoho mírnější příznaky nebo vůbec žádné příznaky, protože již existuje imunita na toto činidlo. Tudíž se indukce imunitní paměti může použít pro vakcinaci.
„Imunitní systém“ představuje komplex orgánů zapojených do obrany organizmu proti cizorodým látkám a mikroorganizmům. Imunitní systém sestává z části buněčné zahrnující různé typy buněk jako například lymfocyty a jiné buňky odvozené od buněk bílých krvinek, a části humorální zahrnující malé peptidy a komplementární faktory.
„Vakcinace“ znamená, že organizmus je vystavený účinku infekčního činidla například oslabené nebo inaktivované formě tohoto infekčního činidla, aby se vyvolala specifická imunita. Termín vakcinace pokrývá také vystavení organizmu účinku rekombinantního viru vakcinie podle předloženého vynálezu, zejména rekombinantního viru MVA-BN a jeho derivátů, exprimujících antigeny a epitopy, které jsou heterologní k viru. Příklady takových epitopů jsou uvedeny v jiných částech popisu a zahrnují například epitopy z proteinů odvozených od jiných virů jako virus Dengue, virus Hepatitis C, HIV nebo epitopy odvozené od proteinů, které jsou spojovány s vývojem nádorů a rakoviny. Po podání rekombinantního viru vakcinie od organizmu jsou epitopy exprimované a prezentované do imunitního systému a je indukovaná specifická imunitní odpověď vůči těmto epitopům. Organizmus je tak imunizovaný vůči činidlu/proteinu obsahujícímu epitop, který je kódovaný rekombinantním virem vakcinie.
„Imunita“ znamená částečnou nebo úplnou ochranu organizmu proti nemocím způsobeným infekčním činidlem v důsledku úspěšné eliminace předchozí infekce uvedeným infekčním činidlem nebo jeho charakteristickou částí. Imunita je založena na existenci, indukci a aktivaci specializovaných buněk imunitního systému.
-9CZ 295808 B6
Jak je výše uvedeno v jednom provedení vynálezu, rekombinantní virus podle předloženého vynálezu, zejména rekombinantní MVA-BN a jeho deriváty, obsahují alespoň jednu heterologní sekvenci nukleové kyseliny. Termín „heterologní“ je dále používán pro každou kombinaci sekvencí nukleových kyselin, které nejsou normálně úzce spojované s přírodním virem, takový virus se rovněž nazývá „rekombinantní virus“.
lou anligenni epitopy, vybrané z jiného zdroje než vakcinie. Výhodněji tento rekombinantní virus exprimuje jeden nebo více antigenních epitopů zPlasmodium falsiparum, Mycobacteria, virus Influenza, z virů vybraných z čeledi Flaviviry, Paramyxoviry, viry hepatitidy, virus imunitní nedostatečnosti (HIV) nebo virů způsobujících hemoragickou horečku jako Hantaviry nebo Filoviry jako například Ebola nebo virus Marburg.
Podle dalšího provedení vynálezu a návdavkem k výše uvedenému výběru antigenních epitopů mohou být heterologní sekvence vybrány z jiného zdroje poxviru nebo viru vakcinie. Tyto virové sekvence lze použít za účelem modifikace spektra hostitele nebo imunogenicity viru.
Podle dalšího provedení může virus podle předloženého vynálezu kódovat heterologní gen/nukleovou kyselinu exprimující terapeutickou sloučeninu. „Terapeutická sloučenina“ kódovaná heterologní nukleovou kyselinou ve viru může být například buď terapeutická nukleová kyselina jako protismyslná nukleová kyselina, nebo peptid nebo protein s požadovaným biologickým účinkem.
Podle dalšího výhodného provedení je exprese heterologní sekvence nukleové kyseliny s výhodou, ale ne výlučně, pod transkripční kontrolou poxvirového promotoru, s výhodou promotoru viru vakcinie.
Dalším výhodným provedením je, že heterologní sekvence nukleové kyseliny je s výhodou začleněna do nepodstatné oblasti virového genomu. Podle jiného výhodného provedení, je heterologní sekvence nukleové kyseliny začleněna v přirozeně se vyskytujícím místě delece MVA genomu (popsaná v PCT/EP96/02926). Způsoby inzerce heterologních sekvencí do genomu poxviru jsou odborníkům v oboru známé.
Podle dalšího výhodného provedení, vynález dále zahrnuje genom viru, jeho rekombinanty nebo jejich funkční části. Takové virové sekvence mohou být použity k identifikaci nebo izolaci viru nebo jeho rekombinant, například použitím polymerázové řetězové reakce (PCR), hybridizačními technologiemi nebo provedením ELISA testů. Navíc mohou být takové virové sekvence exprimováné z expresního vektoru, aby produkovaly kódovaný protein nebo peptid, který potom může doplnit deleční mutanty viru, kterým chybí virová sekvence obsažená v expresním vektoru.
„Funkční část“ virového genomu značí část kompletní genomové sekvence, která kóduje fyzickou entitu jako protein, proteinovou doménu, epitop proteinu. Funkční část virového genomu také popisuje části kompletní genomové sekvence, která kódují regulační elementy nebo části takových elementů s individualizovanou aktivitou, jako promotor, zesilovač, cis-nebo trans-působící elementy.
Rekombinantní virus podle předloženého vynálezu může být použitý k zavedení heterologní sekvence nukleové kyseliny do cílové buňky, přičemž tato sekvence je buď homologická, nebo heterologní k cílové buňce. Zavedení heterologní sekvence nukleové kyseliny do cílové buňky lze použít k přípravě in vitro heterologních peptidů nebo polypeptidů a/nebo kompletních virů kódovaných uvedenou sekvenci. Tento způsob zahrnuje infekci hostitelské buňky rekombinantní MVA, kultivaci infikované hostitelské buňky za vhodných podmínek, a izolaci a/nebo obohacení peptidu, proteinu a/nebo viru produkovaného uvedenou hostitelskou buňkou.
Navíc, způsob zavedení homologní nebo heterologní sekvence do buněk může být použitý pro in vitro a s výhodou in vivo terapii. Pro in vitro terapii se izolované buňky, které byly předtím
-10CZ 295808 B6 (ex vivo) infikované virem podávají živému zvířecímu organizmu, aby se indukovala imunitní odpověď. Pro in vivo terapii se virus nebo jeho rekombinanty podávají přímo živému zvířecímu organizmu pro indukci imunitní odpovědi. V tomto případě, jsou buňky kolem místa očkování přímo infikovaná in vivo virem nebo jejich rekombinantami podle vynálezu.
Protože virus podle předloženého vynálezu je velice růstově omezený v lidských a opičích buňkách, a tudíž silně oslabený, je ideální pro léčení velkého okruhu savců včetně lidí. Předložený vynález rovněž poskytuje farmaceutickou kompozici a vakcínu např. pro indukování imunitní odpovědi v živých zvířecích organizmech, včetně lidí. Virus podle vynálezu je dále bezpečný v kterýkoliv jiných protokolech genové terapie.
Farmaceutická kompozice může obecně obsahovat jeden nebo více farmaceuticky přijatelných a/nebo schválených nosičů, přísad, antibiotik, konzervačních přísad, pomocných látek, rozpouštědel a/nebo stabilizátorů. Takové pomocné látky mohou být voda, fyziologický roztok, glycerin, ethanol, zvlhčovadla nebo emulgátory, pH pufry a podobně. Vhodnými nosiči jsou typické velké, pomalu metabolizované molekuly jako proteiny, polysacharidy, kyseliny poly-mléčné, kyseliny polyglykolové, polymemí aminokyseliny, kopolymery aminokyselin, agregáty lipidů nebo podobně.
Pro přípravu vakcíny je virus nebo jeho rekombinanty převede na fyziologicky přijatelnou formu. To se provádí na základě zkušeností s přípravou poxvirových vakcín používaných na vakcinaci proti pravým neštovicím (popsáno Stickl, H. etal. 1974 Dtsch. med. Wschr. 99, 2386-2392). Například, vyčištěný virus se skladuje při -80 °C stitrem 5 x 108 TCfD50/ml upravený vaši 10 mmol Tris, 140 mmolNaCl pH 7,4. Pro přípravu injekčních vakcín se např. ΙΟ2—108 virových částic lyofilizuje v 100 ml fyziologického roztoku pufřovaného fosfátem (PBS) v přítomnosti 2 % peptonu a 1 % lidského albuminu v ampuli, s výhodou skleněné ampuli. Alternativně mohou být injekce připravené postupným vymrazováním viru ve formulaci. Tato formulace může obsahovat další přísady jako mannitol, dextran, cukr, glycin, laktózu nebo póly viny lpyrrolidon nebo jiné přísady jako antioxydanty nebo inertní plyn, stabilizátory, nebo rekombinantní proteiny (např. lidský sérový albumin) vhodné pro in vivo podávání. Skleněná ampule se uzavře a může se skladovat při teplotách v rozmezí od 4 °C až po teplotu místnosti po dobu několik měsíců. Avšak pokud není potřebná, skladuje se s výhodou při teplotách pod -20 °C.
Pro vakcinaci nebo terapii se lyofilizát může rozpustit v 0,1 až 0,5 ml vodného roztoku, s výhodou fyziologického roztoku nebo Tris pufru a podávat buď systemicky, nebo lokálně například parenterálně, intramuskulámě nebo jakoukoliv jinou cestou podávání známou odborníkovi. Způsob aplikace, dávka a počet podání mohou být optimalizované odborníky v oboru známými způsoby.
Podle dalšího provedení je virus podle předloženého vynálezu zejména užitečný pro indukci imunitní odpovědi ve zvířatech s porušenou imunitou např. opicích (CD4<400/pl krve) infikovaných SIV nebo imunokompromitovaných lidech. Termín „imunokompromitovaný“ znamená stav imunitního systému jedince, který vykazuje jen neúplné imunitní odpovědi nebo má sníženou schopnost obrany proti infekčnímu činidlu. Ještě zajímavější je, že podle dalšího provedení může virus podle předloženého vynálezu zesílit imunitní odpověď v imunokompromitovaných zvířatech nebo lidech, i v přítomnosti již existující imunity těchto zvířat nebo lidi proti poxvirům. Obzvlášť zajímavé bylo, že virus podle předloženého vynálezu může posílit imunitní odpovědi také ve zvířatech a lidech procházejících antivirovou případně antiretrovirovou terapií. „Antivirová terapie“ zahrnuje terapeutické koncepty k eliminaci nebo potlačení virových infekcí například (i) aplikaci analogů nukleotidů, (ii) aplikaci inhibitorů enzymatické aktivity virů nebo sestavy virů, nebo (iii) aplikaci cytokinů na ovlivnění imunitní odpovědi hostitele.
Podle dalšího provedení vynálezu je vakcína obzvláště, ale ne výlučně použitelná v oblasti veterinární například pro imunizaci zvířat proti neštovicové infekci. U malých zvířat se očkování
-11 CZ 295808 B6 k imunizaci provádí s výhodou parenterálně nebo nasálně, u větších zvířat nebo lidí je upřednostňováno očkování podkožní, intramuskulámí nebo orální.
Zjistilo se, že již injekce vakcíny obsahující účinnou dávku jen 102 TCID50 (infekční dávka tkáňové kultury) viru podle předloženého vynálezu je dostačující pro indukci úplné imunity proti divokému viru vakcinie při vyvolání odezvy u myší. Toto je obzvlášť překvapující, protože při tak silném stupni oslabení viru podle předloženého vynálezu by se očekával negativní vliv, a tím snížení imunogenicity. Takovéto očekávání je založené na názoru, že pro indukcí imunitní odpovědi musí být imunitnímu systému prezentováno dostatečné množství antigenních epitopů. Virus, který je silně oslabený a tudíž se nereplikuje, může prezentovat jen malé množství antigenních epitopů, tj. jen tolik kolik jich sám inkorporuje. Toto množství antigenu, neseného virovými částicemi, nebylo považováno za dostatečné pro indukci silné imunitní odpovědi. Nicméně virus podle předloženého vynálezu stimuluje již při velice nízké účinné dávce 102 TCID50 silnou a ochrannou imunitní odpověď při testech na vyvolání odezvy proti vakcinii u myší. Virus podle předloženého vynálezu tak vykazuje neočekávanou a ještě zvětšenou imunogenicitu ve srovnání s dosud charakterizovanými MVA kmeny. Tato vysoká imunogenicita činí virus podle předloženého vynálezu a každou od něho odvozenou vakcínu zvláště vhodnou pro aplikaci u imunokompromitovaných zvířat a lidí.
Podle dalšího provedení podle předloženého vynálezu je virus použitý jako adjuvans. „Adjuvans“ v kontextu s předloženým popisem se týká zesilovače specifické imunitní odpovědi ve vakcínách. „Použití viru jako adjuvans“ znamená vložení viru do předem existující vakcíny pro dodatečnou stimulaci imunitního systému pacienta, který vakcínu obdrží. Imunizační účinek antigenního epitopu je ve většině vakcín často zesílen přidáním tzv. adjuvantu. Adjuvant ko-stimuluje imunitní systém tím, že způsobí silnější imunitní reakci proti antigennímu epitopů vakcíny. Tato stimulace může být regulovaná faktory nespecifického imunitního systému, jako interferon a interleukin.
Podle dalšího provedení podle předloženého vynálezu se virus používá u savců včetně lidí k aktivaci, podpoře nebo potlačení imunitního systému a s výhodou k aktivaci imunitní odpovědi proti jakékoliv antigenní determinantě. Virus lze také použít na podporu imunitního systému v situaci zvýšené náchylnosti k infekcím jako v případě stresu.
Virus použitý jako adjuvans může být ne-rekombinantní virus například virus, který neobsahuje heterologní DNA v genomu. Příkladem tohoto typu viru je MVA-BN. Alternativně je virem použitým jako adjuvans, virus rekombinantní obsahující ve svém genomu heterologní DNA sekvence, které nejsou přirozeně přítomné ve virovém genomu. Pro použití jako adjuvans rekombinantní virová DNA viru s výhodou obsahuje a exprimuje geny kódující imunitu stimulující peptidy nebo proteiny jako interleukiny.
Podle dalšího provedení je výhodné, že virus pro použití jako adjuvans nebo pro přidání k jiné vakcíně je inaktivovaný. Inaktivace viru se může provést například teplem nebo chemikáliemi, známými v oboru. S výhodou se virus inaktivuje β-propiolaktonem. Podle tohoto provedení vynálezu, se inaktivovaný virus může přidat kvakcínám proti řadě infekčních nemocí nebo proliferačních nemocí na zvýšení imunitní odpovědi pacienta vůči této nemoci.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1: Kinetika růstu různých kmenů MVA v různých buněčných liniích. V části A) jsou výsledky seskupené podle testovaných kmenů MVA, a v části B) jsou výsledky seskupené podle testovaných buněčných linií. B) Množství viru regenerovaného z buněčné linie po čtyřech dnech (D4) kultivace bylo stanoveno plakovým testem a vyjádřeno jako poměr viru regenerovaného po čtyřech dnech k původně naočkovanému viru ve dni 1 (Dl).
-12CZ 295808 B6
Obr. 2: Ochrana poskytnutí proti smrtící dávce po vakcinaci s MVA-BN nebo MVA 575. Ochrana se měří redukcí v titrech vajeěníků stanovených čtyři dny po vyvolání odezvy standardním plakovým testem.
Obr. 3: Indukce CTL a ochrana poskytnutá proti vyvolání odezvy s influenza virem za použití různých režimů očkování primámí/posilující.
3A: Indukce CTL odpovědí vůči 4 různým H-2d restringovaným epitopům po vakcinaci s různými kombinacemi DNA nebo MVA-BN vakcín kódujícími myší epitop. BALB/c myši (5 ve skupině) byly očkovány buď s DNA (nitrosvalově) nebo MVA-BN (podkožně) a obdržely zesilující imunizaci o tři týdny později. CTL odpovědi vůči 4 různým epitopům kódovaným vakcínami (TYQRTRALV, Influenza), SYIPSAEKI, P. Berghei, YPHFMPTNL, Cytomegalovirus, RPQASGVYM, LCV) byly stanoveny použitím ELISPOT testu 2 týdny po posilujících imunizacích.
3B: Indukce CTL odpovědí vůči 4 různým epitopům po vakcinaci různými kombinacemi DNA nebo MVA-BN vakcín kódujícími myší polytop. BALB/c myši (5 ve skupině) byly vakcinovány buď s DNA (nitrosvalově), nebo MVA-BN (intravenózně) a obdržely posilující imunizaci po třech týdnech. CTL odpovědi vůči 4 různým epitopům kódovaným vakcínami (TYQRTRALV, Influenza, SYIPSAEKI, P. Berghei, YPHFMPTNL, cytomegalovirus, RPQASGVYM, LCV) byly stanoveny za použití ELISPOT testu 2 týdny po posilujících imunizacích.
3C: Frekvence peptidu a MVA specifických T buněk po homologní primámí/posilující vakcinaci za použití optimální dávky (1 x 108 TQD50) rekombinantního MVA-BN podaného subkutánně. Skupiny 8 myší byly vakcinovány dvěma injekcemi kombinací uvedených na obrázku. Dva týdny po konečné vakcinaci byly změřeny počty specifických splenocytů peptidu za použití IFN-γ ELISPOT testu. Sloupce představují střední počet specifických skvrn terčíků plus/minus standardní odchylka od průměru.
Obr. 4: SIV zátěž opic vakcinovaných s MVA-BN nef nebo MVA-BN.
Obr. 5: Přežití vakcinovaných opic po infekci s SIV (opičí virus imunitní nedostatečnosti).
Obr. 6: Titry protilátek v séru opic vůči MVA-BN. Titry protilátek pro každé zvíře vykazovaly různé tvary, zatímco střední titr je znázorněn jako solidní pravoúhelník.
Obr. 7: Hladiny SIV v imunokompromitovaných opicích (CD4 < 400 ml krvi) po vakcinacich s MVA-BN kódující tat. Opice nejdříve dostaly tři vakcinace s MVA-BN nebo MVA-BN nef (týden 0, 8, 16) a potom byly infikovány patogenním izolátem z SIV (22. týden). V 100., 102. a 106. týdnu (ukázané šipkami) byly opice vakcinovány s MVA-BN tat.
Obr. 8: SIV hladiny v opicích procházejících antiretrovirovou terapii a terapeutickou vakcinaci za použití MVA-BN. Tři skupiny opic (n = 6) byly infikovány s SIV a denně ošetřeny s PMPA (ukázané černou barvou). V 10. a 16. týdnu byla zvířata vakcinovaná (ukázané šipkami) buď směsí rekombinantní MVA, nebo fyziologickým roztokem.
Obr. 9: Humorální odpověď vyvolaná proti SIV po infekci a vakcinacích s rekombinantním MVA. Tři skupiny (n = 6) opic byly infikovány patogenním izolátem z SIV (0. týden) a pak ošetřeny antiretrovirální terapií (PMPA, ukázáno tlustou čárou). Opice byly v 10. a 16. týdnu vakcinovány směsmi rekombinantními MVA nebo fyziologického roztoku. Protilátky proti SIV byly stanoveny za použití lyzátů infikovaných T buněk jako antigenu v standardním ELIS A testu.
Obr. 10: Humorální odpověď vyvolaná vůči MVA v SIV infikovaných myších podstupujících antiretrovirovou terapii. Tři skupiny (n = 6) opic byly infikované patogenním ozolátem SIV (týden 0) a ošetřeny antiretrovirovou terapií (PMPA; ukázáno tlustou čárou). Opice byly vakcinova
- 13CZ 295808 B6 né v 10. a 16. týdnu směsmi rekombinantního MVA nebo fyziologického roztoku. Protilátky proti MVA byly stanoveny za použití standardního ELISA testu pro MVA.
Obr. 11: Indukce protilátek proti MVA po vakcinaci myší různými vakcínami pravých neštovic. Hladiny protilátek vytvářené proti MVA po vakcinacích s MVA-BN (týden 0 a 4) byly porovnány s konvenčními kmeny vakcinie, Elstree a Wyeth, získanými skarifíkací ocasu (týden 0), MVA 572 (týden 0 až 4) a MVA-BN a MVA 572 jako pre-Elstree vakcína. MVA 572 byl uložen v Evropské sbírce mikroorganizmů jako ECACC V94012707. Titry byly stanoveny za použití ELISA testu a spočítané lineární regresi za použití lineární části grafu a definované jako zředění jehož výsledkem je optická hustota 0,3. * MVA-BN : MVA-BN je podstatně (p > 0,05) odlišná od MVA 572: MVA 572.
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady ilustrují předložený vynález. Odborníkům znalým oboru bude jasné, že předložené příklady v žádném případě nelze chápat jako omezení technologie podle vynálezu jen na tyto příklady.
Příklad 1
Kinetika růstu nového kmene MVA ve vybraných buněčných liniích a replikace in vivo.
(i) Kinetika růstu v buněčných liniích
K charakterizaci nově izolovaného kmene podle předloženého vynálezu (dále označovaného jako MVA-BN) byla kinetika růstu tohoto kmene porovnána s těmi kmeny MVA, které již byly charakterizované.
Pokus byl proveden porovnáním kinetiky růstu následujících virů v dále uvedených primárních buňkách a buněčných liniích:,
MVA-BN (virus šarže #23, 18. 02. 99 surový, titrovaný 2,0 x 107 TQD5o/ml),
MVA charakterizovaný Altenburgerem (US patent 5,185,146) a dále označovaný jako MVAHLR,
MVA (pasáž 575) charakterizovaný Antonem Mayrem (Mayr, A. et al (1975) Infection 3, 6-14) a dále označován jako MVA 575 (ECACC V00120707); a MVA-Vero charakterizovaný v mezinárodní patentové přihlášce PCT/EP01/02703 (WO 01/68820) (virus šarže, pasáž 49, #20, 22.03.99 surový, titrovaný 4,2 x 107 TQD5o/ml).
Použité primární buňky a buněčné linie byly:
CEF fíbroblasty kuřecích embryí (čerstvě připravené z SPF vajíček),
HeLa lidský cervikální adenokarcinom (epiteliální), ATCC č. CCL-2,
143B lidský kostní osteosarkom TK-, ECACC č. 91112502,
HaCat lidská keratinocytová buněčná linie, Boukamp etal. 1988, J. Cell Biol 106 (3): 761-771,
BHK ledvinné buněčné linie křeččích mláďat, ECACC 85011433,
- 14CZ 295808 B6
Věro ledvinné fíbroblasty afrických zelených opic, ECACC 85020299,
CV1 ledvinné fíbroblasty afrických zelených opic, ECACC 87032605.
Pro provedení infekce byly různé buňky naočkovány do 6 jamkových destiček v koncentracích 5 x 105 buněk/jamku a inkubovány přes noc při 37 °C, 5 % CO2 v DMEM (Gibco, Cat. č. 61965025) plus 2 % FCS. Kultivační médium bylo odstraněno a buňky byly infikovány při 37 °C přibližně 0,05 moi (multiplicita infekce) za hodinu, 5 % CO2 (u infekce se předpokládá, že počet buněk se přes noc zdvojnásobí). Množství viru použitého pro každou infekci různých typů buněk bylo 5 x 104 TCID50, a to bude uváděné jako Vstup. Buňky byly promyty 3krát s DMEM a nakonec 1 ml DMEM, byly přidány 2 % FCS a destičky se nechaly inkubovat 96 hodin (4 dny) při 37 °C, 5 % CO2. Tyto infekce byly ukončené zmrazením destiček při-80 °C a hotové pro titrační analýzu.
Titrační analýza (kontrastní zbarvení s pro virem vakcinie specifickou protilátkou)
Pro titraci množství viru byly testovací buňky (CEF) naočkovány na 96 ti jamkových destičkách vRPMI (Gibco, kat. č. 61870-010), 7 % FCS, 1% antibiotikum/antimykotikum (Gibco, kat. č. 15240-062) v koncentraci 1 x 104 buněk/jamku a inkubovány přes noc při 37 °C, 5 % CO2. 6ti jamkové destičky obsahující infikované pokusné vzorky byly 3krát zamrazeny/rozmraženy a byla připravena zředění 10“1 až 10~12 za použití RPMI růstového média. Virové roztoky byly naneseny na testované buňky a inkubovány pět dní při 37 °C, 5 % CO2, aby došlo k vývoji cytopatického efektu (CPE = cytopathic effect). Pokusné buňky byly fixovány (aceton/methanol 1:1) 10 minut, promyty s PBS a inkubovány polyklonální protilátkou specifickou proti viru vakcinie (Quartett Berlin, Cat. 4. 9503-2057) při zředění 1:1000 v inkubačním pufru po dobu jedné hodiny při teplotě místnosti. Po promytí dvakrát s PBS (Gibco, Kat. č. 20012-019) byla přidaná HPR-spražená králičí protilátka ve zředěné 1:1000 v inkubačním pufru (PBS obsahující 3 % FCS) jednu hodinu při teplotě místnosti. Buňky byly opět promyty dvakrát s PBS a inkubovány barvícím roztokem (lOml PBS + 20 μΐ nasyceného roztoku o-dianisidinu v 100% ethanolu + 15 μΐ H2O2 čerstvě připraveného) do doby než byly viditelné hnědé skvrny (dvě hodiny). Barvící roztok byl odstraněn a byl přidán PBS k zastavení barvicí reakce. Každá jamka vykazující hnědou skvrnu byla označena jako pozitivní pro CPE a titr byl vypočten podle rovnice Karbera (test založený na TCID50) (Karber, G. 1931, Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 162, 480).
Viry byly použity k infikování duplicitních pokusných sad, na jedné straně CEF a BHK, u nichž se očekávalo, že jsou vhodné pro MVA, a na druhé straně CV-1, Věro, Hela, 143B a HaCat u nichž se očekávalo, že nejsou vhodné pro MVA, při nízké multiplicitě infekce t.j., např. 0,05 infekčních jednotek na buňku (5 x 104 TCID50). Potom bylo virové inokulum odstraněno a buňky třikrát promyty, aby se odstranily všechny zbývající neabsorbované viry. Infekce trvaly celkově 4 dny, kdy byly připravené virové extrakty a titrované na buňkách CEF. Tab. 1 a Obr. 1 ukazují výsledky titračních testů, kde jsou hodnoty dané jako celkové množství viru produkovaného po 4 denní infekci.
Bylo ukázáno, že všechny viry se dobře amplifikovaly v CEF buňkách (fibroblastech kuřecích embryí) jak bylo očekáváno, protože toto je vhodná buněčná linie pro všechny kmeny MVA. Navíc se ukázalo, že všechny viry se dobře amplifikovaly v BHK (ledvinné buněčné linie křeččích mláďat). MVA-Vero se ukázal nejlepší, přičemž BHK je vhodná buněčná linie.
Pokud se týče replikace ve Věro buňkách (opičí ledvinné buněčné linie) MVA-Vero se amplifikoval tak dobře jak bylo očekáváno jmenovitě 1000 násobně nad Vstup. MVA-HLR a také MVA-575 se amplifikovaly dobře, a to s 33 násobným a 10 násobným zvětšením proti Vstupu. Jen u MVA-BN se zjistilo, že se v těchto buňkách neamplifikoval tak dobře v porovnání s ostatními, jmenovitě byl jen 2 násobný nárůst proti Vstupu.
-15 CZ 295808 B6
Také při replikaci v CV1 buňkách (opičí ledvinné buněčné linie) se zjistilo, že MVA-BN je silně oslabený v této buněčné linii. Vykazoval 200 násobné snížení pod Vstup. Také MVA-575 se neamplifíkoval nad hladinu Vstupu a vykazoval slabě negativní amplifíkaci, jmenovitě 16 násobný pokles pod Vstup. MVA-HLR se amplifíkoval nejlépe s 30 násobným vzrůstem nad Vstup, následovaný MVA-Vero s 5násobným vzrůstem proti Vstupu.
Nejzajímavější je porovnání růstové kinetiky různých virů v lidských buněčných liniích. Pokud se týče reproduktivní replikace v 143B buňkách (buněčné linie lidské rakoviny kostí) se ukázalo, že MVA-Vero byl jediný, který vykazoval amplifíkaci nad Vstup (3 násobný vzrůst). Všechny ostatní viry se neamplifíkovaly nad Vstup, ale byl velký rozdíl mezi MVA-HLR a oběma MVABN a MVA-575. MVA-HLR byl na hranici (1 násobný pokles pod Vstup), zatímco MVA-BN vykazuje největší zeslabení (300 násobní pokles pod Vstup), následovaný MVA-575 (59 násobní pokles pod Vstup). Souhrnem lze říct, že MVA-BN je nejlepší co se týče oslabení v lidských 143B buňkách. Navíc, pokud se týče replikace v HeLa buňkách (buňky lidského cervikálního karcinomu) se ukázalo, že MVA-HLR se dobře amplifíkoval v těchto buněčných liniích, a to ještě lépe než ve vhodných BHK buňkách (HeLa = 125 násobný vzrůst nad Vstup; BHK = 88 násobný vzrůst nad Vstup), MVA-Vero se také amplifíkoval v této buněčné linii (27 násobný vzrůst nad Vstup). Avšak MVA-BN a také v menší míře MVA-575, byly oslabené v těchto buněčných liniích (MVA-BN = 29 ti násobný pokles pod Vstup a MVA-575 = 6 ti násobný pokles pod Vstup).
Co se týče replikace vHaCat buňkách (lidské keratinocytové buněčné linie) se ukázalo, že MVA-HLR se v těchto buněčných liniích amplifíkoval dobře (55 ti násobný nárůst nad Vstup). Oba, jak MVA-Vero adaptovaný, tak MVA-575 vykazovaly amplifíkaci v této buněčné linii (1,2, případně 1,1 násobný nárůst nad Vstup). Avšak MVA-BN byl jediný, který vykazoval oslabení (5 ti násobný pokles pod Vstup).
Závěrem lze konstatovat, že MVA-BN je nejvíce oslabeným virovým kmenem z této skupiny virů: MVA-BN se prokázal být mimořádně oslabený v lidských buněčných liniích tím, že vykazoval amplifíkační poměr 0,05 až 0,2 v lidských embryonálních ledvinných buňkách (293: ECACC č. 85120602) (data nejsou zahrnutá do tab. 1), dále vykazoval amplifíkační poměr 0,0 v buňkách 143B, amplifíkační poměr 0,04 v HeLa buňkách, amplifíkační poměr 0,22 vHaCat buňkách. Navíc MVA-BN vykazuje amplifíkační poměr 0,0 vCVl buňkách. Jenom ve Věro buňkách lze pozorovat amplifíkaci (poměr 2,33) i když ne v takovém rozsahu jak je to ve vhodných buněčných liniích jako BHK a CEP (porovnej s tab.l). Tudíž MVA-BN je jediný známý kmen MVA vykazující amplifíkační poměr menší jako 1 ve všech lidských buněčných liniích 143B, HeLa, HaCat a 293.
MVA-575 vykazuje podobný profil jako MVA-BN ale není tak oslabený jako MVA-BN.
MVA-HLR se dobře amplifíkoval ve všech testovaných buněčných liniích (kromě 143B buněk), tudíž ho lze považovat za replikace schopný ve všech buněčných liniích kromě 143B buněk. V jednom případě se dokonce amplifíkoval lépe v lidské buněčné linii (HeLa) než ve vhodné buněčné linii (BHK).
MVA-Vero vykazuje amplifíkaci ve všech buněčných liniích ale v menším rozsahu než byl prokázán u MVA-HLR (neberouc v úvahu výsledky 143B). Nicméně nemůže být považován, co se týče oslabení, za patřící do stejné „třídy“ jako MVA-BN nebo MVA-575).
2. Replikace in vivo
Vycházeje ze skutečnosti, že některém MVA kmeny se jasně replikují in vitro byla zkoumaná schopnost replikace různých kmenů MVA in vivo za použití transgenního myšího kmene AGR129. Tento kmen myší má geneticky cílené disrupce vIFN receptoru typu I (IFN-α/β) a typu II (IFN-γ) genů a vRAG. Vzhledem k těmto disrupcím nemají myši žádný IFN systém
-16CZ 295808 B6 a nejsou schopné produkce zralých B a T buněk a jako takové jsou vážně imunokompromitované a vnímavé vůči replikujícímu se viru. Skupiny po šesti myších byly imunizovány (i. p.) intraperitoneálně s 107 pfu, buď s MVA-BN, MVA-HLR, nebo MVA 572 (použitým na 120 000 lidech v Německu) a denně byly monitorovány klinické příznaky. Všechny myši vakcinované s MVAHLR nebo MVA-752 uhynuly do 28 dnů respektive 60 dnů. Při pitvě byly nalezeny celkové známky silné virové infekce ve většině orgánů a standardním plakovým testem byl MVA (108 pfu) znovu získán zvaječníků. Naproti tomu, myši vakcinované stejnou dávkou MVA-BN (odpovídající uloženému kmenu ECACC V00083008) přežily více než 90 dnů a žáden MVA nemohl být znovu získán z orgánů nebo tkání.
Souhrnně tedy údaje z in vitro a in vivo studií jasně dokazují, že MVA-BN je o mnoho silněji oslabený než výchozí rodičovský nebo komerční kmen MVA-HLR.
Příklad 2
Imunologická a in vivo data
Tyto pokusy byly provedeny za účelem porovnání různých dávek a vakcinačních režimů MVABN v porovnání s jinými kmeny MVA.
2.1 Různé kmeny MVA mají různou schopnost stimulace imunitní odpovědi
Replikací kompetentních kmenů vakcinie se indukují v myších silné imunitní odpovědi a při vyšších dávkách způsobují smrt. Přestože kmeny MVA jsou silně oslabené a mají sníženou schopnost replikace v savčích buňkách, jsou rozdíly v oslabení mezi různými kmeny MVA. Ovšem, MVA-BN se ukazuje být více oslabený než jiné kmeny MVA, dokonce i rodičovský kmen MVA 575. Ke stanovení zda tento rozdíl v oslabení ovlivňuje účinnost MVA při indukci ochranných imunitních odpovědí, byly různé dávky MVA-BN a MVA-575 porovnány v testu vyvolání smrtící odezvy. Hladiny ochrany byly měřeny redukcí titru vakcinie ve vaječnících 4 dny po vyvolání odezvy, protože to umožnilo kvantitativní určení různých dávek a kmenů MVA.
Model vyvolání smrtící odezvy
Specifických patogenů prosté, 6-8 týdnů staré samice BALB/c (H-2d) myši (n=5) byly imunizovány (i.p.) různými dávkami (ΙΟ2, 104 nebo 106 TCID5(}/ml) buď MVA-BN nebo MVA575. MVA-BN a MVA-575 byly rozmnožované na CEF buňkách, čištěny na sacharóze a upraveny v Tris pH 7,4. Po třech týdnech myši obdržely posilující dávku stejné velikosti a kmene MVA, která byla následovaná po dvou týdnech smrtící dávkou (i. p.) replikačně kompetentního kmene vakcinie. Jako replikačně kompetentní kmen viru vakcinie (zkratka „rVV“) byly použity buď kmen WR-L929 TK+, nebo kmen IHD-J. Kontrolní myši dostali placebo vakcínu. Ochrana byla měřena stanovením snížení titrů ve vaječnících 4 dny po injekci k vyvolání odezvy standardním plakovým testem. Ktomu byly myši 4. den po injekci k vyvolání odezvy usmrceny a vaječníky byly odstraněny, homogenizovány v PBS (1 ml) a virální titry stanoveny standardním plakovým testem za použití Věro buněk (Thomson et al., 1998, J. Immunol. 160: 1717).
Myši vakcinované dvěma imunizacemi s buď 104, nebo 106 TCID50/ml MVA-BN nebo MVA575 byly úplně chráněné soudě za 100% snížení rW v titrech vaječníků 4 dny po vyvolání odezvy (obr. 2). Virus pro vyvolání smrtící odezvy vymizel. Avšak rozdíly v hladinách ochrany poskytnuté s MVA-BN nebo MVA-575 byly pozorované při nižších dávkách. Myši, které obdržely dvě imunizace 102 TCID5o/ml MVA-575 nebyly chráněny soudě podle vysokých rW titrů vaječníků (střední hodnota 3,7 x 107 pfu +/- 2,11 x 107). Naproti tomu, myši vakcinované stejnou dávkou MVA-BN indukovaly významné snížení (96%) rVV titrů vaječníků (střední hodnota 0,21 x 107 pfu +/- 0,287 x 107). Kontrolní myši, které dostaly placebo vakcínu měly střední hodnotu virového titru 5,11 x 107 pfu (+/- 3,59 x 107) (obr. 2).
-17CZ 295808 B6
Oba kmeny MVA indukují ochranné imunitní odpovědi v myších proti smrtelné dávce rVV. Přestože oba kmeny MVA jsou stejně účinné při vyšších dávkách, rozdíly v jejich účinnosti jsou evidentní při sub-optimálních dávkách. MVA-BN je o mnoho silnější, než rodičovský kmen MVA-575 při indukci ochranné imunitní odpovědi proti smrtící dávce rVV, což může být spojené se zvýšeným oslabením MVA-BN v porovnání s MVA-575.
2.2 MVA-BN ve vakcinačních režimech primámí/posilující
2.2.1. : Indukce protilátek proti MVA po vakcinaci myší různými vakcínami pravých neštovic
Účinnost MVA-BN byla porovnávaná s jinými kmeny MVA a kmeny vakcinie dříve používanými k vymýcení neštovic. Tyto zahrnovaly jednorázovou imunizaci za použití kmenů vakcinie Elstree a Wyeth produkovaných v CEF buňkách a získaných skarifikací ocásků a imunizace za použití MVA 572, který byl dříve používán v programu vymýcení pravých neštovic v Německu. Navíc byly oba kmeny a to MVA-BN a MVA-572 porovnány jako pre-vakcína po níž následovala vakcinace s kmenem Elstree, získaným skarifikací. Pro každou skupinu bylo použito osm BALB/c myší a všechny MVA vakcinace (1 x 107 TCID50) byly provedeny podkožně v nultém a 3. týdnu. Dva týdny po posilující vakcinaci byly myši vystaveny smrtící odezvě s vakcinii (IHD-J) a titry ve vaječnících byly stanoveny 4 dny po vyvolání odezvy. Všechny vakcíny a režimy indukovaly 100% ochranu.
Všechny indukované imunitní odpovědi za použití různých vakcín nebo režimů byly ve zvířatech měřeny před vyvoláním odezvy. Byly použity testy měření hladiny neutralizace protilátek, proliferace T buněk, produkce cytokinů (IFN-γ vs IL-4) a produkce IFN-γ T buňkami. Hladina odpovědí T buněk indukovaná MVA-BN, změřena ELISPOT analýzou, byla celkově ekvivalentní s jinými MVA a viry vakcinie, vykazujíce bio-ekvivalenci. Analýzy titrů protilátek vůči MVA provedené každý týden po různých vakcinačních režimech ukázaly, že vakcinace s MVA-BN výrazně posílily rychlost a velikost protilátkové odpovědi v porovnání s jinými vakcinačními režimy (obr. 1). Ve skutečnosti byly titry protilátek proti MVA podstatně vyšší (p >0,05) v 2., 4. a 5. (1 týden po posilující vakcinaci v 4. týdnu) při vakcinaci s MVA-BN v porovnání s myšmi vakcinovanými s MVA 572. Po posilující vakcinaci ve 4. týdnu byly titry protilátek podstatně vyšší v MVA-BN skupině v porovnání s myšmi, které obdržely jen jednorázovou vakcinaci buď s kmenem vakcinie Elstree, nebo Wyeth. Tyto výsledky jasně demonstrují, že dvě vakcinace s MVA-BN indukovaly vyšší protilátkovou odpověď v porovnání klasickou jednorázovou vakcinací stradičními kmeny vakcinie (Elstree nebo Wyeth) a potvrzují poznatky zčásti 1.5, že MVA-BN je více imunogenetický než ostatní kmeny MVA.
2.2.2. : MVA režimy primární a posilující vytvářejí stejnou hladinu ochrany jako režimy DNAprimámí MVA-posilující v modelu expozice viru Influenza
Byla stanovena účinnost MVA režimů primámí/posilující k vyvolání vysoké avidity CTL odpovědí a porovnána s režimy DNA-primámí/MVA-posilující, o kterých bylo uvedeno, že jsou vynikající. Byly stanoveny různé režimy za použití konstruktu myšího polytopu kódovaného buď DNA vektorem, nebo MVA-BN a hladiny indukce CTL byly porovnány pomocí EISPOT testu, zatím co avidita odpovědi byla měřena jako stupeň ochrany poskytnutý po expozici viru Influenza.
Konstrukty
DNA plazmid kódující myší polytop (10 CTL epitopy včetně influenza, vaječný albumin) byl už dříve popsán (Thomson et al., 1998, J. Immunol. 160: 1717). Tento myší polytop byl inzertován do místa delece II MVA-BN, rozmnožován na CEP buňkách, čištěn na sacharóze a upraven v Tris pH 7,4.
-18CZ 295808 B6
Vakciiiační protokoly
Při tomto pokusu byly použité specifické patogeny prosté 6-8 týdnů staré samičí BALB/c (H-2d) myši. Skupina pěti myší byla použita pro ELISPOT analýzu, zatímco skupina 6 myšíbyla použita pro pokusy expozicí viru influenza. Myši byly vakcinované podle různých režimů primámí/posilující za použití MVA nebo DNA kódující myší polytop jak je podrobně uvedeno ve výsledcích. Pro imunizace s DNA byly myši anestetikované a potom jim bylo v narkóze injikováno 50 pg endotoxinu prostého plazmidu DNA (v 50 μΐ PBS) do čtyřhlavého svalu. Primární imunizace za použití MVA byly provedeny buď intravenózní aplikací 197 pfu MVA-BN/myš, nebo podkožní aplikací 107 pfu nebo 108 pfu MVA-BN/myš. Posilující imunizace byly provedeny tři týdny po primárních imunizacích. Posílení s DNA plazmidem bylo provedeno stejným způsobem jako primární imunizace s DNA (viz výše). Ke stanovení CTL odpovědí byly provedeny standardní ELISPOT testy (Schneider et al., 1998, Nat. Med. 4, 397-402) na splenocyty 2 týdny po poslední posilující imunizaci za použití influenza CTL epitopu peptidu (TYQRTRALV), P. Berghei epitopu peptidu (SYIPSAEKI), epitopu peptidu cytomegaloviru (YPHFMPTNL) a/nebo LCV epitopu peptidu (RPQASGVYM). Pro experimenty k vyvolávání odezvy byly myši anestetikovány a infikovány i.n. nesmrticí dávkou influenza viru Mem71 (4,5 xlO5 pfu v 50 ml PBS). Pátý den po infekci byly odstraněny plíce a virové titry byly stanoveny duplicitně na Madin-Darby psích ledvinných buněčných liniích za použití standardního influenza plakového testu.
Výsledky
Při použití samotné DNA vakcíny byla indukce CTL vůči 4 H-2d epitopům kódovaným myším polytopem slabá a byly zaznamenány jen slabé odpovědi vůči epitopům pro P. Berghei (SYIPSAEKI) a viru lymfocytámí choriomeningitídy (RPQASGVYM). Naproti tomu při použití režimu DNA primární MVA posilující (podáno 107 pfu MVA-BN podkožně) byly podstatně více CTL indukované vůči SLY (8 násobný vzrůst) a RPQ (3 násobný vzrůst) a byly pozorovány odpovědi také vůči třetímu epitopu pro myší cytomegalovirus (YPHFMPTNL) (obr. 3). Avšak použití 107 pfu MVA-BN aplikováno podkožně v homologním primárním a posilujícím režimu indukovalo stejnou hladinu odpovědí jako DNA následovaná MVA-BN (obr. 3A). Je překvapující, že nebyly významnější rozdíly v počtu CTL indukovaných vůči třem epitopům, když byla použita jedna imunizace s MVA-BN (107 TCID50), což ukazuje, že druhá imunizace s MVA-BN neposílila významně CTL odpovědi. Podkožní aplikace 107 pfu MVA se dříve ukázala jako nejméně účinná cesta a koncentrace viru pro vakcinaci při použití jiných kmenů MVA, zejména ve srovnání s imunizacemi intravenózními (Schneider et al, 1998). Za účelem optimalizace režimů imunizace byl výše uvedený pokus opakován tak, že bylo změněno buď množství viru, nebo způsob podávání. V jednom pokusu byly vakcinace s 107 pfu MVA-BN aplikovány intravenózně (obr. 3B). V dalším pokusu bylo 108 pfu MVA-BN aplikováno podkožně (obr. 3 C). V těchto pokusech MVA-BN primární- posilující imunizace indukovaly vyšší střední hodnotu počtu CTL vůči všem třem CTL epitopům ve srovnání s režimy DNA primární MVA posilující. Také na rozdíl od 107 pfu MVA-BN aplikovaných podkožně, imunizace s 107 pfu MVA-BN aplikovaných intravenózně a imunizace s 108 pfu MVA-BN aplikovaných podkožně podstatně posílilo CTL odpovědi, jasně ukazujíce, že MVA-BN lze použít na posílení CTL odpovědí v přítomnosti již existující imunity vůči vektoru.
2.2.3.: Účinnost MVA-BN nef vakcíny v SIV infikovaných opicích z rodu Macacus
Ke stanovení účinnosti MVA-BN nef vakcíny byly určeny virové zátěže a opoždění nemoci po jejím vyvolání virulentním primárním izolátem SIV. Navíc studie určí zda MVA-BN může být použitý pro bezpečné posílení imunitních odpovědí u imunokompromitovaných opic s již existující imunitou vůči MVA.
-19CZ 295808 B6
Vakcinační protokoly
Dvě skupiny (n=6) opic makaka (Macaca mulatta) byly vakcinované bolusovou dávkou intramuskulámí injekce buď s MVA-BN samotným, nebo rekombinantním MVA-BN nef v nultém,
8. a 16, týdnu. Ve 22. týdnu byla u všech opic vyvolaná odezva intravenózní aplikací 50 MID50 patogenního buněčně asociovaného SIV (lxC) z primárních, nekultivovaných opičích PBMC. Klinický stav opic byl průběžně monitorován a pravidelně byly odebírány vzorky krve pro měření virémie, imunitních parametrů a celého spektra hematologických a krevních klinických chemických parametrů. Zvířata u nichž se rozvinula nemoc podobná AIDS byla utracena a přeživší opice byly monitorovány 99 týdnů po vakcinaci. Ve 100. týdnu byly všechny přeživší opice imunizovaly i.m. s MVA-BN tat a byly opět imunizovány se stejným MVA-BN tat v 102. a 106. týdnu.
Po žádné z vakcinaci s MVA-BN nebo MVA-BN nef nebyly pozorovány žádné nepříznivé účinky. Po infekci opic s SIV hladiny virémie ostře vzrostly a dosáhly vrcholu dva týdny po infekci (obr. 4). V důsledku velkých odchylek od standardu uvnitř skupin nebyl žádný výrazný rozdíl ve středních hladinách SIV mezi skupinami vakcinovanými s MVA-BN nef nebo MVA-BN. Avšak byla 10 ti násobně nižší SIV zátěž ve skupině vakcinované s MVA-BN nef v porovnání s kontrolní skupinou (MVA-BN). Navíc po 35ti týdnech po infekci (počáteční pozorovací perioda) jen jedna ze šesti opic vakcinovaných s MVA-BN nef musela být utracena v důsledku vážnosti nemoci, ve srovnání se 4 až 6 zvířat v kontrolní skupině (obr. 5). Rozvoj nemoci jasně korespondoval s vyšší zátěží viru a jako taková byla zvířata pozorována dalších 29 týdnů po infekci. MVABN nef vakcína se zdála opožďovat progresi nemoci ve srovnání s kontrolní skupinou a ještě v 46. týdnu po infekci 5 ze 6ti zvířat vakcinovaných s MVA-BN nef přežívalo (obr. 5). Avšak v 59. týdnu po infekci byla dvě další zvířata ze skupiny vakcinované s nef usmrcena, čímž zbylo pět přeživších zvířat (tři ze skupiny vakcinované s MVA-BN nef a dvě vakcinované s MVABN). Zkouška titru protilátek vyvolaných s MVA-BN v těchto 12 opicích jasně demonstrovala, že MVA-BN posiloval imunitní odpověď také v přítomnosti již existující imunity vůči MVA (obr. 6). Po primární imunizaci s MVA-BN nebo MVA-BN nef si všechny opice vytvořily protilátkovou odpověď vůči MVA se středním titrem 1000. Tato protilátková odpověď byla významně posílena po druhé imunizaci, což jasně demonstruje, že MVA lze použít pro primámí/posilující imunitní odpověď ve zdravých opicích. Tyto protilátkové titry postupně klesaly, i když se titry ve 49. týdnu po imunizaci srovnaly tak, že v 99. týdnu byly střední hodnoty titrů vůči MVA 2000.
Přeživších pět opic bylo infikováno s SIV a imunokompromitováno s CD4 v množství menším než 400/μ1 krvi. Na zjištění dopadu použití MVA-BN v imunokompromitovaných opicích bylo pět přeživších zvířat vakcinováno třikrát s MVA-BN tat v 100., 102. a 106. týdnu po první vakcinaci. První imunizace s MVA-BN tat významně posílila protilátkovou odpověď těchto imunokompromitovaných opic, která byla dále posílena třetí imunizací po šesti týdnech (obr. 6). Tyto výsledky ukazují, že MVA-BN může posílit imunitní odpovědi v přítomnosti významné preexistující imunity vůči MVA i v imunokompromitovaných opicích. Přestože imunitní odpověď byla po imunizacích s MVA-BN tat posílená, hladiny SIV zůstaly stabilní což ukazuje, že imunizace s MVA-BN jsou bezpečné a neovlivňují hladiny SIV v imunokompromitovaných opicích (obr. 7).
Tyto studie ukázaly, že MVA-BN může primárně posílit imunitní odpovědi v imunokompromitovaných opicích a že imunizace s MVA-BN jsou bezpečné a neovlivňují hladiny virémie ve zvířatech infikovaných SIV. Opoždění progrese nemocí podobných AIDS ve zvířatech vakcinovaných s MVA-BN nef vakcínou ukazuje, že byla úspěšně vytvořena imunita vůči nef.
-20CZ 295808 B6
2.2.4.: Terapeutická vakcinace opic infikovaných s SIV podstupujících antiretrovirovou léčbu
V jedincích podstupujících antiretrovirovou terapii je vhodné použití terapeutické HIV vakcíny na MVA-BN. Proto byla v této studii zkoumaná bezpečnost (účinek na SIV hladiny) a účinnost rekombinantních MVA kódujících různé SIV antigeny (gag, pol, env, rev, tat a nef) v SIV infikovaných opicích léčených s PMPA. PMPA je nukleosidový analog a je účinný proti HIV a SIV (Rosenwirth, B. et al, 2000, J. Virol. 74, 1704—11).
Konstrukty
Všechny rekombinantní MVA konstrukty byly rozšiřovány na CEF buňkách, čištěny na sacharóze a upraveny v Tris pH 7,4.
Vakcinační protokol
Tři skupiny (n = 6) opic (Macaca mulatta) byly infikovány s 50 MID50 patogenního primárního SIV izolátu (lxC) a potom jim byl denně podáván PMPA (60 mg/kg s.c. podkožně) po dobu 19 týdnů. V 10. týdnu byla zvířata vakcinována rekombinantním MVA-BN (i.m.) nebo fyziologickým roztokem a po 6ti týdnech byly opět vakcinovány identicky. Skupina 1 dostala směs MVA gag-pol a MVA-env, skupina 2 dostala MVA-tat, MVA-rev a MVA-nef, zatímco třetí skupina dostala fyziologický roztok. Klinický stav zvířat byl průběžně monitorován a pravidelně byly odebírány vzorky krve pro měření virémie, imunitních parametrů a celého rozsahu hematologických a klinických chemických parametrů krve.
Všechna zvířata vykazovala vysokou SIV zátěž, která vrcholila 2 týdny po infekci (obr. 8). Po každodenním podávání PMPA se hladiny SIV snížily a v 9tém týdnu stabilizovaly na nízkých hladinách. Tak jako v předchozích studiích, vakcinace sMVA v 10. a 16. týdnu neměly žádný účinek na hladiny SIV, což ukazuje, že MVA-BN je bezpečný vektor vakcíny pro imunokompromitovaná zvířata. Jakmile bylo zvířatům přerušeno podávání PMPA (21. týden), hladiny SIV se zvýšily. Přestože tři zvířata ze skupiny 1 měla snížené hladiny SIV ve srovnání s 3., kontrolní skupinou, nebyl významný rozdíl ve střední hodnotě SIV zátěže mezi jednotlivými skupinami po ukončení podávání PMPA (obr. 8). Za použití ELIS A na lyzáty SIV infikovaných T-buněk, zvířata ve všech skupinách vytvářela protilátkovou odpověď vůči SIV ve 4. týdnu po infekci (obr. 9). Titr SIV protilátek v kontrolní skupině (fyziologický roztok) poklesl během podávání PMPA a rapidně se zvýšil po přerušení podávání PMPA, projevujíce pokles a následný nárůst SIV hladin během antiretrovirové terapie (obr. 9). Podobný obraz v titru SIV protilátek byl pozorován v druhé skupině, která dostala MVA-tat, MVA-rev a MVA-nef, pravděpodobně odrážející pod-expresi těchto regulačních proteinů v lyzátech SIV infikovaných T buněk použitých v ELISA. Naproti tomu však se ve skupině 1 titry SIV protilátek zvýšily po vakcinacích s MAV gagpol a MVA-env v 10. týdnu, ukazujíce, že rekombinantní MVA-BN může posílit imunitní odpověď vůči SIV ve SIV infikovaných zvířatech, které procházejí antiretrovirovou terapii. Důležité je, že titry protilátek proti SIV byly posílené po druhé imunizaci v 16. týdnu což ukazuje, že MVA může posílit imunitní odpověď v imunokompromitovaných zvířatech také v přítomnosti již existující imunity vůči MVA (obr. 8). Titry protilátek proti MVA v 1. skupině také zobrazovalo toto schéma s vývojem protilátkové odpovědi po první imunizaci, které bylo silně posílené po druhé vakcinaci (obr. 10).
Odkazy
Schneider, J., Gilbert, SC., Blanchard, TJ., Hanke, T., Robson, KJ., Hannan, CM., Becker, M., Sinden, R., Smith, GL., and Hil, AVS, 1998 - Enhancened immunogenicity for CD8+ T cell induction and complete effícacy of malaria DNA vaccination by boosting with modified vaccinia virus Ankara, Nat. Med. 4, 397-402.
-21 CZ 295808 B6
Thomson, SA., Sherritt, MA., Medveczky, J., Elliott, SL., Mos, DJ., Femando, GJP., Brown, LE., and Suhrbier, A. 1998. Delivery of multiple CD8 cytotoxic T cell epitopes by DNA vaccination. J. Immunol. 160: 1717.
Tabulka 1
CEF HeLa HaCat 143B BHK Věro CV-1
MVA-BN 579,73 0,04 0,22 0,00 65,88 2.33 0.00
MVA-575 796,53 0,15 1,17 0,02 131,2 10,66 0,06
MVA- HLR 86,68 124,97 59,09 0,83 87,86 34,97 29,7
MVA- Vero 251,89 27,41 1,28 2,91 702,77 1416,46 4,48
Amplifíkace viru nad hladinu vstupu po 4 denní infekci
Amplifikační poměr = výstup TCID50 - vstup TCID50.
Hodnoty jsou v TCID50.
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (41)

1. Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara (MVA), a to MVA uložený v Evropské sbírce mikroorganizmů (ECACC), Salisbury (UK) pod číslem V00083008 (MVA-BN) nebo jeho deriváty, přičemž deriváty jsou vyznačené tím, že jsou (i) schopné reproduktivní replikace ve fíbroblastech kuřecích embryí (CEF) a v ledvinných buněčných liniích křeččích mláďat BHK, ale nejsou schopné reproduktivní replikace v lidských buněčných liniích a (ii) selháním replikace in vivo, ve vážně imunokompromitovaných myších.
2. Virus MVA podle nároku 1, kde lidské buněčné linie jsou buněčné linie lidského osteosarkomu 143B, lidské keratinocytové buněčné linie HaCat a buněčné linie lidského cervikálního adenokarcinomu HeLa.
3. Virus MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 a 2, kde vážně imunokompromitované myši jsou myši neschopné tvorby zralých B a T buněk.
4. Virus MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde vážně imunokompromitovanémyši jsou AGR129 transgenní myši.
5. Virus MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, purifíkovaný klonováním.
6. Virus MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, obsahující alespoň jednu heterologní sekvenci nukleové kyseliny.
-22CZ 295808 B6
7. Virus MVA podle nároku 6, kde heterologní sekvence nukleové kyseliny je vybraná ze sekvence kódující alespoň jeden antigen, antigenní epitop a/nebo terapeutickou sloučeninu.
8. Virus MVA podle nároku 7, kde antigenní epitopy jsou vybrané z virů ze skupiny virus Influenza, Flavivirus, Paramyxovirus, virus hepatitidy, virus lidské imunitní nedostatečnosti (HIV) nebo virů způsobujících hemoragickou horečku.
9. MVA podle kteréhokoliv z nároků 6 až 8, kde MVA je MVA-BN obsahující nef gen.
10. Genom MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9.
11. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje virus MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 a/nebo genom podle nároku 10 a farmaceuticky přijatelný nosič, rozpouštědlo a/nebo přísadu.
12. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje virus MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 a/nebo genom podle nároku 10.
13. Farmaceutická kompozice podle nároku 11 nebo vakcína podle nároku 12, vyznačující se tí m, že obsahuje alespoň 102 TCID50 MVA.
14. Virus MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, genom podle nároku 10, kompozice podle nároků 11 nebo 13 nebo vakcína podle nároků 12 nebo 13 pro ovlivnění a/nebo indukci imunologické odpovědi v živých zvířatech, včetně lidí.
15. Virus MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, genom podle nároku 10, kompozice podle nároků 11 nebo 13 nebo vakcína podle kteréhokoliv z nároků 12 nebo 13 pro očkování živých zvířat, včetně člověka proti lidské neštovicové nemoci.
16. MVA, genom, kompozice nebo vakcína podle nároku 15, kde lidské neštovicové onemocnění jsou pravé neštovice.
17. MVA, genom, kompozice nebo vakcína podle kteréhokoliv z nároků 14 až 16, kde zvíře je imunokompromitované.
18. MVA, genom, kompozice nebo vakcína podle kteréhokoliv z nároků 14 až 17, kde zvíře má již existující imunitu vůči poxvirům.
19. MVA, genom, kompozice nebo vakcína podle kteréhokoliv z nároků 14 až 18, kde zvíře prochází antivirovou terapií.
20. MVA, genom, kompozice nebo vakcína podle kteréhokoliv z nároků 14 až 19, kde antivirová terapie je antiretrovirovou terapií.
21. MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, farmaceutická kompozice podle nároků 11 nebo 13, vakcína podle nároku 12, kde MVA, kompozice nebo vakcína se podává v terapeuticky účinných množstvích při primárním očkování a v posilujícím očkování.
22. MVA podle kteréhokoliv z nároků 6 až 9 nebo genom podle nároku 10 pro zavedení homologní a/nebo heterologní sekvence nukleové kyseliny do cílové buňky.
23. Použití MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 a/nebo genomu podle nároku 10 pro přípravu léčiva nebo vakcíny.
-23 CZ 295808 B6
24. Použití podle nároku 23, kde léčivo nebo vakcína se podává pro indukci imunologické odpovědi živému zvířeti včetně člověka.
25. Použití podle kteréhokoliv z nároků 23 a 24, kde léčivo nebo vakcína je proti lidským poxvirovým nemocím.
26. Použití podle nároku 25, kde lidská poxvirová nemoc jsou pravé neštovice.
27. Použití podle kteréhokoliv z nároků 23 až 26, kde léčivo nebo vakcína obsahuje alespoň 102 TCIDso MVA.
28. Použití podle kteréhokoliv z nároků 23 až 27, kde MVA se podává v terapeuticky účinných množstvích při primárním očkování a v posilujícím očkování.
29. Použití podle kteréhokoliv z nároků 23 až 28, kde zvíře je imunokompromitované.
30. Použití podle kteréhokoliv z nároků 23 až 29, kde zvíře má již existující imunitu vůči poxvirům.
31. Použití podle kteréhokoliv z nároků 23 až 30, kde zvíře prochází antivirovou terapií.
32. Použití podle kteréhokoliv z nároků 23 až 31, kde antivirovou terapií je antiretrovirová terapie.
33. MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 jako adjuvans.
34. Použití MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 jako adjuvans.
35. Způsob zavedení homologní a/nebo heterologní sekvence nukleové kyseliny do cílových buněk in vitro, vyznačující se tím, že zahrnuje infikování cílových buněk virem MVA podle nároků 6 až 9 nebo transfekcí cílové buňky genomem podle nároku 10.
36. Způsob produkce peptidu, proteinu a/nebo viru MVA, vyznačující se tím, že zahrnuje
d) infikování hostitelské buňky virem MVA podle nároků 1 až 9,
e) kultivaci infikované hostitelské buňky za vhodných podmínek, a
f) izolaci a/nebo obohacení peptidu a/nebo proteinu a/nebo virus MVA produkovaného hostitelskou buňkou.
37. Buňka, včetně lidské, obsahující MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9 nebo genom podle nároku 10.
38. Způsob získání viru MVA podle kteréhokoliv z nároků laž5, vyznačující se t í m, že zahrnuje následující kroky:
- zavedení obecně dostupného kmene viru vakcinie do jiných než lidských buněk, ve kterých je virus schopný reproduktivní replikace,
- izolaci/obohacení virových částic z těchto buněk a
- analýzu zda získaný virus má alespoň jednu z biologických vlastností definovaných v nároku 1,
-24CZ 295808 B6 přičemž výše uvedené kroky mohou být libovolně opakovány do té doby než se získá virus s požadovanými replikačními vlastnostmi.
39. Způsob podle nároku 38, vyznačující se tím, že obecně dostupný kmen viru vakcinie je MVA 575.
40. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 38 až 39, vyznačující se tím, že jiné než lidské buňky jsou vybrané ze skupiny CEF buněk a BHK buněčných linií.
41. Souprava pro primámí/posilující imunizaci, vyznačující se tím, že obsahuje virus MVA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, kompozici podle nároků 11 nebo 13, vakcínu podle nároků 12 nebo 13 pro primární očkování v první ampuli/nádobce a pro posilující očkování v druhé ampuli/nádobce.
CZ20031366A 2000-11-23 2001-11-22 Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara CZ295808B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DKPA200001764 2000-11-23

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20031366A3 CZ20031366A3 (cs) 2003-08-13
CZ295808B6 true CZ295808B6 (cs) 2005-11-16

Family

ID=8159864

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20031366A CZ295808B6 (cs) 2000-11-23 2001-11-22 Modifikovaný virus vakcinie typu Ankara

Country Status (30)

Country Link
US (11) US6913752B2 (cs)
EP (4) EP2204452A1 (cs)
JP (1) JP4421188B2 (cs)
KR (3) KR100830295B1 (cs)
CN (2) CN100537773C (cs)
AT (1) ATE314483T2 (cs)
AU (2) AU3163902A (cs)
BE (1) BE2013C065I2 (cs)
BR (1) BRPI0115533B8 (cs)
CA (1) CA2421151C (cs)
CY (2) CY1105594T1 (cs)
CZ (1) CZ295808B6 (cs)
DE (2) DE20122302U1 (cs)
DK (1) DK1335987T4 (cs)
EE (1) EE05680B1 (cs)
ES (1) ES2256323T5 (cs)
FR (1) FR13C0070I2 (cs)
HK (1) HK1059453A1 (cs)
HU (2) HU230198B1 (cs)
IL (2) IL154712A0 (cs)
LU (1) LU92311I2 (cs)
MX (1) MXPA03002513A (cs)
NO (1) NO337867B1 (cs)
NZ (1) NZ524661A (cs)
PL (1) PL212047B1 (cs)
PT (1) PT1335987E (cs)
RU (1) RU2290438C2 (cs)
SI (1) SI1335987T2 (cs)
UA (1) UA76731C2 (cs)
WO (1) WO2002042480A2 (cs)

Families Citing this family (150)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7628980B2 (en) 2000-11-23 2009-12-08 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
US7445924B2 (en) 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
EE05680B1 (et) 2000-11-23 2013-10-15 Bavarian Nordic A/S Muundatud vaktsiiniaviirus, selle valmistamine ja kasutamine, seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon ning vaktsiin
US7097842B2 (en) 2000-11-23 2006-08-29 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
UA82466C2 (uk) * 2001-07-18 2008-04-25 Бавариан Нордика А/С Спосіб посилення ампліфікації хордопоксвірусу
CA2466413C (en) * 2001-12-04 2014-11-04 Bavarian Nordic A/S Flavivirus ns1 subunit vaccine
KR101028937B1 (ko) * 2002-04-19 2011-04-12 버베리안 노딕 에이/에스 신생아의 백신접종용 변형 백시니아 바이러스 안카라
NZ536500A (en) * 2002-05-16 2008-01-31 Bavarian Nordic As Expression of genes in modified vaccinia virus ankara by using the cowpox ATI promoter
PL218318B1 (pl) 2002-05-16 2014-11-28 Bavarian Nordic As Rekombinowany wirus krowianki Ankara (MVA), zawierająca go komórka, szczepionka lub kompozycja farmaceutyczna, sposób lub zestaw do jego otrzymywania, sekwencja DNA zawierająca genom tego wirusa oraz sposób wykrywania tego wirusa lub komórek nim zainfekowanych
US7501127B2 (en) 2002-05-16 2009-03-10 Bavarian Nordic A/S Intergenic regions as novel sites for insertion of HIV DNA sequences in the genome of Modified Vaccinia virus Ankara
EA009008B1 (ru) 2002-09-05 2007-10-26 Бавариан Нордик А/С Способ амплификации вируса оспы
EP1845164B1 (en) * 2003-11-24 2010-06-16 Bavarian Nordic A/S Promoters for expression in modified vaccinia virus ankara
ES2357772T3 (es) * 2004-06-14 2011-04-29 Ishihara Sangyo Kaisha, Ltd. Composición liofilizada de envuelta viral inactivada con actividad de fusión de membrana.
CN1295339C (zh) * 2005-01-11 2007-01-17 武汉大学 减毒痘苗病毒天坛株载体及制备方法和应用
LT1855720T (lt) * 2005-02-23 2017-01-10 Bavarian Nordic A/S Modifikuoto raupų viruso panaudojimas greitam imuniteto sužadinimui prieš raupų virusą arba kitus infekcinius agentus
US20090269365A1 (en) * 2005-04-20 2009-10-29 University Of Washington Immunogenic vaccinia peptides and methods of using same
KR100717279B1 (ko) * 2005-08-08 2007-05-15 삼성전자주식회사 마스크롬 소자 및 그 형성 방법
US7913477B2 (en) * 2006-01-27 2011-03-29 William Anthony Harper Insert registration in packets
EP1826264A1 (en) * 2006-02-24 2007-08-29 Deutsches Primatenzentrum GmbH Primate model for orthopox virus infections
EP1835031A1 (en) 2006-03-14 2007-09-19 Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt für Sera und Impfstoffe Use of a recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) for the treatment of type I hypersensitivity in a living animal including humans
EP2029756B1 (en) * 2006-06-20 2016-11-09 Transgene S.A. Process for producing poxviruses and poxvirus compositions
CN101472610A (zh) 2006-06-20 2009-07-01 特朗斯吉有限公司 重组病毒疫苗
CA2662730A1 (en) * 2006-09-08 2008-03-13 Bavarian Nordic A/S Phenotypic and genotypic differences of mva strains
DK2073837T3 (da) * 2006-10-06 2014-09-29 Bavarian Nordic Inc Rekombinant modificeret vaccinia-ankara-virus, der koder for et her-2-antigen, i kombination med en taxan til anvendelse til behandling af cancer
US8268327B2 (en) 2007-04-27 2012-09-18 Bavarian Nordic A/S Immediate protection against pathogens via MVA
US8003364B2 (en) * 2007-05-14 2011-08-23 Bavarian Nordic A/S Purification of vaccinia viruses using hydrophobic interaction chromatography
JP2010526546A (ja) 2007-05-14 2010-08-05 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ ワクシニアウイルス系及び組換えワクシニアウイルス系ワクチンの精製
AU2008312444B2 (en) * 2007-10-18 2014-02-06 Bavarian Nordic A/S Use of MVA to treat prostate cancer
KR100970449B1 (ko) * 2007-12-21 2010-07-16 (주)이지아이 안전성을 갖는 어린이 놀이터용 고무 바닥재 및 설치방법
WO2009152969A1 (en) * 2008-06-20 2009-12-23 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus measles vaccine
MX2011007386A (es) 2009-01-20 2011-08-03 Transgene Sa Icam-1 soluble como un biomarcador para la prediccion de una respuesta terapeutica.
US8613936B2 (en) 2009-03-13 2013-12-24 Bavarian Nordic A/S Replication deficient recombinant viruses expressing antigens regulated by transcriptional control elements comprising multiple elements
US8394385B2 (en) * 2009-03-13 2013-03-12 Bavarian Nordic A/S Optimized early-late promoter combined with repeated vaccination favors cytotoxic T cell response against recombinant antigen in MVA vaccines
SG2014014021A (en) 2009-03-24 2014-07-30 Transgene Sa Biomarker for monitoring patients
NZ594896A (en) 2009-04-17 2013-07-26 Transgene Sa Biomarker for monitoring patients
SG176619A1 (en) 2009-07-10 2012-01-30 Transgene Sa Biomarker for selecting patients and related methods
JP2013507107A (ja) 2009-10-08 2013-03-04 バヴァリアン・ノルディック・アクティーゼルスカブ Ｈｉｖに対するヒトにおける広範なｔ細胞応答の生成
US9011874B2 (en) * 2009-11-20 2015-04-21 Takeda Vaccines, Inc. Compositions, methods and uses for poxvirus elements in vaccine constructs
DK2529010T3 (en) 2010-01-28 2017-07-24 Bavarian Nordic As MUTANTS OF VACCINIAVIRUS CONTAINING THE MAIN GENOMIC DELETIONS OF VAT
EP2550362B1 (en) 2010-03-25 2017-01-04 Oregon Health&Science University Cmv glycoproteins and recombinant vectors
AU2011281982B2 (en) 2010-07-20 2015-12-17 Bavarian Nordic A/S Method for harvesting expression products
WO2012018856A2 (en) * 2010-08-02 2012-02-09 Virxsys Corporation Hiv vaccine therapy with concomitant antiviral monotherapy
NZ608143A (en) 2010-10-15 2015-02-27 Bavarian Nordic As Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) influenza vaccine
RS57397B8 (sr) 2011-06-10 2020-01-31 Univ Oregon Health & Science Cmv glikoproteini i rekombinantni vektori
PL2739293T3 (pl) 2011-08-05 2020-11-16 Sillajen Biotherapeutics, Inc. Sposoby i kompozycje wytwarzania wirusa krowianki
EP2568289A3 (en) 2011-09-12 2013-04-03 International AIDS Vaccine Initiative Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies
US9402894B2 (en) 2011-10-27 2016-08-02 International Aids Vaccine Initiative Viral particles derived from an enveloped virus
EP2788021B1 (en) 2011-12-09 2017-01-18 Bavarian Nordic A/S Poxvirus vector for the expression of bacterial antigens linked to tetanus toxin fragment c
EP2620446A1 (en) 2012-01-27 2013-07-31 Laboratorios Del Dr. Esteve, S.A. Immunogens for HIV vaccination
US10111946B2 (en) 2012-06-22 2018-10-30 Bavarian Nordic A/S Poxviral vectors for low antibody response after a first priming immunization
EP2679596B1 (en) 2012-06-27 2017-04-12 International Aids Vaccine Initiative HIV-1 env glycoprotein variant
CA2878800A1 (en) 2012-07-10 2014-01-16 Transgene Sa Mycobacterial antigen vaccine
WO2014009433A1 (en) 2012-07-10 2014-01-16 Transgene Sa Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant
KR102264852B1 (ko) 2012-08-01 2021-06-14 버베리안 노딕 에이/에스 재조합 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(ankara) (mva) 호흡기 신시티알 바이러스(rsv) 백신
EP2892549A1 (en) 2012-09-04 2015-07-15 Bavarian Nordic A/S Methods and compositions for enhancing vaccine immune responses
WO2014043535A1 (en) 2012-09-14 2014-03-20 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Compositions for the treatment of cancer
CA2888367A1 (en) 2012-10-19 2014-04-24 Bavarian Nordic, Inc. Methods and compositions for the treatment of cancer
SI2912183T1 (sl) 2012-10-28 2020-07-31 Bavarian Nordic A/S Promotor Pr13.5 za odzive robustne T-celice in protiteles
CN105101993A (zh) * 2013-03-15 2015-11-25 巴法里安诺迪克有限公司 单次高剂量的mva在新生儿和婴儿中诱导保护性免疫反应
EP2848937A1 (en) 2013-09-05 2015-03-18 International Aids Vaccine Initiative Methods of identifying novel HIV-1 immunogens
US10058604B2 (en) 2013-10-07 2018-08-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers
JP6788500B2 (ja) 2013-10-23 2020-11-25 アメリカ合衆国 Ｍｕｃ１−ｃ癌タンパク質のｈｌａ−ａ２４アゴニストエピトープ及び組成物及び使用方法
WO2015077717A1 (en) 2013-11-25 2015-05-28 The Broad Institute Inc. Compositions and methods for diagnosing, evaluating and treating cancer by means of the dna methylation status
NZ759538A (en) 2013-11-28 2022-10-28 Bavarian Nordic As Compositions and methods vectors for inducing an enhanced immune response using poxvirus vectors
US11725237B2 (en) 2013-12-05 2023-08-15 The Broad Institute Inc. Polymorphic gene typing and somatic change detection using sequencing data
CN106456724A (zh) 2013-12-20 2017-02-22 博德研究所 使用新抗原疫苗的联合疗法
WO2015104380A1 (en) 2014-01-09 2015-07-16 Transgene Sa Fusion of heterooligomeric mycobacterial antigens
DK3142689T3 (da) 2014-05-13 2021-02-15 Bavarian Nordic As Kombinationsbehandling til behandling af cancer med en koppevirus, som udtrykker et tumorantigen, og et monoklonalt antistof mod tim-3
MX2016016533A (es) 2014-06-13 2017-05-01 Glaxosmithkline Biologicals Sa Combinaciones inmunogenas.
IL250743B (en) 2014-09-03 2022-08-01 Bavarian Nordic As Methods and compositions for inducing protective immunity against filovirus infection
BR112017004202A2 (pt) 2014-09-03 2019-09-03 Bavarian Nordic As composições para intensificar respostas imunes e seus usos
BR112017005917A2 (pt) 2014-09-26 2017-12-12 Beth Israel Deaconess Medical Ct Inc processos e composições para indução de imunidade protetora contra infecção com o vírus da imunodeficiência humana
KR101623498B1 (ko) 2014-10-16 2016-05-24 대한민국 약독화 백시니아 바이러스주 kvac１０３
KR101645642B1 (ko) 2014-10-16 2016-08-11 대한민국 Kvac１０３ 유래의 재조합 백시니아 바이러스
SG11201702997YA (en) 2014-11-04 2017-05-30 Janssen Vaccines & Prevention Bv Therapeutic hpv16 vaccines
US10975442B2 (en) 2014-12-19 2021-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Molecular biomarkers for cancer immunotherapy
WO2016100977A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 The Broad Institute Inc. Methods for profiling the t-cel- receptor repertoire
AU2016229408A1 (en) 2015-02-25 2017-09-14 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Use of inactivated nonreplicating modified vaccinia virus ankara (mva) as monoimmunotherapy or in combination with immune checkpoint blocking agents for solid tumors
EP3069730A3 (en) 2015-03-20 2017-03-15 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
EP3072901A1 (en) 2015-03-23 2016-09-28 International Aids Vaccine Initiative Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers
WO2016168862A1 (en) 2015-04-17 2016-10-20 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Use of mva or mvadeltae3l as immunotherapeutic agents against solid tumors
EP3297660A2 (en) 2015-05-20 2018-03-28 The Broad Institute Inc. Shared neoantigens
TWI750122B (zh) 2015-06-09 2021-12-21 美商博德研究所有限公司 用於贅瘤疫苗之調配物及其製備方法
EA201890042A1 (ru) * 2015-06-15 2018-05-31 Бавариан Нордик А/С Вакцина против вируса ящура (вя) на основе рекомбинантного модифицированного вируса осповакцины анкара (mva)
US9925258B2 (en) 2015-10-02 2018-03-27 International Aids Vaccine Initiative Replication-competent VSV-HIV Env vaccines
FR3042121A1 (fr) 2015-10-08 2017-04-14 Jean-Marc Limacher Composition anti-tumorale
CN106591361A (zh) * 2015-10-20 2017-04-26 钱文斌 一种重组痘溶瘤病毒及其构建方法和应用
TWI792091B (zh) 2015-12-15 2023-02-11 荷蘭商傑森疫苗防護公司 人類免疫缺陷病毒抗原、載體、組成物、及其使用方法
CA3009928A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Bavarian Nordic A/S Recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) equine encephalitis virus vaccine
CN109152815B (zh) 2016-02-25 2022-10-18 纪念斯隆凯特琳癌症中心 用于癌症免疫治疗的具有胸苷激酶缺失和具有或不具有人flt3l或gm-csf表达的复制型减毒痘苗病毒
IL261321B2 (en) 2016-02-25 2023-12-01 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Recombinant MVA or MVADELE3L expressing human FLT3L and their use as immunotherapeutic agents against solid tumors
CA3020426A1 (en) 2016-04-13 2017-10-19 Synthetic Genomics, Inc. Recombinant arterivirus replicon systems and uses thereof
WO2017184590A1 (en) 2016-04-18 2017-10-26 The Broad Institute Inc. Improved hla epitope prediction
CA3021341A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 Janssen Vaccine & Prevention B.V. Therapeutic hpv vaccine combinations
CN109219448B (zh) 2016-06-16 2022-09-20 扬森疫苗与预防公司 Hiv疫苗配制品
US10925956B2 (en) 2016-07-15 2021-02-23 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against a marburg virus infection
US10307477B2 (en) 2016-09-02 2019-06-04 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
JP7178344B2 (ja) 2016-09-15 2022-11-25 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー 三量体安定化ｈｉｖエンベロープタンパク質変異
WO2018060368A2 (en) 2016-09-28 2018-04-05 Bavarian Nordic A/S Compositions and methods for enhancing the stability of transgenes in poxviruses
CA3040264A1 (en) 2016-10-17 2018-04-26 Synthetic Genomics, Inc. Recombinant virus replicon systems and uses thereof
CA3042703A1 (en) 2016-11-07 2018-05-11 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Development of agonist epitopes of the human papillomavirus
US11845939B2 (en) 2016-12-05 2023-12-19 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhancing gene expression
EP3574116A1 (en) 2017-01-24 2019-12-04 The Broad Institute, Inc. Compositions and methods for detecting a mutant variant of a polynucleotide
US11173204B2 (en) 2017-04-06 2021-11-16 Janssen Vaccines & Prevention B.V. MVA-BN and Ad26.ZEBOV or Ad26.filo prime-boost regimen
US11242509B2 (en) 2017-05-12 2022-02-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Vaccinia virus mutants useful for cancer immunotherapy
JP2020519666A (ja) 2017-05-15 2020-07-02 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． 安定性のウイルス含有組成物
EP3624845A1 (en) 2017-05-15 2020-03-25 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stable virus-containing composition
KR20200015759A (ko) 2017-06-15 2020-02-12 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Hiv 항원을 인코딩하는 폭스바이러스 벡터, 및 그 사용 방법
KR20200031655A (ko) 2017-07-19 2020-03-24 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 삼량체를 안정화하는 hiv 엔벨로프 단백질 돌연변이
WO2019018724A1 (en) 2017-07-21 2019-01-24 Janssen Vaccines & Prevention B.V. METHODS FOR SAFE INDUCTION OF MULTICLADED CROSS-IMMUNITY AGAINST HUMAN IMMUNODEFICIENCY VIRUS INFECTION IN HUMAN BEINGS
MX2020001856A (es) 2017-08-24 2020-07-13 Bavarian Nordic As Terapia de combinacion para tratar el cancer con administracion intravenosa de un virus vaccinia ankara modificado (mva) recombinante y un anticuerpo.
US20190083620A1 (en) 2017-09-18 2019-03-21 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
EA202091513A1 (ru) 2017-12-19 2020-09-09 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Вакцины против вируса гепатита b (hbv) и их применение
EA202091517A1 (ru) 2017-12-19 2020-11-03 Янссен Сайенсиз Айрлэнд Анлимитед Компани Способы и устройство для доставки вакцин против вируса гепатита b (hbv)
MX2020006471A (es) 2017-12-19 2020-09-22 Janssen Sciences Ireland Unlimited Co Metodos y composiciones para inducir una respuesta inmune contra el virus de hepatitis b (hbv).
US11020476B2 (en) 2017-12-19 2021-06-01 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Methods and compositions for inducing an immune response against Hepatitis B Virus (HBV)
EP3728291A1 (en) 2017-12-20 2020-10-28 GlaxoSmithKline Biologicals S.A. Epstein-barr virus antigen constructs
US11083786B2 (en) 2018-01-19 2021-08-10 Janssen Pharmaceuticals, Inc. Induce and enhance immune responses using recombinant replicon systems
US20220001001A1 (en) * 2018-07-13 2022-01-06 University Of Georgia Research Foundation Broadly reactive immunogens of dengue virus, compositions, and methods of use thereof
US20210187100A1 (en) 2018-09-06 2021-06-24 Bavarian Nordic A/S Storage Improved Poxvirus Compositions
WO2020072700A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Hla single allele lines
CA3113818A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Bavarian Nordic A/S Combination therapy for treating cancer with an intravenous administration of a recombinant mva and an immune checkpoint antagonist or agonist
EP3880694A1 (en) 2018-11-14 2021-09-22 The United States of America, as represented by the Secretary, Department of Health and Human Services Tp5, a peptide inhibitor of aberrant and hyperactive cdk5/p25 as treatment for cancer
AU2019385665A1 (en) 2018-11-20 2021-05-27 Bavarian Nordic A/S Therapy for treating cancer with an intratumoral and/or intravenous administration of a recombinant MVA encoding 4-1BBL (CD137L) and/or CD40l
WO2020131586A2 (en) 2018-12-17 2020-06-25 The Broad Institute, Inc. Methods for identifying neoantigens
TW202043256A (zh) 2019-01-10 2020-12-01 美商健生生物科技公司 前列腺新抗原及其用途
WO2020237052A1 (en) 2019-05-22 2020-11-26 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods for inducing an immune response against human immunodeficiency virus infection in subjects undergoing antiretroviral treatment
US20220305120A1 (en) 2019-06-11 2022-09-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Mucosal vaccine formulations
WO2021094984A1 (en) 2019-11-14 2021-05-20 Aelix Therapeutics, S.L. Dosage regimens for vaccines
WO2021099572A1 (en) 2019-11-20 2021-05-27 Bavarian Nordic A/S Medical uses of 4-1bbl adjuvanted recombinant modified vaccinia virus ankara (mva)
WO2021099586A1 (en) 2019-11-20 2021-05-27 Bavarian Nordic A/S Recombinant mva viruses for intratumoral and/or intravenous administration for treating cancer
WO2021150713A2 (en) 2020-01-21 2021-07-29 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Human immunogenic epitopes of h, k, and e human endogenous retroviruses (hervs)
US20230287067A1 (en) 2020-01-21 2023-09-14 The United States Of America,As Represented By The Secretary,Department Of Health And Human Services Human immunogenic epitopes of hemo and hhla2 human endogenous retroviruses (hervs)
CN115243717A (zh) 2020-03-12 2022-10-25 巴法里安诺迪克有限公司 改善痘病毒稳定性的组合物
CA3181431A1 (en) 2020-06-10 2021-12-16 Jurgen Hausmann A recombinant modified vaccinia virus ankara (mva) vaccine against coronavirus disease
WO2021260065A1 (en) 2020-06-24 2021-12-30 Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens
EP3928789A1 (en) 2020-06-24 2021-12-29 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Mva-based vaccine against covid-19 expressing sars-cov-2 antigens
WO2022008613A1 (en) 2020-07-08 2022-01-13 Janssen Sciences Ireland Unlimited Company Rna replicon vaccines against hbv
WO2022084333A1 (en) 2020-10-20 2022-04-28 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Hiv vaccine regimens
EP4358999A1 (en) 2021-06-23 2024-05-01 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Mva-based vaccine expressing a prefusion-stabilized sars-cov-2 s protein
EP4108257A1 (en) 2021-06-23 2022-12-28 Consejo Superior De Investigaciones Científicas Mva-based vaccine against covid-19 expressing a prefusion-stabilized sars-cov-2 s protein
KR20240051214A (ko) 2021-09-03 2024-04-19 버베리안 노딕 에이/에스 변형 백시니아 바이러스 앙카라(mva)에 의한 세포독성 전이유전자 발현의 하향조절을 위한 마이크로rna의 활용
WO2023118508A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Bavarian Nordic A/S Recombinant mva viruses for intraperitoneal administration for treating cancer
WO2023118563A1 (en) 2021-12-23 2023-06-29 Bavarian Nordic A/S Therapy for modulating immune response with recombinant mva encoding il-12
WO2023198815A1 (en) 2022-04-14 2023-10-19 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Sequential administration of adenoviruses
WO2024003239A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Bavarian Nordic A/S RECOMBINANT MODIFIED saRNA (VRP) AND VACCINIA VIRUS ANKARA (MVA) PRIME-BOOST REGIMEN
WO2024003238A1 (en) 2022-06-29 2024-01-04 Bavarian Nordic A/S Epstein-barr-virus vaccine
WO2024003346A1 (en) 2022-06-30 2024-01-04 Bavarian Nordic A/S Mammalian cell line for the production of modified vaccinia virus ankara (mva)
WO2024015892A1 (en) 2022-07-13 2024-01-18 The Broad Institute, Inc. Hla-ii immunopeptidome methods and systems for antigen discovery
EP4316514A1 (en) 2022-08-03 2024-02-07 Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) Mva-based vectors and their use as vaccine against sars-cov-2

Family Cites Families (71)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4072565A (en) * 1974-11-04 1978-02-07 The Dow Chemical Company Production of viruses in tissue culture without use of serum
US3914408A (en) * 1973-10-12 1975-10-21 Univ Nebraska Vaccine for neonatal calf diarrhea
DE2714665A1 (de) * 1977-04-01 1978-10-05 Mayr Anton Praeparat zur behandlung von herpes zoster und anderen herpes-infektionen, sowie verfahren zu seiner herstellung
US5155020A (en) * 1989-03-08 1992-10-13 Health Research Inc. Recombinant poxvirus host range selection system
US5338683A (en) 1981-12-24 1994-08-16 Health Research Incorporated Vaccinia virus containing DNA sequences encoding herpesvirus glycoproteins
GB8322414D0 (en) * 1983-08-19 1983-09-21 Szelke M Renin inhibitors
AU613583B2 (en) 1986-08-22 1991-08-08 Transgene S.A. Proteins and the method for preparing them, DNA sequences, antibodies and their application, poxviruses, transformed or infected cells, pharmaceutical compositions which are useful in the prevention of schistosomiasis and application by way of an agent possessing glutathione s-transferase activity
FR2603040B1 (fr) 1986-08-22 1990-01-26 Transgene Sa Proteine, sequence d'adn, poxvirus, cellules et leur procede de culture, ainsi que les compositions pharmaceutiques les contenant, utiles dans la prevention de la schistosomose
DE3743298A1 (de) 1987-12-19 1989-06-29 Wilkinson Sword Gmbh Rasierapparat und verfahren zur herstellung einer flaeche geringen reibungswiderstands an einem rasierapparat
CA1341245C (en) 1988-01-12 2001-06-05 F. Hoffmann-La Roche Ag Recombinant vaccinia virus mva
US6248333B1 (en) * 1990-04-04 2001-06-19 Health Research Inc. Isolated nucleic acid sequence of equine herpesvirus type 1 glycoprotein D (EHV-1 gD)
EP0550638A4 (en) 1990-09-25 1993-12-08 Smithkline Beecham Corporation Medium for culture of mammalian cells
JP3602530B2 (ja) * 1991-03-07 2004-12-15 ヴァイロジェネティクス コーポレイション 遺伝子操作したワクチン菌株
US5843456A (en) * 1991-03-07 1998-12-01 Virogenetics Corporation Alvac poxvirus-rabies compositions and combination compositions and uses
US5403582A (en) 1993-01-21 1995-04-04 Nippon Zeon Co., Ltd. Vaccine comprising fowlpox virus recombinants expressing the envelope glycoprotein of an avian reticuloendotheliosis retrovirus
US5405772A (en) 1993-06-18 1995-04-11 Amgen Inc. Medium for long-term proliferation and development of cells
US6015686A (en) 1993-09-15 2000-01-18 Chiron Viagene, Inc. Eukaryotic layered vector initiation systems
US5490794A (en) * 1993-11-05 1996-02-13 Sumitomo Wiring Systems, Ltd. Branch joint box
US6190655B1 (en) 1993-12-03 2001-02-20 Immunex Corporation Methods of using Flt-3 ligand for exogenous gene transfer
DE4405841C1 (de) * 1994-02-23 1995-01-05 Mayr Anton Prof Dr Med Vet Dr Multipotente Paramunitätsinducer auf der Basis von Kombinationen von Pockenviruskomponenten, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung als Arzneimittel
ES2243937T3 (es) * 1994-04-29 2005-12-01 Baxter Healthcare S.A. Poxvirus recombinados en regiones esenciales con la ayuda de polinucleotidos extraños.
CN1180843C (zh) * 1994-07-27 2004-12-22 昆士兰医学研究所 多表位疫苗
US5676950A (en) * 1994-10-28 1997-10-14 University Of Florida Enterically administered recombinant poxvirus vaccines
US5756341A (en) 1994-11-10 1998-05-26 Immuno Ag Method for controlling the infectivity of viruses
US5753489A (en) 1994-11-10 1998-05-19 Immuno Ag Method for producing viruses and vaccines in serum-free culture
US5566011A (en) * 1994-12-08 1996-10-15 Luncent Technologies Inc. Antiflector black matrix having successively a chromium oxide layer, a molybdenum layer and a second chromium oxide layer
UA68327C2 (en) † 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
JP2000517290A (ja) 1996-02-21 2000-12-26 リスジーウィックス，ジュリアナ 保護的及び治療的な遺伝子免疫化のための方法及び組成物
WO1998004680A1 (en) 1996-07-26 1998-02-05 University Of Manitoba Serum-free medium for growth of anchorage-dependant mammalian cells
EP0951555A2 (en) † 1996-09-24 1999-10-27 Bavarian Nordic Research Institute A/S Recombinant mva virus expressing dengue virus antigens, and the use thereof in vaccines
WO1998017283A1 (en) 1996-10-25 1998-04-30 The Wistar Institute Of Anatomy & Biology Method of vaccinating infants against infections
US6204250B1 (en) * 1996-11-22 2001-03-20 The Mount Sinai Medical Center Of The City Of New York Immunization of infants
US20030138454A1 (en) * 1997-06-09 2003-07-24 Oxxon Pharmaccines, Ltd. Vaccination method
GB9711957D0 (en) * 1997-06-09 1997-08-06 Isis Innovation Methods and reagents for vaccination
GB0023203D0 (en) 2000-09-21 2000-11-01 Isis Innovation Vaccination method
DE19729279A1 (de) † 1997-07-09 1999-01-14 Peter Hildebrandt Urologisches Implantat, insbesondere Gefäßwandstütze für den Urinaltrakt
WO1999007869A1 (en) † 1997-08-05 1999-02-18 University Of Florida Live recombinant vaccine comprising inefficiently or non-replicating virus
US6667176B1 (en) * 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
DE69839970D1 (de) 1998-11-10 2008-10-16 Univ Rochester Methoden zu herstellung von genbanken
EP2042598A1 (en) 1998-11-18 2009-04-01 Oxford Biomedica (UK) Limited 5T4 tumour-associated antigen for use in tumour immunotherapy
GB2370571B (en) 1998-11-18 2003-05-07 Oxford Biomedica Ltd A modified 5t4 antigen
US6173813B1 (en) 1998-12-23 2001-01-16 Otis Elevator Company Electronic control for an elevator braking system
US6497883B1 (en) 1999-06-10 2002-12-24 Merial Porcine circovirus recombinant poxvirus vaccine
CN1311871C (zh) * 2000-03-02 2007-04-25 爱莫里大学 Dna表达载体及其应用方法
CA2397675C (en) 2000-03-14 2012-11-13 Anton Mayr Altered strain of the modified vaccinia virus ankara (mva)
KR100341030B1 (ko) 2000-03-16 2002-06-20 유태욱 캡션 데이터와 음성 데이터의 재생방법 및 이를 이용한 디스플레이장치
JP2003533989A (ja) 2000-05-24 2003-11-18 メリアル ブタ生殖・呼吸症候群ウィルス（ｐｒｒｓｖ）の組換えポックスウィルスワクチン
JP5037775B2 (ja) * 2000-07-11 2012-10-03 アイキュリス・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング・ウント・コムパニー・コマンディットゲゼルシャフト 抗ウイルス薬および癌に対する医薬の製造のためのパラポックスウイルスｏｖｉｓの使用
US6733993B2 (en) * 2000-09-15 2004-05-11 Merck & Co., Inc. Enhanced first generation adenovirus vaccines expressing codon optimized HIV1-gag, pol, nef and modifications
EE05680B1 (et) * 2000-11-23 2013-10-15 Bavarian Nordic A/S Muundatud vaktsiiniaviirus, selle valmistamine ja kasutamine, seda sisaldav farmatseutiline kompositsioon ning vaktsiin
US7445924B2 (en) * 2000-11-23 2008-11-04 Bavarian Nordic A/S Modified Vaccinia Ankara virus variant and cultivation method
US7628980B2 (en) * 2000-11-23 2009-12-08 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
US7097842B2 (en) * 2000-11-23 2006-08-29 Bavarian Nordic A/S Modified vaccinia virus ankara for the vaccination of neonates
UA82466C2 (uk) * 2001-07-18 2008-04-25 Бавариан Нордика А/С Спосіб посилення ампліфікації хордопоксвірусу
CA2466413C (en) * 2001-12-04 2014-11-04 Bavarian Nordic A/S Flavivirus ns1 subunit vaccine
UA77735C2 (en) 2001-12-20 2007-01-15 Bavarian Nordic As Method for recovery of poxviruses from infected cells
WO2003078640A2 (en) 2002-03-15 2003-09-25 Baxter International Inc. Recombinant drug-sensitive vaccinia virus as smallpox vaccine
KR101028937B1 (ko) * 2002-04-19 2011-04-12 버베리안 노딕 에이/에스 신생아의 백신접종용 변형 백시니아 바이러스 안카라
PL218318B1 (pl) * 2002-05-16 2014-11-28 Bavarian Nordic As Rekombinowany wirus krowianki Ankara (MVA), zawierająca go komórka, szczepionka lub kompozycja farmaceutyczna, sposób lub zestaw do jego otrzymywania, sekwencja DNA zawierająca genom tego wirusa oraz sposób wykrywania tego wirusa lub komórek nim zainfekowanych
NZ536500A (en) * 2002-05-16 2008-01-31 Bavarian Nordic As Expression of genes in modified vaccinia virus ankara by using the cowpox ATI promoter
EA009008B1 (ru) * 2002-09-05 2007-10-26 Бавариан Нордик А/С Способ амплификации вируса оспы
CN1717488A (zh) * 2002-11-25 2006-01-04 巴法里安诺迪克有限公司 包含至少两个牛痘ati启动子的重组痘病毒
US6976752B2 (en) * 2003-10-28 2005-12-20 Lexmark International, Inc. Ink jet printer with resistance compensation circuit
EP1845164B1 (en) * 2003-11-24 2010-06-16 Bavarian Nordic A/S Promoters for expression in modified vaccinia virus ankara
EP1586330A1 (en) * 2004-04-16 2005-10-19 Georg-August-Universität Göttingen Vaccination against malignant melanoma
US8354093B2 (en) * 2004-10-15 2013-01-15 Washington University Cell permeable nanoconjugates of shell-crosslinked knedel (SCK) and peptide nucleic acids (“PNAs”) with uniquely expressed or over-expressed mRNA targeting sequences for early diagnosis and therapy of cancer
EP1835031A1 (en) 2006-03-14 2007-09-19 Paul-Ehrlich-Institut Bundesamt für Sera und Impfstoffe Use of a recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA) for the treatment of type I hypersensitivity in a living animal including humans
DK2073837T3 (da) * 2006-10-06 2014-09-29 Bavarian Nordic Inc Rekombinant modificeret vaccinia-ankara-virus, der koder for et her-2-antigen, i kombination med en taxan til anvendelse til behandling af cancer
EP1925318A1 (en) 2006-11-20 2008-05-28 Paul-Ehrlich-Institut Recombinant modified vaccinia virus Ankara (MVA)-based vaccine for the avian flu
US8268327B2 (en) * 2007-04-27 2012-09-18 Bavarian Nordic A/S Immediate protection against pathogens via MVA
AU2008312444B2 (en) * 2007-10-18 2014-02-06 Bavarian Nordic A/S Use of MVA to treat prostate cancer

Also Published As

Publication number Publication date
CA2421151A1 (en) 2002-05-30
US20110182933A1 (en) 2011-07-28
BR0115533A (pt) 2004-02-03
SI1335987T1 (sl) 2006-06-30
UA76731C2 (uk) 2006-09-15
US20030206926A1 (en) 2003-11-06
WO2002042480A2 (en) 2002-05-30
NO20032309L (no) 2003-05-21
ES2256323T3 (es) 2006-07-16
US7335364B2 (en) 2008-02-26
PL361459A1 (en) 2004-10-04
JP4421188B2 (ja) 2010-02-24
US20110182932A1 (en) 2011-07-28
CZ20031366A3 (cs) 2003-08-13
US20120328650A1 (en) 2012-12-27
US20090169579A1 (en) 2009-07-02
EP2202315A1 (en) 2010-06-30
CY1105594T1 (el) 2010-07-28
US7189536B2 (en) 2007-03-13
CA2421151C (en) 2013-07-02
US7923017B2 (en) 2011-04-12
US6913752B2 (en) 2005-07-05
US7459270B2 (en) 2008-12-02
PT1335987E (pt) 2006-05-31
FR13C0070I1 (cs) 2014-01-17
MXPA03002513A (es) 2004-09-10
HU230198B1 (hu) 2015-10-28
WO2002042480A3 (en) 2002-08-01
EP2204452A1 (en) 2010-07-07
LU92311I2 (fr) 2014-01-20
CN100537773C (zh) 2009-09-09
AU3163902A (en) 2002-06-03
FR13C0070I2 (fr) 2019-06-21
DE60116371T3 (de) 2016-11-17
DK1335987T3 (da) 2006-04-24
CY2013048I2 (el) 2015-12-09
DE60116371T2 (de) 2006-09-07
IL154712A0 (en) 2003-10-31
AU2002231639B2 (en) 2007-01-04
NZ524661A (en) 2005-03-24
NO337867B1 (no) 2016-07-04
SI1335987T2 (sl) 2016-10-28
NO20032309D0 (no) 2003-05-21
HUP0400685A2 (hu) 2004-07-28
IL154712A (en) 2010-05-31
KR20030081333A (ko) 2003-10-17
EE200300173A (et) 2003-06-16
ES2256323T5 (es) 2016-11-21
HUS1600010I1 (hu) 2020-01-28
EP1598425A1 (en) 2005-11-23
EP1335987B2 (en) 2016-06-15
US8268325B2 (en) 2012-09-18
DK1335987T4 (en) 2016-09-19
BRPI0115533B8 (pt) 2021-05-25
CN1476483A (zh) 2004-02-18
EP1335987A2 (en) 2003-08-20
US20100119545A1 (en) 2010-05-13
KR20090057335A (ko) 2009-06-04
DE20122302U1 (de) 2005-02-24
KR100830295B1 (ko) 2008-05-16
RU2290438C2 (ru) 2006-12-27
CY2013048I1 (el) 2015-12-09
EP1335987B1 (en) 2005-12-28
US7384644B2 (en) 2008-06-10
US20050271688A1 (en) 2005-12-08
DE60116371D1 (de) 2006-02-02
HUP0400685A3 (en) 2004-10-28
US20060280758A1 (en) 2006-12-14
US20030215466A1 (en) 2003-11-20
BR0115533B1 (pt) 2017-11-14
US6761893B2 (en) 2004-07-13
US8268329B2 (en) 2012-09-18
EE05680B1 (et) 2013-10-15
JP2004514436A (ja) 2004-05-20
CN101676389A (zh) 2010-03-24
HK1059453A1 (en) 2004-07-02
PL212047B1 (pl) 2012-08-31
KR100910297B1 (ko) 2009-08-03
ATE314483T2 (de) 2006-01-15
BE2013C065I2 (cs) 2021-01-29
KR20080032016A (ko) 2008-04-11
US20030202988A1 (en) 2003-10-30
US20080089907A1 (en) 2008-04-17
US7939086B2 (en) 2011-05-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CA2421151C (en) Modified vaccinia ankara virus variant
AU2002231639A1 (en) Modified vaccinia ankara virus variant

Legal Events

Date Code Title Description
MK4A Patent expired

Effective date: 20211122